JP4008481B2 - Organic anion transporters involved in renal drug excretion - Google Patents
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Description
本発明は、腎臓に発現し、腎臓の薬物再吸収と排泄機能に関与する有機アニオントランスポーター、より詳細には、配列表の配列番号１又は２に記載されたアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸配列が欠失し、置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する、腎臓に発現し、腎臓の薬物の排泄と再吸収機能に関与する有機アニオントランスポーター、それをコードする遺伝子、当該遺伝子を安定に発現する動物細胞株、それを用いた被検物質の当該細胞への取り込みを測定する方法、及びそれを用いた被検物質の腎臓における当該有機アニオントランスポーターを介した薬物の再吸収と排泄経路、腎毒性、及び／又は腎臓における薬物相互作用を検定する方法、特にインビトロで検定する方法、並びに当該遺伝子の１０〜１５０塩基からなるオリゴヌクレオチド、その利用方法に関する。また、本発明は、当該有機アニオントランスポーターに対する抗体、及びその遺伝子を含有してなる医薬組成物にも関する。 The present invention relates to an organic anion transporter that is expressed in the kidney and is involved in the drug reabsorption and excretion functions of the kidney, more specifically, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing, or a part of the amino acid sequence An organic anion transporter that is expressed in the kidney and has an amino acid sequence that is deleted, substituted, and / or added with other amino acids, and that is involved in the excretion and reabsorption functions of the kidney drug, and encodes it Gene, animal cell line that stably expresses the gene, a method for measuring the uptake of the test substance into the cell using the gene, and the organic anion transporter in the kidney of the test substance using the gene Methods for assaying the reabsorption and excretion pathways of the selected drugs, nephrotoxicity, and / or drug interactions in the kidney, in particular in vitro assays, and Oligonucleotide consisting 0-150 bases, their usage. The present invention also relates to an antibody against the organic anion transporter and a pharmaceutical composition comprising the gene.
細胞膜は脂質二重層膜であり、一般に疎水性物質は比較的自由に通過することができるが、親水性物質は通過することができない構造になっている。親水性物質などの各種物質を細胞内外に移動させる機構としてチャネルとトランスポーターが細胞膜に存在している。イオンチャネルや水チャネルのようなチャネルは、その開閉によりイオンや水を細胞内外に流通させる。トランスポーターは細胞外から物質を細胞内に取り込むキャリアや、細胞内に流入した疎水性物質などを細胞外に排出するためのポンプなどがある。 The cell membrane is a lipid bilayer membrane, and generally has a structure in which a hydrophobic substance can pass through relatively freely but a hydrophilic substance cannot pass through. Channels and transporters exist in the cell membrane as a mechanism for moving various substances such as hydrophilic substances into and out of the cell. Channels such as ion channels and water channels allow ions and water to flow inside and outside the cell by opening and closing. The transporter includes a carrier that takes a substance into the cell from outside the cell, a pump for discharging a hydrophobic substance that has flowed into the cell, and the like.
腎臓は薬物排泄の主要臓器で、血液中の高濃度の薬物にさらされるため薬剤性害を起こしやすく、このため薬物の腎移行性や腎毒性発現の機構が生理学的に研究されてきているが、薬物の腎臓からの排泄と再吸収経路、腎毒性、腎臓における薬物相互作用をインビトロ（in-vitro）に検定する方法は見出されていなかった。
腎臓における薬物の取り込みは、トランスポーターによるものがあると考えられてきたが、未だ十分には解明されていなかった。腎臓におけるトランスポーターを解明することにより腎臓での薬物の腎臓からの再吸収と排泄経路、腎毒性、腎臓における薬物相互作用を解明することができる。
本発明者らは、各種のトランスポーターをクローニングしてきており、これらの知見に基づいて腎臓のトランスポーター、特に有機アニオントランスポーターを探索してきた。
The kidney is a major organ for drug excretion and is susceptible to drug damage due to exposure to high concentrations of drugs in the blood. For this reason, the mechanism of drug migration to the kidney and the manifestation of nephrotoxicity has been studied physiologically. No method has been found for in vitro assay for drug excretion from the kidney and reabsorption pathways, nephrotoxicity, and drug interactions in the kidney.
Drug uptake in the kidney has been thought to be due to transporters, but has not yet been fully elucidated. By elucidating the transporter in the kidney, it is possible to elucidate the reabsorption and excretion pathway of the drug in the kidney, the renal toxicity, and the drug interaction in the kidney.
The present inventors have cloned various transporters, and based on these findings, have been searching for kidney transporters, particularly organic anion transporters.
本発明は、腎臓に発現している有機アニオントランスポーターを提供することを目的としている。また、本発明は、当該トランスポーターを安定に発現する動物細胞株を提供することを目的にしている。さらに、本発明は、当該トランスポーターを用いて、薬物の腎臓からの排泄と再吸収経路、腎毒性、腎臓における薬物相互作用をインビトロ（in-vitro）で検定する方法、及び当該トランスポーターを介して腎臓から再吸収し得る薬物を検出、同定する方法を提供するものである。 An object of the present invention is to provide an organic anion transporter expressed in the kidney. Another object of the present invention is to provide an animal cell line that stably expresses the transporter. Furthermore, the present invention provides a method for in vitro (in-vitro) assay of drug excretion from the kidney and reabsorption pathway, nephrotoxicity, drug interaction in the kidney using the transporter, and the transporter. Thus, a method for detecting and identifying a drug that can be reabsorbed from the kidney is provided.
本発明者らは、肝臓に少量発現している肝臓特異的有機アニオントランスポーター（ＬＳＴ−２）をクローニングしてきた（Takaaki, Abe, et al., Gastroenterology, (2001), 120, 1689-1699）。ＬＳＴ−２は肝臓特異的なトランスポーターであるが、意外にもＬＳＴ−２が腎臓に発現する有機アニオントランスポーターと相同性を有していることを見出し、このＬＳＴ−２に基づいて腎臓に発現する有機アニオントランスポーターを単離できることを見出し本発明を完成した。本発明者らは、ＬＳＴ−２の塩基配列をもとに分子生物学的な一連の操作を経て、ヒトおよびラットの腎臓に主に発現している新規な有機アニオントランスポータ（ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１及びラットｏａｔｐ−Ｍ１）を単離した。 The present inventors have cloned a liver-specific organic anion transporter (LST-2) expressed in a small amount in the liver (Takaaki, Abe, et al., Gastroenterology, (2001), 120, 1689-1699). . LST-2 is a liver-specific transporter. Surprisingly, LST-2 was found to have homology with an organic anion transporter expressed in the kidney. The present invention was completed by finding that an organic anion transporter that can be expressed can be isolated. The present inventors have conducted a series of molecular biological operations based on the base sequence of LST-2, and then developed a novel organic anion transporter (human OATP-M1) mainly expressed in human and rat kidneys. And rat oatp-M1).
即ち、本発明は、腎臓に発現し、腎臓の薬物再吸収と排泄機能に関与する有機アニオントランスポーター、より詳細には、配列表の配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸配列が欠失し、置換され、及び／又は他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する、腎臓に発現し、腎臓の薬物再吸収と排泄機能に関与する有機アニオントランスポーターに関する。
また、本発明は、前記した有機アニオントランスポーターをコードする遺伝子、より詳細には、配列表の配列番号３又は４に記載された塩基配列、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有する遺伝子に関する。本発明は、前記した遺伝子にハイブリダイズし得る塩基配列を有する１０〜１５０塩基、好ましくは１５〜１００、より好ましくは１５〜５０、さらには１５〜３０塩基からなるオリゴヌクレオチドにも関する。また、本発明は、前記遺伝子の発現を検出又は同定する方法、より詳細には、前記オリゴヌクレオチドを用いて、前記遺伝子の発現を検出又は同定する方法に関する。
That is, the present invention relates to an organic anion transporter expressed in the kidney and involved in the drug reabsorption and excretion functions of the kidney, more specifically, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing, or a part thereof The present invention relates to an organic anion transporter that is expressed in the kidney and has an amino acid sequence that is deleted, substituted, and / or added with other amino acids, and is involved in the drug reabsorption and excretion functions of the kidney.
The present invention also relates to a gene encoding the organic anion transporter described above, more specifically, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 4 in the sequence listing, or a base sequence that can hybridize under stringent conditions. It relates to a gene having The present invention also relates to an oligonucleotide having 10 to 150 bases, preferably 15 to 100, more preferably 15 to 50, and further 15 to 30 bases having a base sequence capable of hybridizing to the above gene. The present invention also relates to a method for detecting or identifying the expression of the gene, and more particularly to a method for detecting or identifying the expression of the gene using the oligonucleotide.
また、本発明は、前記した本発明の遺伝子が導入され、前記した本発明の有機アニオントランスポーターを安定に発現し得る動物細胞株、より詳細には遺伝子が導入されたＭＤＣＫ（Madin-Darby canine kidney）細胞株に関する本発明は、前記した本発明の遺伝子が発現している細胞に、被検物質を接触させて、被検物質の当該細胞への取り込みを測定する方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の遺伝子が発現している細胞に、被検物質を接触させて、被検物質の当該細胞への取り込みを測定することからなる当該細胞への取り込み量の多い物質をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、前記した本発明の遺伝子が発現している細胞、より詳細には前記した本発明の有機アニオントランスポーターを安定に発現し得る動物細胞株に、被検物質を接触させて、腎臓における本発明の有機アニオントランスポーターを介した薬物の排泄と再吸収経路、腎毒性、及び／又は腎臓における薬物相互作用を検定する方法に関する。
また、本発明は、前記した本発明の有機アニオントランスポーターに対する抗体にも関する。さらに、本発明は、前記した本発明の遺伝子を含有するキャリアー、及び製薬上許容される担体を含有してなる薬物の代謝を促進するための医薬組成物、及び、これを患者に投与してヒト腎臓に特異的に本発明の有機アニオントランスポーターを発現させて、当該有機アニオントランスポーターを介して薬物の排泄を促進させる方法にも関する。
The present invention also relates to an animal cell line into which the above-described gene of the present invention has been introduced and can stably express the above-described organic anion transporter, and more specifically MDCK (Madin-Darby canine into which the gene has been introduced. The present invention relating to a kidney cell line relates to a method for measuring the uptake of a test substance into the cell by contacting the test substance with a cell expressing the gene of the present invention.
Furthermore, the present invention relates to the amount of uptake into the cell comprising contacting the test substance with a cell expressing the gene of the present invention and measuring the uptake of the test substance into the cell. The present invention relates to a method for screening many substances.
The present invention further comprises contacting a test substance with a cell expressing the gene of the present invention, more specifically, an animal cell line capable of stably expressing the organic anion transporter of the present invention. The invention relates to methods for assaying drug excretion and reabsorption pathways, nephrotoxicity, and / or drug interactions in the kidney via the organic anion transporter of the present invention in the kidney.
The present invention also relates to an antibody against the organic anion transporter of the present invention described above. Furthermore, the present invention includes a carrier containing the above-described gene of the present invention, a pharmaceutical composition for promoting metabolism of a drug comprising a pharmaceutically acceptable carrier, and administering this to a patient. The present invention also relates to a method of specifically expressing the organic anion transporter of the present invention in the human kidney and promoting the excretion of the drug via the organic anion transporter.
本発明は、腎臓に特異的に発現し、腎臓からのアニオン性薬物の排泄の役割に関与する新規な有機アニオントランスポーターを単離し、その動物細胞安定発現細胞株を構築したことにより、この細胞株を使えばこのトランスポーターを介した薬物の再吸収と排泄経路をインビトロ（in-vitro）に検討でき、医薬品適性使用へ応用できるようになる。
また、ラットｏａｔｐ−Ｍ１を特異的に発現させたラットを用い、このトランスポーターを介した薬物の排泄経路などをインビボ（in-vivo）に検討できるようになる。
The present invention isolates a novel organic anion transporter that is specifically expressed in the kidney and is involved in the role of excretion of anionic drugs from the kidney, and constructed an animal cell stable expression cell line thereof. By using strains, the reabsorption and excretion pathways of drugs via this transporter can be examined in-vitro, and can be applied to pharmaceutical aptitude use.
In addition, using a rat that specifically expresses rat oatp-M1, the excretion route of the drug through this transporter can be examined in vivo.
本発明者らは、ＬＳＴ−２の塩基配列をもとに分子生物学的な一連の操作を経て、ヒト及びラットから新規な有機アニオントランスポータ（ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１およびラットｏａｔｐ−Ｍ１）を単離した。
即ち、ＬＳＴ−２の塩基配列をもとにＥＳＴデータベース検索を行い、ＢＦ９００２２５という部分配列（４１１ｂｐ）を得、この配列をもとに作製したプライマーを用いて各種臓器のＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、腎臓に存在していることが明らかとなった。そこで腎臓より得られたｃＤＮＡを用いて５’及び３’ＲＡＣＥ法を行った。これにより得られた塩基配列はシークエンスの結果、５’側の配列が欠けていることが予想されたので、５’ＲＡＣＥ産物である１８８１ｂｐ（コーディング領域の８ｂｐから１８８０ｂｐにあたる配列）をプロープとしてヒト肝臓ライブラリーを７０万個スクリーニングした。ハイブリダイゼーションは２５％ホルムアミド，４×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ，５×デンハード溶液を用いて４２℃、一晩行った。洗浄は２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５０℃、６０分間行った。その結果、３０個程のクローンが得られ、そのうち１３個のシークエンスを行ったところ、７２４アミノ酸からなる新規トランスポーターの単離に成功した。これをヒトＯＡＴＰ−Ｍ１と命名した。また、本発明のＯＡＴＰ−Ｍ１は、他のＯＡＴＰ(Organic anion trasporting polypeptide）ファミリーのトランスポーターと同様に１２回膜貫通型で、細胞内に５個のリン酸化部位、細胞外に４個の糖鎖結合を持つことが想定された。
相同性はヒトＯＡＴＰ−Ｅと最も高く４０．４％であった。さらに、上記フラグメントを用い、５０％ホルムアミド，５×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、０．２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５０℃、６０分間洗浄し、ノザンプロット解析を行った。その結果図１に示すように主として腎臓に、わずかに気管に発現し、胎児では腎臓の他、肝臓、肺に発現することが明らかとなった。
The present inventors have performed a series of molecular biological operations based on the base sequence of LST-2, and have obtained novel organic anion transporters (human OATP-M1 and rat oatp-M1) from humans and rats. Released.
That is, an EST database search was performed based on the base sequence of LST-2, a partial sequence (411 bp) called BF90025 was obtained, and RT-PCR of various organs was performed using primers prepared based on this sequence. It was revealed that it is present in the kidneys. Therefore, 5 ′ and 3 ′ RACE methods were performed using cDNA obtained from the kidney. As a result of sequencing, it was predicted that the 5′-side sequence was lacking, so that the human liver was obtained by using 1881 bp (sequence corresponding to 8 to 1880 bp of the coding region) as the 5 ′ RACE product. 700,000 libraries were screened. Hybridization was performed overnight at 42 ° C. using 25% formamide, 4 × SSC, 1% SDS, 5 × Denhardt's solution. Washing was performed using 2 × SSC, 1% SDS at 50 ° C. for 60 minutes. As a result, about 30 clones were obtained, and 13 of them were sequenced. As a result, a novel transporter consisting of 724 amino acids was successfully isolated. This was named human OATP-M1. Further, OATP-M1 of the present invention is a 12-transmembrane type like other OATP (Organic anion trasporting polypeptide) family transporters, and has 5 phosphorylation sites in the cell and 4 sugars outside the cell. It was assumed to have chain bonds.
The homology was the highest with human OATP-E, 40.4%. Furthermore, using the above fragment, hybridization was performed overnight at 42 ° C. using 50% formamide, 5 × SSC, 1% SDS, and washed at 50 ° C. for 60 minutes using 0.2 × SSC, 1% SDS. Northern plot analysis was performed. As a result, as shown in FIG. 1, it was revealed that it was mainly expressed in the kidney and slightly in the trachea, and in the fetus, it was expressed in the liver and lungs in addition to the kidney.
また、上記ヒト腎臓ライブラリーをスクリーニングした同じフラグメントを用いて、ラットの腎臓ライブラリーを５０万個スクリーニングし、１８個ほどのクローンを得、ラットｏａｔｐ−Ｍ１の単離に成功した。ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１との相同性は８５％であった。また、ラットｏａｔｐ−Ｍ１全長を用いて上記ヒトノザンと同様にハイブリダイズを行い、ノザンブロット解析したところ、図２に示すように、主として腎臓に発現していることが明らかとなった。 Moreover, using the same fragment obtained by screening the above human kidney library, 500,000 rat kidney libraries were screened to obtain about 18 clones, and rat oatp-M1 was successfully isolated. The homology with human OATP-M1 was 85%. Further, hybridization was performed in the same manner as the above human Northern using the full length of rat oatp-M1, and Northern blot analysis revealed that it was mainly expressed in the kidney as shown in FIG.
次に機能解析を行うため、ＯＡＴＰ−Ｍ１を強制発現させたＭＤＣＫ細胞を樹立するため、５’ＵＴＲを５ｂｐ，３’ＵＴＲを１３ｂｐ，ｃｏｄｉｎｇ２１７５ｂｐを含む２１９３ｂｐの配列を動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に入れた。これをＦｕＧＥＮＥ６を用いてＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションした。遺伝子が入っている細胞のみがＧ４１８に耐性となるためＧ４１８を培地中に７５０μｇ／ｍＬの濃度で１０日間培養・選択を行い２４個のＧ４１８耐性株を得た。これらの細胞から全ＲＮＡを抽出してノザンブロットを行った結果、３個のクローン（Ｃ５，１４，２３）がＭ１を発現していることがわかった。これらのクローンを用いて基質のスクリーニングを行った結果、図３内因性化合物として甲状腺ホルモンであるＴ３を最も運ぶのは、Ｃ１４であった（コントロールであるＧＦＰ発現細胞では５．５２±０．２０ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であるのに対し、１５．２１±０．５１ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。）。
その取り込みの作用機作を明らかとするために、ナトリウム非依存性試験を行った。即ち、まず、Ｎａ依存性をみるためにＮａＣｌをコリンＣｌに、ＮａＨＣＯ３をコリンｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅに置換したクレブス−ヘンセレイト緩衝液（142mM NaCl,23.8mM Na２O３,4.83mM KCl, 0.96mM KH２PO４,1.20mM MgSO４,12.5mM HEPPS,5.0mM glucose and 1.53mM CaCl２ adjusted to pH7.3）を用いて取り込み実験を行った。図４に示すように、取り込みはナトリウム非依存的であることを確認した。
また、上記クレブス−ヘンセレイト緩衝液を用いて３０分間前培養した後、ＲＩ化合物の入った緩衝液を加え３０分間取り込みをさせた。取り込みの停止は緩衝液の吸引後、Ｃｏｌｄ Ｃｈｏｌｉｎｅ ｂａｆｆｅｒ＋１％ＢＳＡを加えることで行った。その後Ｃｏｌｄ Ｃｈｏｌｉｎｅ ｂａｆｆｅｒで３回以上洗浄し、２５０μｌの１Ｎ−ＮａＯＨで一晩細胞を溶解後、２５０μｌの水を加えてそのうちの４００μｌをカウントした。残りは蛋白補正用として使用した。補正はＢｉｏ−Ｒａｄのｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（modified lowly method）を用いてＢＳＡを対照として行った。その結果、図５に示すように外因性化合物としてはジゴキシンにおいて取り込みが見られた。
Next, for functional analysis, in order to establish MDCK cells in which OATP-M1 is forcibly expressed, a sequence of 2193 bp including 5 bp of 5′UTR, 13 bp of 3′UTR, and 2175 bp of coding is added to animal cell expression vector pcDNA3.1. I put it in. This was transfected into MDCK cells using FuGENE6. Since only the cells containing the gene are resistant to G418, G418 was cultured and selected in a medium at a concentration of 750 μg / mL for 10 days to obtain 24 G418-resistant strains. As a result of extracting the total RNA from these cells and carrying out Northern blotting, it was found that three clones (C5, 14, 23) expressed M1. As a result of screening a substrate using these clones, it was C14 that carried the thyroid hormone T3 most as an endogenous compound in FIG. 3 (5.52 ± 0.20 fmol in the GFP-expressing cell as a control). It was 15.21 ± 0.51 fmol / mg protein versus / mg protein).
To elucidate the mechanism of action of the uptake, a sodium independent test was performed. That is, first, in order to see the Na dependence, Krebs-Henseleit buffer (142 mM NaCl, 23.8 mM Na 2 O 3 , 4.83 mM KCl, 0.96 mM KH 2 PO) in which NaCl is replaced with choline Cl and NaHCO 3 is replaced with choline bicarbonate. 4 , 1.20 mM MgSO 4 , 12.5 mM HEPPS, 5.0 mM glucose and 1.53 mM CaCl 2 adjusted to pH 7.3). As shown in FIG. 4, it was confirmed that the uptake was independent of sodium.
Moreover, after pre-cultured for 30 minutes using the Krebs-Henseleit buffer, a buffer containing the RI compound was added for uptake for 30 minutes. Uptake was stopped by adding Cold Choline buffer + 1% BSA after the buffer was aspirated. Thereafter, the cells were washed three times or more with Cold Choline buffer, and the cells were lysed overnight with 250 μl of 1N-NaOH, 250 μl of water was added, and 400 μl of them was counted. The rest was used for protein correction. Correction was performed using BSA as a control using Bio-Rad's protein assay kit (modified lowly method). As a result, as shown in FIG. 5, uptake was observed in digoxin as an exogenous compound.
以上から本発明のヒトＯＡＴＰ−Ｍ１は主として腎臓に発現し、甲状腺ホルモンをはじめどする種々の化合物の輸送に関与する有機アニオントランスポーターであることが明らかとなった。
腎臓は薬物排池の主要臓器であり豊富な血流を受けることから必然的に高濃度の薬物に曝され、薬剤性障害の発現しやすい状況にある。これまで、抗癌剤シスプラチン、アミノグリコシド系抗生物質ゲンタマイシンや、グリコベプチド系抗生物質バンコマイシンなど、腎障害を誘発する薬物の腎移行特性や腎毒性発現のメカニズムについて生理学的に研究されてきた。今回、本発明者らは腎臓に特異的に発現しており腎臓からのアニオン性薬物の再吸収と排泄に重要な役割を担う多選択性有機アニオントランスポーターを単離しその動物細胞安定発現細胞株を構築した。そして、この系を用いることでトランスポーターを介した薬物の再吸収と排泄経路の同定を動物実験をする前に予測することが可能となり、腎毒性の検討、腎臓における薬物相互作用のインビトロでの評価・予測系の開発を可能とするとともに医薬品適正使用に向けた応用が可能となる系と考えられた。
Expressed in human OATP-M1 mainly kidneys present invention from above, it was found that an organic anion transporter is involved in the transport of various compounds etc. including thyroid hormone.
The kidney is a major organ for drug drainage and receives abundant blood flow, so it is inevitably exposed to high concentrations of drugs and is prone to drug damage. So far, physiological studies have been conducted on the renal transit characteristics and mechanisms of nephrotoxicity of drugs that induce renal damage, such as the anticancer drug cisplatin, the aminoglycoside antibiotic gentamicin, and the glycopeptide antibiotic vancomycin. This time, the present inventors isolated a multi-selective organic anion transporter that is specifically expressed in the kidney and plays an important role in the reabsorption and excretion of anionic drugs from the kidney, Built. By using this system, it becomes possible to predict the reabsorption of drugs via transporters and the identification of excretion routes before conducting animal experiments, studying nephrotoxicity, and in vitro drug interactions in the kidney. It was considered to be a system that enables the development of evaluation and prediction systems and the application for proper use of pharmaceuticals.
本発明は、腎臓に特異的に発現している新規な有機アニオントランスポーターを提供するものである。本発明の有機アニオントランスポーターは、甲状腺ホルモン（Ｔ３）やジゴキシン、メトトレキセートなどの薬物の取り込みの関与しており、腎臓における薬物の再吸収と排泄経路、腎毒性、腎臓における薬物相互作用に深く関与しているものであると考えられる。
本発明の好ましい有機アニオントランスポーターとしては、配列表の配列番号１又は２に記載されたアミノ酸配列、又はその一部のアミノ酸配列が欠失し、その一部が他のアミノ酸で置換され、若しくは他のアミノ酸が付加されてた、又はこれらの欠失、置換、付加が組み合わされてなるアミノ酸配列を有するものであって、腎臓に発現し、腎臓の薬物排泄機能に関与する有機アニオントランスポーターが挙げられる。配列表の配列番号１のアミノ酸配列は、ヒト由来の本発明の有機アニオントランスポーターであり、配列番号２のアミノ酸配列は、ラット由来の本発明の有機アニオントランスポーターである。
The present invention provides a novel organic anion transporter that is specifically expressed in the kidney. The organic anion transporter of the present invention is involved in the uptake of drugs such as thyroid hormone (T3), digoxin and methotrexate, and is deeply involved in drug reabsorption and excretion pathways in the kidney, nephrotoxicity, and drug interactions in the kidney. It is thought that it is.
As a preferred organic anion transporter of the present invention, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing, or a part of the amino acid sequence is deleted, and part of the amino acid sequence is substituted with another amino acid, or It has an amino acid sequence to which other amino acids have been added or a combination of these deletions, substitutions and additions, and is expressed in the kidney, and an organic anion transporter involved in the renal drug excretion function Can be mentioned. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is a human-derived organic anion transporter of the present invention, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a rat-derived organic anion transporter of the present invention.
本発明の遺伝子は、前記した本発明の有機アニオントランスポーターをコードする遺伝子であり、本発明の遺伝子はｃＤＮＡ、ＲＮＡ又はゲノムであってもよい。これらの遺伝子は本発明の有機アニオントランスポーターのアミノ酸配列をコードする翻訳領域のみから成っていてもよいし、これにさらにプロモーター領域やエンハンサー領域などの他の必要な領域を有するものであってもよい。本発明の遺伝子の好ましい例としては、配列表の配列番号３又は４に記載された塩基配列、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものが挙げられるがこれに限定されるものではない。なお、配列表の配列番号３の塩基配列は、ヒト由来の本発明の有機アニオントランスポーターをコードする遺伝子のものであり、配列番号４の塩基配列は、ラット由来の本発明の有機アニオントランスポーターをコードする遺伝子のものである。
また、本発明が開示した塩基配列を利用してゲノム中からＰＣＲ法などにより本発明の遺伝子をクローニングすることもできる。
The gene of the present invention is a gene encoding the organic anion transporter of the present invention described above, and the gene of the present invention may be cDNA, RNA or genome. These genes may consist only of the translation region encoding the amino acid sequence of the organic anion transporter of the present invention, or may have other necessary regions such as a promoter region and an enhancer region. Good. Preferred examples of the gene of the present invention include, but are not limited to, those having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 4 in the sequence listing, or those having a nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions. It is not a thing. The base sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is that of a gene encoding the human-derived organic anion transporter of the present invention, and the base sequence of SEQ ID NO: 4 is the rat-derived organic anion transporter of the present invention. Of the gene encoding.
In addition, the gene of the present invention can be cloned from the genome by PCR or the like using the base sequence disclosed by the present invention.
本発明の有機アニオントランスポーターは、動物の腎臓細胞などの本発明の遺伝子が発現している細胞から得ることもできるが、本発明の遺伝子を適当な発現ベクターに組み込んで、通常の遺伝子工学の手法により形質転換した細胞、たとえば大腸菌やＣＨＯ細胞などで発現させて、これを精製し、単離することにより製造することもできる。
また、本発明の有機アニオントランスポーター、又はその一部のアミノ酸配列を抗原として用いて、マウスやウサギなどの動物に感作させた後、これを定法に従って細胞融合法などにより抗体を製造することができる。抗体としてはポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体としてもよい。また、必要により、キメラ抗体やヒト型抗体に加工することもできる。
The organic anion transporter of the present invention can be obtained from a cell expressing the gene of the present invention, such as an animal kidney cell. It can also be produced by expressing in cells transformed by the technique, for example, E. coli or CHO cells, purifying and isolating the cells.
In addition, the organic anion transporter of the present invention or a part of the amino acid sequence thereof is used as an antigen to sensitize an animal such as a mouse or rabbit, and then an antibody is produced by a cell fusion method or the like according to a conventional method. Can do. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. If necessary, it can be processed into a chimeric antibody or a human antibody.
本発明は、前記した本発明の遺伝子にハイブリダイズし得る塩基配列を有する１０〜１５０塩基からなるオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のオリゴヌクレオチドの長さとしては、特に制限はなく、前記した本発明の遺伝子の検出や同定や定量に利用できるのに充分な長さを有するものであればよい。好ましい長さとしては、１０〜１５０塩基、１０〜１００塩基、１０〜３０塩基、１５〜３０塩基程度が挙げられるがこれに限定されるものではない。本発明のオリゴヌクレオチドは、通常の放射性元素や蛍光物質や化学発光物質などを用いて標識化を行ってプローブとして利用することもできるし、てきとうな長さのものを使用してＰＣＲなどのプライマーとして利用することができる。 The present invention provides an oligonucleotide consisting of 10 to 150 bases having a base sequence capable of hybridizing to the gene of the present invention described above. There is no restriction | limiting in particular as the length of the oligonucleotide of this invention, What is necessary is just to have sufficient length that it can utilize for the detection, identification, and quantification of the gene of this invention mentioned above. Preferred lengths include, but are not limited to, 10 to 150 bases, 10 to 100 bases, 10 to 30 bases, and 15 to 30 bases. The oligonucleotide of the present invention can be used as a probe by labeling with a normal radioactive element, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, etc. It can be used as a primer.
本発明は、前記した本発明の遺伝子の発現を検出又は同定する方法を提供するものである。本発明の遺伝子を検出、同定又は定量する方法としては、前記した本発明のオリゴヌクレオチドによるプローブを使用してもよいし、プライマーとしてＰＣＲ法などにより増幅して行うこともできる。またアンチセンス鎖を用いてＲＮＡのみを検出、同定することもできる。また、前記した本発明の有機アニオントランスポーターに対する抗体を用いて、蛋白質を検出、同定することもできる。 The present invention provides a method for detecting or identifying the expression of the gene of the present invention described above. As a method for detecting, identifying or quantifying the gene of the present invention, the above-described probe using the oligonucleotide of the present invention may be used, or amplification may be performed by PCR or the like as a primer. Moreover, only RNA can also be detected and identified using an antisense strand. Moreover, a protein can also be detected and identified using the antibody with respect to the organic anion transporter of this invention mentioned above.
本発明は、本発明の有機アニオントランスポーターをコードするヒトの遺伝子で形質転換されたヒト以外の細胞を提供するものである。形質転換される細胞（宿主細胞）としては、大腸菌や酵母などの微生物細胞や、ＣＨＯやサルなどの動物細胞を使用することができる。また、永久細胞株（permanent cell line）としてＭＤＣＫを使用することもできる。
この場合のプロモーターとしては、ヒトゲノムからのプロモーターをそのまま使用することもできるが、他のプロモーターを使用することもできる。本発明の遺伝子は胎児期や癌化により発現すると考えられることから、本発明の他が常に発現している細胞を得ようとする場合には、ゲノムからのものではなく他の発現用のプロモーターを使用するほうが好ましい。
本発明は、このようにして形質転換され、安定に本発明の有機アニオントランスポーターを発現する動物細胞株を提供するものである。このような動物細胞としては、永久細胞株（permanent cell line）としてＭＤＣＫ（Madin-Darby canine kidney）を挙げることができる。
本発明は、前記した本発明の遺伝子が発現している細胞に、被検物質を接触させて、被検物質の当該細胞への取り込みを測定する方法を提供する。この方法における本発明の遺伝子が発現している細胞としてはヒト癌細胞などの動物の癌細胞を使用することができるが、前記した形質転換細胞を使用することもできる。この方法としては、取り込み量を測定できる方法であれば特に制限はないが、被検物質を放射性元素などで標識化し、標識化された被検物質を本発明の遺伝子が発現している細胞に接触させて、細胞内の被検物質の量を定量して行うことができる。
The present invention provides a non-human cell transformed with a human gene encoding the organic anion transporter of the present invention. As cells to be transformed (host cells), microbial cells such as E. coli and yeast, and animal cells such as CHO and monkeys can be used. Moreover, MDCK can also be used as a permanent cell line.
As a promoter in this case, a promoter from the human genome can be used as it is, but other promoters can also be used. Since the gene of the present invention is considered to be expressed by fetal stage or canceration, when trying to obtain a cell in which the other of the present invention is always expressed, it is not from the genome but another promoter for expression. Is preferred.
The present invention provides an animal cell line transformed as described above and stably expressing the organic anion transporter of the present invention. Examples of such animal cells include MDCK (Madin-Darby canine kidney) as a permanent cell line.
The present invention provides a method for measuring the uptake of a test substance into the cell by bringing the test substance into contact with a cell expressing the gene of the present invention. Animal cells such as human cancer cells can be used as the cells expressing the gene of the present invention in this method, but the above-mentioned transformed cells can also be used. The method is not particularly limited as long as it can measure the amount of uptake, but the test substance is labeled with a radioactive element or the like, and the labeled test substance is applied to the cell expressing the gene of the present invention. The amount of the test substance in the cell can be quantified by contacting.
本発明は、前記した本発明の遺伝子が発現している細胞に、被検物質を接触させて、被検物質の当該細胞への取り込みを測定することからなる当該細胞への取り込み量の多い物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は前記した検出、同定する方法と同様な手段で行うことができる。また、この場合の被検物質としては抗癌剤の候補物質であるのが好ましいが、これに限定されるものではない。
本発明の有機アニオントランスポーターは、腎臓細胞に特異的に発現しているものであることを特徴にしている。したがって、本発明の有機アニオントランスポーターによってのみ特異的に取り込まれる物質をスクリーニングすることができれば、当該物質の腎臓での代謝過程を検討することができる。
また、前記した本発明の安定発現動物細胞株を用いることにより、被検物質の腎臓における本発明の有機アニオントランスポーターを介した薬物の排泄経路、腎毒性、及び／又は腎臓における薬物相互作用を、インビトロで検定することができ、薬物などの物質の腎臓での挙動を解明することが可能となる。本発明の有機アニオントランスポーターは、ヒト以外の動物にも発現していることから、ヒト以外の動物に当該動物の遺伝子を挿入して、本発明の有機アニオントランスポーターを強制的に発現させて、生体における被検物質の腎臓における本発明の有機アニオントランスポーターを介した薬物の再吸収と排泄経路、腎毒性、及び／又は腎臓における薬物相互作用を、インビボで検定することも可能となる。
したがって、本発明は、このような実験動物を提供するものでもある。
The present invention relates to a substance having a large amount of uptake into the cell comprising contacting the test substance with a cell expressing the gene of the present invention and measuring the uptake of the test substance into the cell. A method for screening is provided. This method can be performed by the same means as the detection and identification method described above. In this case, the test substance is preferably a candidate substance for an anticancer agent, but is not limited thereto.
The organic anion transporter of the present invention is characterized in that it is specifically expressed in kidney cells. Therefore, if a substance specifically taken up only by the organic anion transporter of the present invention can be screened, the metabolic process of the substance in the kidney can be examined.
In addition, by using the above-described stable expression animal cell line of the present invention, the excretion route of the drug via the organic anion transporter of the present invention in the kidney of the test substance, nephrotoxicity, and / or drug interaction in the kidney. It can be assayed in vitro, and the behavior of a substance such as a drug in the kidney can be elucidated. Since the organic anion transporter of the present invention is also expressed in animals other than humans, the gene of the animal is inserted into a non-human animal to forcibly express the organic anion transporter of the present invention. The reabsorption and excretion route of the drug via the organic anion transporter of the present invention in the kidney of the test substance in the living body, nephrotoxicity, and / or drug interaction in the kidney can be assayed in vivo.
Therefore, the present invention also provides such a laboratory animal.
また、本発明の有機アニオントランスポーターの遺伝子をヒトに導入して、ヒト腎臓に特異的に本発明の有機アニオントランスポーターを発現させて、当該有機アニオントランスポーターを介して薬物の再吸収や排泄を促進させることが可能となる。したがって、本発明は、前記した本発明の遺伝子を含有するキャリアー、及び製薬上許容される担体を含有してなる薬物の代謝を促進するための医薬組成物を提供するものである。当該キャリアーとしては、遺伝子治療に通常使用されるウイルスやベクターなどが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、遺伝子を導入することにより、腎臓からの排泄を促進するものであり、過剰に投与された薬物の排泄のみならず、毒物の排泄を促進する解毒剤的な使用をすることもできる。
In addition, the organic anion transporter gene of the present invention is introduced into a human, the organic anion transporter of the present invention is expressed specifically in the human kidney, and the reabsorption and excretion of the drug through the organic anion transporter. Can be promoted. Therefore, the present invention provides a pharmaceutical composition for promoting metabolism of a drug comprising the carrier containing the gene of the present invention described above and a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of the carrier include viruses and vectors usually used for gene therapy.
The pharmaceutical composition of the present invention promotes excretion from the kidney by introducing a gene, and is used not only for excretion of an excessively administered drug but also as an antidote for promoting excretion of a toxic substance. You can also
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
実施例１ （ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１の単離）
ＬＳＴ−２の塩基配列をもとにＥＳＴデータベース検索を行い、ＢＦ９００２２５という部分配列（４１１ｂｐ）を得、この配列をもとに作製したプライマーを用いて各種臓器のＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、腎臓に存在していることが明らかとなったので腎臓より得られたｃＤＮＡを用いて５’及び３’ＲＡＣＥ法を行った。これにより得られた塩基配列はシークエンスの結果、５’側の配列が欠けていることが予想されたので、５’ＲＡＣＥ産物である１８８１ｂｐ（コーディング領域の８ｂｐから１８８０ｂｐにあたる配列）をプロープとしてヒト腎臓ライブラリーを７０万個スクリーニングした。ハイブリダイゼーションは２５％ホルムアミド，４×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ，５×デンハルト溶液を用いて４２℃で一晩行った。洗浄は２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５０℃、６０分間行った。その結果、３０個程のクローンが得られ、そのうち１３個のシークエンスを行ったところ、７２４アミノ酸からなる新規トランスポーターの単離に成功した。
Example 1 (Isolation of human OATP-M1)
An EST database search was performed based on the base sequence of LST-2 to obtain a partial sequence (411 bp) called BF90025, and RT-PCR of various organs was performed using primers prepared based on this sequence. 5 'and 3' RACE methods were performed using cDNA obtained from the kidney. As a result of sequencing, it was predicted that the 5'-side sequence was lacking in the base sequence thus obtained, and therefore, the human kidney using the 5'RACE product 1881 bp (sequence corresponding to 8 bp to 1880 bp in the coding region) as a probe. 700,000 libraries were screened. Hybridization was performed overnight at 42 ° C. using 25% formamide, 4 × SSC, 1% SDS, 5 × Denhardt's solution. Washing was performed using 2 × SSC, 1% SDS at 50 ° C. for 60 minutes. As a result, about 30 clones were obtained, and 13 of them were sequenced. As a result, a novel transporter consisting of 724 amino acids was successfully isolated.
実施例２ （ラットｏａｔｐ−Ｍ１の単離）
上記ヒト腎臓ライブラリーをスクリーニングした同じフラグメントを用いて、ラットの腎臓ライブラリーを５０万個スクリーニングし、１８個ほどのクローンを得、またラットｏａｔｐ−Ｍ１の単離に成功した。
Example 2 (Isolation of rat oatp-M1)
Using the same fragment that screened the above human kidney library, 500,000 rat kidney libraries were screened to obtain about 18 clones, and rat oatp-M1 was successfully isolated.
実施例３ （ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１のノーザンブロット解析）
上記フラグメントを用い、５０％ホルムアミド，５×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、０．２×ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて５０℃で６０分間洗浄し、ノザンプロット解析を行った。その結果、主として腎臓、胎児では腎臓の他、肝臓、肺に発現することが明らかとなった。
この結果を図１に図面に代わる写真で示す。図中のβーアクチンは，ブロットを確認するためのコントロールであり、左側の数字は分子量（ｋｂ）を示す。
Example 3 (Northern blot analysis of human OATP-M1)
Using the above fragment, hybridization was performed overnight at 42 ° C. using 50% formamide, 5 × SSC, 1% SDS, and washed for 60 minutes at 50 ° C. using 0.2 × SSC, 1% SDS. Plot analysis was performed. As a result, it was revealed that in the kidney and fetus, it is expressed not only in the kidney but also in the liver and lung.
The results are shown in FIG. 1 with a photograph replacing the drawing. Β-actin in the figure is a control for confirming the blot, and the number on the left indicates the molecular weight (kb).
実施例４ （ラットｏａｔｐ−Ｍ１のノーザンブロット解析）
ラットｏａｔｐ−Ｍ１の全長を用いて上記ヒトノザンと同様にハイブリダイズを行い、ノザンブロット解析したところ、主として腎臓に発現していることが明らかとなった。
この結果を図２に図面に代わる写真で示す。図中のβーアクチンは，ブロットを確認するためのコントロールであり、左側の数字は分子量（ｋｂ）を示す。
Example 4 (Northern blot analysis of rat oatp-M1)
Hybridization was performed in the same manner as the above human Northern using the full length of rat oatp-M1, and Northern blot analysis revealed that it was mainly expressed in the kidney.
The result is shown in FIG. 2 with a photograph replacing the drawing. Β-actin in the figure is a control for confirming the blot, and the number on the left indicates the molecular weight (kb).
実施例５ （ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１を安定に発現する細胞株の構築）
ＯＡＴＰ−Ｍ１を強制発現させたＭＤＣＫ（Madin-Darby canine kidney）細胞を樹立するため、５’ＵＴＲを５ｂｐ，３’ＵＴＲを１３ｂｐ，ｃｏｄｉｎｇ２１７５ｂｐを含む２１９３ｂｐの配列を動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に入れた。これをＦｕＧＥＮＥ６を用いてＭＤＣＫ細胞にトランスフェクションした。遺伝子が入っている細胞のみがＧ４１８に耐性となるためＧ４１８を培地中に７５０μｇ／ｍＬの濃度で１０日間飼育および選択を行い２４個のＧ４１８耐性株を得た。これらの細胞から全ＲＮＡを抽出してノザンブロットを行った結果、３個のクローン（Ｃ５，１４，２３）がＭ１を発現していることがわかった。また、これらのクローンで基質のスクリーニングを行い、Ｔ３を最も運ぶのはクローンＣ１４であった。
この結果を図３に示す。図３の横軸は濃度（μＭ）を示し、縦軸は甲状腺ホルモン（Ｔ３）の取り込み量（ｐmol/mgタンパク質）を示す。黒丸部印は各測定点における平均値を示す。
Example 5 (Construction of a cell line stably expressing human OATP-M1)
In order to establish MDCK (Madin-Darby canine kidney) cells in which OATP-M1 is forcibly expressed, a sequence of 2193 bp including 5 bp of 5′UTR, 13 bp of 3′UTR, and 2175 bp of coding is put into an animal cell expression vector pcDNA3.1. It was. This was transfected into MDCK cells using FuGENE6. Since only the cells containing the gene are resistant to G418, G418 was bred and selected in a medium at a concentration of 750 μg / mL for 10 days to obtain 24 G418-resistant strains. As a result of extracting the total RNA from these cells and carrying out Northern blotting, it was found that three clones (C5, 14, 23) expressed M1. Also, these clones were screened for substrates, and clone C14 carried T3 most.
The result is shown in FIG. The horizontal axis in FIG. 3 indicates the concentration (μM), and the vertical axis indicates the thyroid hormone (T3) uptake (pmol / mg protein). A black circle mark indicates an average value at each measurement point.
実施例６ （ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１のナトリウム非依存性試験）
取り込みの作用機作を明らかとするために、ナトリウム非依存性試験を行った。即ち、まず、Ｎａ依存性をみるためにＮａＣｌをコリンＣｌに、ＮａＨＣＯ３を炭酸コリンに置換したクレブス−ヘンセレイト緩衝液（142mM NaCl,23.8mM Na２O３,4.83mM KCl, 0.96mM KH２PO４,1.20mM MgSO４,12.5mM HEPPS,5.0mM glucose, 1.53mM CaCl２, pH7.3）を用いて取り込み実験を行った。その結果、取り込みはナトリウム非依存的であることを確認した。
この結果を図４に示す。図４のＫＨはクレブス−ヘンセレイト緩衝液の場合を示し、Ｎａ（−）はコリンＣｌの場合を示し、Ｃｌ（−）は炭酸コリンの場合を示す。縦軸は取り込み量（Ｆmol/mgタンパク質）を示す。
Example 6 (Sodium-independent test of human OATP-M1)
A sodium-independent test was performed to clarify the mechanism of action of uptake. That is, first, in order to see the Na dependence, Krebs-Henseleit buffer (142 mM NaCl, 23.8 mM Na 2 O 3 , 4.83 mM KCl, 0.96 mM KH 2 PO) in which NaCl is replaced with choline Cl and NaHCO 3 is replaced with choline carbonate. 4 , 1.20 mM MgSO 4 , 12.5 mM HEPPS, 5.0 mM glucose, 1.53 mM CaCl 2 , pH 7.3). As a result, it was confirmed that the uptake was independent of sodium.
The result is shown in FIG. 4 shows the case of Krebs-Henseleit buffer, Na (−) shows the case of choline Cl, and Cl (−) shows the case of choline carbonate. The vertical axis represents the amount of uptake (Fmol / mg protein).
実施例７ （ヒトＯＡＴＰ−Ｍ１による薬物の取り込み試験）
クレブス−ヘンセレイト緩衝液を用いて３０分間前培養した後、ＲＩ化合物の入った緩衝液を加え３０分間取り込みをさせた。取り込みの停止は緩衝液の吸引後、冷コリン緩衝液＋１％ＢＳＡをことで行った。冷コリン緩衝液で３回以上洗浄し、２５０μｌの１Ｎ−ＮａＯＨで一晩細胞を溶解後、２５０μｌの水を加えそのうちの４００μｌでカウントした。残りは蛋白補正用として使用した。補正はバイオ−ラッドのプロテインアッセイキットを用いてＢＳＡを対照として行った。その結果、外因性化合物としてはジゴキシンにおいて取り込みが見られた。
ジゴキシンの取り込み結果を図５に示す。図５の横軸は濃度（μＭ）を示し、縦軸はジゴキシンの取り込み量（ｐmol/mgタンパク質）を示す。黒丸部印は各測定点における平均値を示す。
Example 7 (Drug uptake test with human OATP-M1)
After pre-incubating for 30 minutes with Krebs-Henseleit buffer, a buffer containing RI compound was added to allow uptake for 30 minutes. The uptake was stopped by aspirating the buffer solution followed by cold choline buffer solution + 1% BSA. After washing with cold choline buffer three times or more and lysing the cells overnight with 250 μl of 1N NaOH, 250 μl of water was added and counting was performed with 400 μl of them. The rest was used for protein correction. Correction was performed using a Bio-Rad protein assay kit with BSA as a control. As a result, uptake was observed in digoxin as an exogenous compound.
The results of digoxin uptake are shown in FIG. The horizontal axis in FIG. 5 indicates the concentration (μM), and the vertical axis indicates the digoxin uptake amount (pmol / mg protein). A black circle mark indicates an average value at each measurement point.
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