JP3663781B2

JP3663781B2 - 安定化方法

Info

Publication number: JP3663781B2
Application number: JP28135296A
Authority: JP
Inventors: 泰三原; 賢治中村; 慎二里村
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd; Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1995-12-26
Filing date: 1996-10-02
Publication date: 2005-06-22
Anticipated expiration: 2016-10-02
Also published as: JPH09236603A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、溶液中での抗原の安定化方法に関するものである。
【０００２】
【従来技術及びその問題点】
近年、免疫化学の発展にともない、臨床検査や疾病の診断に免疫学的測定法による測定結果が広く用いられるようになった。
【０００３】
免疫学的測定法の測定対象物となる各種ホルモンや薬物の中には、血液中の蛋白質と結合する性質を有するものがあり、これらは血液中で２つの型、即ち血液中の蛋白質と結合していない型（遊離型）と血液中の蛋白質と結合した型（結合型）で存在している。これらの中には、遊離型のみにホルモン活性,薬物活性が認められるものがあることも知られている。
【０００４】
このような性質を有する各種ホルモンや薬物等の、血液中の蛋白質に対する結合率は個人差及び病状の変化に伴って変化する。そのためこれらの遊離型の濃度を特異的に測定することは、適確な診断、適切な治療の選択のために必要である。
【０００５】
このような遊離型の測定方法は、免疫学的手法を用いて開発されてきた。免疫学的測定法では、通常遊離型の抗原含有溶液（標準物質溶液）を用いて検量線を作成し、この検量線を用いて各種検体中の目的物の遊離型濃度を測定しているが、このような遊離型の標準物質は、通常溶液中で不安定であるため、従来は血清そのものやアルブミンやグロブリン等の血清蛋白質を加えて安定化する方法により調製されている。しかし、血清や血清蛋白質を加えて安定化した遊離型の標準物質溶液では、調製後に遊離型の標準物質の一部が溶液中の血清蛋白質と結合して結合型となり、結果的に遊離型の標準物質濃度が減少して、添加した遊離型の標準物質濃度と、調製後の標準溶液中の遊離型の標準物質濃度とが異なるという問題があった。しかも、遊離型の標準物質が結合型に変化する率は、血清や血清蛋白質の種類、純度、製造ロット、標準物質溶液の保存期間等により変化するので、このような標準物質溶液を遊離型測定で使用するためには、調製後（遊離型の標準物質と血清蛋白質とを混合後）、適当な時期に遊離型の標準物質濃度を再度測定して、標準物質濃度を設定しなければならないという、煩雑な操作が必要であった。更に、一旦標準物質濃度を設定した標準物質溶液であっても、保存中にその濃度が変化する場合もあり、分析誤差の原因となっていた。
【０００６】
このようなことから、血液中の蛋白質と結合する性質を有する各種ホルモンや薬物等の抗原を、血清や血清蛋白質を用いずに安定化し得る方法の開発が望まれている現状にある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑み成されたもので、その課題は、血清や血清蛋白質を用いずに安定化された、血液中の蛋白質と結合する性質を有する各種ホルモンや薬物等の抗原含有溶液、及び該抗原の安定化方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、水溶性合成高分子化合物を共存させた、血液中の蛋白質と結合する性質を有する抗原を溶解状態で含有する溶液の発明である。
【０００９】
また、本発明は、水溶性合成高分子化合物を共存させて、血液中の蛋白質と結合する性質を有する抗原を溶解状態で含有させることを特徴とする、当該抗原の溶液中での安定化方法、の発明である。
【００１０】
即ち、本発明者らは、血液中の蛋白質と結合する性質を有する抗原を、血清や血清蛋白質を用いずに溶液中で安定化し得る方法について鋭意研究の結果、安定化剤として水溶性合成高分子化合物を用いることにより、このような抗原を溶液中で長期間安定化し得ることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明に用いられる水溶性合成高分子化合物としては、分子内に疎水性部分と親水性部分を有し、本発明の目的に使用し得るものであれば特に限定することなく挙げられるが、具体的には例えばポリビニルアルコール,ポリエチレングリコール,ポリビニルピロリドン等が好ましく挙げられる。また、これら水溶性合成高分子化合物の重量平均分子量としては通常1000〜250000、好ましくは3000〜100000程度のものが挙げられ、安定化しようとする抗原を含む溶液中に於けるこれらの安定化剤としての使用濃度は、使用する水溶性合成高分子化合物の種類により若干異なるが、通常0.01〜10(W/V)％、好ましくは、0.01〜５(W/V)％の範囲から適宜選択される。
【００１２】
本発明の水溶性合成高分子化合物として用いられるポリビニルアルコールの好ましい具体例としては、通常平均分子量が4400〜220000（平均重合度100〜5000）、好ましくは平均分子量が8800〜132000（平均重合度200〜3000）のものが挙げられる。ポリビニルアルコールを、抗原含有溶液中で安定化剤として使用するときの濃度は、通常0.01〜５(W/V)％、好ましくは0.1〜２(W/V)％である。尚、ポリビニルアルコールは、分子量が大きくなると水に対する溶解性が低くなり、５(W/V)％に満たない濃度までしか溶けなくなる場合もあるが、このような場合には、当然のことながらその濃度が使用時の濃度の上限となる。また、ポリビニルアルコール濃度が２(W/V)％を越えると溶液の粘性が高くなる為、分注時の精度が低下する場合もあり、その場合には分析時の誤差が生じ易くなるので、２(W/V)％を越えないように使用する方がよい。また、本発明に使用されるポリビニルアルコールは、水に可溶であれば完全にけん化処理されていないものであっても良く、そのけん化処理の割合は特に限定されないが、通常は全体の70％以上、好ましくは80％以上けん化処理されているものが用いられる。又、本発明の水溶性高分子化合物として用いられるポリエチレングリコールの好ましい具体例としては、その重量平均分子量が通常1000〜250000、好ましくは3000〜100000のものが挙げられ、ポリビニルピロリドンの好ましい具体例としては、その重量平均分子量が通常1000〜250000、好ましくは3000〜100000のものが挙げられる。又、ポリエチレングリコール又はポリビニルピロリドンを、抗体含有溶液中で安定化剤として使用するとその濃度は、通常0.01〜10(W/V)％、好ましくは0.01〜5(W/V)％である。
【００１３】
本発明により安定化し得る、血液中の蛋白質と結合する性質を有する抗原は、血液中で２つの型、即ち血液中の蛋白質と結合していない型（遊離型）と血液中の蛋白質と結合した型（結合型）で存在しているものであって、その２つの型のうち遊離型のみに例えばホルモン活性、薬物活性等の生理活性が認められるものであれば、所謂抗原でもハプテンでもよく、特に限定されない。具体的には、上記した如き性質を有する蛋白質、ペプチド、核酸、糖鎖、脂質、ホルモン、薬物等であって、例えば血清、血液、血漿等の生体体液、尿、リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中の遊離型濃度測定値が臨床的に有用であるようなものは全て挙げられる。更に具体的には、血液中の蛋白質との結合率が通常５〜100％未満、好ましくは30〜100％未満、より好ましくは70〜100％未満、更に好ましくは80〜100％未満となる様なハプテンが好ましく挙げられる。
ハプテンの具体例としては、例えばフェニトイン，カルバマゼピン，バルプロ酸，フェノバルビタール，プリミドン，クロナゼパム，ジアゼパム，ニトラゼパム等の抗てんかん薬、例えばクロルプロマジン，ハロペリドール等の抗精神薬、例えばイミプラミン，デシプラミン，アミトリプチリン，ノルトリプチリン等の抗うつ薬、例えばテオフィリン等の気管支拡張薬、例えばジゴキシン，ジギトキシン等の強心配糖体、例えばキニジン等の抗不整脈薬、例えばアミノ配糖体系抗生物質，クロラムフェニコール等の抗菌薬、例えばメソトレキセート等の抗癌剤、例えばシクロスポリン等の免疫抑制剤、例えばアスピリン等の解熱鎮痛剤等の薬物、例えばサイロキシン（Ｔ4），トリヨードサイロニン（Ｔ3）等の甲状腺ホルモン、例えばテストステロン，コルチコステロン等の副腎皮質ホルモン等のホルモン等が好ましく挙げられる。中でも、血液中の蛋白質との結合率が70〜100％未満である以下に挙げるようなハプテンの溶液中での安定化に特に効果的である。即ち、サイロキシン（Ｔ4），トリヨードサイロニン（Ｔ3）等の甲状腺ホルモン、テストステロン，コルチコステロン等の副腎皮質ホルモン、フェニトイン、ジアゼパム、クロルプロマジン、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、ジギトキシン、キニジンなどである。
【００１４】
尚、ここで用いられている、血液中の蛋白質に対する抗原の結合率とは、通常この分野で用いられる測定方法である平衡透析法（「化学と薬学の教室」，70巻，６〜７頁(1981)，（株）廣川書店発行等）により求められるものをいう。
【００１５】
本発明を実施するには、例えば以下のように行えばよい。
即ち、適当な溶液中に、安定化したい目的の抗原を所定濃度、及び本発明に係る水溶性合成高分子化合物を通常0.01〜10(W/V)％、好ましくは0.1〜５(W/V)％となるように溶解することにより実施できる。
【００１６】
尚、本発明により抗原溶液を調製すれば、目的の濃度の抗原溶液を容易に得ることができ、改めて抗原濃度を測定する必要は特にはないが、調製後の抗原濃度を確認するために、抗原濃度の測定を行っても良い。
【００１７】
また、抗原と水溶性合成高分子化合物の溶解順序は、特に限定されないが、先に水溶性合成高分子化合物を溶解した後に抗原を溶解する方が、抗原濃度の変動をより小さくできるので望ましい。
【００１８】
抗原及び水溶性合成高分子化合物を溶解する溶液としては、抗原としての性質を失わせるようなものでなければ特に限定されることなく挙げられる。通常は例えば免疫学的測定法に於いて緩衝液として用いられるようなものが好ましく用いられる。具体的には、例えばリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタン等の緩衝剤、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の塩類、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等の有機溶媒類、例えばポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル等の界面活性剤等から、抗原の性質に応じて適宜選択して調製された、通常pＨ２〜11、好ましくはpＨ４〜９の緩衝液が好ましく用いられる。
【００１９】
本発明の安定化された抗原含有溶液は、血液中の蛋白質と結合する性質を有する抗原であって、血液中で２つの型、即ち血液中の蛋白質と結合していない型（遊離型）と血液中の蛋白質と結合した型（結合型）で存在し、その２つの型のうち遊離型のみに、例えばホルモン活性、薬物活性等の生理活性が認められる抗原を所謂免疫学的測定法により測定しようとする場合に於ける標準液として、有用性の高いものである。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
実施例１．サイロキシン（Ｔ4）標準液の安定化の検討
（Ｔ4標準液調製用緩衝液）
グッド緩衝剤のＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate）21.3ｇをイオン交換水900mlに溶解し、pH7.0となるように1N NaOH水溶液を加えた後、全量１リットルとしたものをＴ4標準液調製用緩衝液とした。
（Ｔ4標準液）
上で調製したＴ4標準液調製用緩衝液に、ポリビニルアルコール（平均重合度200〜230 Aldrich社製、平均分子量8800〜10120）、ポリエチレングリコール４０００（和光純薬工業(株)製、平均分子量4000）、ポリビニルピロリドン（和光純薬工業(株)製、平均分子量40000）、牛血清アルブミン（Sigma社製）又は牛グロブリン（Sigma社製）を夫々１(W/V)％、及びＴ4（シグマ社製）を１ng/dlとなるように溶解したものをＴ4標準液とした。
尚、対照として、上で調製したＴ4標準液調製用緩衝液にＴ4を１ng/dlとなるように溶解しただけの、Ｔ4標準液も調製した。
（抗体液）
抗Ｔ4モノクローナル抗体（Capricorn社製）を常法により処理してFab'とし、これに常法により西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識して得たＰＯＤ標識抗Ｔ4-Fab'（以後Fab'-POD）を0.2M MES緩衝液（pH7.0）中に、Fab'-PODが9.3×10^-10Mの濃度となるように添加したものを抗体液とした。
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析条件］
システムの概略を図１に記載した。
測定条件は以下の通り。

（測定操作）
抗体液100μlとＴ4標準液10μlとを混合し８℃で2.5分間放置した後、該混合液の50μlをＨＰＬＣにより分析した。
（結果）
調製したＴ4標準液の、調製直後、30℃で１週間保存後、及び30℃で３週間保存後の遊離型Ｔ4濃度を測定した結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】

【００２２】
表１の結果から、本発明に係る水溶性高分子化合物であるポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドンを共存させたＴ4標準液が、遊離型のＴ4を長期間安定に保存し得ること、並びに従来からの安定化剤であるアルブミンやグロブリンを共存させても、調製直後に遊離型のＴ4濃度が著しく低下し、更には経時的に遊離型のＴ4濃度が変動することが判る。
【００２３】
実施例２．ポリビニルアルコールによるサイロキシン溶液の安定化の検討
（Ｔ4標準液）
実施例１で調製したＴ4標準液調製用緩衝液に、所定平均重合度のポリビニルアルコールを所定濃度となるように溶解し、更にＴ4（シグマ社製）を１ng/dlとなるように溶解したものもＴ4標準液とした。
尚、使用したポリビニルアルコールは、以下の通り。
a)平均重合度200〜230(Aldrich製、けん化度80%)、b)平均重合度500(和光純薬工業（株）製、けん化度96%以上)、c)平均重合度1500(和光純薬工業（株）製) 、d)平均重合度2800(和光純薬工業（株）製、けん化度86-90%) 、e)平均重合度3500(和光純薬工業（株）製、けん化度86-90%)。
（抗体液）
実施例１と同じ。
（ＨＰＬＣによる分析条件）
実施例１と同じ。
（測定操作）
実施例１と同様に行った。
（結果）
調製したＴ4標準液の、30℃で１週間保存後の遊離型Ｔ4濃度を測定した結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】

【００２５】
表２の結果から、ポリビニルアルコールの平均重合度と濃度とを変化させても、そのＴ4の安定化能には変化が見られないこと、言い換えれば、ポリビニルアルコールのＴ4安定化能は、その平均重合度や使用濃度によっては変化しないことが判る。
【００２６】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明は、水溶性合成高分子化合物を用いることにより安定化された抗原含有溶液、及び抗原の安定化方法を提供するものである。
血液中の蛋白質と結合する性質を有する抗原は、血液中で２つの型、即ち血液中の蛋白質と結合していない型（遊離型）と血液中の蛋白質と結合した型（結合型）で存在しているが、本発明によれば、その２つの型のうち遊離型のみに例えばホルモン活性、薬物活性等の生理活性が認められる抗原の遊離型を、遊離型のままで長期間安定に溶液中で保存することができる。従って、本発明により安定化された抗原含有溶液を標準液として用いれば、従来の標準液を用いた場合よりも、遊離型の測定を精度良く実施し得るという効果を奏するので、本発明は、斯業に貢献するところ大なる発明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１及び２で用いられた、高速液体クロマトグラフの概略図である。

Claims

水溶性合成高分子化合物を共存させた、血液中の蛋白質と結合する性質を有する抗原を溶解状態で含有する溶液。
抗原がハプテンである、請求項１に記載の溶液。
ハプテンが、血液中の蛋白質との結合率が７０％以上のハプテンである、請求項２に記載の溶液。
ハプテンが、甲状腺ホルモン、副腎皮質ホルモン、フェニトイン、ジアゼパム、クロルプロマジン、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、ジギトキシン、又はキニジンである、請求項２又は３に記載の溶液。
水溶性合成高分子化合物の重量平均分子量が 1000 〜 250000 である、請求項１〜４の何れかに記載の溶液。
水溶性合成高分子化合物が、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール又はポリビニルピロリドンである、請求項１〜５の何れかに記載の溶液。
水溶性合成高分子化合物を共存させて、血液中の蛋白質と結合する性質を有する抗原を溶解状態で含有させることを特徴とする、当該抗原の溶液中での安定化方法。
抗原がハプテンである、請求項７に記載の方法。
ハプテンが、血液中の蛋白質との結合率が７０％以上のハプテンである、請求項８に記載の方法。
ハプテンが、甲状腺ホルモン、副腎皮質ホルモン、フェニトイン、ジアゼパム、クロルプロマジン、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、ジギトキシン、又はキニジンである、請求項８又は９に記載の方法。
水溶性合成高分子化合物の重量平均分子量が 1000 〜 250000 である、請求項７〜１０の何れかに記載の方法。
水溶性合成高分子化合物が、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール又はポリビニルピロリドンである、請求項７〜１１の何れかに記載の方法。