JP3658640B2

JP3658640B2 - Method for recovering basic compound using temperature-stimulated responsive copolymer

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Publication number: JP3658640B2
Application number: JP2001121575A
Authority: JP
Inventors: 豊常盤; 隆生楽; 博巳嶋川
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2001-04-19
Filing date: 2001-04-19
Publication date: 2005-06-08
Anticipated expiration: 2021-04-19
Also published as: JP2002317017A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヌクレオシドやヌクレオチド及び核酸回収用沈殿剤として、温度刺激応答性共重合体を利用したアフィニティ沈殿によるヌクレオシドやヌクレオチド及び核酸の回収方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシドやヌクレオチドの精製には、そのリガンドを担体に結合したアフィニティカラムクロマトグラフィーが広く利用されている（Ｋ．Ｒａｈｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１６（３）３６８−３６８（１９８８）Ｑ．Ｗａｎｇｅｔａｌ．Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌ．Ｔｅｃｈ．１３，４６３−４６７（１９９９）Ｄ．Ｐ．Ｃｈａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，Ｔａｌａｎｔａ４９．９６９−９８３（１９９９））。しかし、その精製工程においては長時間を要し、また大量の溶出液を必要とする。近年、生理活性物質を機能性高分子で修飾したハイブリッド技術がめざましく進展してきている。現在、タンパク質の簡便、大量精製を目的としたアフィニティ沈殿法も報告されている（Ｋ．Ｈｏｓｈｉｎｏｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６０，５６８−５７９，１９９８）。しかしながら、ヌクレオシド及びヌクレオチド、核酸の精製についてのアフィニティ沈殿法は報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ポリマー鎖にヌクレオシドを有する温度感受性ポリマーを利用したヌクレオシド、ヌクレオチド及び核酸を分離回収する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ジカルボン酸ビニルエステルにヌクレオシドが結合した重合性のヌクレオシドエステルとＮ−イソプロピルアクリルアミドとからなる温度感受性を有する共重合体が、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸の間でアフィニティ沈殿を生じることを見いだし、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下の発明を提供するものである。
（１）ヌクレオシド、ヌクレオチド及び核酸の中から選ばれる塩基化合物を含む水溶液中から沈殿剤を用いて該塩基化合物を沈殿させて回収する方法であって、該沈殿剤として下記一般式（１）で表される構造単位と下記式（２）で表される構造単位とからなる共重合体Ａを用いることからなり、該共重合体中に含まれるヌクレオシド残基と該水溶液中に含まれる塩基化合物とは構造的に相補的関係にあることを特徴とする前記の方法。
【化１３】

（式中、Ｒ₁はアルキレン基、Ｓ₁はヌクレオシドから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す）
【化１４】

（２）アデノシン、２’−デオキシアデノシン、アデノシン系ヌクレオチド及びアデノシン系核酸の中から選ばれる塩基化合物を含む水溶液中から沈殿剤を用いて該塩基化合物を沈殿させて回収する方法であって、該沈殿剤として下記一般式（３）で表される構造単位と下記式（２）で表される構造単位とからなる共重合体Ｂを用いることを特徴とする前記の方法。
【化１５】

（式中、Ｒ₁はアルキレン基、Ｓ₂はウリジンあるいは２’−デオキシウリジンから１個の水酸基が除かれたヌクレオチド残基を表す）
【化１６】

（３）ウリジン、２’−デオキシウリジン、ウリジン系ヌクレオチド、ウリジン系核酸、チミンリボシド、２’−デオキシチミジン、チミジン系ヌクレオチド及びチミジン系核酸の中から選ばれる塩基化合物を含む水溶液中から沈殿剤を用いて該塩基化合物を沈殿させて回収する方法であって、該沈殿剤として下記一般式（４）で表される構造単位と下記式（２）で表される構造単位とからなる共重合体Ｃを用いることを特徴とする前記の方法。
【化１７】

（式中、Ｒ₁はアルキレン基、Ｓ₃はアデノシンあるいは２’−デオキシアデノシンから１個の水酸基が除かれた糖残基を表す）
【化１８】

（４）シチジン、２’−デオキシシチジン、シチジン系ヌクレオチド及びシチジン系核酸の中から選ばれる塩基化合物を含む水溶液中から沈殿剤を用いて該塩基化合物を沈殿させて回収する方法であって、該沈殿剤として下記一般式（５）で表される構造単位と下記式（２）で表される構造単位とからなる共重合体Ｄを用いることを特徴とする前記の方法。
【化１９】

（式中、Ｒ₁はメチレン基又はアルキレン基、Ｓ₄はグアノシンあるいは２’−デオキシグアノシンから１個の水酸基が除かれた糖残基を表す）
【化２０】

（５）グアノシン、２’−デオキシグアノシン、グアノシン系ヌクレオチド及びグアノシン系核酸の中から選ばれる塩基化合物を含む水溶液中から沈殿剤を用いて該塩基化合物を沈殿させて回収する方法であって、該沈殿剤として下記一般式（６）で表される構造単位と下記式（２）で表される構造単位とからなる共重合体Ｅを用いることを特徴とする前記の方法。
【化２１】

（式中、Ｒ₁はアルキレン基、Ｓ₅はシチジンあるいは２’−デオキシシチジンから１個の水酸基が除かれた糖残基を表す）
【化２２】

（６）アデノシン、２’−デオキシアデノシン、アデノシン系ヌクレオチド及びアデノシン系核酸の中から選ばれる塩基化合物を含む水溶液中から沈殿剤を用いて該塩基化合物を沈殿させて回収する方法であって、該沈殿剤として下記一般式（７）で表される構造単位と下記式（２）で表される構造単位とからなる共重合体Ｆを用いることを特徴とする前記の方法。
【化２３】

（式中、Ｒ₁はアルキレン基、Ｓ₆はチミンリボシドあるいは２’−デオキシチミジンから１個の水酸基が除かれた糖残基を表す）
【化２４】

【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明で用いる前記共重合体（Ａ）〜（Ｆ）に関し、以下において詳述する。
【０００６】
［共重合体（Ａ）］共重合体（Ａ）は、下記一般式（８）で表される重合性エステルと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとを、重合開始剤の存在下にラジカル重合させることによって合成される。この共重合体（Ａ）において、前記一般式（１）で表される構造単位は、前記一般式（８）の重合性エステル由来の構造単位であり、前記一般式（２）で表される構造単位は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド由来の構造単位である。この共重合体（Ａ）において、一般式（１）の構造単位は、分子中０．１〜９９．９モル％、好ましくは０．１〜２０％、より好ましくは０．１〜１０モル％である。
【化２５】

（式中、Ｒ₁はアルキレン基、Ｓ₁はヌクレオシドから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す）
【０００７】
本発明の共重合体（Ａ）は、例えば下記の方法により製造することができる。即ち、一般式（８）のヌクレオシドエステルとＮ−イソプロピルアクリルアミドとを混合し、該混合物をラジカル重合開始剤の存在下、加熱等により重合反応を開始させることによって合成できる。好ましくは、両者のモノマーを溶媒中に溶解し、該混合物をラジカル重合開始剤の存在下、加熱等により重合反応を開始させることによって合成するのがよい。溶媒としては、重合反応に関与せず、原料モノマーが溶解可能であれば、特に限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピリジン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、水等が例示でき、好ましくＤＭＦ、ＤＭＳＯである。溶媒と該モノマー混合物との混合比は、得られる共重合体の要求物性に基づいて任意の範囲で混合できるが、通常は、モノマー混合物１重量部に対して、溶媒を１〜１００重量部、好ましくは１〜１０重量部の範囲で混合するのがよい。この範囲を超えると分子量が低下するおそれがある。ラジカル重合開始剤としては、特に限定されないが、アゾビスイソブチルニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスアミジノプロパン塩酸塩等のアゾ化合物や、フェントン試薬等が例示でき、好ましくは、アゾ化合物、特にＡＩＢＮである。ラジカル重合開始剤の使用量としては、得られる共重合体の要求物性に応じて任意の範囲で用いられるが、通常はモノマー総量の０．１〜５モル％程度である。重合は、例えば、上記各モノマー及び溶媒を均一に混合したモノマー溶液に、ラジカル重合開始剤を添加、混合し、５０〜８０℃で１時間以上行わせる。望ましくは、６５℃程度で２〜２４時間程度反応させることにより実施される。モノマー溶液は、高分子量のポリマーを得るために脱気することが好ましく、また、ラジカル重合開始剤を加えた後も同様である。反応終了後、溶媒を除去し、残査を蒸留水等に溶解させる。得られた共重合体は、温度応答性があるので、２９〜５０℃程度の条件にすることによって沈殿物として回収することができる。さらに必要に応じて、例えば、有機溶剤で洗浄や、透析等による精製を行なってもよい。
【０００８】
本発明の共重合体（Ａ）の分子量には特に制限はないが、好ましくは数平均分子量で３０００〜１０００００、好ましくは５０００〜４００００である。分子量は、共重合体の使用目的に応じて適当な大きさのものを選択することができる。また、重合性ヌクレオシドエステルの組成比率を多くすることによって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸の吸着量を増やすことができる。本発明の共重合体は、ランダム構造を有してもよいし、ブロック構造を有していてもよい。上記製造方法は、ランダム構造の共重合体を製造する方法であるが、ブロック共重合体の製造についても、上記製法を参照し、常法に従い、製造することができる。
【０００９】
前記一般式（１）及び（８）において、Ｒ_１は直鎖状又は分岐状アルキレン基を示すが、その炭素数は１〜１８、好ましくは２〜８である。このアルキレン基には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、テトラメチレン、ヘキサメチレン、オクタメチレン等が挙げられる。好ましいアルキレン基は、テトラメチレンである。前記一般式（１）及び（８）において、ヌクレオシド残基Ｓ_１は特に制約されず、従来公知の各種のヌクレオシドから１つの水酸基を除いた残基、即ち、ヌクレオシド由来の残基を包含する。この場合のヌクレオシドは、プリン塩基またはピリミジン塩基のような窒素を含む有機塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物、例えば、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、チミンリボシド、イノシン、キサントシン、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシウリジン、２’−デオキシシチジン、２’−デオキシチミジン、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシキサントシン等が挙げられる。好ましくは、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、チミンリボシドである。
【００１０】
本発明で用いられる前記一般式（８）の重合性のヌクレオシドは、ジカルボン酸ビニルエステルとヌクレオシドとを化学的にエステル結合させるか、あるいは加水分解酵素（もしくは該酵素を産生する微生物等）を用いて酵素化学的に（もしくは発酵的に）結合させることにより合成することができる。酵素化学的にエステル結合させる場合には、酵素としてプロテアーゼやリパーゼ、特に放線菌ストレプトマイセス属由来やバチルス属由来のプロテアーゼやアルカリゲネス属やブタ膵臓由来のリパーゼが好ましく用いられる。または、各種由来のエステラーゼを用いてもよい。化学的にエステル結合させる場合には、例えば、塩基触媒を用いた方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５３，４４９（１９９８））で記載の方法によって合成し、例えばシリカゲル等のカラムで分離し得ることができる。
【００１１】
［共重合体（Ｂ）］共重合体（Ｂ）は、下記一般式（９）で表される重合性エステルと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとを、重合開始剤の存在下にラジカル重合させることによって合成される。この共重合体（Ｂ）において、前記一般式（３）で表される構造単位は、前記一般式（９）の重合性エステル由来の構造単位であり、前記式（２）で表される構造単位は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド由来の構造単位である。この共重合体（Ｂ）において、一般式（３）の構造単位は、分子中０．１〜９９．９モル％、好ましくは０．１〜２０％、より好ましくは０．１〜１０モル％である。本発明の共重合体（Ｂ）の製造は、前記共重合体（Ａ）の製造の場合と同様にして行うことができる。
【化２６】

（式中、Ｒ₁はメチレン基又はアルキレン基、Ｓ₂はウリジンあるいは２’−デオキシウリジンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す）
【００１２】
本発明の共重合体（Ｂ）の分子量には特に制限はないが、数平均分子量で３０００〜１０００００、好ましくは５０００〜４００００である。分子量は、共重合体の使用目的に応じて適当な大きさのものを選択することができる。また、重合性ヌクレオシドエステルの組成比率を多くすることによって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸の吸着量を増やすことができる。本発明の共重合体（Ｂ）は、ランダム構造を有してもよいし、ブロック構造を有していてもよい。上記製造方法は、ランダム構造の共重合体を製造する方法であるが、ブロック共重合体の製造についても、上記製法を参照し、常法に従い、製造することができる。
【００１３】
前記一般式（３）及び（９）において、Ｒ_１は直鎖状又は分岐状アルキレン基を示すが、その炭素数は１〜１８、好ましくは２〜８である。このアルキレン基には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、テトラメチレン、ヘキサメチレン、オクタメチレン等が挙げられる。好ましいアルキレン基は、テトラメチレンである。前記一般式（３）及び（９）において、Ｓ_２はウリジンあるいは２’−デオキシウリジンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す。
【００１４】
前記一般式（９）の重合性ヌクレオシドは、前記一般式（８）の重合性ヌクレオシドと同様にして合成することができる。
【００１５】
［共重合体（Ｃ）］共重合体（Ｃ）は、下記一般式（１０）で表される重合性エステルと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとを、重合開始剤の存在下にラジカル重合させることによって合成される。この共重合体（Ｃ）において、前記一般式（４）で表される構造単位は、前記一般式（１０）の重合性エステル由来の構造単位であり、前記式（２）で表される構造単位は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド由来の構造単位である。この共重合体（Ｃ）において、一般式（４）の構造単位は、分子中０．１〜９９．９モル％、好ましくは０．１〜２０モル％、より好ましくは０．１〜１０モル％である。本発明の共重合体（Ｃ）の製造は、前記共重合体（Ａ）の製造の場合と同様にして行うことができる。
【化２７】

（式中、Ｒ₁はアルキレン基、Ｓ₃はアデノシンあるいは２’−デオキシアデノシンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す）
【００１６】
本発明の共重合体（Ｃ）の分子量には特に制限はないが、数平均分子量で３０００〜１０００００、好ましくは５０００〜４００００である。分子量は、共重合体の使用目的に応じて適当な大きさのものを選択することができる。また、重合性ヌクレオシドエステルの組成比率を多くすることによって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸の吸着量を増やすことができる。本発明の共重合体（Ｃ）は、ランダム構造を有してもよいし、ブロック構造を有していてもよい。上記製造方法は、ランダム構造の共重合体を製造する方法であるが、ブロック共重合体の製造についても、上記製法を参照し、常法に従い、製造することができる。
【００１７】
前記一般式（４）及び（１０）において、Ｒ_１は直鎖状又は分岐状アルキレン基を示すが、その炭素数は１〜１８、好ましくは２〜８である。このアルキレン基には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、テトラメチレン、ヘキサメチレン、オクタメチレン等が挙げられる。好ましいアルキレン基は、テトラメチレンである。前記一般式（４）及び（１０）において、Ｓ_３はアデノシンあるいは２’−デオキシアデノシンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す。
【００１８】
前記一般式（１０）の重合性ヌクレオシドは、前記一般式（８）の重合性ヌクレオシドと同様にして合成することができる。
【００１９】
［共重合体（Ｄ）］共重合体（Ｄ）は、下記一般式（１１）で表される重合性エステルと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとを、重合開始剤の存在下にラジカル重合させることによって合成される。この共重合体（Ｄ）において、前記一般式（５）で表される構造単位は、前記一般式（１１）の重合性エステル由来の構造単位であり、前記式（２）で表される構造単位は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド由来の構造単位である。この共重合体（Ｄ）において、一般式（５）の構造単位は、分子中０．１〜９９．９モル％、好ましくは０．１〜２０モル％、より好ましくは０．１〜１０モル％である。本発明の共重合体（Ｄ）の製造は、前記共重合体（Ａ）の製造の場合と同様にして行うことができる。
【化２８】

（式中、Ｒ₁はアルキレン基、Ｓ₄はグアノシンあるいは２’−デオキシグアノシンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す）
【００２０】
本発明の共重合体（Ｄ）の分子量には特に制限はないが、数平均分子量で３０００〜１０００００、好ましくは５０００〜４００００である。分子量は、共重合体の使用目的に応じて適当な大きさのものを選択することができる。また、重合性ヌクレオシドエステルの組成比率を多くすることによって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸の吸着量を増やすことができる。本発明の共重合体（Ｄ）は、ランダム構造を有してもよいし、ブロック構造を有していてもよい。上記製造方法は、ランダム構造の共重合体を製造する方法であるが、ブロック共重合体の製造についても、上記製法を参照し、常法に従い、製造することができる。
【００２１】
前記一般式（５）及び（１１）において、Ｒ_１は直鎖状又は分岐状アルキレン基を示すが、その炭素数は１〜１８、好ましくは２〜８である。このアルキレン基には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、テトラメチレン、ヘキサメチレン、オクタメチレン等が挙げられる。好ましいアルキレン基は、テトラメチレンである。前記一般式（５）及び（１１）において、Ｓ_４はアデノシンあるいは２’−デオキシアデノシンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す。
【００２２】
前記一般式（１１）の重合性ヌクレオシドは、前記一般式（８）の重合性ヌクレオシドと同様にして合成することができる。
【００２３】
［共重合体（Ｅ）］共重合体（Ｅ）は、下記一般式（１２）で表される重合性エステルと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとを、重合開始剤の存在下にラジカル重合させることによって合成される。この共重合体（Ｅ）において、前記一般式（６）で表される構造単位は、前記一般式（１２）の重合性エステル由来の構造単位であり、前記式（２）で表される構造単位は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド由来の構造単位である。この共重合体（Ｅ）において、一般式（６）の構造単位は、分子中０．１〜９９．９モル％、好ましくは０．１〜２０モル％、より好ましくは０．１〜１０モル％である。本発明の共重合体（Ｅ）の製造は、前記共重合体（Ａ）の製造の場合と同様にして行うことができる。
【化２９】

（式中、Ｒ₁はアルキレン基、Ｓ₅はシチジンあるいは２’−デオキシシチジンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す）
【００２４】
本発明の共重合体（Ｅ）の分子量には特に制限はないが、数平均分子量で３０００〜１０００００、好ましくは５０００〜４００００である。分子量は、共重合体の使用目的に応じて適当な大きさのものを選択することができる。また、重合性ヌクレオシドエステルの組成比率を多くすることによって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸の吸着量を増やすことができる。本発明の共重合体（Ｅ）は、ランダム構造を有してもよいし、ブロック構造を有していてもよい。上記製造方法は、ランダム構造の共重合体を製造する方法であるが、ブロック共重合体の製造についても、上記製法を参照し、常法に従い、製造することができる。
【００２５】
前記一般式（６）及び（１２）において、Ｒ_１は直鎖状又は分岐状アルキレン基を示すが、その炭素数は１〜１８、好ましくは２〜８である。このアルキレン基には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、テトラメチレン、ヘキサメチレン、オクタメチレン等が挙げられる。好ましいアルキレン基は、テトラメチレンである。前記一般式（６）及び（１２）において、Ｓ_５はシチジンあるいは２’−デオキシシチジンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す。
【００２６】
前記一般式（１２）の重合性ヌクレオシドは、前記一般式（８）の重合性ヌクレオシドと同様にして合成することができる。
【００２７】
［共重合体（Ｆ）］共重合体（Ｆ）は、下記一般式（１３）で表される重合性エステルと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとを、重合開始剤の存在下にラジカル重合させることによって合成される。この共重合体（Ｆ）において、前記一般式（７）で表される構造単位は、前記一般式（１３）の重合性エステル由来の構造単位であり、前記式（２）で表される構造単位は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド由来の構造単位である。この共重合体（Ｆ）において、一般式（７）の構造単位は、分子中０．１〜９９．９モル％、好ましくは０．１〜２０モル％、より好ましくは０．１〜１０モル％である。本発明の共重合体（Ｆ）の製造は、前記共重合体（Ａ）の製造の場合と同様にして行うことができる。
【化３０】

（式中、Ｒ₁はアルキレン基、Ｓ₆はチミンリボシドあるいは２’−デオキシチミジンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す）
【００２８】
本発明の共重合体（Ｆ）の分子量には特に制限はないが、数平均分子量で３０００〜１０００００、好ましくは５０００〜４００００である。分子量は、共重合体の使用目的に応じて適当な大きさのものを選択することができる。また、重合性ヌクレオシドエステルの組成比率を多くすることによって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸の吸着量を増やすことができる。本発明の共重合体（Ｆ）は、ランダム構造を有してもよいし、ブロック構造を有していてもよい。上記製造方法は、ランダム構造の共重合体を製造する方法であるが、ブロック共重合体の製造についても、上記製法を参照し、常法に従い、製造することができる。
【００２９】
前記一般式（７）及び（１３）において、Ｒ_１は直鎖状又は分岐状アルキレン基を示すが、その炭素数は１〜１８、好ましくは２〜８である。このアルキレン基には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、プロピレン、テトラメチレン、ヘキサメチレン、オクタメチレン等が挙げられる。好ましいアルキレン基は、テトラメチレンである。前記一般式（７）及び（１３）において、Ｓ_６はチミンリボシドあるいは２’−デオキシチミジンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基を示す。
【００３０】
前記一般式（１３）の重合性ヌクレオシドは、前記一般式（８）の重合性ヌクレオシドと同様にして合成することができる。
【００３１】
本発明で用いる共重合体（Ａ）〜（Ｆ）は、ヌクレオシド分岐構造を有する温度刺激応答性ポリマーであるため、温度刺激応答性の機能性材料として使用することができる。即ち、該共重合体（Ａ）〜（Ｆ）は、例えば、ウリジンエステル構造単位を５モル％含む場合、２７℃程度以下では、水溶液として存在するが、２９℃程度以上になると沈殿する特性を有している。従って、該温度刺激応答性共重合体（Ａ）〜（Ｆ）は、物質精製材料、ドラッグデリバリーシステム制御材料等として用いることができ、各用途に応じて適宜、通常用いられる汎用性の重合性モノマー、水溶性を付加するために重合性糖エステルなど他の成分を共重合させてもよい。
【００３２】
該共重合体（Ａ）〜（Ｆ）は、それに含まれているヌクレオシド残基と構造的に相補するヌクレオシド、ヌクレオチド又は核酸に対する沈殿剤として用いることができる。即ち、本発明においては、ヌクレオシド、ヌクレオチド及び核酸の中から選ばれる塩基化合物を含む水溶液中から、その塩基化合物を沈殿として分離回収する際に、その塩基化合物に対する沈殿剤として、共重合体（Ａ）を用いることによって、その塩基化合物沈殿物として回収することができる。この場合、共重合体（Ａ）としては、それに含まれるヌクレオシド残基（Ｓ_１）が、その水溶液中に溶解する分離回収対象となる塩基化合物と構造的に相補的関係にあるものを選択する。
【００３３】
なお、この場合の構造的に相補的にあるものとは、以下のことを意味する。即ち、Ｓ_１がウリジンあるいは２’−デオキシウリジンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基の場合、アデノシン、２’−デオキシアデノシン、アデノシン系ヌクレオシド又はアデノシン系核酸と構造的に相補性がある。Ｓ_１がアデノシンあるいは２’−デオキシアデノシンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基の場合、ウリジン、２’−デオキシウリジン、ウリジン系ヌクレオシド、ウリジン系核酸、チミンリボシド、２’−デオキシチミジン、チミジン系ヌクレオシド又はチミジン系核酸と構造的に相補性がある。Ｓ_１がグアノシンあるいは２’−デオキシグアノシンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基の場合、シチジン、２’−デオキシシチジン、シチジン系ヌクレオシド又はシチジン系核酸と構造的に相補性がある。Ｓ_１がシチジンあるいは２’−デオキシシチジンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基の場合、グアノシン、２’−デオキシグアノシン、アデノシン系グアノシン又はグアノシン系核酸と構造的に相補性がある。Ｓ_１がチミンリボシドあるいは２’−デオキシチミジンから１個の水酸基が除かれたヌクレオシド残基の場合、アデノシン、２’−デオキシアデノシン、アデノシン系ヌクレオシド又はアデノシン系核酸と構造的に相補性がある。
【００３４】
該共重合体（Ｂ）を用いることにより、水溶液中に溶解する該共重合体（Ｂ）中に含まれるウリジン又は２’−デオキシウリジンと構造的に相補的関係にある塩基化合物、即ち、アデノシン、２’−デオキシアデノシン、アデノシン系ヌクレオチド又はアデノシン系核酸を沈殿させることができる。
【００３５】
該共重合体（Ｃ）を用いることにより、水溶液中に溶解する、該共重合体（Ｃ）中に含まれるアデノシン又は２’−デオキシアデノシンと構造的に相補的関係にある塩基化合物、即ち、ウリジン、２’−デオキシウリジン、ウリジン系ヌクレオチド、ウリジン系核酸、チミンリボシド、２’−デオキシチミジン、チミジン系ヌクレオチド又はチミジン系核酸を沈殿させることができる。
【００３６】
該共重合体（Ｄ）を用いることにより、水溶液中に溶解する、該共重合体（Ｄ）中に含まれるグアノシン又は２’−デオキシグアノシンと構造的に相補的関係にある塩基化合物、即ち、シチジン、２’−デオキシシチジン、シチジン系ヌクレオチド又はシチジン系核酸を沈殿させることができる。
【００３７】
該重合体（Ｅ）を用いることにより、水溶液中に溶解する、該共重合体（Ｅ）中に含まれるシチジン又は２’−デオキシシチジンと構造的に相補的関係にある塩基化合物、即ち、グアノシン、２’−デオキシグアノシン、グアノシン系ヌクレオチド又はグアノシン系核酸を沈殿させることができる。
【００３８】
該共重合体（Ｆ）を用いることにより、水溶液中に溶解する、該共重合体（Ｆ）中に含まれるチミンリボシド又は２’−デオキシチミジンと構造的に相補的関係にある塩基化合物、即ち、アデノシン、２’−デオキシアデノシン、アデノシン系ヌクレオチド又はアデノシン系核酸を沈殿させることができる。
【００３９】
なお、前記に示したアデノシン系ヌクレオチドとは、その構造中にアデノシン残基又は２’−デオキシアデノシン残基を含むヌクレオチドを意味する。アデノシン系核酸とは、その構造中にアデノシン残基又は２’−デオキシアデノシン残基を含む核酸を意味する。ウリジン系ヌクレオチドとは、その構造中にウリジン又は２’−デオキシウリジンを含むヌクレオチドを意味する。ウリジン系核酸とは、その構造中にウリジン又は２’−デオキシウリジンを含む核酸を意味する。チミジン系ヌクレオチドとは、その構造中にチミンリボシド残基又は２’−デオキシチミジン残基を含むヌクレオチドを意味する。チミジン系核酸とは、その構造中にチミンリボシド残基又は２’−デオキシチミジン残基を含む核酸を意味する。シチジン系ヌクレオチドとは、その構造中にシチジン又は２’−デオキシシチジンを含むヌクレオチドを意味する。シチジン系核酸とは、その構造中にシチジン又は２’−デオキシシチジンを含む核酸を意味する。グアノシン系ヌクレオチドとは、その構造中にグアノシン残基又は２’−デオキシグアノシン残基を含むヌクレオチドを意味する。グアノシン系核酸とは、その構造中にグアノシン残基又は２’−デオキシグアノシン残基を含む核酸を意味する。
【００４０】
該共重合体を用いて前記塩基化合物を水溶液中から沈殿分離し、回収するには、該水溶液中に該共重合体を、その共重合体が溶解する温度条件で添加混合し、次いでその共重合体が不溶化する温度条件に昇温させ、溶液（母液）と不溶化物（沈殿）とに分離する。次いで、得られた沈殿物に、その共重合体が溶解する温度条件下で脱離剤を加え、共重合体を結合する塩基化合物を解離させる。前記塩基化合物を含有する水溶液は、該塩基化合物に対して溶解性を示す水や水溶液等の水性溶媒に対して塩基化合物を溶解させることによって調製することができる。この場合、その水性溶媒としては、例えば、酢酸やリン酸等の緩衝液が例示することができる。塩基化合物を含む水溶液と本発明の共重合体の配合比については、共重合体中のヌクレオシド、ヌクレオチド又は核酸の含有量に依存するが、例えば、塩基化合物１ｇ当たり、共重合体を１０〜５００ｇ、好ましくは５０〜２００ｇの割合で混合する。塩基化合物を含む水溶液と本発明の共重合体を混合し、該共重合体が水中に溶解する温度の条件下に静置させることによって所望の塩基化合物を本発明の共重合体に結合させる。この場合、好ましくは、撹拌した方がよい。共重合体が不溶になる温度に水溶液の温度を上げることによって、塩基化合物が結合している共重合体は不溶化されるが、不溶化した共重合体を遠心分離によって、沈殿物として回収する。
【００４１】
得られた沈殿物には、例えば、蒸留水、緩衝液を添加し、共重合体が溶解できる温度に温度を下げ、脱離剤を加えることによって、共重合体から所望の塩基化合物を解離させることができる。この場合の解離剤としては、各種塩が例示できる。塩としてはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２等が例示できるが、ＭｇＣｌ_２が好ましい。使用する濃度としては０．１〜３Ｍ、好ましくは、０．４〜２Ｍ程度である。沈殿物に対するこれら解離剤の量は適宜設定される。解離を行うに際しては、撹拌する方がよい。また、解離した塩基化合物は、温度上げて共重合体を沈殿させ、上清を集めることによって得ることができる。また、所望により、高速液体クロマトグラフィー、透析等によって精製してもよい。上記精製方法は、バッチ法によって行うのが好ましい。
【００４２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳述する。
【００４３】
参考例１
ウリジン３．０５ｇおよびアジピン酸ジビニル９．９ｇを含むピリジン５０ｍｌにナガセケムテックス社製バチラスズブチリス由来のプロテアーゼ２．５ｇを添加し、３０℃、１６０ｒｐｍにて７日間撹拌した。また、反応液の薄層クロマトグラフィー分析から、生成物は一つであった。反応液をろ過し、酵素を取り除き、減圧下、濃縮後、シリカゲル（メルク製、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ−６０）を充填したカラム（内径：５ｃｍ、長さ：５０ｃｍ）に負荷し、ヘキサン：酢酸エチル（５：１）の混合溶媒で溶出し、生成物を分離した。反応物の高速液体クロマトグラフィー分析（カラム：ＴＯＳＯＨＡｍｉｄｅ−８０、溶媒：アセトニトリル：水＝３：１、示差屈折計検出）より約１００％のウリジンエステルの変換を確認し、５’−Ｏ−ｖｉｎｙｌａｄｉｐｏｌｙｌ−Ｄ−ｕｒｉｄｉｎｅ（ＶＡＵ）を白色結晶として４．０ｇ得た。
【００４４】
実施例１：ウリジンエステル／Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体の合成
ウリジンエステル／Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体の合成は、以下のようにして行った。１０ｍｌのアンプル管にＶＡＵおよびＮ−イソプロピルアクリルアミドを併せて２ｍｏｌ、ＡＩＢＮ４０ｍｇをＤＭＦ４ｍｌに溶解させた後、窒素ガスにより脱気し、６５℃で２４時間重合させた。この反応の後、反応液を２００ｍｌのジエチルエーテル沈殿させる。得られた沈殿物を５％含む水溶液とした後、感熱応答性を示す温度にまで上昇させて、再沈殿させると純粋なウリジンエステル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体が得られる。上記と同様に、ウリジンエステル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの配合比を変えて共重合体を得た。得られた各共重合体の特性を以下の表１に示す。
【００４５】
【表１】

【００４６】
表１に示したＭｎ（数平均分子量）及びＭｗ（重量平均分子量）は、ゲルパーミューションクロマトグラフィーで測定した。曇点（℃）は、分光光度計で測定した。共重合体中に含まれるウリジンエステル含量は、２６２ｎｍのウリジン標準曲線と比較して決定した。Ｎ．Ｄは、水中において５〜３３℃では曇点が観察できないことを示す。Ｎｏｔｓｈｏｗｎは、曇点のないことを示す。
【００４７】
試験例１温度刺激応答性の評価
実施例１で得られた共重合体ａ〜ｇについて温度刺激応答性（温度に対する溶解性の応答）の評価を行った。即ち、熱分析計を用いて共重合体の熱変化を評価した。使用した共重合体溶液の濃度は５ｗ．ｔ．％である。その結果を図１に示す。共重合体ｂとｃは、２７〜３２℃に明らかな転移点が観察できる。共重合体ｂの水溶液は２５℃以下で水に可溶で２９℃以上で完全に不溶化した。
【００４８】
実施例２：ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸の精製
ヌクレオシドを５モル％含む温度刺激応答性重合体を使用し、ウリジン、チミンリボシド、グアノシン、シチジン、アデノシン、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド、アデノシン５’−一リン酸、ウリジン二リン酸グルコース、ポリアデニンの吸着・回収を行った。３ｍｌの蒸留水に共重合体６０ｍｇ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸をそれぞれ１２ｍｇ加え、溶解した。その溶液を１０℃でそれぞれ２ｈｒ撹拌した。その溶液を感熱応答性を示す温度まで温度を上げ、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。引き続いて上清を２５９ｎｍで測定した。沈殿した共重合体を２Ｍの塩化マグネシウム３ｍｌで洗浄した。洗浄液を２５９ｎｍで測定し、回収率を求め、表２に示した。
【００４９】
【表２】

【００５０】
【発明の効果】
ヌクレオシドの水酸基に重合性置換基を導入した重合性ヌクレオシドエステルを温度刺激応答性高分子のモノマーであるＮ−イソプロピルアクリルアミドと共重合することにより、温度刺激応答性共重合体を得ることができる。このものを用いることにより、相補性のあるヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸をアフィニティ沈殿法により短時間でしかも少量の水で精製することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた共重合体ａ〜ｆについて温度刺激応答性（温度に対する溶解性の応答）の評価を示す。横軸に温度、縦軸に熱量を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for recovering nucleosides, nucleotides, and nucleic acids by affinity precipitation using a temperature-stimulated responsive copolymer as a precipitant for recovering nucleosides, nucleotides, and nucleic acids.
[0002]
[Prior art]
For purification of nucleosides and nucleotides, affinity column chromatography in which the ligand is bound to a carrier is widely used (K. Rahman et al., Biochem. Soc. Trans. 16 (3) 368-368 (1988) Q. Wang et al., Biotechnol.Tech., 13, 463-467 (1999) D. P. Chandler et al., Talanta 49. 969-983 (1999)). However, the purification process takes a long time and requires a large amount of eluate. In recent years, hybrid technology in which a physiologically active substance is modified with a functional polymer has made remarkable progress. At present, an affinity precipitation method for the purpose of convenient and mass purification of proteins has also been reported (K. Hoshino et al., Biotechnol. Bioeng., 60, 568-579, 1998). However, no affinity precipitation method has been reported for purification of nucleosides, nucleotides and nucleic acids.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for separating and recovering nucleosides, nucleotides and nucleic acids using a temperature sensitive polymer having nucleosides in the polymer chain.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a temperature-sensitive copolymer comprising a polymerizable nucleoside ester in which a nucleoside is bonded to a dicarboxylic acid vinyl ester and N-isopropylacrylamide, It has been found that affinity precipitation occurs between nucleosides, nucleotides and nucleic acids, and the present invention has been completed. That is, the present invention provides the following inventions.
(1) A method for precipitating the base compound from an aqueous solution containing a base compound selected from nucleosides, nucleotides and nucleic acids using a precipitating agent, and recovering the base compound by the following general formula (1) A nucleoside residue contained in the copolymer and a base compound contained in the aqueous solution, which comprises using a copolymer A comprising the structural unit represented by the structural unit represented by the following formula (2): Wherein the method is structurally complementary.
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(Wherein R ₁ Is an alkylene group, S ₁ Indicates a nucleoside residue obtained by removing one hydroxyl group from a nucleoside)
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(2) A method for precipitating and recovering a base compound from an aqueous solution containing a base compound selected from adenosine, 2′-deoxyadenosine, adenosine nucleotides and adenosine nucleic acids using a precipitant, The method as described above, wherein a copolymer B comprising a structural unit represented by the following general formula (3) and a structural unit represented by the following formula (2) is used as a precipitant.
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(Wherein R ₁ Is an alkylene group, S ₂ Represents a nucleotide residue obtained by removing one hydroxyl group from uridine or 2'-deoxyuridine)
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(3) Using a precipitant from an aqueous solution containing a base compound selected from uridine, 2′-deoxyuridine, uridine nucleotides, uridine nucleic acids, thymine riboside, 2′-deoxythymidine, thymidine nucleotides and thymidine nucleic acids. A copolymer C comprising a structural unit represented by the following general formula (4) and a structural unit represented by the following formula (2) as the precipitating agent: A method as described above, characterized in that
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(Wherein R ₁ Is an alkylene group, S _Three Represents a sugar residue obtained by removing one hydroxyl group from adenosine or 2'-deoxyadenosine)
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(4) A method of precipitating and recovering the base compound from a solution containing a base compound selected from cytidine, 2′-deoxycytidine, cytidine nucleotides and cytidine nucleic acids using a precipitant, The method as described above, wherein a copolymer D comprising a structural unit represented by the following general formula (5) and a structural unit represented by the following formula (2) is used as a precipitant.
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(Wherein R ₁ Is a methylene group or alkylene group, S _Four Represents a sugar residue obtained by removing one hydroxyl group from guanosine or 2′-deoxyguanosine)
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(5) A method for precipitating and recovering the base compound from an aqueous solution containing a base compound selected from guanosine, 2′-deoxyguanosine, guanosine nucleotides and guanosine nucleic acids using a precipitant, The method as described above, wherein a copolymer E comprising a structural unit represented by the following general formula (6) and a structural unit represented by the following formula (2) is used as a precipitant.
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(Wherein R ₁ Is an alkylene group, S _Five Represents a sugar residue obtained by removing one hydroxyl group from cytidine or 2′-deoxycytidine)
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(6) A method for precipitating and recovering the base compound using a precipitant from an aqueous solution containing a base compound selected from adenosine, 2′-deoxyadenosine, adenosine nucleotides and adenosine nucleic acids, The method as described above, wherein a copolymer F comprising a structural unit represented by the following general formula (7) and a structural unit represented by the following formula (2) is used as a precipitant.
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(Wherein R ₁ Is an alkylene group, S ₆ Represents a sugar residue obtained by removing one hydroxyl group from thymine riboside or 2'-deoxythymidine)
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[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The copolymers (A) to (F) used in the present invention will be described in detail below.
[0006]
[Copolymer (A)] The copolymer (A) is obtained by radical polymerization of a polymerizable ester represented by the following general formula (8) and N-isopropylacrylamide in the presence of a polymerization initiator. Synthesized. In this copolymer (A), the structural unit represented by the general formula (1) is a structural unit derived from the polymerizable ester of the general formula (8), and is represented by the general formula (2). The structural unit is a structural unit derived from N-isopropylacrylamide. In this copolymer (A), the structural unit of the general formula (1) is 0.1 to 99.9 mol%, preferably 0.1 to 20%, more preferably 0.1 to 10 mol% in the molecule. It is.
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(Wherein R ₁ Is an alkylene group, S ₁ Indicates a nucleoside residue obtained by removing one hydroxyl group from a nucleoside)
[0007]
The copolymer (A) of the present invention can be produced, for example, by the following method. That is, it can be synthesized by mixing the nucleoside ester of the general formula (8) and N-isopropylacrylamide and starting the polymerization reaction by heating or the like in the presence of a radical polymerization initiator. Preferably, both monomers are dissolved in a solvent, and the mixture is synthesized by initiating a polymerization reaction by heating or the like in the presence of a radical polymerization initiator. The solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the polymerization reaction and the raw material monomer can be dissolved, but alcohols such as dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), pyridine, methanol, ethanol, t-butyl alcohol, etc. Examples thereof include water and the like, preferably DMF and DMSO. The mixing ratio of the solvent and the monomer mixture can be mixed in an arbitrary range based on the required physical properties of the copolymer to be obtained, but usually 1 to 100 parts by weight of the solvent with respect to 1 part by weight of the monomer mixture, It is preferable to mix in the range of 1 to 10 parts by weight. If it exceeds this range, the molecular weight may decrease. The radical polymerization initiator is not particularly limited, and examples thereof include azo compounds such as azobisisobutylnitrile (AIBN) and azobisamidinopropane hydrochloride, Fenton's reagent, and the like, preferably an azo compound, particularly AIBN. The amount of the radical polymerization initiator used is in an arbitrary range depending on the required physical properties of the copolymer to be obtained, but is usually about 0.1 to 5 mol% of the total amount of monomers. For example, the polymerization is carried out at 50 to 80 ° C. for 1 hour or longer by adding and mixing a radical polymerization initiator to a monomer solution in which the above monomers and solvent are uniformly mixed. Desirably, it is carried out by reacting at about 65 ° C. for about 2 to 24 hours. The monomer solution is preferably degassed to obtain a high molecular weight polymer, and the same applies after the radical polymerization initiator is added. After completion of the reaction, the solvent is removed and the residue is dissolved in distilled water or the like. Since the obtained copolymer has temperature responsiveness, it can be recovered as a precipitate under conditions of about 29 to 50 ° C. Furthermore, if necessary, for example, washing with an organic solvent or purification by dialysis may be performed.
[0008]
Although there is no restriction | limiting in particular in the molecular weight of the copolymer (A) of this invention, Preferably it is 3000-100000 in a number average molecular weight, Preferably it is 5000-40000. The molecular weight can be selected appropriately depending on the intended use of the copolymer. Further, by increasing the composition ratio of the polymerizable nucleoside ester, the adsorption amount of nucleoside, nucleotide and nucleic acid can be increased. The copolymer of the present invention may have a random structure or a block structure. Although the said manufacturing method is a method of manufacturing the copolymer of random structure, it can manufacture according to a conventional method with reference to the said manufacturing method also about manufacture of a block copolymer.
[0009]
In the general formulas (1) and (8), R ₁ Represents a linear or branched alkylene group, the carbon number thereof is 1-18, preferably 2-8. Examples of the alkylene group include methylene, ethylene, trimethylene, propylene, tetramethylene, hexamethylene, octamethylene and the like. A preferred alkylene group is tetramethylene. In the general formulas (1) and (8), the nucleoside residue S ₁ Is not particularly limited, and includes residues obtained by removing one hydroxyl group from various conventionally known nucleosides, that is, residues derived from nucleosides. In this case, the nucleoside is a glycoside compound in which a nitrogen-containing organic base such as a purine base or a pyrimidine base and a sugar reducing group are linked by a glycosidic bond, such as adenosine, guanosine, uridine, cytidine, thymine riboside, inosine, Xanthosine, 2′-deoxyadenosine, 2′-deoxyguanosine, 2′-deoxyuridine, 2′-deoxycytidine, 2′-deoxythymidine, 2′-deoxyinosine, 2′-deoxyxanthosine and the like can be mentioned. Adenosine, guanosine, uridine, cytidine, and thymine riboside are preferable.
[0010]
As the polymerizable nucleoside of the general formula (8) used in the present invention, a dicarboxylic acid vinyl ester and a nucleoside are chemically ester-bonded or a hydrolase (or a microorganism or the like that produces the enzyme) is used. Can be synthesized by enzymatic chemical (or fermentative) binding. In the case of enzymatically esterifying, an enzyme is preferably a protease or lipase, particularly a protease derived from Streptomyces or Bacillus, or a lipase derived from Alkagenes or porcine pancreas. Alternatively, esterases derived from various sources may be used. In the case of chemically ester-bonding, for example, it can be synthesized by the method described in the method using a base catalyst (J. Org. Chem., 53, 449 (1998)) and separated by a column such as silica gel. be able to.
[0011]
[Copolymer (B)] The copolymer (B) is obtained by radical polymerization of a polymerizable ester represented by the following general formula (9) and N-isopropylacrylamide in the presence of a polymerization initiator. Synthesized. In this copolymer (B), the structural unit represented by the general formula (3) is a structural unit derived from the polymerizable ester of the general formula (9), and the structure represented by the formula (2). The unit is a structural unit derived from N-isopropylacrylamide. In this copolymer (B), the structural unit of the general formula (3) is 0.1 to 99.9 mol%, preferably 0.1 to 20%, more preferably 0.1 to 10 mol% in the molecule. It is. Production of the copolymer (B) of the present invention can be carried out in the same manner as in the production of the copolymer (A).
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(Wherein R ₁ Is a methylene group or alkylene group, S ₂ Is a nucleoside residue obtained by removing one hydroxyl group from uridine or 2'-deoxyuridine)
[0012]
Although there is no restriction | limiting in particular in the molecular weight of the copolymer (B) of this invention, It is 3000-100000 by the number average molecular weight, Preferably it is 5000-40000. The molecular weight can be selected appropriately depending on the intended use of the copolymer. Further, by increasing the composition ratio of the polymerizable nucleoside ester, the adsorption amount of nucleoside, nucleotide and nucleic acid can be increased. The copolymer (B) of the present invention may have a random structure or a block structure. Although the said manufacturing method is a method of manufacturing the copolymer of random structure, it can manufacture according to a conventional method with reference to the said manufacturing method also about manufacture of a block copolymer.
[0013]
In the general formulas (3) and (9), R ₁ Represents a linear or branched alkylene group, the carbon number thereof is 1-18, preferably 2-8. Examples of the alkylene group include methylene, ethylene, trimethylene, propylene, tetramethylene, hexamethylene, octamethylene and the like. A preferred alkylene group is tetramethylene. In the general formulas (3) and (9), S ₂ Represents a nucleoside residue obtained by removing one hydroxyl group from uridine or 2′-deoxyuridine.
[0014]
The polymerizable nucleoside of the general formula (9) can be synthesized in the same manner as the polymerizable nucleoside of the general formula (8).
[0015]
[Copolymer (C)] The copolymer (C) is obtained by radical polymerization of a polymerizable ester represented by the following general formula (10) and N-isopropylacrylamide in the presence of a polymerization initiator. Synthesized. In this copolymer (C), the structural unit represented by the general formula (4) is a structural unit derived from the polymerizable ester of the general formula (10), and the structure represented by the formula (2). The unit is a structural unit derived from N-isopropylacrylamide. In this copolymer (C), the structural unit of the general formula (4) is 0.1 to 99.9 mol%, preferably 0.1 to 20 mol%, more preferably 0.1 to 10 mol in the molecule. %. The copolymer (C) of the present invention can be produced in the same manner as in the production of the copolymer (A).
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(Wherein R ₁ Is an alkylene group, S _Three Is a nucleoside residue in which one hydroxyl group is removed from adenosine or 2'-deoxyadenosine)
[0016]
Although there is no restriction | limiting in particular in the molecular weight of the copolymer (C) of this invention, It is 3000-100000 by a number average molecular weight, Preferably it is 5000-40000. The molecular weight can be selected appropriately depending on the intended use of the copolymer. Further, by increasing the composition ratio of the polymerizable nucleoside ester, the adsorption amount of nucleoside, nucleotide and nucleic acid can be increased. The copolymer (C) of the present invention may have a random structure or a block structure. Although the said manufacturing method is a method of manufacturing the copolymer of random structure, it can manufacture according to a conventional method with reference to the said manufacturing method also about manufacture of a block copolymer.
[0017]
In the general formulas (4) and (10), R ₁ Represents a linear or branched alkylene group, the carbon number thereof is 1-18, preferably 2-8. Examples of the alkylene group include methylene, ethylene, trimethylene, propylene, tetramethylene, hexamethylene, octamethylene and the like. A preferred alkylene group is tetramethylene. In the general formulas (4) and (10), S ₃ Represents a nucleoside residue in which one hydroxyl group has been removed from adenosine or 2′-deoxyadenosine.
[0018]
The polymerizable nucleoside of the general formula (10) can be synthesized in the same manner as the polymerizable nucleoside of the general formula (8).
[0019]
[Copolymer (D)] The copolymer (D) is obtained by radical polymerization of a polymerizable ester represented by the following general formula (11) and N-isopropylacrylamide in the presence of a polymerization initiator. Synthesized. In this copolymer (D), the structural unit represented by the general formula (5) is a structural unit derived from the polymerizable ester of the general formula (11), and the structure represented by the formula (2). The unit is a structural unit derived from N-isopropylacrylamide. In this copolymer (D), the structural unit of the general formula (5) is 0.1 to 99.9 mol%, preferably 0.1 to 20 mol%, more preferably 0.1 to 10 mol in the molecule. %. Production of the copolymer (D) of the present invention can be carried out in the same manner as in the production of the copolymer (A).
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(Wherein R ₁ Is an alkylene group, S _Four Is a nucleoside residue in which one hydroxyl group is removed from guanosine or 2'-deoxyguanosine)
[0020]
Although there is no restriction | limiting in particular in the molecular weight of the copolymer (D) of this invention, It is 3000-100000 in a number average molecular weight, Preferably it is 5000-40000. The molecular weight can be selected appropriately depending on the intended use of the copolymer. Further, by increasing the composition ratio of the polymerizable nucleoside ester, the adsorption amount of nucleoside, nucleotide and nucleic acid can be increased. The copolymer (D) of the present invention may have a random structure or a block structure. Although the said manufacturing method is a method of manufacturing the copolymer of random structure, it can manufacture according to a conventional method with reference to the said manufacturing method also about manufacture of a block copolymer.
[0021]
In the general formulas (5) and (11), R ₁ Represents a linear or branched alkylene group, the carbon number thereof is 1-18, preferably 2-8. Examples of the alkylene group include methylene, ethylene, trimethylene, propylene, tetramethylene, hexamethylene, octamethylene and the like. A preferred alkylene group is tetramethylene. In the general formulas (5) and (11), S ₄ Represents a nucleoside residue in which one hydroxyl group has been removed from adenosine or 2′-deoxyadenosine.
[0022]
The polymerizable nucleoside of the general formula (11) can be synthesized in the same manner as the polymerizable nucleoside of the general formula (8).
[0023]
[Copolymer (E)] The copolymer (E) is obtained by radical polymerization of a polymerizable ester represented by the following general formula (12) and N-isopropylacrylamide in the presence of a polymerization initiator. Synthesized. In this copolymer (E), the structural unit represented by the general formula (6) is a structural unit derived from the polymerizable ester of the general formula (12), and the structure represented by the formula (2). The unit is a structural unit derived from N-isopropylacrylamide. In this copolymer (E), the structural unit of the general formula (6) is 0.1 to 99.9 mol%, preferably 0.1 to 20 mol%, more preferably 0.1 to 10 mol in the molecule. %. Production of the copolymer (E) of the present invention can be carried out in the same manner as in the production of the copolymer (A).
Embedded image

(Wherein R ₁ Is an alkylene group, S _Five Is a nucleoside residue in which one hydroxyl group is removed from cytidine or 2'-deoxycytidine)
[0024]
Although there is no restriction | limiting in particular in the molecular weight of the copolymer (E) of this invention, it is 3000-100000 in a number average molecular weight, Preferably it is 5000-40000. The molecular weight can be selected appropriately depending on the intended use of the copolymer. Further, by increasing the composition ratio of the polymerizable nucleoside ester, the adsorption amount of nucleoside, nucleotide and nucleic acid can be increased. The copolymer (E) of the present invention may have a random structure or a block structure. Although the said manufacturing method is a method of manufacturing the copolymer of random structure, it can manufacture according to a conventional method with reference to the said manufacturing method also about manufacture of a block copolymer.
[0025]
In the general formulas (6) and (12), R ₁ Represents a linear or branched alkylene group, the carbon number thereof is 1-18, preferably 2-8. Examples of the alkylene group include methylene, ethylene, trimethylene, propylene, tetramethylene, hexamethylene, octamethylene and the like. A preferred alkylene group is tetramethylene. In the general formulas (6) and (12), S ₅ Represents a nucleoside residue in which one hydroxyl group is removed from cytidine or 2′-deoxycytidine.
[0026]
The polymerizable nucleoside of the general formula (12) can be synthesized in the same manner as the polymerizable nucleoside of the general formula (8).
[0027]
[Copolymer (F)] The copolymer (F) is obtained by radical polymerization of a polymerizable ester represented by the following general formula (13) and N-isopropylacrylamide in the presence of a polymerization initiator. Synthesized. In this copolymer (F), the structural unit represented by the general formula (7) is a structural unit derived from the polymerizable ester of the general formula (13), and the structure represented by the formula (2). The unit is a structural unit derived from N-isopropylacrylamide. In this copolymer (F), the structural unit of the general formula (7) is 0.1 to 99.9 mol%, preferably 0.1 to 20 mol%, more preferably 0.1 to 10 mol in the molecule. %. Production of the copolymer (F) of the present invention can be carried out in the same manner as in the production of the copolymer (A).
Embedded image

(Wherein R ₁ Is an alkylene group, S ₆ Is a nucleoside residue in which one hydroxyl group is removed from thymine riboside or 2'-deoxythymidine)
[0028]
Although there is no restriction | limiting in particular in the molecular weight of the copolymer (F) of this invention, It is 3000-100000 by the number average molecular weight, Preferably it is 5000-40000. The molecular weight can be selected appropriately depending on the intended use of the copolymer. Further, by increasing the composition ratio of the polymerizable nucleoside ester, the adsorption amount of nucleoside, nucleotide and nucleic acid can be increased. The copolymer (F) of the present invention may have a random structure or a block structure. Although the said manufacturing method is a method of manufacturing the copolymer of random structure, it can manufacture according to a conventional method with reference to the said manufacturing method also about manufacture of a block copolymer.
[0029]
In the general formulas (7) and (13), R ₁ Represents a linear or branched alkylene group, the carbon number thereof is 1-18, preferably 2-8. Examples of the alkylene group include methylene, ethylene, trimethylene, propylene, tetramethylene, hexamethylene, octamethylene and the like. A preferred alkylene group is tetramethylene. In the general formulas (7) and (13), S ₆ Represents a nucleoside residue obtained by removing one hydroxyl group from thymine riboside or 2′-deoxythymidine.
[0030]
The polymerizable nucleoside of the general formula (13) can be synthesized in the same manner as the polymerizable nucleoside of the general formula (8).
[0031]
Since the copolymers (A) to (F) used in the present invention are temperature stimulus responsive polymers having a nucleoside branched structure, they can be used as temperature stimulus responsive functional materials. That is, when the copolymers (A) to (F) contain, for example, 5 mol% of a uridine ester structural unit, the copolymer (A) to (F) exists as an aqueous solution at about 27 ° C. or lower, but precipitates at about 29 ° C. Have. Therefore, the temperature-stimulated responsive copolymers (A) to (F) can be used as substance purification materials, drug delivery system control materials, etc. In order to add monomer and water solubility, other components such as a polymerizable sugar ester may be copolymerized.
[0032]
The copolymers (A) to (F) can be used as a precipitating agent for nucleosides, nucleotides or nucleic acids that are structurally complementary to the nucleoside residues contained therein. That is, in the present invention, when separating and recovering the base compound as a precipitate from an aqueous solution containing a base compound selected from nucleosides, nucleotides and nucleic acids, a copolymer (A ) Can be recovered as the basic compound precipitate. In this case, the copolymer (A) includes a nucleoside residue (S ₁ ) Is structurally complementary to the base compound to be separated and recovered dissolved in the aqueous solution.
[0033]
In this case, the structurally complementary means the following. That is, S ₁ Is a nucleoside residue in which one hydroxyl group is removed from uridine or 2′-deoxyuridine, it is structurally complementary to adenosine, 2′-deoxyadenosine, adenosine nucleoside or adenosine nucleic acid. S ₁ Is a nucleoside residue in which one hydroxyl group is removed from adenosine or 2′-deoxyadenosine, uridine, 2′-deoxyuridine, uridine nucleoside, uridine nucleic acid, thymine riboside, 2′-deoxythymidine, thymidine nucleoside Alternatively, it is structurally complementary to thymidine nucleic acid. S ₁ Is a nucleoside residue in which one hydroxyl group is removed from guanosine or 2′-deoxyguanosine, it is structurally complementary to cytidine, 2′-deoxycytidine, cytidine-based nucleoside or cytidine-based nucleic acid. S ₁ Is a nucleoside residue in which one hydroxyl group is removed from cytidine or 2′-deoxycytidine, it is structurally complementary to guanosine, 2′-deoxyguanosine, adenosine guanosine or guanosine nucleic acid. S ₁ Is a nucleoside residue in which one hydroxyl group is removed from thymine riboside or 2′-deoxythymidine, it is structurally complementary to adenosine, 2′-deoxyadenosine, adenosine nucleoside or adenosine nucleic acid.
[0034]
By using the copolymer (B), a base compound structurally complementary to uridine or 2′-deoxyuridine contained in the copolymer (B) dissolved in an aqueous solution, that is, adenosine 2'-deoxyadenosine, adenosine nucleotides or adenosine nucleic acids can be precipitated.
[0035]
By using the copolymer (C), a base compound having a structurally complementary relationship with adenosine or 2′-deoxyadenosine contained in the copolymer (C), which is dissolved in an aqueous solution, Uridine, 2′-deoxyuridine, uridine nucleotide, uridine nucleic acid, thymine riboside, 2′-deoxythymidine, thymidine nucleotide or thymidine nucleic acid can be precipitated.
[0036]
By using the copolymer (D), a basic compound that is structurally complementary to the guanosine or 2′-deoxyguanosine contained in the copolymer (D), which is dissolved in an aqueous solution, Cytidine, 2′-deoxycytidine, cytidine nucleotides or cytidine nucleic acids can be precipitated.
[0037]
By using the polymer (E), a base compound having a structurally complementary relationship with cytidine or 2′-deoxycytidine contained in the copolymer (E), which is dissolved in an aqueous solution, ie, guanosine 2'-deoxyguanosine, guanosine nucleotides or guanosine nucleic acids can be precipitated.
[0038]
By using the copolymer (F), a basic compound that is structurally complementary to the thymine riboside or 2′-deoxythymidine contained in the copolymer (F), which is dissolved in an aqueous solution, Adenosine, 2′-deoxyadenosine, adenosine nucleotides or adenosine nucleic acids can be precipitated.
[0039]
The above-mentioned adenosine nucleotide means a nucleotide containing an adenosine residue or 2′-deoxyadenosine residue in the structure. An adenosine nucleic acid means a nucleic acid containing an adenosine residue or 2′-deoxyadenosine residue in its structure. The uridine nucleotide means a nucleotide containing uridine or 2′-deoxyuridine in its structure. Uridine nucleic acid means a nucleic acid containing uridine or 2′-deoxyuridine in its structure. A thymidine nucleotide means a nucleotide containing a thymine riboside residue or a 2′-deoxythymidine residue in the structure. The thymidine nucleic acid means a nucleic acid containing a thymine riboside residue or a 2′-deoxythymidine residue in its structure. A cytidine-based nucleotide means a nucleotide containing cytidine or 2′-deoxycytidine in its structure. The cytidine nucleic acid means a nucleic acid containing cytidine or 2′-deoxycytidine in its structure. A guanosine nucleotide means a nucleotide containing a guanosine residue or a 2′-deoxyguanosine residue in the structure. A guanosine nucleic acid means a nucleic acid containing a guanosine residue or a 2′-deoxyguanosine residue in its structure.
[0040]
In order to precipitate and recover the basic compound from an aqueous solution using the copolymer, the copolymer is added and mixed in the aqueous solution under a temperature condition in which the copolymer is dissolved, and then the copolymer is added. The temperature is raised to a temperature condition at which the polymer is insolubilized, and it is separated into a solution (mother liquor) and an insolubilized product (precipitation). Next, a releasing agent is added to the obtained precipitate under a temperature condition in which the copolymer is dissolved to dissociate the basic compound that binds the copolymer. The aqueous solution containing the base compound can be prepared by dissolving the base compound in an aqueous solvent such as water or an aqueous solution that is soluble in the base compound. In this case, examples of the aqueous solvent include buffer solutions such as acetic acid and phosphoric acid. The blending ratio of the aqueous solution containing the base compound and the copolymer of the present invention depends on the content of nucleoside, nucleotide or nucleic acid in the copolymer. , Preferably it mixes in the ratio of 50-200g. The aqueous solution containing the base compound and the copolymer of the present invention are mixed, and the desired base compound is bonded to the copolymer of the present invention by allowing the copolymer to stand at a temperature at which the copolymer is dissolved in water. In this case, it is preferable to stir. By raising the temperature of the aqueous solution to a temperature at which the copolymer becomes insoluble, the copolymer to which the base compound is bonded is insolubilized, but the insolubilized copolymer is recovered as a precipitate by centrifugation.
[0041]
For example, distilled water and a buffer solution are added to the resulting precipitate, the temperature is lowered to a temperature at which the copolymer can be dissolved, and a releasing agent is added to dissociate the desired basic compound from the copolymer. be able to. In this case, examples of the dissociating agent include various salts. Salts include NaCl, KCl, MgCl ₂ Etc., but MgCl ₂ Is preferred. The concentration used is 0.1 to 3M, preferably about 0.4 to 2M. The amount of these dissociating agents relative to the precipitate is appropriately set. When performing dissociation, it is better to stir. The dissociated base compound can be obtained by raising the temperature to precipitate the copolymer and collecting the supernatant. Moreover, you may refine | purify by high performance liquid chromatography, dialysis, etc. if desired. The purification method is preferably performed by a batch method.
[0042]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[0043]
Reference example 1
To 50 ml of pyridine containing 3.05 g of uridine and 9.9 g of divinyl adipate, 2.5 g of a protease derived from Bacillus subtilis manufactured by Nagase ChemteX Corporation was added and stirred at 30 ° C. and 160 rpm for 7 days. Moreover, the product was one from the thin layer chromatography analysis of the reaction liquid. The reaction solution was filtered to remove the enzyme, concentrated under reduced pressure, loaded onto a column (inner diameter: 5 cm, length: 50 cm) packed with silica gel (Merck, Kieselgel-60), hexane: ethyl acetate (5: Elution was performed with the mixed solvent of 1) to separate the product. High-performance liquid chromatographic analysis of the reaction product (column: TOSOH Amide-80, solvent: acetonitrile: water = 3: 1, differential refractometer detection) confirmed about 100% conversion of uridine ester, and 5′-O-vinylpolypolyl. 4.0 g of D-uridine (VAU) was obtained as white crystals.
[0044]
Example 1: Synthesis of uridine ester / N-isopropylacrylamide copolymer
The uridine ester / N-isopropylacrylamide copolymer was synthesized as follows. 2 mol of VAU and N-isopropylacrylamide were combined in a 10 ml ampoule tube and 40 mg of AIBN were dissolved in 4 ml of DMF, degassed with nitrogen gas, and polymerized at 65 ° C. for 24 hours. After this reaction, the reaction solution is precipitated with 200 ml of diethyl ether. After making the obtained precipitate an aqueous solution containing 5%, a pure uridine ester-N-isopropylacrylamide copolymer is obtained by raising the temperature to a temperature showing heat-responsiveness and reprecipitation. Similarly to the above, a copolymer was obtained by changing the blending ratio of uridine ester-N-isopropylacrylamide. The properties of each copolymer obtained are shown in Table 1 below.
[0045]
[Table 1]

[0046]
Mn (number average molecular weight) and Mw (weight average molecular weight) shown in Table 1 were measured by gel permeation chromatography. The cloud point (° C.) was measured with a spectrophotometer. The uridine ester content contained in the copolymer was determined by comparison with a 262 nm uridine standard curve. N. D indicates that a cloud point cannot be observed at 5 to 33 ° C. in water. Not show indicates no cloud point.
[0047]
Test Example 1 Evaluation of temperature stimulus responsiveness
The copolymers a to g obtained in Example 1 were evaluated for temperature stimulus responsiveness (solubility response to temperature). That is, the thermal change of the copolymer was evaluated using a thermal analyzer. The concentration of the copolymer solution used was 5 w. t. %. The result is shown in FIG. Copolymers b and c can observe a clear transition point at 27 to 32 ° C. The aqueous solution of copolymer b was soluble in water at 25 ° C. or lower and completely insolubilized at 29 ° C. or higher.
[0048]
Example 2: Purification of nucleosides, nucleotides and nucleic acids
Adsorption of uridine, thymine riboside, guanosine, cytidine, adenosine, nicotinamide-adenine dinucleotide, adenosine 5′-monophosphate, uridine diphosphate glucose, polyadenine using a temperature-stimulated responsive polymer containing 5 mol% of nucleoside -Collected. In 3 ml of distilled water, 60 mg of a copolymer, 12 mg of nucleoside, nucleotide and nucleic acid were added and dissolved. The solutions were stirred at 10 ° C. for 2 hours each. The temperature of the solution was raised to a temperature showing heat responsiveness, and the solution was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was subsequently measured at 259 nm. The precipitated copolymer was washed with 3 ml of 2M magnesium chloride. The cleaning liquid was measured at 259 nm, and the recovery rate was determined and shown in Table 2.
[0049]
[Table 2]

[0050]
【The invention's effect】
A temperature-stimulated responsive copolymer can be obtained by copolymerizing a polymerizable nucleoside ester having a polymerizable substituent introduced into the hydroxyl group of a nucleoside with N-isopropylacrylamide, which is a monomer of a temperature-stimulated responsive polymer. By using this, it is possible to purify complementary nucleosides, nucleotides, and nucleic acids by affinity precipitation in a short time and with a small amount of water.
[Brief description of the drawings]
1 shows the evaluation of temperature stimulus responsiveness (solubility response to temperature) for copolymers a to f obtained in Example 1. FIG. The horizontal axis shows temperature, and the vertical axis shows heat.

Claims

A method of precipitating the base compound from an aqueous solution containing a base compound selected from nucleosides, nucleotides and nucleic acids by using a precipitating agent, and the precipitating agent is represented by the following general formula (1) A copolymer comprising a structural unit and a structural unit represented by the following formula (2), wherein the nucleoside residue contained in the copolymer and the basic compound contained in the aqueous solution are structurally The method is characterized in that it is in a complementary relationship.

(Wherein R ₁ represents an alkylene group, and S ₁ represents a nucleoside residue obtained by removing one hydroxyl group from a nucleoside)

A method of precipitating and recovering a base compound from an aqueous solution containing a base compound selected from adenosine, 2′-deoxyadenosine, adenosine nucleotides and adenosine nucleic acids, using the precipitant as the precipitant The method as described above, wherein a copolymer comprising a structural unit represented by the following general formula (3) and a structural unit represented by the following formula (2) is used.

(Wherein R ₁ represents an alkylene group, S ₂ represents a nucleotide residue obtained by removing one hydroxyl group from uridine or 2′-deoxyuridine)

The base using a precipitant from an aqueous solution containing a base compound selected from uridine, 2'-deoxyuridine, uridine nucleotides, uridine nucleic acids, thymine riboside, 2'-deoxythymidine, thymidine nucleotides and thymidine nucleic acids. A method for precipitating and recovering a compound, comprising using a copolymer comprising a structural unit represented by the following general formula (4) and a structural unit represented by the following formula (2) as the precipitant: Said method characterized.

(Wherein R ₁ represents an alkylene group, and S ₃ represents a sugar residue obtained by removing one hydroxyl group from adenosine or 2′-deoxyadenosine)

A method for precipitating the base compound from an aqueous solution containing a base compound selected from cytidine, 2′-deoxycytidine, cytidine nucleotides, and cytidine nucleic acids using a precipitant, and collecting the base compound as the precipitant The method as described above, wherein a copolymer comprising a structural unit represented by the following general formula (5) and a structural unit represented by the following formula (2) is used.

(In the formula, R ₁ represents a methylene group or an alkylene group, and S ₄ represents a sugar residue obtained by removing one hydroxyl group from guanosine or 2′-deoxyguanosine)

A method for precipitating and recovering a base compound from an aqueous solution containing a base compound selected from guanosine, 2′-deoxyguanosine, guanosine nucleotides and guanosine nucleic acids, using the precipitant as the precipitant The method as described above, wherein a copolymer comprising a structural unit represented by the following general formula (6) and a structural unit represented by the following formula (2) is used.

(Wherein R ₁ represents an alkylene group, and S ₅ represents a sugar residue obtained by removing one hydroxyl group from cytidine or 2′-deoxycytidine)

A method of precipitating and recovering a base compound from an aqueous solution containing a base compound selected from adenosine, 2′-deoxyadenosine, adenosine nucleotides and adenosine nucleic acids, using the precipitant as the precipitant The method as described above, wherein a copolymer comprising a structural unit represented by the following general formula (7) and a structural unit represented by the following formula (2) is used.

(Wherein R ₁ represents an alkylene group, and S ₆ represents a saccharide residue obtained by removing one hydroxyl group from thymine riboside or 2′-deoxythymidine)