JP3685583B2 - Cyanide-degrading bacteria - Google Patents

Description

フザリウム オキシスポルム N-10 株の菌学的性質は以下の通りである。
〔１〕 培養的・形態的性質
(1) 生育速度（ポテトデキストロース寒天平板培地, 25℃, 4 日間) : コロニーの直径 44 〜46 mm
(2) 集落表面の色調（ポテトデキストロース寒天平板培地）：白色〜赤色がかった白色
(3) 集落裏面の色調（ポテトデキストロース寒天平板培地）：赤色がかった灰色
集落裏面の色調（カーネーションリーフ寒天平板培地）：オレンジがかった白色〜白色
以下、(4) 〜(9) はカーネーションリーフ寒天平板培地上での性状を示す。
【０００９】
(4) 集落裏面の形状、組織：集落形状は円形、表面は羊毛状、束状、周囲は全縁
(5) スポロドキア : 形成する
(6) 分生子形成細胞 : アンプル形のフィアライド 10 〜32×2 〜3 μm
(7) 大型分生子 : 湾曲した流線形, 隔壁３〜５個，21〜35×3 〜4 μm
(8) 小型分生子 : 豊富に形成, 楕円形〜円筒形, 直線状, 湾曲, 隔壁０〜１個，集塊状に形成，６〜12×2 〜4 μm
(9) 厚膜胞子 : 形成する（頂生、間生）
分生子形成細胞、および分生子の顕微鏡観察結果を図１に示す。
〔２〕 生理学的性質
(1) 最適生育条件 温度20〜30℃ pH6.5〜7.5
(2) 生育の範囲 温度15〜35℃ pH 5 〜8
以上の菌学的諸性質から、本菌株は、楕円形の小型分生子を形成し、厚膜胞子をよく形成するという点において、フザリウム オキシスポルムと同定した。また、ニッケルシアン錯体を窒素源として生育するものはいままでに知られていないことから、本菌株を、フザリウム オキシスポルムの新菌株として、フザリウム オキシスポルム N-10 株と命名した。
【００１０】
本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号FERM P-16160として寄託されている（寄託日平成９年３月27日）。
本菌株の培養には、通常の微生物の培養に使用される炭素源、窒素源、無機物を含む各種培地を使用することができる。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、デンプン等の各種糖類、窒素源としては、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、各種アミノ酸等の有機窒素類、また硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の各種無機窒素である。炭素源、窒素源とも、単独または組合わせて用いられる。その他の無機物として、リン、ナトリウム、カリウム、カルシウム、微量金属類等、必要に応じて添加する。
【００１１】
本菌株は、シアン化合物による汚染土壌、工場廃液などの処理に使用することができる。
上記処理は、本菌株の菌体、菌体処理物、またそれらの固定化物で用いて行うことができる。菌体とは、本菌株を培地に培養し、その培養物の中から回収した菌体自体をいい、生細胞、凍結物、または凍結乾燥物のいずれでも良い。また、菌体処理物とは、菌体破砕物、または培養物（菌体、培養上清を含む）からの抽出物をいう。また、固定化物とは、該菌体または菌体処理物を担体等に固定化したものをいう。
【００１２】
以下、実施例により本発明を説明する。
【００１３】
【実施例】
〔実施例１〕 フザリウム オキシスポルムN-10株によるシアン化合物の分解
(1) 高濃度ニッケルシアン錯体の分解
フザリウム オキシスポルムN-10株（以下、N-10株という）による高濃度ニッケルシアン錯体の分解を検討した。
【００１４】
唯一の窒素源としてニッケルシアン錯体を0 から50mMの範囲で添加する以外は表１と同組成の合成無機培地でN-10株を30℃で振盪培養し、N-10株の菌体の生育と培養液中の残存基質量を経時的に測定した。生育は培養液の濁度の増加を610nm の吸光度の上昇として測定した。基質の分解は表２に示す条件下で高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。結果を図２および３に示す。 N-10 株は20mM (約5000ppm)の高濃度においても速やかに生育し、10mMのニッケルシアン錯体を１週間の培養で分解した。
【００１５】
【表２】

(2) 遊離シアンを窒素源とした生育
N-10株が遊離シアンを窒素源として生育できるか否かについて検討した。
【００１６】
ニッケルシアン錯体の代わりに、窒素源としてシアン化カリウムを初発濃度を1mM で添加した合成無機培地（表１）にてN-10株を30℃で振盪培養し、48時間毎に1mM のシアン化カリウムを添加して菌体の生育を観察した。結果を図４に示す。N-10株は最終的に250ppmのシアン化カリウムの添加に同調して生育したことから、本菌が遊離シアンを窒素源として旺盛に生育でき、遊離シアン分解活性を有することが確認された。
【００１７】
(3) ニトリル化合物を窒素源とした生育
N-10 株がニトリル化合物を窒素源として生育できるか否かについて検討した。
ニッケルシアン錯体の代わりに、窒素源としてニトリル化合物を0.2%になるように添加した合成無機培地（表１）にてN-10株を30℃で振盪培養し、菌株の生育を観察した。結果を図５に示す。N-10株はアセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、サクシニトリルなどの脂肪族ニトリル、ベンゾニトリルなどの芳香族ニトリルを窒素源として生育できることが明らかとなった。
【００１８】
また、遊離シアン（ＫＣＮ）、ニッケルシアン錯体を窒素源とした結果も併せて図５に示す。
〔実施例２〕 N-10 株による金属シアン錯体分解代謝物の分析
(1) N-10 株の休止菌体を用いたニッケルシアン錯体と遊離シアンの分解
1mM のニッケルシアン錯体を含む合成無機培地（表１）で48時間生育させたN-10株を集菌した後、100mM のリン酸カリウム緩衝液(pH7.0) で洗菌した。休止菌体反応(1.0ml) は、10mMニッケルシアン錯体またはシアン化カリウム、100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 、N-10株休止菌体（湿重量：0.26mg) からなる反応液中で30℃で攪拌した。経時的に試料を採取し、反応生成物として推定されるホルムアミドはＧＣ分析（表３）により、アンモニアはアンモニアテストワコーによる比色定量により、ギ酸はベーリンガー・マンハイム社のＦ−キットを用いた定量により、それぞれ測定した。
【００１９】
【表３】

10mM(2500ppm）のニッケルシアン錯体の分解に伴い、ホルムアミド、ギ酸、およびアンモニアが生成された（図６）。N-10株休止菌体は、24時間で1200ppm のニッケルシアン錯体を分解する高性能分解菌であった。一方、N-10株の10mM(600ppm)のシアン化カリウムからのホルミアミドへの分解活性は極めて高く、菌体との反応によりシアン化カリウムは瞬時に変換された。変換されたホルムアミドの減少に伴い、ギ酸およびアンモニアが生成された（図７）。以上のように、高い毒性を有する遊離型シアンに対してもN-10株休止菌体は、24時間で600ppmのシアンを完全にギ酸とアンモニアに分解する高性能菌であった。
【００２０】
(2) N-10 株細胞から調製した無細胞抽出液を用いたニッケルシアン錯体と遊離シアンの分解
1mM のニッケルシアン錯体を含む合成無機培地（表１）で48時間生育させたN-10株を集菌し、菌体を100mM のリン酸カリウム緩衝液(pH7.0) で洗菌した。1gの洗浄菌体に対し、1.5gの海砂と2ml の100mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0, 1mM 2-メルカプトエタノールを含む) を添加して、氷冷しつつ乳鉢中で破砕した。得られた破砕液の1000rpm 遠心分離上清を無細胞抽出液とした。酵素反応(1.0ml) は、10mMニッケルシアン錯体またはシアン化カリウム、100mM リン酸緩衝液(pH7.0）、無細胞抽出液(1.4mg protein) からなる反応液中で３０℃で行った。経時的に試料を採取し、反応生成物として推定されるホルムアミド、アンモニア、ギ酸をそれぞれ(1) と同様にして定量分析した。
【００２１】
10mM(2500ppm) のニッケルシアン錯体の分解に伴い、ホルムアミド、ギ酸、およびアンモニアが生成された（図８）。シアン化カリウムの場合では、10mM(600 ppm) のシアン化カリウムからのホルムアミドへの分解活性は極めて高く、シアン化カリウムは瞬時に変換された。変換されたホルムアミドの減少に伴い、ギ酸およびアンモニアが生成された（図９）。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によって提供される微生物は、シアン化合物に対して顕著な分解活性を有するため、この微生物を種々の方法で培養し、種々の形態で利用することにより、シアン化合物がもたらす土壌・水質汚染の微生物による効率的な分解除去が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 N-10株の分生子形成細胞（写真１）、および分生子（写真２）の顕微鏡写真である。
【図２】 高濃度ニッケルシアン錯体を窒素源としたN-10株の生育を示す図である。
【図３】 N-10株による高濃度ニッケルシアン錯体の分解を示す図である。
【図４】 シアン化カリウムを窒素源としたN-10株の生育を示す図である。
【図５】 各種ニトリル化合物を窒素源としたN-10株の生育を示す図である。
【図６】 N-10株の休止菌体による10mMニッケルシアン錯体の分解を示す図である。
【図７】 N-10株の休止菌体による10mMシアン化カリウムの分解を示す図である。
【図８】 N-10株の無細胞抽出液による10mMニッケルシアン錯体の分解を示す図である。
【図９】 N-10株の無細胞抽出液による10mMシアン化カリウムの分解を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel microorganism and a use thereof which are filamentous fungi belonging to the genus Fusarium and have a remarkable degrading activity against cyanide compounds, particularly nickel cyanide complexes.
[0002]
[Prior art]
In recent years, contamination of soil and water by heavy metals such as cyan, cadmium and lead has become a problem.
Conventionally, many attempts at bioremediation have been made to decompose and remove such soil and water pollution by microorganisms. However, cyanide compounds are often present in the form of stable cyanide complexes with metal ions in soil and water, and no microorganism has yet been found that can efficiently decompose such cyanide complexes.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a microorganism having a remarkable degrading activity against cyanide compounds, particularly cyanide complexes.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of screening the microorganisms capable of decomposing cyanide complexes in soils throughout Japan to solve the above-mentioned problems, the present inventors have excellent degradation of cyanogen compounds including nickel cyanide complexes, free cyanides, and nitriles. Succeeded in isolating Fusarium oxysporum N-10 strain, a novel filamentous fungus that exerts its properties, and completed the present invention.
[0005]
That is, the present invention is a new strain Fusarium oxysporum N-10 which has a degradation activity against cyanide compounds.
Moreover, this invention is a processing method of the cyanide characterized by decomposing | disassembling a cyanide using said strain.
The inventors of the present invention isolated a new strain Fusarium oxysporum N-10 having a degrading activity for cyanide compounds as follows.
[0006]
First, a glass test tube containing 5 ml of a synthetic inorganic medium (Table 1) using 100 samples of soil from various parts of Japan as a sample, 0.5 mM nickel cyanide complex as a nitrogen source, and 0.25% glucose as a carbon source. The soil sample was suspended in and a cotton plug was applied, followed by shaking culture at 30 ° C. After about 5 days of culture, a part of the culture was inoculated into a culture solution having the same composition, and further cultured for 5 days. After such enrichment culture was repeated about 5 times, colonies were formed on a plate medium, and the desired bacteria were isolated from the colonies.
[0007]
The decomposition activity of the nickel cyanide complex of the isolated fungus was measured by comparing the concentration of the complex remaining in the culture end product. By comparing this degradation rate, Fusarium oxysporum N-10 strain with the highest degradation rate was selected.
[0008]
[Table 1]

The mycological properties of Fusarium oxysporum N-10 are as follows.
[1] Culture and morphological properties
(1) Growth rate (potato dextrose agar plate, 25 ° C, 4 days): Colony diameter 44 to 46 mm
(2) Color of village surface (potato dextrose agar plate medium): white to reddish white
(3) Color of the back of the village (potato dextrose agar plate): Reddish gray color of the back of the colony (carnation leaf agar plate): Orangeish white to white or less, (4) to (9) are carnation leaf agar The properties on the plate medium are shown.
[0009]
(4) Shape and structure of the back of the village: The shape of the village is circular, the surface is wooly, bundled, and the entire periphery is
(5) Sporodocia: forming
(6) Conidia-forming cells: Ampoule-shaped fiarides 10-32 × 2-3 μm
(7) Large conidia: curved streamline, 3-5 partition walls, 21-35 × 3-4 μm
(8) Small conidia: abundantly formed, oval-cylindrical, linear, curved, 0-1 septum, agglomerated, 6-12 × 2-4 μm
(9) Thick film spore: Forms (vertical, mesozoic)
FIG. 1 shows the results of microscopic observation of conidia-forming cells and conidia.
[2] Physiological properties
(1) Optimal growth conditions Temperature 20-30 ° C pH 6.5-7.5
(2) Growth range Temperature 15-35 ° C pH 5-8
Based on the above mycological properties, this strain was identified as Fusarium oxysporum in that it formed oval small conidia and well formed thick spore. In addition, since it has not been known that a nickel cyanide complex grows as a nitrogen source, this strain was named Fusarium oxysporum N-10 as a new strain of Fusarium oxysporum.
[0010]
This strain has been deposited at the Biotechnology Institute of Industrial Technology, Depository Number FERM P-16160 (Deposit Date March 27, 1997).
For the culture of this strain, various media containing a carbon source, a nitrogen source, and an inorganic substance that are commonly used for culturing microorganisms can be used. Examples of the carbon source include various sugars such as glucose, fructose, and starch, and examples of the nitrogen source include organic nitrogens such as yeast extract, meat extract, peptone, and various amino acids, and various inorganic nitrogens such as ammonium nitrate and ammonium sulfate. Both a carbon source and a nitrogen source are used alone or in combination. Other inorganic substances such as phosphorus, sodium, potassium, calcium, and trace metals are added as necessary.
[0011]
This strain can be used for the treatment of soil contaminated with cyanide compounds, factory waste liquids and the like.
The said process can be performed using the microbial cell of this strain, a microbial cell processed material, and those fixed products. The microbial cell refers to the microbial cell itself obtained by culturing this strain in a medium and recovered from the culture, and may be any of living cells, frozen products, or lyophilized products. Moreover, a microbial cell processed material means the extract from a microbial cell crushed material or a culture (a microbial cell and a culture supernatant are included). The immobilized product refers to a product obtained by immobilizing the bacterial cell or the treated bacterial cell on a carrier or the like.
[0012]
Hereinafter, the present invention will be described by way of examples.
[0013]
【Example】
[Example 1] Decomposition of cyanide by Fusarium oxysporum N-10
(1) Decomposition of high-concentration nickel cyanide complex We investigated the decomposition of high-concentration nickel-cyanide complex by Fusarium oxysporum N-10 (hereinafter referred to as N-10).
[0014]
N-10 strain was shaken at 30 ° C in a synthetic inorganic medium with the same composition as in Table 1 except that nickel cyanide complex was added in the range of 0 to 50 mM as the only nitrogen source. The residual base mass in the culture solution was measured over time. Growth was measured by increasing the turbidity of the culture as an increase in absorbance at 610 nm. Substrate degradation was measured using high performance liquid chromatography under the conditions shown in Table 2. The results are shown in FIGS. The N-10 strain grew rapidly even at a high concentration of 20 mM (about 5000 ppm), and 10 mM nickel cyanide complex was decomposed by one week of culture.
[0015]
[Table 2]

(2) Growth using free cyanide as nitrogen source
We examined whether N-10 strain can grow using free cyanide as a nitrogen source.
[0016]
Instead of nickel cyanide complex, N-10 strain was shaken at 30 ° C in a synthetic inorganic medium (Table 1) containing potassium cyanide as a nitrogen source at an initial concentration of 1 mM, and 1 mM potassium cyanide was added every 48 hours. The growth of the cells was observed. The results are shown in FIG. Since the N-10 strain finally grew in synchronism with the addition of 250 ppm potassium cyanide, it was confirmed that this bacterium can grow vigorously using free cyanide as a nitrogen source and has free cyanide-degrading activity.
[0017]
(3) Growth using nitrile compound as nitrogen source
We examined whether the N-10 strain could grow using a nitrile compound as a nitrogen source.
In place of the nickel cyanide complex, the N-10 strain was cultured with shaking at 30 ° C. in a synthetic inorganic medium (Table 1) to which a nitrile compound was added as a nitrogen source at 0.2%, and the growth of the strain was observed. The results are shown in FIG. It became clear that the N-10 strain can grow using aliphatic nitriles such as acetonitrile, propionitrile, butyronitrile, succinonitrile, and aromatic nitriles such as benzonitrile as a nitrogen source.
[0018]
FIG. 5 also shows the results of using free cyanide (KCN) and nickel cyanide as a nitrogen source.
[Example 2] Analysis of metal cyanide complex metabolites by N-10 strain
(1) Degradation of nickel cyanide complex and free cyanide using resting cells of N-10 strain
The N-10 strain grown for 48 hours on a synthetic inorganic medium (Table 1) containing 1 mM nickel cyanide complex was collected and then washed with 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The resting cell reaction (1.0 ml) was performed at 30 ° C in a reaction solution consisting of 10 mM nickel cyanide complex or potassium cyanide, 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) and N-10 strain resting cell (wet weight: 0.26 mg). And stirred. Samples were collected over time, formamide estimated as a reaction product was analyzed by GC analysis (Table 3), ammonia was colorimetrically determined by Ammonia Test Wako, and formic acid was determined by Boehringer Mannheim F-kit. Respectively.
[0019]
[Table 3]

With the decomposition of 10 mM (2500 ppm) nickel cyanide complex, formamide, formic acid, and ammonia were produced (FIG. 6). The N-10 strain resting cells were high-performance degrading bacteria that decomposed 1200 ppm of nickel cyanide complex in 24 hours. On the other hand, the decomposition activity of N-10 strain from 10 mM (600 ppm) potassium cyanide to formamide was extremely high, and potassium cyanide was instantaneously converted by the reaction with bacterial cells. With the reduction of converted formamide, formic acid and ammonia were produced (FIG. 7). As described above, the N-10 strain resting cells were high-performance bacteria that completely decomposed 600 ppm of cyanide into formic acid and ammonia in 24 hours against highly toxic free cyanide.
[0020]
(2) Degradation of nickel cyanide complex and free cyanide using cell-free extract prepared from N-10 cell line
The N-10 strain grown for 48 hours on a synthetic inorganic medium (Table 1) containing 1 mM nickel cyanide complex was collected, and the cells were washed with 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). To 1 g of washed cells, 1.5 g of sea sand and 2 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (containing pH 7.0, 1 mM 2-mercaptoethanol) were added and crushed in an ice-cooled mortar. The 1000 rpm centrifugal supernatant of the resulting disrupted solution was used as a cell-free extract. The enzyme reaction (1.0 ml) was performed at 30 ° C. in a reaction solution consisting of 10 mM nickel cyanide complex or potassium cyanide, 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), and cell-free extract (1.4 mg protein). Samples were collected over time, and formamide, ammonia, and formic acid estimated as reaction products were quantitatively analyzed in the same manner as in (1).
[0021]
With the decomposition of 10 mM (2500 ppm) nickel cyanide complex, formamide, formic acid, and ammonia were produced (FIG. 8). In the case of potassium cyanide, the decomposition activity of 10 mM (600 ppm) potassium cyanide to formamide was extremely high, and potassium cyanide was instantaneously converted. With the reduction of converted formamide, formic acid and ammonia were produced (FIG. 9).
[0022]
【The invention's effect】
Since the microorganisms provided by the present invention have a remarkable degrading activity against cyanide, culturing these microorganisms in various ways and using them in various forms can reduce soil and water pollution caused by cyanide. Efficient decomposition and removal by microorganisms becomes possible.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photomicrograph of N-10 strain conidia-forming cells (Photo 1) and conidia (Photo 2).
FIG. 2 is a graph showing the growth of N-10 strain using a high concentration nickel cyanide complex as a nitrogen source.
FIG. 3 is a diagram showing decomposition of a high concentration nickel cyanide complex by N-10 strain.
FIG. 4 is a graph showing the growth of N-10 strain using potassium cyanide as a nitrogen source.
FIG. 5 shows the growth of N-10 strains using various nitrile compounds as nitrogen sources.
FIG. 6 is a diagram showing degradation of 10 mM nickel cyanide complex by resting cells of N-10 strain.
FIG. 7 shows the degradation of 10 mM potassium cyanide by resting cells of N-10 strain.
FIG. 8 is a diagram showing the decomposition of a 10 mM nickel cyanide complex by a cell-free extract of N-10 strain.
FIG. 9 is a diagram showing the degradation of 10 mM potassium cyanide by a cell-free extract of N-10 strain.

Claims (3)

A new strain Fusarium oxysporum N-10, which has a degrading activity for cyanide complexes . A method for treating a cyanide complex , comprising decomposing a cyanide complex using the strain according to claim 1. 3. The method for treating a cyanide complex according to claim 2, wherein a bacterial cell of the strain, a treated product of the bacterial cell, or an immobilized product thereof is used.

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