JP3814005B2

JP3814005B2 - Method for conversion of glucose to fructose by acid-resistant glucose isomerase

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Publication number: JP3814005B2
Application number: JP02616396A
Authority: JP
Inventors: 義幸高崎
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1996-01-20
Filing date: 1996-01-20
Publication date: 2006-08-23
Anticipated expiration: 2016-01-20
Also published as: JPH09191894A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、pH４〜６の酸性下で、グルコースからフラクトースを酵素的に製造する方法を提供する。より詳細には、耐酸性グルコースイソメラーゼを酸性下で、かつ嫌気的条件下及び／又は還元剤の存在下でグルコースに作用させることを特徴とする、グルコースをフラクトースに変換する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フラクトースは天然に存在する糖の中で最も甘味の強い糖であり、甘味料として使用されている。フラクトースは、現在、澱粉を原料として製造されるグルコースをグルコースイソメラーゼで異性化して製造されており、一般に、異性化糖と呼ばれ、フラクトース42〜45％を含む液糖として市販されている。
【０００３】
澱粉から異性化糖の製造において、α-アミラーゼによる澱粉の液化はpH６〜７で行われ、グルコアミラーゼによる液化澱粉の糖化はpH4.5付近で行われ、そして、グルコースイソメラーゼによるグルコースの異性化はpH７〜８で行われている。糖はアルカリ性側で不安定で、分解して、着色物質を生成したり、プシコース、ダイフラクトース、有機酸などの副産物を生成する。このため、酸性下、少なくともグルコアミラーゼの反応pH（pH４〜５）で使用できるグルコースイソメラーゼの開発が要望されてきた。
【０００４】
しかしながら、これまでに知られている殆どのグルコースイソメラーゼは、最適pHが７〜８にあり、pH６以下では不安定で、pH５の酸性下では殆ど作用しない酵素であった［図１および図２の−●−は、市販されているストレプトマイセス・ルビジノサス（Streptomyces rubiginosus)のグルコースイソメラーゼのpH安定性と作用pHを示している］。
【０００５】
一方、W. D. Cotterらは、USP-3,623,9538において、グルコースイソメラーゼによるグルコースの異性化反応を、pH6.5〜7.5で、亜硫酸イオンまたは亜硫酸水素イオンを存在させて行うことにより、反応時の着色が防止され、酵素も安定化されると記述している。
【０００６】
しかしながら、ここで用いられているグルコースイソメラーゼは前記のストレプトマイセス・ルビジノサスの生産する酵素であり、上述したようにこの酵素はpH５では殆ど作用しない酵素である。
【０００７】
また、酵素の有効利用と異性化糖生産を能率的に行うため、グルコースイソメラーゼを固定化酵素として、これをカラムに詰め、連続的に異性化糖を製造することも行われているが、これまでの異性化糖の製造はpH７〜８で反応が行われている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
発明者は、澱粉から異性化糖の製造をより経済的、かつ効率的に行うため、グルコアミラーゼと同じpHで作用するグルコースイソメラーゼを求めて自然界から微生物の検索を行ってきた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
その結果、本発明者は新たに土壌中より分離し、ストレプトマイセス・エスピーＧ−27（Streptomyces sp. G-27）と同定した微生物がpH５付近においても効率的にグルコースをフラクトースに異性化する耐酸性のグルコースイソメラーゼを生産することを認め、特許を出願した（特願平3-59344）。
【００１０】
しかし、更に鋭意研究を重ねた結果、前述したようなpH４〜６で安定な耐酸性のグルコースイソメラーゼは、酸性下、特にpH６以下で酸化失活しやすいこと、その失活は可逆的であり、嫌気的条件に保つことにより、活性が回復することを認めた。そして、これらの酵素を嫌気下で使用すれば、pH５においても、これまでの異性化糖製造の反応pH（pH７〜８）の活性と大差ない活性（80％程度）でグルコースをフラクトースに異性化できることを認め、本発明を完成した。更に、ストレプトマイセス・エスピーＧ−27（Streptomyces sp. G-27）以外の菌株について酸性域での活性を示すことを指標として、土壌からスクリーニングすることにより、上記したような性質を示す耐酸性のグルコースイソメラーゼを得ることができる。本発明には、このようにして得られ、pH４〜６の酸性下で安定であるが、pH４〜６で可逆的に酸化失活する性質を有する酵素であれば使用することができる。
【００１１】
例えば、本発明に使用できる酵素の１例として、上述したストレプトマイセス・エスピーＧ−27（Streptomyces sp. G-27）由来のグルコースイソメーゼについてその詳細を記載する。本酵素は、pH４〜12の範囲で安定であるが、最適pHは７〜８にあり、pH５での活性は、pH７での活性の20％程度である（図２参照）。
【００１２】
しかし、この活性の差の要因としては、特に酸性下で加速される可逆的酸化失活が含まれており、実際は、pH5.0においても、pH7.0での活性の70〜80％もあることがわかった。
【００１３】
このような酸性下での可逆的失活は、pH６以下、特に、pH5.5以下の酸性側で著しく、pH６以上、特にpH７付近では殆どおこらないことを認めた（表１を参照）。
【００１４】
また、この酸性下でおこる酸化失活は、該酵素を空気との接触を断つような嫌気的条件、例えば、反応液を、トルエンのような水に不溶の有機溶媒で重層し、空気との接触を断つと、基質であるグルコースあるいはこれから生成するフラクトースの還元力により次第に還元され活性を回復する。更に、適当な還元剤を存在させ、より嫌気的条件を保てば、より短時間に活性が回復する。従って、これを考慮して、グルコースの異性化反応を行えば、pH４〜６の酸性下でも効果的にグルコースをフラクトースに異性化できることがわかった。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。
【００１５】
即ち、本発明は、耐酸性グルコースイソメラーゼを酸性下で、かつ嫌気的条件下及び／又は還元剤の存在下でグルコースに作用させることを特徴とする、グルコースをフラクトースに変換する方法である。更に詳細には、pH４〜６の酸性下で安定であるが、pH４〜６で可逆的に酸化失活する性質を有する耐酸性グルコースイソメラーゼを、pH４〜６の酸性下、かつ嫌気的条件下及び／又は還元剤の存在下でグルコースと接触させることを特徴とするグルコースをフラクトースに変換する方法である。
【００１６】
本発明でいう、pH４〜６の酸性下で安定な酵素とは、図１および後述するように、本発明で使用できる酵素の一例として挙げたストレプトマイセス・エスピーＧ−27（Streptomyces sp. G-27）由来のグルコースイソメーゼの性質「ｆ）pH安定性」に記載しているように、グルコースイソメラーゼ液を室温（約25℃）で３時間インキュベート後、pH７に戻して活性を測定したとき、pH４〜７で活性の低下が殆ど認められない酵素をいう。
【００１７】
そして、pH４〜６で可逆的に酸化失活する酵素とは、空気と接触するような好気的条件では、pH４〜６の酸性下で急速に活性が低下するが、嫌気的条件に保てば活性が可逆的に回復する酵素をいう。
【００１８】
以下、本発明の内容を更に詳細に説明する。
例えば、本発明に使用できる、pH４〜６の酸性下で安定であるが、pH４〜６で可逆的に酸化失活する性質を有する耐酸性グルコースイソメラーゼの一例として、ストレプトマイセス・エスピーＧ−27（FERM P-12036）より生産されるグルコースイソメラーゼが挙げられる。次いで、本酵素の主な酵素化学的性質について記載する。
【００１９】
ａ）作用：酸性下でＤ−グルコースをＤ−フラクトースに変換する。
【００２０】
ｂ）基質特異性：Ｄ−グルコースとＤ−フラクトースの相互変換を行う他、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノースとＤ−リボースをそれぞれ対応するケトースに異性化する。しかしＤ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−アラビノースなどには実質的に作用しない。
【００２１】
ｃ）作用pH：４〜８である。
【００２２】
ｄ）最適pH：７付近に認められるが、pH５付近でもよく作用し、約３０％の活性を示す。
【００２３】
ｅ）最適温度：0.1Ｍグルコースを基質としpH８、10分反応での最適温度は85〜 87℃である。
【００２４】
ｆ）安定pH：0.1Ｍ緩衝液（酢酸又はリン酸緩衝液）の下で、室温（約25℃）で時間放置後、残存活性を測定した。その結果、pH４〜12の範囲で安定であった。
【００２５】
ｇ）熱安定性：酵素水溶液を各温度で加熱した結果、80℃、85℃では、30分間加熱しても失活は認められず、むしろ活性の増加が認められた。又、90℃、 10分間の加熱では約30％失活した。
【００２６】
ｈ）Km値：グルコースに対するKmは約0.083Ｍ、Ｄ−キシロースに対するKmは約 0.13Ｍで、本酵素はＤ−キシロースよりもＤ−グルコースに対してより親和性が大きい。
【００２７】
ｉ）賦活剤：Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺などにより賦活される。その活性の強さは、５× 10^-3ＭにおいてCoCl₂を100％としたとき、MgSO₄約42％、MnSO₄約17％であった。
【００２８】
ｊ）阻害剤：５×10^-3ＭのHgCl₂、AgNO₃、CuSO₄、CaCl₂などにより阻害された。
【００２９】
ｋ）精製法：硫酸アンモニウムによる分画、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィー及びセファデックスＧ−150ゲルろ過などにより電気泳動的に単一まで精製することができる。
【００３０】
ｌ）活性測定法：0.1Ｍのリン酸緩衝液（pH7.0）、0.01Ｍ MgSO₄及び0.2Ｍのグルコースを含む溶液0.5mlに、適量の酵素を加え、水で全量を1.0mlとし、 60℃で反応させる。そして生成したフラクトースをシステイン−カルバゾール法で定量する。この条件で、１分間に１マイクロモルのフラクトースを生成する酵素量を１単位とした。
【００３１】
本酵素は、現在、工業的に広く使用されているストレプトマイセス・ルビジノサス（Streptomyces rubiginosus）のグルコースイソメラーゼ（以下、酵素Ａという）〔Y. Takasaki, アグリカルチャル・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.），33巻，1523頁（1969）〕及びストレプトマイセス・フェオクロモゲネス（Streptomyces phaeochromogenes）のグルコースイソメラーゼ（以下、酵素Ｂという）〔N.Tsumuraら，アグリカルチャル・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.），29巻，1192頁（1965）〕に比べ、以下に記載する酵素的性質の差異が認められた。
【００３２】
すなわち、
(1) 本酵素の最適pHは７付近にあるが、図１に示す通り、pH５以下でもよく作用する。一方、酵素Ａの最適pHは8.5付近にあり、pH６における活性はpH8.5のときの約30％である。そして、pH５以下では不安定で実質的に作用しない。又、酵素Ｂの最適pHはよりアルカリ側のpH9.3〜9.5に認められており、そして同様にpH５以下では実質的に作用しない。
【００３３】
(2) 本酵素の最適温度は85〜87℃にあり、酵素Ａ及び酵素Ｂに比べ５〜７℃高い。
【００３４】
(3) 本酵素は85℃で30分加熱しても失活が認められないが、酵素Ａは80℃、10分の加熱で約30％失活し、酵素Ｂは70℃、10分の加熱で80〜85％失活する。
【００３５】
(4) 本酵素は、Ｄ−グルコースの他、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノースなどにも作用し、それぞれ対応するケトースに異性化する。すなわち、本酵素は巾広い基質特異性を示すのに対し、酵素ＡはＤ−グルコースとＤ−キシロースのみに作用し、酵素ＢはＤ−グルコース、Ｄ−キシロースとＬ−アラビノースに作用する。
【００３６】
(5) 酵素Ａ及び酵素Ｂは、Ｄ−グルコースに対するKm値がＤ−キシロースに対するKmより大きく、Ｄ−グルコースよりもＤ−キシロースに対する親和性の方が大きいのに対し、本酵素は、Ｄ−グルコースに対するKmは約0.083Ｍ、Ｄ−キシロースに対するKmは約0.13Ｍであり、Ｄ−キシロースよりもＤ−グルコースに対してより親和性が大きい。
【００３７】
(6) 酵素Ａ及び酵素ＢはMg²⁺により最も強く賦活されるのに対し、本酵素は Mg²⁺よりCo²⁺によって強く賦活される。
【００３８】
本酵素の理化学的性質のうち、主な性質について、公知のグルコースイソメラーゼと比較した結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】

【００４０】
以上のとおり、本酵素は作用pH、熱安定性などの性質において、公知のグルコースイソメラーゼに比べ重要な差異が認められ、耐酸性と耐熱性に優れた新規なグルコースイソメラーゼと考えられる。
【００４１】
本酵素はストレプトマイセス・エスピー G-27より生産されうる。本菌株の菌学的性質は下記の通りである。尚、本菌株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に第12036号（FERM P-12036）として寄託されている。
【００４２】
Ａ．形態
(1) 基生菌糸は樹枝状に分岐し発育、液体・固体をとわず、いかなる培地においても、断裂しない。
(2) 気菌糸は単純分枝で、直状の長い胞子連鎖を形成する。培養が長期となると先端部でゆるく波状になるが、らせん状は稀である。
(3) 胞子柄は基生菌糸から形成されるが、認められるほど長くない（10μm以下）。分枝は菌糸の主軸に対し20〜40℃、分枝数は通常１〜３本。
(4) 胞子嚢、菌核、球状体は形成しない。
(5) 胞子は気菌糸上にのみ生じ、出来る方向は求心的。胞子の表面は平滑で、卵円形又は円筒系、1.0×1.5〜2.0μm、通常50個以上の直状の連鎖となる。
(6) 基生菌糸、気菌糸の幅はそれぞれ1.0〜1.5μm。
【００４３】

【００４４】

【００４５】
以上の菌学的諸性質についてバージェイス・マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）（第７版）及びThe Actinomycetes（２巻、152〜292頁）を参照し、本菌をストレプトマイセス・エスピー G-27（Streptomyces sp. G-27）と同定した。
【００４６】
本菌を培養して耐酸性グルコースイソメラーゼを生産するには、窒素源として、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ブイヨン、カゼイン、大豆粕、酵母、酵母エキスなど、通常、微生物の培養に使用される有機窒素源、あるいは塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源を単独又は有機窒素源に補足して使用される。
【００４７】
炭素源としては、キシロース、又はその原料であるキシラン及びその派生物が使用される。この他、ソルビトール、グリセリン、マンノース、グルコース、シュークロースなども有効である。
【００４８】
以上の窒素源と炭素源の他に、補足する培地成分としてリン酸塩、マグネシウム塩、コバルト塩、マンガン塩などが添加される。
【００４９】
培養は、pH５〜９、好ましくはpH5.5〜８、温度25〜50℃、好ましくは30℃で１〜４日間程度行われる。グルコースイソメラーゼは菌体内に生産される酵素であるので、培養後、ろ過又は遠心分離により菌体を回収し、そのまま、又は適当な固定化処理を行なって使用するか、超音波又は自己消化法により該酵素を抽出し使用される。抽出された酵素は必要により、濃縮し、硫酸アンモニウム、アセトン、メタノール、エタノールなどで沈殿し、乾燥保存する。
【００５０】
本酵素を用い、グルコースからフラクトースを生成する反応は、20〜60％のグルコース溶液又はグルコース含有液、例えば、澱粉糖化液が使用され、pH4.5〜８、温度50〜90℃で行うことができる。すなわちアスペルギルス・ニガー又はリゾープス属のグルコアミラーゼを用い、pH4.5〜5.5で糖化された糖化液を、実質的にpHを調整することなく、そのまま異性化原料として使用するか、又は、澱粉液化液又はデキストリン含有液を原料とし、グルコアミラーゼが作用する条件（pH4.5〜5.5、温度55〜60℃）で、グルコアミラーゼによる糖化と本発明の酵素による異性化を同時に行うことができる。
【００５１】
又、澱粉を原料とし、α−アミラーゼによる液化、グルコアミラーゼによる糖化と本発明の酵素による異性化の、３つの反応を、pH５〜６、温度55〜60℃で同時に行い、澱粉から直接、異性化糖を製造することも可能である。
【００５２】
上記したストレプトマイセス・エスピーＧ−27（Streptomyces sp. G-27）より得られるような、pH４〜６の酸性下で安定であるが、pH４〜６で可逆的に酸化失活する性質を有する耐酸性グルコースイソメラーゼを用いて、上記のような方法でグルコースからフラクトースを生成する反応を行うことができるが、本発明に使用する酵素としてはストレプトマイセス・エスピーＧ−27（Streptomyces sp. G-27）由来の耐酸性グルコースイソメラーゼに限定されない。即ち、pH４〜６の酸性下で安定であるが、pH４〜６で可逆的に酸化失活する性質を有する酵素であれば本発明を適用することができる。これらの酵素のように、pH４〜６で可逆的に酸化失活するグルコースイソメラーゼの活性を回復する為には、嫌気的条件下／及び又は還元剤の存在下での反応が効果的である。
【００５３】
嫌気的条件としては、簡単には、反応液を、水に溶解しない有機溶媒、例えば、トルエンを重層して、空気との接触を断つだけでも達成できる。このことにより、基質であるグルコースあるいは生成フラクトースの還元力により、次第に活性が回復される。
【００５４】
また、基質溶液を脱気したり、基質溶液に窒素ガスのような不活性ガスを注入したり、基質溶液を減圧下で貯蔵したり、基質溶液を加温するなどして、溶存酸素を除去したり、酸素が入り込まないようにすればより効果的である。
【００５５】
更に、固定化酵素バイオリアクターを用いて連続的に異性化反応を行う場合には、基質の貯槽から固定化酵素床までの配管とポンプに空気層がないようにするか、或いはできるだけ少なくして、基質溶液が酵素と接触するまでの間に酸素が溶け込まないよう配慮する。
【００５６】
これらの嫌気的条件をつくる方法を、単独または適宜組み合わせて行えば、基質グルコースにより、同酵素の活性は次第に回復し、活性が長時間にわたり維持される。
【００５７】
また、例えば、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、システイン、グルタチオンなどの還元剤を添加することにより短時間に活性が回復し、保持される。より好ましくは亜硫酸水素ナトリウムが使用できる。
【００５８】
これらの還元剤の添加量は通常0.1〜２mM程度であり、更に基質溶液をできるだけ脱気し、溶存酸素を少なくし、減圧下で貯蔵するのが望ましい。反応系への還元剤の添加時期としては特に限定されないが、基質溶液に含有させることも可能であり、更に基質溶液がグルコースイソメラーゼと接触する直前に添加するようにすれば、還元剤の添加量を少なくし、効果も大きい。
【００５９】
従って、本発明をより効果的に実施するには、これらの条件を適宜組み合わせ、できるだけ空気を遮断し嫌気的状態を保てるよう装置上の工夫を行うことにより、効率的に本発明を実施することができる。
【００６０】
尚、特に記載しない限り、異性化した反応物の糖組成の分析は高速液体クロマトグラフィーによるか、又は、フラクトースはシステインーカルバゾール法による比色定量により、グルコースはグルコースオキシダーゼを用いる酵素法により、そして全糖量はアンスロン法又はフェノール−硫酸法による比色定量法により行なった。
【００６１】
次に、実施例により本発明の内容を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものでない。
【実施例】
実施例１
コーン・スティ−プ・リカー 1.2％（固形分換算）、魚肉エキス0.1％、CoCl₂ １×10^-3Ｍ、Ｄ−キシロース 0.6％、グリセリン 0.4％からなる培地（pH6.5）50mlを200ml容三角フラスコに入れ、常法により殺菌後、ストレプトマイセス・エスピーＧ−27（FERM P-12036）を接種し、30℃で３日間振盪培養した。
【００６２】
培養後、遠心分離して菌体区分を集め、水洗滌後、20KC超音波細胞破砕機で破砕し、抽出液を得た。該抽出液の一定量を採り、生産されたグルコースイソメラーゼを測定した結果、培地１ml当たり約1.5単位生産された。
【００６３】
該抽出液に硫安を70％飽和になるよう加え、生成する沈殿を集め、セロファンチューブに入れ、蒸溜水で透析してのち、膜濃縮し、セファデックＧ−150カラムクロマトグラフィーにより精製した酵素液を使用し、以下の実験を行った。
【００６４】
(1) pH安定性
ストレプトマイセス・エスピーＧ−27（FERM P-12036）由来のグルコースイソメラーゼと市販のストレプトマイセス・ルビジノサス（Streptomyces rubiginosus)由来のグルコースイソメラーゼ［Y. Takasaki他, Agriculture Biological Chemistry, vol.33, 1527-1534 (1969)及び同誌, Vol.30, 1247-1253(1966)記載のストレプトマイセス・エスピーＹＴ−No.５（Streptomyces sp.YT-5）と同じ菌株］を、それぞれ0.05単位と、各pHの50mM酢酸またはリン酸緩衝液を全量0.4mlで、室温（約25℃）で３時間放置後、0.4Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）を加えて、pH7.0に戻し、残存活性を測定した。その結果を図１に示す。
【００６５】
図１から明らかなように、市販酵素は、pH６以下で不安定であったのに対し、本発明で使用する酵素は、pH４〜11の幅広いpHで安定であり、特に、pH４〜６の酸性域での安定性が顕著であった。
【００６６】
(2) グルコース異性化反応に対するpHの影響
ストレプトマイセス・エスピーＧ−27由来の耐酸性グルコースイソメラーゼと(1)記載の市販グルコースイソメーラーゼの活性に対するpHの影響を測定した。
【００６７】
反応は、各pHの0.1Ｍ酢酸またはリン酸緩衝液、各グルコースイソメラーゼ 0.05単位、グルコース 0.1Ｍ、MgSO₄ ５mMの下、全量0.4mlを、内径14mm、長さ100mmの試験管に入れ、60℃で30分間反応を行った。
【００６８】
図２から明らかなように、ストレプトマイセス・エスピーＧ−27由来の酵素の最適pHは７付近にあり、pH５では、pH７での活性の20％程度の活性であった。一方、前記市販の酵素はpH5.0において殆ど活性は示さなかった。
【００６９】
実施例２
ストレプトマイセス属由来の耐酸性グルコースイソメラーゼの固定化酵素を用いた連続反応を詳細に検討した結果、上記(2)で記載した、pH７と比較したpH５での活性値（約20％）は、この酵素のこのpHでの実際の活性値を示すものでなく、酸性下で促進される可逆的酸化失活が含まれていることを見い出した。
【００７０】
そこで、本実験では、酸性下で失活した活性を回復し、保持するため、試験管に入れた反応液の液面をトルエンで重層した上、還元剤を添加して反応を行った。
【００７１】
実施例１の(2)の実験において、反応時のpHを5.0、5.5、6.0、6.5及び7.0とし、通常の反応（対照）と空気との接触を断つため液面をトルエンで重層し、更に、還元剤として、亜硫酸水素ナトリウムを１mM添加して反応を行った。得られた結果を表２に示す。
【００７２】
【表２】

【００７３】
表２から明らかなように、特に、pH６以下において、嫌気的条件下の反応の効果が顕著に認められた。
【００７４】
表中において酸化による失活率は以下のようにして求めた。
【００７５】
【式１】

【００７６】
実施例３
嫌気性を高めるため、各種還元剤を添加して異性化反応を行った。反応は、グルコース40％、マレイン酸緩衝液（pH５またはpH７）50mM、MgSO₄ ５mM、グルコースイソメラーゼ 0.086単位、各種還元剤１mM、全量 2.0 mlを、内径13mm、長さ100mmの試験管に入れ、トルエン0.5mlを重層し、60℃て行った。経時的に一定量を採り、生成フラクトースを定量した。
【００７７】
図３から明らかなように、pH5.0の反応において、トルエンを重層して空気を遮断し、更に、各種の還元剤を添加して行った結果、いずれの還元剤を使用した場合も、反応初期から顕著な効果が認められた。なかでも亜硫酸水素ナトリウムが良好であった。しかし、還元剤無添加の場合でも、時間の経過とともに活性の回復が認められた。一方、pH7.0の反応では、図４から明らかなように、いずれの還元剤も添加効果は認められなかった。
【００７８】
比較的良好であった亜硫酸水素ナトリウムについて、濃度を変えて試験した。反応は、グルコース40％、マレイン酸緩衝液（pH５及びpH７）50mM、MgSO₄ ５mM、グルコースイソメラーゼ 0.086単位、亜硫酸水素ナトリウムを0.5、１、２又は４mM、全量2.0mlを、内径13mm、長さ100mmの試験管に入れ、トルエン0.5mlで重層し、60℃で行った。得られた結果を図５に示す。
【００７９】
図から明らかなように、最適濃度は１〜２mMであった。
【００８０】
実施例４
ストレプトマイセス属由来のグルコースイソメラーゼ（実施例１で使用の酵素）について、空気酸化の影響について検討した。
酢酸緩衝液（pH5.0）またはリン酸緩衝液（pH7.0）50mMとグルコースイソメラーゼ 4.3×10^-3単位、全量0.2mlを内径13mm、長さ100mmの試験管に入れ、室温（25℃）で、静置または振盪（200rpm）した。０時間目と１時間目で、それぞれ、0.4Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）を0.3ml加えて、pH７に調整後、残存活性を測定した。得られた結果を表３に示す。
【００８１】
【表３】

【００８２】
表３から明らかなように、pH7.0では、静置、振盪とも１時間後、殆ど活性の低下が認められなかったが、pH5.0では、静置でも１時間後、約10％の活性低下があり、振盪した場合は、約32％の活性が低下した。このことから、空気中の酸素が活性低下に関与しているものと考えられた。しかし、この低下した活性は、同酵素を嫌気下で保つことにより回復した。
【００８３】
実施例５
耐酸性グルコースイソメラーゼ固定化酵素を用いて実験した。実施例１により調製された耐酸性グルコースイソメラーゼを含むストレプトマイセス属菌体を凍結乾燥し、乾燥菌体当たり、10％量のゼラチンを加え、少量の水とともに、60℃で加温して、ペースト状とした後、注射器で0.5％グルタルアルデヒド／アセトン溶液に滴下し、10分放置後、固定化菌体を集め、30℃で１夜風乾した。このようにして得られた固定化酵素約24.6単位を、内径13mm、長さ80mmのカラムに詰めた。
【００８４】
基質としては、グルコース40％、MgSO₄ 50mMとマレイン酸緩衝液（pH５またはpH７）50mMからなる組成のものを用いた。基質の貯槽からポンプ（チューブポンプを使用）を経て固定化酵素床までの間をビニールチューブで接続し、途中空気層がないようすべて基質溶液で満たし、60℃で反応を行った。流量は、各pHとも異性化率が45％前後となるよう調節した。
【００８５】
その結果、pH7.0での反応の流量は約0.62ml／時であり、pH5.0での反応の流量は約0.41ml／時であった。約１ケ月間運転後の結果を図６に示す。この結果から、異性化率が半減する期間は、pH7.0の場合で約６ケ月、pH5.0の場合で約２ケ月と算出された。
【００８６】
図７は、カラムの操作日数に対して、生成したフラクトースの積算量を図示したものである。この結果から、pH5での活性は、pH7.0の約60％と計算された。
【００８７】
実施例６
実施例５において、より嫌気的状態を維持するため、基質液に１mMの亜硫酸水素ナトリウムを添加して使用して異性化反応を行った。カラムには、約19.6単位の固定化グルコースイソメラーゼを充填し、反応は60℃で行った。流量は異性化率が約45％になるよう調整した。
【００８８】
その結果、流量は、pH5.0の場合で0.24ml／時、pH7.0の場合で0.32ml／時であった。図８は、カラムの操作日数に対して、生成したフラクトースの積算量を図示したものである。
【００８９】
この結果から、pH５での同酵素の活性は、pH7.0の場合の約75％と計算され、還元剤を添加することにより嫌気性が向上したことにより、pH5.0での活性を顕著に向上させることができた。
【００９０】
実施例７
実施例６において、基質液のpHをpH4.5、5.0、6.0、6.5と7.0に変え、異性化率約10％となるよう流量を調整し、60℃で反応を行った。流量から算出したそれぞれのpHでの活性値を表４と図９に示す。
【００９１】
【表４】

【００９２】
実施例１の(2)の結果（図２）のように試験管を用い、液面が空気と接触しているこれまでの活性測定では、pH7.0、6.0、5.5、5.0及び4.5での活性は、それぞれ、約100％、約81％、約42％、約20％と約６％であったのに対し、固定化酵素を用い嫌気的状態で反応を行うと、それぞれのpHで、100％、93％、86％、72％及び67％と高い活性が得られた。
【００９３】
【発明の効果】
本発明は、pH４〜６の酸性域で可逆的に酸化失活するストレプトマイセス属耐酸性グルコースイソメラーゼを、pH４〜６の酸性下、かつ嫌気的条件下及び／又は還元剤の存在下で反応することにより、活性を回復、保持して，pH４〜６の酸性下でグルコースをフラクトースに効果的に変換する方法に関し、これにより、グルコアミラーゼによる液化澱粉の糖化と同じpHでグルコースをフラクトースに異性化を行うことを可能にする。また、酸性下での反応により、従来、異性化糖の製造において問題となっていた糖液の着色を少なくし、プシコース、ダイフラクトース、有機酸などの副産物の生成も抑制し、商業的に有利に異性化糖を製造することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の(1)の各グルコースイソメラーゼのpH安定性を示す。
【符号の説明】
図中で−○−は耐酸性グルコースイソメラーゼを示し、−●−はストレプトマイセス・ルビジノサス由来のグルコースイソメラーゼを示す。
【図２】実施例１の(2)の各グルコースイソメラーゼの活性に対するpHの影響を示す。
【符号の説明】
図中で−○−は耐酸性グルコースイソメラーゼを示し、−●−はストレプトマイセス・ルビジノサス由来のグルコースイソメラーゼを示す。
【図３】実施例３の耐酸性グルコースイソメラーゼを用いたpH5.0での反応において、各種還元剤の影響を示す。
【符号の説明】
図中で−△−は亜硫酸水素ナトリウム、−＋−は亜硫酸ナトリウム、−○−は２−メルカプトエタノール、−×−はグルタチオン、−●−はチオ硫酸ナトリウム、−◇−はシステイン、−□−は無添加の場合を示す。
【図４】実施例３の耐酸性グルコースイソメラーゼを用いたpH7.0での反応において、各種還元剤の影響を示す。
【符号の説明】
図中で−△−は亜硫酸水素ナトリウム、−＋−は亜硫酸ナトリウム、−○−は２−メルカプトエタノール、−×−はグルタチオン、−●−はチオ硫酸ナトリウム、−◇−はシステイン、−□−は無添加の場合を示す。
【図５】実施例３の耐酸性グルコースイソメラーゼを用いたpH5.0での反応における亜硫酸水素ナトリウム添加の影響を示す。
【符号の説明】
図中で−●−は無添加でpH7.0で反応した場合を示し、−○−は無添加でpH5.0で反応した場合を示している。−×−は２mM、−△−は１mM、−＋−は４mM、そして、−□−は0.5mMの亜硫酸水素ナトリウムを添加した場合を示す。
【図６】実施例５の固定化耐酸性グルコースイソメラーゼを用いた連続異性化反応の操作日数と異性化率の結果を示す。
【符号の説明】
図中で、−○−はpH5.0の結果を、−●−はpH7.0の結果を示す。
【図７】実施例５の固定化耐酸性グルコースイソメラーゼを用いた連続異性化反応の操作日数と生成したフラクトースの積算量の結果を示す。
【符号の説明】
図中で、−○−はpH5.0の結果を、−●−はpH7.0の結果を示す。
【図８】実施例６の固定化耐酸性グルコースイソメラーゼを用い、亜硫酸水素ナトリウム存在下で行った連続異性化反応の操作日数と異性化率の結果を示す。
【符号の説明】
図中で、−○−はpH5.0の結果を、−●−はpH7.0の結果を示す。
【図９】実施例７の基質液のpHと活性の結果を示す。
【符号の説明】
図中で、−○−は実施例１の(2)に示した液面が空気と接触している場合の結果であり、−●−は固定化酵素を用いた嫌気性条件下での結果を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention provides a method for enzymatically producing fructose from glucose under acidic conditions of pH 4-6. More particularly, the present invention relates to a method for converting glucose into fructose, characterized by allowing acid-resistant glucose isomerase to act on glucose under anaerobic conditions and / or in the presence of a reducing agent.
[0002]
[Prior art]
Fructose is the most sweet sugar among the naturally occurring sugars and is used as a sweetener. Fructose is currently produced by isomerizing glucose produced from starch as a raw material with glucose isomerase, and is generally called isomerized sugar and is commercially available as liquid sugar containing 42-45% fructose.
[0003]
In the production of isomerized sugar from starch, liquefaction of starch with α-amylase is performed at pH 6-7, liquefaction of liquefied starch with glucoamylase is performed around pH 4.5, and glucose isomerization with glucose isomerase is performed. It is carried out at pH 7-8. Sugars are unstable on the alkaline side and decompose to produce colored substances and by-products such as psicose, difructose, and organic acids. For this reason, development of glucose isomerase that can be used at least at the reaction pH of glucoamylase (pH 4 to 5) under acidic conditions has been desired.
[0004]
However, most of the glucose isomerases known so far are those having an optimum pH of 7-8, unstable at pH 6 or lower, and hardly acting under acidic pH 5 [FIGS. 1 and 2] -●-indicates the pH stability and working pH of the commercially available glucose isomerase of Streptomyces rubiginosus].
[0005]
On the other hand, WD Cotter et al. In USP-3,623,9538 performed the isomerization reaction of glucose with glucose isomerase at pH 6.5 to 7.5 in the presence of sulfite ion or hydrogen sulfite ion, thereby allowing coloring during the reaction. It is prevented and the enzyme is also stabilized.
[0006]
However, the glucose isomerase used here is an enzyme produced by Streptomyces rubidinosus, and as described above, this enzyme hardly acts at pH 5.
[0007]
In addition, in order to efficiently use the enzyme and produce isomerized sugar efficiently, glucose isomerase is used as an immobilized enzyme and packed in a column to produce isomerized sugar continuously. The production of the isomerized sugar up to is carried out at pH 7-8.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The inventor has been searching for microorganisms from nature in search of glucose isomerase that acts at the same pH as glucoamylase in order to more economically and efficiently produce isomerized sugar from starch.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result, the inventor newly separated from soil and identified as Streptomyces sp. G-27 efficiently isomerizes glucose into fructose even at around pH 5. Recognizing the production of acid-resistant glucose isomerase, a patent was filed (Japanese Patent Application No. 3-59344).
[0010]
However, as a result of further earnest research, the acid-resistant glucose isomerase stable at pH 4 to 6 as described above is easily oxidized and deactivated under acidic conditions, particularly at pH 6 or lower, and the deactivation is reversible. It was observed that the activity was restored by maintaining anaerobic conditions. If these enzymes are used under anaerobic conditions, glucose is isomerized to fructose even at pH 5 with an activity (approximately 80%) that is not significantly different from the activity of conventional reaction pH (pH 7-8) for isomerized sugar production. Recognizing that this is possible, the present invention was completed. Furthermore, by screening from soil using as an indicator that the strains other than Streptomyces sp. G-27 (Streptomyces sp. G-27) show the activity in the acidic range, the acid resistance showing the above-mentioned properties Of glucose isomerase can be obtained. In the present invention, any enzyme can be used as long as it is obtained in this manner and is stable under acidic conditions of pH 4-6, but has the property of being reversibly oxidized and deactivated at pH 4-6.
[0011]
For example, as an example of an enzyme that can be used in the present invention, the details of glucose isomerase derived from Streptomyces sp. G-27 described above will be described. The enzyme is stable in the range of pH 4-12, but the optimum pH is 7-8, and the activity at pH 5 is about 20% of the activity at pH 7 (see FIG. 2).
[0012]
However, this difference in activity includes reversible oxidative deactivation, especially under acidic conditions. In fact, even at pH 5.0, there are 70-80% of the activity at pH 7.0. I understood it.
[0013]
It was found that such reversible deactivation under acidic conditions was remarkable on the acidic side at pH 6 or lower, particularly pH 5.5 or lower, and hardly occurred at pH 6 or higher, particularly around pH 7 (see Table 1).
[0014]
In addition, the oxidative deactivation that occurs under the acidic condition is caused by anaerobic conditions in which the enzyme is disconnected from air, for example, the reaction solution is overlaid with an organic solvent insoluble in water such as toluene, When the contact is cut off, the activity is gradually reduced by the reducing power of glucose as a substrate or fructose produced therefrom. Furthermore, if an appropriate reducing agent is present and more anaerobic conditions are maintained, the activity is recovered in a shorter time. Therefore, in view of this, it was found that glucose isomerization can be effectively isomerized to fructose even under acidic conditions of pH 4-6. The present invention has been made based on this finding.
[0015]
That is, the present invention is a method for converting glucose to fructose, characterized by allowing acid-resistant glucose isomerase to act on glucose under anaerobic conditions and / or in the presence of a reducing agent. More specifically, acid-resistant glucose isomerase, which is stable under acidic conditions at pH 4-6 but reversibly oxidatively deactivates at pH 4-6, is obtained under acidic conditions at pH 4-6 and under anaerobic conditions. It is a method for converting glucose into fructose, which is characterized by contacting with glucose in the presence of a reducing agent.
[0016]
The enzyme that is stable under acidic conditions of pH 4 to 6 in the present invention is, as shown in FIG. 1 and later described, Streptomyces sp. G-27 (Streptomyces sp. G) mentioned as an example of an enzyme that can be used in the present invention. -27) Properties of derived glucose isomerase As described in “f) pH stability”, the glucose isomerase solution was incubated at room temperature (about 25 ° C.) for 3 hours and then returned to pH 7 to measure the activity. Sometimes, it refers to an enzyme with almost no decrease in activity at pH 4-7.
[0017]
And, an enzyme that is reversibly oxidized and deactivated at pH 4 to 6 is rapidly reduced in activity under acidic conditions at pH 4 to 6 under aerobic conditions such as contact with air, but can be kept under anaerobic conditions. An enzyme whose activity is reversibly restored.
[0018]
Hereinafter, the contents of the present invention will be described in more detail.
For example, Streptomyces sp. G-27 is an example of an acid-resistant glucose isomerase that can be used in the present invention and is stable under acidic conditions at pH 4-6 but reversibly oxidized and deactivated at pH 4-6. And glucose isomerase produced from (FERM P-12036). The main enzyme chemistry of the enzyme is then described.
[0019]
a) Action: Converts D-glucose to D-fructose under acidic conditions.
[0020]
b) Substrate specificity: In addition to interconversion of D-glucose and D-fructose, D-xylose, L-arabinose and D-ribose are isomerized to the corresponding ketoses, respectively. However, it does not substantially act on D-mannose, D-galactose, D-arabinose and the like.
[0021]
c) Working pH: 4-8.
[0022]
d) Optimal pH: found at around 7, but works well at around pH 5, showing about 30% activity.
[0023]
e) Optimum temperature: Optimum temperature in a reaction of

pH

8 and 10 minutes using 0.1M glucose as a substrate is 85 to 87 ° C.
[0024]
f) Stable pH: Residual activity was measured after standing at room temperature (about 25 ° C.) under 0.1 M buffer (acetic acid or phosphate buffer). As a result, it was stable in the pH range of 4-12.
[0025]
g) Thermal stability: As a result of heating the enzyme aqueous solution at each temperature, at 80 ° C. and 85 ° C., no inactivation was observed even when heated for 30 minutes, but rather an increase in activity was observed. In addition, it was deactivated by about 30% when heated at 90 ° C for 10 minutes.
[0026]
h) Km value: Km for glucose is about 0.083 M, Km for D-xylose is about 0.13 M, and this enzyme has a higher affinity for D-glucose than D-xylose.
[0027]
i) Activator: Co ²⁺ , Mg ²⁺ , Mn ²⁺ It is activated by. Its strength is 5 × 10 ^-3 CoCl at M ₂ Is 100%, MgSO _Four About 42%, MnSO _Four About 17%.
[0028]
j) Inhibitor: 5 × 10 ^-3 M HgCl ₂ , AgNO _Three , CuSO _Four , CaCl ₂ It was inhibited by etc.
[0029]
k) Purification method: It can be purified electrophoretically to single by fractionation with ammonium sulfate, DEAE-Sepharose column chromatography and Sephadex G-150 gel filtration.
[0030]
l) Activity measurement method: 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), 0.01 M MgSO _Four Then, an appropriate amount of enzyme is added to 0.5 ml of a solution containing 0.2 M glucose, and the total amount is made up to 1.0 ml with water and reacted at 60 ° C. The produced fructose is quantified by the cysteine-carbazole method. Under these conditions, the amount of enzyme that produces 1 micromole of fructose per minute was defined as 1 unit.
[0031]
This enzyme is a glucose isomerase of Streptomyces rubiginosus (hereinafter referred to as enzyme A) [Y. Takasaki, Agricultural Biological Chemistry (Agric. Biol), which is currently widely used industrially. Chem.), 33, 1523 (1969)] and Streptomyces phaeochromogenes glucose isomerase (hereinafter referred to as enzyme B) [N. Tsumura et al., Agricultural Biological Chemistry. (Agric. Biol. Chem.), 29, 1192 (1965)], the following differences in enzymatic properties were observed.
[0032]
That is,
(1) Although the optimum pH of this enzyme is around 7, it works well even at pH 5 or lower as shown in FIG. On the other hand, the optimum pH of enzyme A is around 8.5, and the activity at pH 6 is about 30% at pH 8.5. And below pH5, it is unstable and does not act substantially. In addition, the optimum pH of enzyme B is recognized at pH 9.3 to 9.5 on the more alkaline side, and similarly, it does not substantially work at pH 5 or lower.
[0033]
(2) The optimum temperature of this enzyme is 85 to 87 ° C, which is 5 to 7 ° C higher than that of enzyme A and enzyme B.
[0034]
(3) This enzyme is not inactivated even when heated at 85 ° C for 30 minutes, but enzyme A is inactivated by about 30% by heating at 80 ° C for 10 minutes, and enzyme B is at 70 ° C for 10 minutes. Deactivate 80-85% by heating.
[0035]
(4) In addition to D-glucose, this enzyme also acts on D-xylose, D-ribose, L-arabinose, etc., and isomerizes to the corresponding ketose. That is, the present enzyme exhibits a broad substrate specificity, whereas enzyme A acts only on D-glucose and D-xylose, and enzyme B acts on D-glucose, D-xylose and L-arabinose.
[0036]
(5) Enzyme A and enzyme B have a Km value for D-glucose that is greater than Km for D-xylose and a greater affinity for D-xylose than D-glucose, The Km for glucose is about 0.083 M and the Km for D-xylose is about 0.13 M, which has a higher affinity for D-glucose than D-xylose.
[0037]
(6) Enzyme A and Enzyme B are Mg ²⁺ The enzyme is most strongly activated by ²⁺ More Co ²⁺ Is strongly activated.
[0038]
Of the physicochemical properties of this enzyme, the results of comparing the main properties with known glucose isomerase are shown in Table 1.
[0039]
[Table 1]

[0040]
As described above, the present enzyme is considered to be a novel glucose isomerase excellent in acid resistance and heat resistance, with significant differences compared to known glucose isomerase in properties such as working pH and heat stability.
[0041]
This enzyme can be produced from Streptomyces sp. G-27. The bacteriological properties of this strain are as follows. This strain has been deposited as No. 12036 (FERM P-12036) at the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry.
[0042]
A. Form
(1) The vegetative mycelium branches and grows in a dendritic shape, does not take a liquid / solid state, and does not break in any medium.
(2) The aerial hyphae are simple branches and form a long, straight spore chain. Long-term culturing results in a loose wave at the tip, but spirals are rare.
(3) The spore pattern is formed from the basic mycelium, but not long enough to be observed (less than 10 μm). Branches are 20 to 40 ° C with respect to the main axis of the mycelium, and the number of branches is usually 1 to 3.
(4) No sporangia, fungal nuclei or spheroids are formed.
(5) Spores occur only on the aerial hyphae, and the direction that can be achieved is centripetal. The surface of the spore is smooth, oval or cylindrical, 1.0 × 1.5 to 2.0 μm, usually 50 or more straight chains.
(6) The width of the basic hyphae and aerial hyphae is 1.0-1.5 μm, respectively.
[0043]

[0044]

[0045]
For the above mycological properties, refer to Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7th edition) and The Actinomycetes (Vol. 2, pages 152-292). Was identified as Streptomyces sp. G-27 (Streptomyces sp. G-27).
[0046]
In order to produce acid-resistant glucose isomerase by culturing this fungus, corn steep liquor, meat extract, peptone, bouillon, casein, soybean meal, yeast, yeast extract, etc. are usually used as a nitrogen source for culturing microorganisms. Organic nitrogen sources or inorganic nitrogen sources such as ammonium chloride, ammonium sulfate, urea and ammonium nitrate are used alone or in addition to the organic nitrogen source.
[0047]
As the carbon source, xylose or xylan which is a raw material thereof and derivatives thereof are used. In addition, sorbitol, glycerin, mannose, glucose, sucrose, etc. are also effective.
[0048]
In addition to the above nitrogen source and carbon source, phosphate, magnesium salt, cobalt salt, manganese salt and the like are added as supplemental medium components.
[0049]
Culturing is performed at pH 5-9, preferably pH 5.5-8, temperature 25-50 ° C, preferably 30 ° C for about 1-4 days. Glucose isomerase is an enzyme produced in the microbial cells, so after culturing, the microbial cells are collected by filtration or centrifugation and used as they are or after appropriate immobilization treatment, or by ultrasonic or self-digestion method. The enzyme is extracted and used. If necessary, the extracted enzyme is concentrated, precipitated with ammonium sulfate, acetone, methanol, ethanol, etc., and stored in a dry state.
[0050]
The reaction for producing fructose from glucose using this enzyme is carried out at a pH of 4.5 to 8 and a temperature of 50 to 90 ° C. using a 20 to 60% glucose solution or a glucose-containing solution, for example, starch saccharified solution. it can. That is, using a glucoamylase belonging to the genus Aspergillus niger or Rhizopus, a saccharified solution saccharified at pH 4.5 to 5.5 is used as it is as an isomerization raw material without substantially adjusting the pH, or a starch liquefied solution Alternatively, saccharification with glucoamylase and isomerization with the enzyme of the present invention can be performed simultaneously under the conditions (pH 4.5 to 5.5, temperature 55 to 60 ° C.) in which dextrin-containing liquid is used as a raw material.
[0051]
Also, using starch as a raw material, three reactions, liquefaction with α-amylase, saccharification with glucoamylase, and isomerization with the enzyme of the present invention, are carried out simultaneously at pH 5-6 and at a temperature of 55-60 ° C. It is also possible to produce a chemical sugar.
[0052]
As obtained from Streptomyces sp. G-27 (Streptomyces sp. G-27), it is stable under acidic conditions at pH 4-6, but has the property of being reversibly oxidized and deactivated at pH 4-6. The acid-resistant glucose isomerase can be used to carry out a reaction for producing fructose from glucose by the method as described above. As an enzyme used in the present invention, Streptomyces sp. G-27 (Streptomyces sp. G- 27) It is not limited to acid-resistant glucose isomerase derived from. That is, the present invention can be applied to any enzyme that has a property that is stable under acidic conditions of pH 4 to 6 but reversibly oxidatively deactivates at pH 4 to 6. In order to recover the activity of glucose isomerase which is reversibly oxidized and deactivated at pH 4 to 6 like these enzymes, the reaction under anaerobic conditions and / or in the presence of a reducing agent is effective.
[0053]
The anaerobic condition can be achieved simply by overlaying the reaction solution with an organic solvent that does not dissolve in water, such as toluene, and cutting off the contact with air. As a result, the activity is gradually recovered by the reducing power of the substrate glucose or generated fructose.
[0054]
Also, remove the dissolved oxygen by degassing the substrate solution, injecting an inert gas such as nitrogen gas into the substrate solution, storing the substrate solution under reduced pressure, and warming the substrate solution. It is more effective to prevent oxygen from entering.
[0055]
Furthermore, when performing an isomerization reaction continuously using an immobilized enzyme bioreactor, the piping and pump from the substrate storage tank to the immobilized enzyme bed should have no air layer or be as small as possible. Care should be taken so that oxygen does not dissolve before the substrate solution comes into contact with the enzyme.
[0056]
When these methods for creating anaerobic conditions are carried out alone or in combination, the activity of the enzyme is gradually recovered by the substrate glucose, and the activity is maintained for a long time.
[0057]
Further, for example, by adding a reducing agent such as sodium sulfite, sodium hydrogen sulfite, sodium thiosulfate, 2-mercaptoethanol, cysteine, glutathione, the activity is recovered and retained in a short time. More preferably, sodium bisulfite can be used.
[0058]
The amount of these reducing agents to be added is usually about 0.1 to 2 mM, and it is desirable to deaerate the substrate solution as much as possible to reduce dissolved oxygen and store it under reduced pressure. There is no particular limitation on the timing of addition of the reducing agent to the reaction system, but it can also be contained in the substrate solution, and if the substrate solution is added immediately before contact with glucose isomerase, the amount of reducing agent added The effect is great.
[0059]
Therefore, in order to implement the present invention more effectively, the present invention can be efficiently implemented by combining these conditions as appropriate and by devising the apparatus so as to keep the anaerobic state by blocking air as much as possible. Can do.
[0060]
Unless otherwise specified, analysis of the sugar composition of the isomerized reactant is performed by high performance liquid chromatography, or fructose is determined by colorimetry using the cysteine-carbazole method, glucose is determined by an enzymatic method using glucose oxidase, and The total sugar amount was determined by an anthrone method or a colorimetric determination method using a phenol-sulfuric acid method.
[0061]
Next, the content of the present invention will be described with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited by these examples.
【Example】
Example 1
Corn steep liquor 1.2% (converted to solid content), fish extract 0.1%, CoCl ₂ 1 × 10 ^-3 50 ml of medium (pH 6.5) consisting of 0.6% M, D-xylose and 0.4% glycerin is placed in a 200 ml Erlenmeyer flask, sterilized by a conventional method, and then inoculated with Streptomyces sp. G-27 (FERM P-12036) And cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days.
[0062]
After cultivation, the cells were separated by centrifugation, washed with water, and then crushed with a 20 KC ultrasonic cell crusher to obtain an extract. As a result of measuring a certain amount of the extract and measuring the produced glucose isomerase, about 1.5 units were produced per 1 ml of the medium.
[0063]
To the extract, ammonium sulfate is added to 70% saturation, and the resulting precipitate is collected, put into a cellophane tube, dialyzed with distilled water, concentrated in a membrane, and purified by Sephadex G-150 column chromatography. The following experiment was conducted.
[0064]
(1) pH stability
Glucose isomerase derived from Streptomyces sp. G-27 (FERM P-12036) and commercially available glucose isomerase derived from Streptomyces rubiginosus [Y. Takasaki et al., Agriculture Biological Chemistry, vol.33, 1527- 1534 (1969) and the same magazine, Vol. 30, 1247-1253 (1966) described in Streptomyces sp. YT-No. 5 (Streptomyces sp. YT-5)] 50 mM acetic acid or phosphate buffer in a total volume of 0.4 ml, let stand at room temperature (about 25 ° C) for 3 hours, add 0.4 M phosphate buffer (pH 7.0) to return to pH 7.0, It was measured. The result is shown in FIG.
[0065]
As is clear from FIG. 1, the commercially available enzyme was unstable at pH 6 or lower, whereas the enzyme used in the present invention is stable at a wide pH range of pH 4 to 11, and particularly acidic at pH 4 to 6. The stability in the region was remarkable.
[0066]
(2) Effect of pH on glucose isomerization reaction
The effect of pH on the activity of acid-resistant glucose isomerase derived from Streptomyces sp. G-27 and the commercially available glucose isomerase described in (1) was measured.
[0067]
The reaction consists of 0.1 M acetic acid or phosphate buffer at each pH, 0.05 units of each glucose isomerase, 0.1 M glucose, MgSO _Four Under 5 mM, a total volume of 0.4 ml was placed in a test tube having an inner diameter of 14 mm and a length of 100 mm, and the reaction was performed at 60 ° C. for 30 minutes.
[0068]
As is clear from FIG. 2, the optimum pH of the enzyme derived from Streptomyces sp. G-27 is around 7, and at pH 5, the activity was about 20% of the activity at pH 7. On the other hand, the commercially available enzyme showed almost no activity at pH 5.0.
[0069]
Example 2
As a result of detailed examination of the continuous reaction using the immobilized enzyme of acid-resistant glucose isomerase derived from the genus Streptomyces, the activity value (about 20%) at pH 5 compared with pH 7 described in (2) above is: We have found that this enzyme does not show the actual activity value at this pH, but includes reversible oxidative deactivation that is promoted under acidic conditions.
[0070]
Therefore, in this experiment, in order to recover and retain the activity deactivated under acidic conditions, the reaction liquid placed in the test tube was overlaid with toluene, and the reaction was performed by adding a reducing agent.
[0071]
In the experiment of (2) of Example 1, the reaction pH was set to 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 and 7.0, and the liquid surface was overlaid with toluene in order to cut off the contact between the normal reaction (control) and air, and Then, 1 mM sodium bisulfite was added as a reducing agent to carry out the reaction. The obtained results are shown in Table 2.
[0072]
[Table 2]

[0073]
As apparent from Table 2, the effect of the reaction under anaerobic conditions was remarkably observed particularly at pH 6 or lower.
[0074]
In the table, the deactivation rate due to oxidation was determined as follows.
[0075]
[Formula 1]

[0076]
Example 3
In order to enhance anaerobic properties, isomerization reaction was performed by adding various reducing agents. The reaction consists of 40% glucose, 50 mM maleate buffer (pH 5 or pH 7), MgSO _Four 5 mM, glucose isomerase 0.086 units, various reducing agents 1 mM, and a total volume of 2.0 ml were placed in a test tube having an inner diameter of 13 mm and a length of 100 mm, and 0.5 ml of toluene was overlaid, followed by 60 ° C. A certain amount was taken over time, and the generated fructose was quantified.
[0077]
As is apparent from FIG. 3, in the reaction at pH 5.0, toluene was layered to block air, and various reducing agents were added. As a result, no matter which reducing agent was used, the reaction A remarkable effect was recognized from the beginning. Among them, sodium bisulfite was good. However, even when no reducing agent was added, recovery of activity was observed over time. On the other hand, in the reaction at pH 7.0, as is apparent from FIG. 4, the effect of adding any reducing agent was not recognized.
[0078]
Sodium bisulfite, which was relatively good, was tested at varying concentrations. The reaction consisted of 40% glucose, 50 mM maleate buffer (pH 5 and pH 7), MgSO _Four 5 mM, glucose isomerase 0.086 units, sodium bisulfite 0.5, 1, 2 or 4 mM, 2.0 ml in total were placed in a test tube having an inner diameter of 13 mm and a length of 100 mm, layered with 0.5 ml of toluene, and performed at 60 ° C. The obtained results are shown in FIG.
[0079]
As is apparent from the figure, the optimum concentration was 1-2 mM.
[0080]
Example 4
Regarding the glucose isomerase derived from the genus Streptomyces (enzyme used in Example 1), the effect of air oxidation was examined.
Acetate buffer (pH 5.0) or phosphate buffer (pH 7.0) 50 mM and glucose isomerase 4.3 × 10 ^-3 A unit and a total amount of 0.2 ml were put in a test tube having an inner diameter of 13 mm and a length of 100 mm, and left standing or shaking (200 rpm) at room temperature (25 ° C.). At 0 hour and 1 hour, 0.3 ml of 0.4 M phosphate buffer (pH 7.0) was added to adjust the pH to 7, and then the residual activity was measured. The obtained results are shown in Table 3.
[0081]
[Table 3]

[0082]
As is apparent from Table 3, at pH 7.0, there was almost no decrease in activity after 1 hour for both standing and shaking, but at pH 5.0, about 10% of the activity was observed after 1 hour of standing. There was a decrease, and about 32% of the activity decreased when shaken. From this, it was considered that oxygen in the air was involved in the decrease in activity. However, this reduced activity was restored by keeping the enzyme under anaerobic conditions.
[0083]
Example 5
Experiments were performed using an acid-resistant glucose isomerase immobilized enzyme. Streptomyces cells containing acid-resistant glucose isomerase prepared in Example 1 were lyophilized, 10% gelatin was added to the dried cells, and heated at 60 ° C. with a small amount of water. After making it into a paste, it was dropped into a 0.5% glutaraldehyde / acetone solution with a syringe and allowed to stand for 10 minutes. The immobilized cells were collected and air-dried at 30 ° C. overnight. About 24.6 units of the immobilized enzyme thus obtained were packed in a column having an inner diameter of 13 mm and a length of 80 mm.
[0084]
As substrates, glucose 40%, MgSO _Four A composition composed of 50 mM and 50 mM maleate buffer (pH 5 or pH 7) was used. The space between the substrate storage tank, the pump (using a tube pump) and the immobilized enzyme bed was connected with a vinyl tube, filled with the substrate solution so that there was no air layer on the way, and reacted at 60 ° C. The flow rate was adjusted so that the isomerization rate was around 45% at each pH.
[0085]
As a result, the flow rate of the reaction at pH 7.0 was about 0.62 ml / hour, and the flow rate of the reaction at pH 5.0 was about 0.41 ml / hour. The result after about one month of operation is shown in FIG. From this result, the period during which the isomerization rate is halved was calculated to be about 6 months at pH 7.0 and about 2 months at pH 5.0.
[0086]
FIG. 7 shows the integrated amount of generated fructose with respect to the number of days of operation of the column. From this result, the activity at pH 5 was calculated to be about 60% of pH 7.0.
[0087]
Example 6
In Example 5, in order to maintain a more anaerobic state, isomerization reaction was performed using 1 mM sodium bisulfite added to the substrate solution. The column was packed with about 19.6 units of immobilized glucose isomerase and the reaction was carried out at 60 ° C. The flow rate was adjusted so that the isomerization rate was about 45%.
[0088]
As a result, the flow rate was 0.24 ml / hour at pH 5.0 and 0.32 ml / hour at pH 7.0. FIG. 8 shows the accumulated amount of generated fructose with respect to the number of days of operation of the column.
[0089]
From this result, the activity of the enzyme at pH 5 was calculated to be about 75% of that at pH 7.0, and the anaerobic property was improved by adding a reducing agent. I was able to improve.
[0090]
Example 7
In Example 6, the pH of the substrate solution was changed to pH 4.5, 5.0, 6.0, 6.5 and 7.0, the flow rate was adjusted so that the isomerization rate was about 10%, and the reaction was performed at 60 ° C. The activity value at each pH calculated from the flow rate is shown in Table 4 and FIG.
[0091]
[Table 4]

[0092]
As shown in the results of Example 1 (2) (Fig. 2), the activity was measured at pH 7.0, 6.0, 5.5, 5.0 and 4.5 using a test tube and the liquid level was in contact with air. While the activities were about 100%, about 81%, about 42%, about 20% and about 6%, respectively, when the reaction was carried out in an anaerobic state using an immobilized enzyme, High activity of 100%, 93%, 86%, 72% and 67% was obtained.
[0093]
【The invention's effect】
The present invention reacts Streptomyces acid-resistant glucose isomerase, which is reversibly oxidized and deactivated in the acidic range of pH 4-6, under acidic conditions of pH 4-6 and under anaerobic conditions and / or in the presence of a reducing agent. To recover and retain the activity and effectively convert glucose to fructose under acidic conditions of pH 4-6, whereby glucose is converted to fructose at the same pH as saccharification of liquefied starch by glucoamylase. Make it possible to In addition, the reaction under acidic conditions reduces the coloration of sugar solution, which has been a problem in the production of isomerized sugar, and suppresses the production of by-products such as psicose, difructose, and organic acids, which is commercially advantageous. It is possible to produce isomerized sugars.
[Brief description of the drawings]
1 shows the pH stability of each glucose isomerase of (1) in Example 1. FIG.
[Explanation of symbols]
In the figure, -o- indicates an acid-resistant glucose isomerase, and-●-indicates a glucose isomerase derived from Streptomyces rubidinosus.
FIG. 2 shows the influence of pH on the activity of each glucose isomerase in (2) of Example 1.
[Explanation of symbols]
In the figure, -o- indicates an acid-resistant glucose isomerase, and-●-indicates a glucose isomerase derived from Streptomyces rubidinosus.
FIG. 3 shows the influence of various reducing agents in the reaction at pH 5.0 using the acid-resistant glucose isomerase of Example 3.
[Explanation of symbols]
In the figure,-△-is sodium bisulfite,-+-is sodium sulfite,-○-is 2-mercaptoethanol, -X- is glutathione,-●-is sodium thiosulfate,-◇-is cysteine,-□- Indicates the case of no addition.
FIG. 4 shows the influence of various reducing agents in the reaction at pH 7.0 using the acid-resistant glucose isomerase of Example 3.
[Explanation of symbols]
In the figure,-△-is sodium bisulfite,-+-is sodium sulfite,-○-is 2-mercaptoethanol, -X- is glutathione,-●-is sodium thiosulfate,-◇-is cysteine,-□- Indicates the case of no addition.
FIG. 5 shows the influence of sodium bisulfite addition in the reaction at pH 5.0 using the acid-resistant glucose isomerase of Example 3.
[Explanation of symbols]
In the figure,-●-indicates the case of reaction at pH 7.0 without addition, and-○-indicates the case of reaction at pH 5.0 without addition. -X- indicates 2 mM, -Δ- indicates 1 mM,-+-indicates 4 mM, and-□-indicates the case where 0.5 mM sodium bisulfite is added.
6 shows the results of the operation days and isomerization rate of the continuous isomerization reaction using the immobilized acid-resistant glucose isomerase of Example 5. FIG.
[Explanation of symbols]
In the figure, -o- indicates the result at pH 5.0, and-●-indicates the result at pH 7.0.
FIG. 7 shows the results of the operation days of the continuous isomerization reaction using the immobilized acid-resistant glucose isomerase of Example 5 and the integrated amount of fructose produced.
[Explanation of symbols]
In the figure, -o- indicates the result at pH 5.0, and-●-indicates the result at pH 7.0.
FIG. 8 shows the results of operation days and isomerization rate of the continuous isomerization reaction performed using the immobilized acid-resistant glucose isomerase of Example 6 in the presence of sodium hydrogen sulfite.
[Explanation of symbols]
In the figure, -o- indicates the result at pH 5.0, and-●-indicates the result at pH 7.0.
FIG. 9 shows the results of pH and activity of the substrate solution of Example 7.
[Explanation of symbols]
In the figure,-○-is the result when the liquid surface shown in (2) of Example 1 is in contact with air, and-●-is the result under anaerobic conditions using an immobilized enzyme. Indicates.

Claims

Under acidic conditions in a reversible manner Streptomyces sp has the following physicochemical properties: oxidizing deactivated G - 27 a (FERM P-12036) derived novel glucose isomerase, under acidic conditions, and under anaerobic conditions and / or A method for converting glucose into fructose, wherein the enzyme activity is recovered in the presence of a reducing agent and the glucose is allowed to act on glucose.
a) Action: Converts D-glucose to D-fructose under acidic conditions.
b) Substrate specificity: In addition to interconversion of D-glucose and D-fructose, D-xylose, L-arabinose and D-ribose are isomerized to the corresponding ketoses, respectively. However, it does not substantially act on D-mannose, D-galactose, D-arabinose and the like.
c) Working pH : 4-8.
d) Optimal pH : around 7.
e) optimal temperature: 0.1 M glucose as a substrate pH 8.0, the optimal temperature at 10 minutes the reaction is 85 ~ 87 ° C..
f) stable pH: a pH. 4 to 12.
g) Thermal stability: As a result of heating the enzyme aqueous solution at each temperature, inactivation was not observed when heated at 85 ° C for 30 minutes, and about 30 % was deactivated when heated at 90 ° C for 10 minutes .
h) Km value: Km for glucose of about 0.083 M, at Km about 0.13M for D- xylose, the enzyme is larger and more affinity for D- glucose than D- xylose.
i) Activator: Activated by Co ²⁺ , Mg ²⁺ , Mn ^{2+ and the} like. The strength of the activity, when the CoCl ₂ was 100% at 5 × 10 ^-3 M, MgSO ₄ about 42%, and MnSO ₄ about 17%.
j) Inhibitors: inhibited by like 5 × 10 ^-3 M of _{_{_{HgCl 2, AgNO 3, CuSO 4}}} , CaCl 2.

Under acidic conditions is in the range of pH 4.5 ~ 6.0, the activity recovery of the novel glucose isomerase, 67% ~ 93% der Ru method of claim 1 as relative activity ratio of pH 7.0.

The method according to claim 1 or 2, wherein the novel glucose isomerase is derived from Streptomyces.

4. The method according to claim 1, wherein the reducing agent is at least one selected from sodium sulfite, sodium hydrogen sulfite, sodium thiosulfate, 2-mercaptoethanol, cysteine, and glutathione.