JP4101682B2

JP4101682B2 - How to determine when insects are mixed

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Publication number: JP4101682B2
Application number: JP2003072544A
Authority: JP
Inventors: 俊介福原; 和久安井; 利夫栗原
Original assignee: Sapporo Holdings Ltd
Current assignee: Sapporo Holdings Ltd
Priority date: 2003-03-17
Filing date: 2003-03-17
Publication date: 2008-06-18
Anticipated expiration: 2023-03-17
Also published as: JP2004279275A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビール・発泡酒、その他の飲料などの液体食品中に混入した虫類の混入時期を判定するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品メーカーにおいては、顧客から製品中にハエやゴキブリ等の虫類が混入している旨の苦情が寄せられることがある。この場合、その虫類が混入した時期、すなわち食品の製造工程中に混入したのか開封後に混入したのかを明確にすることは顧客の苦情に適切に対応する上で非常に重要である。従って、その虫類がいつ混入したかを判定するため、酵素学的ないくつかの方法が提案されている。そのうちの一つの方法としてアセチルコリンエステラーゼの残存活性により虫類の死亡時期を判定する方法が特許文献１に開示されている。
【０００３】
【特許文献１】
特開平８−５６６９６号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような従来の方法ではゴキブリ類のようにアセチルコリンエステラーゼ活性が低く、大きさにばらつきのある虫類の場合、正確な死亡時期判定が困難であった。また、この死亡時期判定方法は虫類の死亡した時期を判定するものであり、虫類の混入した時期を直接判定するものではないため、既に死亡した虫類が混入した場合には混入時期を正確に判定することはできないという問題もあった。
【０００５】
そこで、本発明は上記課題を解決し、液体食品に混入した虫類の混入時期を簡便に再現性よく判定する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、虫類が液体食品に浸漬された場合に虫類と液体食品との間で互いの各種含有成分が相互に拡散及び浸透し、平衡に達するまでは虫類体内において虫類中より液体食品中に多く含まれる所定成分は経時的に増加し、液体食品中より虫類中に多く含まれる所定成分は経時的に減少することに着目し、このような所定成分の虫類体内における経時的な変化とその虫類が浸漬されてからの経過期間との間に相関関係があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の虫類混入時期判定方法は、液体食品に混入した被検虫類中における所定の成分の含有量及び／又は所定の複数成分の組成比を測定する測定工程と、液体食品中に浸漬せしめた被検虫類と同種のサンプル虫類中の所定成分の含有量及び／又は所定の複数成分の組成比と、サンプル虫類を液体食品に浸漬してからの経過期間との間の予め得られている相関関係に基づいて、測定工程において得られた所定成分の含有量及び／又は所定の複数成分の組成比の測定値から被検虫類が液体食品に混入した時期を判定する判定工程と、を備え、所定の成分は、糖類及びアミノ酸からなる群から選択される少なくとも一つの成分であることを特徴とする。
【０００８】
上記虫類混入時期判定方法によれば、上記相関関係を予め求めておけば、同種の虫類が同種の液体食品に混入した場合にも、当該虫類中における所定成分の含有量及び／又は所定の複数成分の組成比を測定するだけで混入時期を簡便に再現性よく判定することができる。また、糖類、アミノ酸は液体食品中に多く含まれる成分であり、検出方法も比較的容易であるので虫類混入時期判定の指標として好適である。
【００１２】
また、本発明の虫類混入時期判定方法は、液体食品は麦芽アルコール飲料であり、所定の成分は糖類、アミノ酸、及びイソα酸からなる群から選択される少なくとも１つの成分であることを特徴としてもよい。
【００１３】
また、本発明の虫類混入時期判定方法は、測定工程において、被検虫類から抽出した抽出液の紫外線領域から可視光線領域の所定領域の吸収強度又は蛍光強度を測定し、得られた吸収強度又は蛍光強度に基づいて所定成分の含有量及び／又は所定の複数成分の組成比を求めることを特徴としてもよい。
【００１４】
また、本発明の虫類混入時期判定方法は、測定工程において、被検虫類から抽出した抽出液の紫外線領域から可視光線領域の所定領域の吸収スペクトル又は蛍光スペクトルを測定し、得られた吸収スペクトル又は蛍光スペクトルに基づいて所定成分の含有量及び／又は所定の複数成分の組成比を求めることを特徴としてもよい。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の虫類混入時期判定方法を適用可能な液体食品としては例えば麦芽アルコール飲料（例えば、ビール、発泡酒等）、清涼飲料、清酒、ウイスキー、焼酎、ワインがある。また、本発明の虫類混入時期判定方法を適用可能な虫類としては例えばゴキブリ類、ハエ類、クモ類等の一般的な虫類のみならず他の虫類についても適用が可能である。
【００１６】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１７】
（第１実施形態）
まず、本発明の虫類混入時期判定方法の第１の実施形態について説明する。本実施形態においては、まず液体食品に混入した被検虫類中の所定の成分の含有量及び／又は所定の複数成分の組成比を測定する（以下「測定工程」という）。
【００１８】
その際、前処理として液体食品に混入した虫類の体の一部又は全部（サンプル）から所定の溶媒を用いて成分を抽出し、虫類抽出液を作製する（以下「前処理工程」という）。体の一部としてはサンプルの重量や体積が再現性よく測定可能な肢を用いることが好ましい。また抽出溶媒としては水や有機溶媒（アルコール等）を用いることができる。水でゴキブリ類の肢の抽出液を抽出する場合は肢をホモジナイザーでホモジナイズし、室温で１〜２分程度抽出し、その上澄を抽出液とする。
【００１９】
次に上記作製した虫類抽出液中に含まれる所定成分の含有量及び／又は所定の複数成分の組成比を測定する。
【００２０】
上記所定成分としては、虫類に含まれている成分のうち虫類を浸漬せしめる液体食品に含まれていないもの（あるいは含有量が大幅に少ないもの）、又は逆に浸漬せしめる液体食品に含まれている成分のうち虫類には含まれていないもの（あるいは含有量が大幅に少ないもの）が測定対象となる。すなわち、液体食品に含まれる特有の成分（甘味料等）、逆に虫類に含まれる特有の成分が対象となる。
【００２１】
例えば、元々ビール等の麦芽アルコール飲料中には、酵母にとって難資化性のプロリン以外のアミノ酸は極めて低濃度である。このようなアミノ酸組成比の液体に虫類が浸漬された場合、虫類体内のアミノ酸組成比は麦芽アルコール飲料のそれに近似していき、プロリンの含量が相対的に多くなる。一方、虫類は、死後、体内で自己消化によりアミノ酸が生成されるが、その組成バランスは、例えば上記麦芽アルコール飲料のそれとは異なり、プロリンのみ他のアミノ酸に比べて多い組成比にはならない。このような虫類が浸漬した麦芽アルコール飲料では、虫体内からプロリン以外のアミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン等）が拡散していき、個々のアミノ酸の含量は増加し、プロリン含量が他の含有アミノ酸に比べて多いという傾向は変わらないものの含量の組成比が変化する可能性が考えられる。
【００２２】
麦芽アルコール飲料、蒸留酒に多く含まれる糖類としては、β−グルカン等のグルコースの多糖類がある。これらグルコースの多糖類は浸漬時間に応じて虫類の体内における濃度が高くなっていく。なお、このような糖類としては他にフルクトース、マルトース等も挙げられる。
【００２３】
虫類抽出液中に含まれる所定成分の含有量を測定する方法としては、既存の手法で高感度のものであればいずれの方法を用いてもよい。例えば上記糖類、アミノ酸については吸光光度法、蛍光光度法が好適である。これらの手法を用いることにより、所定成分の含有量を測定することができる。
【００２４】
所定の成分の含有量の算出方法としては例えば、所定波長のピーク強度又は所定波長のピーク強度の積分値を算出し、内部標準法によって含有量を算出する方法が好ましい。また、虫類個体のバラツキを補正するためにサンプルの単位重量当たりの含有量（以下「含有率」という）を算出することが好ましい。
【００２５】
所定の複数成分の組成比の算出方法としては例えば、上記の方法によって所定の複数成分の含有量を算出し含有量同士の比を算出する方法や所定の複数成分に対応するピークの強度又はピーク強度積分値の比を算出する方法がある。中でも後者の方法はサンプルの重量測定が不要となる点、内部標準物質を用いる必要がなくなる点でより簡便であり、好ましい。
【００２６】
続いて、上記測定した測定値から、予め得られている測定値と虫類が液体食品に浸漬されてからの経過期間（以下「浸漬期間」という）との相関関係に基づいて虫類が混入した時期を判定する（以下「判定工程」という）。
【００２７】
相関関係を求める方法としては、例えば以下のような方法がある。予め液体食品に所定期間浸漬せしめた虫類のサンプル（サンプル虫類）を作製する。上記測定工程によりサンプル虫類中の所定成分の含有量、含有率、又は所定の複数成分の組成比をさまざまな浸漬期間について求めておき、上記測定値と浸漬期間についてグラフ上にプロットすることによって浸漬期間とそれらの測定値との相関関係（検量線）を求めることができる。
【００２８】
上記のように求めた検量線に基づいて、液体食品へ混入時期が未知の被検虫類について上記測定値（虫類体内の所定成分の含有量、所定成分の含有率、所定複数成分の組成比）を求めることによって上記検量線に基づき、液体食品への浸漬期間を知ることができ、混入した時期を判定することができる。
【００２９】
（第２実施形態）
本発明の虫類混入時期判定方法の第２の実施形態について説明する。本実施形態においてはまず、液体食品中に混入した被検虫類から抽出した抽出液の吸収又は蛍光スペクトルを測定する（測定工程）。
【００３０】
まず、抽出液を作製する前処理工程については第１実施形態と同様に行う。次に、抽出液のスペクトルを測定する方法としては、紫外線領域から可視光線領域の吸収強度や蛍光強度を測定する方法が挙げられる。吸収スペクトルの中でも可視光吸収スペクトルを測定する方法は比較的安価な装置（分光光度計）によって比較的簡単に測定できるためより好ましい。
【００３１】
抽出液の所定成分の吸収あるいは蛍光スペクトルを測定することにより、そのスペクトル波形によって所定成分の含有量及び／又は所定の複数成分の組成比を判断することができる。また、測定したスペクトルのピーク強度あるいはそのピーク強度の積分値を算出することにより所定成分の含有量を判断することが可能となる。すなわち、上記測定した吸収又は蛍光スペクトル波形と、サンプル虫類を液体食品に浸漬してからの経過時間との間の予め得られている相関関係に基づいて得られる比較スペクトル波形とを比較して判断する。
【００３２】
続いて、上記測定した吸収又は蛍光スペクトルと、サンプル虫類を液体食品に浸漬してからの経過期間との間の予め得られている相関関係に基づいて、測定工程において得られたスペクトルから被検虫類が液体食品に混入した時期を判定する。相関関係としては、スペクトルの所定波長のピーク強度又はピーク強度積分値と浸漬期間との相関関係、あるいはスペクトルの波形と浸漬期間との相関関係を用いることが好ましい。
【００３３】
相関関係を求める方法としては例えば、以下のような方法がある。液体食品に所定期間浸漬せしめたサンプル虫類の抽出液を作製し、これらの虫類抽出液のスペクトルを測定する。その測定をさまざまな浸漬期間について行えば、ピーク強度又はピーク強度積分値と浸漬期間との相関関係、吸収又は蛍光スペクトルの波形と浸漬期間との相関関係を求めることができる。被検虫類についてのスペクトルと各サンプル虫類についてのピーク強度又はピーク強度積分値、波形とを比較することによって浸漬期間が未知の被検虫類について浸漬期間を知ることができる。
【００３４】
上記のように求めた吸光又は蛍光スペクトルと浸漬期間との相関関係に基づいて、液体食品への混入時期が未知の被検虫類について上記スペクトルを測定することによって上記相関関係に基づき、液体食品への浸漬期間を知ることができ、混入した時期を判定することができる。
【００３５】
予め上記のように得られた相関関係を用いれば、液体食品への混入時期が未知の虫類についても虫類の体内成分について測定値（虫類体内の所定成分の含有量、所定成分の含有率、所定複数成分の組成比）や可視吸収スペクトルの波形を求めることによって上記相関関係に基づき、液体食品への浸漬期間を知ることができ、混入した時期を判定することができる。
【００３６】
上記虫類混入時期判定方法によれば、虫類の死亡時期ではなく液体食品に浸漬されていた期間すなわち混入した時期を直接判定することができるため、既に死亡した虫類が混入した場合であっても正確な混入時期の判定が可能となる。また、混入した虫類の一部（例えば肢）があれば判定が可能であるので、虫類を大きく破壊する必要もなく試料の返却の要請にも応じることができる。
【００３７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
第１の実施例はビール中に混入したクロゴキブリから抽出した抽出液の可視光吸収スペクトルに基づき混入時期を判定する方法である。すなわち、抽出液中にアンスロン−硫酸試薬を加えて抽出液中のグルコースと呈色反応させ、可視光吸収スペクトルを測定した。以下、詳細に説明する。
【００３９】
（サンプルのクロゴキブリの作製）
クロゴキブリ（幼虫）はアース環境サービス株式会社より入手した体長１．５ｃｍ〜２ｃｍ程度のものを冷凍庫にて凍死させて用いた。大瓶のビールに死亡したクロゴキブリを１匹ずつ入れ、打栓して２０℃下で保存した。浸漬後１日後、４日後、１週間後、２週間後、４週間後、８週間後、１２週間後、２０週間後にそれぞれ３匹ずつ取り出してサンプルとした。また比較のためビールに浸漬させていないクロゴキブリ（対照サンプル）も作製した。死亡したクロゴキブリを粒状シリカゲルを入れたデシケータに入れ２０℃下で保存し、ビールに浸漬させたサンプルと同様の時期に取り出して対照サンプルとした。
【００４０】
（虫類抽出液の調製）
サンプルとなるクロゴキブリの肢をエッペンドルフチューブに取り、周りについている汚れなどを落とすために蒸留水で洗浄した。洗浄は中身が溶け出る恐れがあるので蒸留水を３回交換することで行った。次に減圧しながら半日程度乾燥させた。乾燥させたクロゴキブリの肢をサンプルとして採取し、その重量を精密天秤で測定した。次に操作中の組成の変化を防ぐために蒸留水を200μL加えて沸騰水浴で3分間煮沸して酵素類を失活させた。次にホモジナイザーで外骨格が粉々になるまで肢をホモジナイズした（ホモジナイザーはエッペンドルフチューブの中でホモジナイズできるタイプのものを用いた）。肢がよくホモジナイズされたら、10000×g程度で10分間遠心分離した。上澄を0.45μmのメンブランフィルターでろ過し、ろ液を虫類抽出液とした。
【００４１】
（アンスロン-硫酸試薬の調製）
95％硫酸5mLにアンスロン（和光純薬社）を10mg溶解したものを用いた。ただし、95％硫酸は保存可能であるが、アンスロンを95％硫酸に溶かした試薬は劣化してしまうので用時調整した。
【００４２】
（アンスロン-硫酸法による呈色及び測定）
調整した虫類抽出液50μLとアンスロン-硫酸試薬250μLを容量10mL程度のキャップ付き試験管に入れてよく混合し、軽く遠心して混合液を試験管の底に集めた。沸騰水浴中で10分間反応させ、あらかじめ用意しておいた氷水ですぐに冷却して反応を止め、分光光度計（日立製作所製U3310型分光光度計）を用いて400〜800nmの可視光の吸収スペクトルを測定した。
【００４３】
（混入時期の判定）
ビールに各期間浸漬せしめた各浸漬期間のそれぞれのクロゴキブリのサンプルについて上記測定を行うことによって各浸漬期間における可視光吸収スペクトルのデータが得られた。浸漬後１日後（図１（ａ））、４日後（図１（ｂ））、１週間後（図１（ｃ））、２週間後（図２（ａ））、４週間後（図２（ｂ））、８週間後（図２（ｃ））、１２週間後（図３（ａ））、２０週間後（図３（ｂ））のサンプルについての可視光吸収スペクトル測定結果を図に示した。また、比較のため、デシケータ中に保存した対照サンプルについてのスペクトル、及び２００倍希釈ビールのスペクトルを比較のために併せて示した。このようにしてクロゴキブリの浸漬期間と可視吸収スペクトル波形との相関関係を得ることができた。なお、各図のスペクトルデータは各期間のサンプル３匹の平均値を示したものであり、クロゴキブリ個体間のバラツキを無視できるように縦軸を肢の単位重量あたりの吸光度に補正して表示したものである。
【００４４】
浸漬期間と可視吸収スペクトルとの間には上記相関関係があることから、浸漬期間が未知のクロゴキブリについても可視光吸収スペクトルを測定しこれらのスペクトルデータの波形と比較することによって、浸漬期間を求めることができ、混入した時期を簡便に再現性よく判定することができた。
【００４５】
上記のように判定できる理由は以下のとおりである。クロゴキブリがビールに浸漬されるとクロゴキブリとビールとの間で互いの含有成分が相互に拡散及び浸透し、平衡に達するまではクロゴキブリ体内のビールの成分が時間の経過と共に増加し、クロゴキブリ体内の成分はビール成分に近づいていく。すなわちクロゴキブリ体内の糖組成はビールの糖組成（ほとんどがグルコース）に近づいていく。図４（ａ）は本実施例の測定方法によりグルコース１００ｐｐｍ溶液及びビールに浸漬されていないクロゴキブリサンプルの抽出液のスペクトルを測定したデータを示したものである。また図４（ｂ）はグルコース１００ｐｐｍ溶液及び２００倍希釈したビールのスペクトルを測定したデータを示したものである。図４（ａ）（ｂ）によれば、クロゴキブリ（ビールに浸漬されていないクロゴキブリ）の抽出液の可視光吸収スペクトルが６７０ｎｍ付近にピークを有するのに対し（図４（ａ））、ビールのスペクトル（グルコースのスペクトルとほぼ同じ波形）にはそのピークが無く５９０ｎｍ以上の波長域は緩やかに減少する波形となっている（図４（ｂ））。
【００４６】
すなわち、ビールに浸漬されていないクロゴキブリの抽出液はビール（グルコースとほぼ同じ）とは明らかに違う可視光吸収スペクトルの波形を示すことが分かる。また、ビールに浸漬されたクロゴキブリ抽出液のスペクトルは浸漬期間の経過とともにビールのスペクトルの波形に近づいていき、期間の経過とともに可視光吸収スペクトルの波形が推移していくため、浸漬期間が未知のクロゴキブリについて可視光吸収スペクトルの波形が予め得られている各浸漬期間のサンプルについてのスペクトル波形と比較することによって浸漬期間を求めることができる。
【００４７】
実施例２
第２の実施例はビール中に混入したクロゴキブリから抽出した抽出液中のアミノ酸の含有量に基づき混入時期を判定する方法である。抽出液中のアルギニン、ヒスチジン、グリシンの含有量をＨＰＬＣを用いて蛍光検出法によって分離・検出し、内部標準法による定量を行うことによって含有量を測定した。
【００４８】
（サンプルのクロゴキブリの作成）
第１の実施例と全く同様にクロゴキブリをビールに浸漬し、浸漬当日（６〜１０時間後）、１日後、４日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、６週間後、８週間後、１０週間後、１２週間後、１６週間後、２０週間後、３０週間後にそれぞれ４匹ずつ取り出し、サンプルとした。
【００４９】
（虫類抽出液の調整）
本実施例は虫類の単位体積当たりに含まれるアミノ酸の量を測定する必要があるため、サンプルから肢を取り出し、肢を洗浄・乾燥した後、ホモジナイズする前に肢の体積を測定した。まず、デジタルマイクロスコープ（キーエンス社VH-6300）を用いて肢の各関節間の長さ及び幅を測定した。各関節間について円柱形近似として体積を算出した。各部分が円柱形よりも扁平であることを考慮して求めた値の１／２を各部分の体積と仮定して肢の体積を近似的に求めた。その後は第１の実施例と全く同様に行い虫類抽出液を調整した。
【００５０】
（ＨＰＬＣによる測定）
虫類抽出液に含まれる各アミノ酸の分析は、ＨＰＬＣ（高精度液体クロマトグラフィ）を用いて行った。抽出液をＨＰＬＣを用いて分離、蛍光検出法によって検出し、内部標準法によりアミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、グリシン）の定量を行った。測定条件は以下のとおりである。
ＨＰＬＣ：Agilent1100,AminoQuant蛍光検出法（OPAおよびFMOC誘導体化，内部標準法）
カラム：Hypersil AA-ODS,5μm, 2.1×200mm
カラム温度：４０℃
【００５１】
【表１】

【００５２】
測定で得られた各アミノ酸の含有量及び測定した肢の体積より単位体積当たりの各アミノ酸の含有量を算出した。図５（ａ）はビールに浸漬されたクロゴキブリ体内の単位体積当たりのアルギニンの量、図５（ｂ）はヒスチジンの量、図５（ｃ）はグリシンの量の経時変化を示したものであり、横軸に浸漬期間、縦軸に肢の単位体積当りの含有モル数をプロットしたものである。それぞれの期間デシケータ中に保存した対照サンプルについての分析結果を比較のために併せて示した。このようにして、虫類がビールに浸漬されてからの浸漬期間と各アミノ酸の単位体積当たりの含有量との相関関係（検量線）を求めることができた。
【００５３】
浸漬期間と各アミノ酸含有量の間には上記相関関係があることから、浸漬期間が未知のクロゴキブリについても各アミノ酸含有量を測定し上記相関関係に基づいて、浸漬期間を求めることができ、混入した時期を簡便に再現性よく判定することができた。
【００５４】
上記のように判定できる理由は以下のとおりである。大気中に放置されたクロゴキブリの体内には自己消化によって各アミノ酸は比較的高い濃度で存在し、期間が経過してもあまり減少することはない（図５（ａ）（ｂ）（ｃ）中の対照サンプルのデータ参照）。しかし、クロゴキブリがビールに浸漬された場合には、周囲のビール中の遊離アミノ酸（酵母にとって難資化性のプロリン以外）は低濃度であるため、クロゴキブリ体内の各アミノ酸は時間の経過とともにビール中に拡散して失われ、クロゴキブリ体内の各アミノ酸含有量は少なくなっていく。例えば、本実施例によれば、ビールに浸漬されてから２週間程度でクロゴキブリ体内の単位体積当たりの各アミノ酸の量は１０ｐｍｏｌ／ｍｍ³以下になることがわかる。逆に各アミノ酸の量が１０ｐｍｏｌ／ｍｍ³以下であれば浸漬後２週間以上経過していると判定することができる。例えば、封印された液体食品（例えばビール・発泡酒など）の場合は、封印から開栓までの間に虫類が混入する可能性がないため、虫類浸漬後２週間以上経過していると判定された場合は開栓後ではなく製造工程中に混入したものと判定することができる。
【００５５】
実施例３
第３の実施例はビール中に混入したクロゴキブリから抽出した抽出液中のアミノ酸の組成比に基づき混入時期を判定する方法である。抽出液中のアルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、プロリンの含有量をＨＰＬＣを用いて分離、蛍光検出法によって検出し、内部標準法による定量を行うことによって含有量を測定した。また、測定した含有量からセリンとプロリンの組成比、グリシンとプロリンの組成比、アルギニンとプロリンの組成比を算出した。
【００５６】
（サンプルのクロゴキブリの作成）
第２の実施例と全く同様に行った。
（虫類抽出液の調整）
第２の実施例と全く同様に行った。但し、肢の体積を測定する工程は不要であるため省略した。
（ＨＰＬＣによる測定）
虫類抽出液に含まれるアミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、プロリン）の分析は、第２実施例と全く同様にして、ＨＰＬＣ（高精度液体クロマトグラフィ）を用いて行った。得られたそれぞれのアミノ酸の含有量からセリンとプロリンの組成比、グリシンとプロリンの組成比、アルギニンとプロリンの組成比を算出した。
【００５７】
図６（ａ）はビールに浸漬させたクロゴキブリ肢中のセリンとプロリンのモル比、図６（ｂ）はグリシンとプロリンのモル比、図６（ｃ）はアルギニンとプロリンのモル比の経時変化を示したものであり、横軸に浸漬期間、縦軸にモル比をプロットした。なお、比較のため各期間デシケータ中に保存した対照サンプルについてのデータを併せて示した。このようにして、虫類のビールへの浸漬期間と各アミノ酸の組成比との相関関係（検量線）を求めることができた。
【００５８】
浸漬期間と各アミノ酸組成比の間には上記相関関係があることから、浸漬期間が未知のクロゴキブリについてもアミノ酸組成比を測定し上記相関関係に基づいて、浸漬期間を求めることができ、混入した時期を簡便に再現性よく判定することができた。
【００５９】
上記のように判定できる理由は以下のとおりである。ビール中には酵母に資化されにくいアミノ酸であるプロリンが多く残存しているが他のアミノ酸（例えばセリン、グリシン、アルギニン）は極微量であり、ビールのアミノ酸はプロリンに富む組成となっている。一方、死亡したクロゴキブリの体内には自己消化によりアミノ酸が生成され、その組成は各他のアミノ酸とプロリンとの組成比が１〜２程度となっている。死亡したクロゴキブリが大気中にある場合には期間が経過しても組成比はあまり変化することはない（図６（ａ）（ｂ）（ｃ）中の対照サンプルのデータ参照）。しかし、クロゴキブリがビールに浸漬されると、ビールの成分がクロゴキブリ体内に浸透・拡散し、クロゴキブリ体内のアミノ酸組成がビールのアミノ酸組成に近づいていき、プロリンに対する各アミノ酸の組成比は次第に小さくなっていく。例えば本実施例によれば、浸漬されてから２週間程度でクロゴキブリ体内の各他のアミノ酸とプロリンとの組成比は０．５以下になることがわかる。逆に組成比が０．５であれば浸漬後２週間以上経過していると判定することができる。封印された液体食品（例えばビール・発泡酒など）の場合は、封印から開栓までの間に虫類が混入する可能性がないため、虫類浸漬後２週間以上経過していると判定された場合は開栓後ではなく製造工程中に混入したものと判定することができる。
【００６０】
【発明の効果】
本発明によれば、液体食品に混入した虫類の混入時期を簡便に再現性よく判定する方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、ビール（２００倍希釈）、ビールに所定期間浸漬したサンプル、対照サンプルについての可視吸光スペクトルを示すグラフである。
【図２】（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、ビール（２００倍希釈）、ビールに所定期間浸漬したサンプル、対照サンプルについての可視吸光スペクトルを示すグラフである。
【図３】（ａ）、（ｂ）は、ビール（２００倍希釈）、ビールに所定期間浸漬したサンプル、対照サンプルについての可視吸光スペクトルを示すグラフである。
【図４】（ａ）、（ｂ）は、ビール（２００倍希釈）、ビールに所定期間浸漬したサンプル、対照サンプルについての可視吸光スペクトルを示すグラフである。
【図５】ビールに所定期間浸漬したサンプル及び対照サンプルの各アミノ酸の含有量を示したデータであり、（ａ）はアルギニン、（ｂ）はヒスチジン、（ｃ）はグリシンの含有量を示す。
【図６】ビールに所定期間浸漬したサンプル及び対照サンプルの各アミノ酸の組成比を示したデータであり、（ａ）はプロリンに対するセリン、（ｂ）はプロリンに対するグリシン、（ｃ）はプロリンに対するアルギニンの組成比を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for determining the mixing time of insects mixed in liquid food such as beer, happoshu and other beverages.
[0002]
[Prior art]
In food manufacturers, customers may complain that insects such as flies and cockroaches are mixed in their products. In this case, it is very important to clarify when the insects are mixed, that is, whether they are mixed during the manufacturing process of the food or after the opening, in order to appropriately respond to customer complaints. Therefore, several enzymatic methods have been proposed to determine when the reptile is contaminated. As one of the methods, Patent Document 1 discloses a method for determining the death time of an insect by the residual activity of acetylcholinesterase.
[0003]
[Patent Document 1]
JP-A-8-56696
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, such conventional methods have a low acetylcholinesterase activity, such as cockroaches, and it has been difficult to accurately determine the time of death in the case of reptiles that vary in size. In addition, this death time determination method is to determine the time when the reptile died, not directly determine the time when the reptile was mixed. There was also a problem that it could not be judged.
[0005]
Then, this invention solves the said subject and aims at providing the method of determining easily the mixing time of the insect mixed in the liquid food with sufficient reproducibility.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
When the reptile is immersed in a liquid food, the inventor diffuses and infiltrates each other's various components between the reptile and the liquid food. Paying attention to the fact that the predetermined components contained in foods increase with time, and the predetermined components contained more in insects than in liquid foods decrease over time. The present invention has been completed by finding that there is a correlation between the actual change and the elapsed time since the insect was immersed.
[0007]
That is, the method for determining the timing of insect contamination according to the present invention is performed in a test insect mixed in a liquid food.InA measuring step for measuring a content of a predetermined component and / or a composition ratio of a plurality of predetermined components, and a content of a predetermined component in a sample insect of the same kind as a test insect immersed in a liquid food and / or The content of the predetermined component obtained in the measurement step based on the correlation obtained in advance between the composition ratio of the predetermined plural components and the elapsed time since the sample reptile was immersed in the liquid food And / or a determination step of determining when the test insects are mixed into the liquid food from the measured values of the composition ratio of a plurality of predetermined components.The predetermined component is at least one component selected from the group consisting of saccharides and amino acids..
[0008]
According to the method for determining the insect contamination time, if the correlation is obtained in advance, even when the same kind of insects are mixed in the same kind of liquid food,In the wormBy simply measuring the content of the predetermined component and / or the composition ratio of the predetermined plural components, the mixing time can be easily determined with good reproducibility.In addition, saccharides and amino acids are components that are contained in a large amount in liquid foods, and the detection method is relatively easy.
[0012]
Also, in the method for determining the insect contamination time of the present invention, the liquid food is a malt alcoholic beverage, and the predetermined component is at least one component selected from the group consisting of sugars, amino acids, and isoalpha acids. It is good.
[0013]
In addition, the method for determining the insect contamination time of the present invention includes measuring the absorption intensity or fluorescence intensity in a predetermined region from the ultraviolet region to the visible light region of the extract extracted from the test insect in the measurement step, and obtaining the obtained absorption The content of the predetermined component and / or the composition ratio of the predetermined plural components may be obtained based on the intensity or the fluorescence intensity.
[0014]
In addition, the method for determining the time of insect contamination according to the present invention includes measuring the absorption spectrum or fluorescence spectrum in a predetermined region from the ultraviolet region to the visible light region of the extract extracted from the test insect in the measurement step, and obtaining the obtained absorption The content of the predetermined component and / or the composition ratio of the predetermined plural components may be obtained based on the spectrum or the fluorescence spectrum.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of liquid foods to which the method for determining the insect contamination time of the present invention is applicable include malt alcoholic beverages (for example, beer and sparkling liquor), soft drinks, sake, whiskey, shochu, and wine. In addition, the insects applicable to the method for determining the insect contamination time of the present invention can be applied not only to general insects such as cockroaches, flies and spiders but also to other insects.
[0016]
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail.
[0017]
(First embodiment)
First, a first embodiment of the method for determining the insect contamination time according to the present invention will be described. In this embodiment, first, the content of a predetermined component and / or the composition ratio of a plurality of predetermined components in the test insect mixed in the liquid food is measured (hereinafter referred to as “measurement step”).
[0018]
At that time, components are extracted from a part or all of the worm body mixed in the liquid food as a pretreatment using a predetermined solvent to prepare a worm extract (hereinafter referred to as “pretreatment step”). ). It is preferable to use a limb that can measure the weight and volume of the sample with good reproducibility as a part of the body. Moreover, water or an organic solvent (alcohol etc.) can be used as an extraction solvent. When extracting a cockroach limb extract with water, the limb is homogenized with a homogenizer, extracted at room temperature for about 1 to 2 minutes, and the supernatant is used as the extract.
[0019]
Next, the content of the predetermined component and / or the composition ratio of the predetermined plural components contained in the prepared insect extract are measured.
[0020]
Among the components contained in the reptile, the above-mentioned predetermined component is not contained in the liquid food in which the reptile is immersed (or the content is significantly low), or conversely included in the liquid food in which the reptile is immersed. Among the components that are not included in the reptiles (or those that have a significantly low content) are the measurement targets. That is, specific components (such as sweeteners) contained in liquid foods, and conversely, specific components contained in reptiles are targeted.
[0021]
For example, in malt alcoholic beverages such as beer, amino acids other than proline, which are difficult for yeast, are extremely low in concentration. When a reptile is immersed in a liquid having such an amino acid composition ratio, the amino acid composition ratio in the reptile body approximates that of a malt alcoholic beverage, and the proline content is relatively increased. On the other hand, after death, amino acids are produced by self-digestion in the body after death, but the composition balance is different from that of the malt alcoholic beverage, for example, and proline alone does not have a higher composition ratio than other amino acids. In malt alcoholic beverages immersed in such insects, amino acids other than proline (arginine, histidine, glycine, serine, etc.) diffuse from the insect body, the content of individual amino acids increases, and the proline content of other There is a possibility that the composition ratio of the content may change although the tendency to be higher than the contained amino acid does not change.
[0022]
Examples of sugars contained in a large amount of malt alcoholic beverages and distilled spirits include glucose polysaccharides such as β-glucan. These polysaccharides of glucose become higher in the body of the reptile according to the immersion time. Other examples of such sugars include fructose and maltose.
[0023]
As a method for measuring the content of the predetermined component contained in the insect extract, any method may be used as long as it is a highly sensitive one using an existing method. For example, the absorptiometric method and the fluorometric method are suitable for the above saccharides and amino acids. By using these techniques, the content of the predetermined component can be measured.
[0024]
As a method for calculating the content of the predetermined component, for example, a method of calculating a peak intensity at a predetermined wavelength or an integrated value of the peak intensity at a predetermined wavelength and calculating the content by an internal standard method is preferable. In addition, it is preferable to calculate the content per unit weight of the sample (hereinafter referred to as “content ratio”) in order to correct the variation of individual insects.
[0025]
Examples of the method for calculating the composition ratio of a plurality of predetermined components include, for example, a method for calculating the content of a plurality of predetermined components by the above method and calculating the ratio between the contents, and the intensity or peak of a peak corresponding to the predetermined plurality of components There is a method for calculating a ratio of intensity integrated values. Among these, the latter method is preferable because it does not require the weight measurement of the sample and eliminates the need to use an internal standard.
[0026]
Subsequently, worms are mixed based on the correlation between the measurement value obtained in advance and the elapsed time since the insect was immersed in the liquid food (hereinafter referred to as “immersion period”). Is determined (hereinafter referred to as “determination step”).
[0027]
As a method for obtaining the correlation, for example, there are the following methods. A sample of insects (sample insects) that has been previously immersed in a liquid food for a predetermined period is prepared. By determining the content of the predetermined component in the sample reptile, the content ratio, or the composition ratio of the predetermined multiple components for various immersion periods by the measurement step, and plotting the measured value and the immersion period on a graph The correlation (calibration curve) between the immersion period and the measured values can be obtained.
[0028]
Based on the calibration curve obtained as described above, the above measured values (content of the predetermined component in the worm body, content ratio of the predetermined component, composition of the predetermined plural components) for the test insect whose mixing time is unknown in the liquid food By calculating the ratio, it is possible to know the period of immersion in the liquid food based on the calibration curve, and to determine the time of mixing.
[0029]
(Second Embodiment)
A second embodiment of the method for determining the insect contamination time according to the present invention will be described. In this embodiment, first, the absorption or fluorescence spectrum of the extract extracted from the test insect mixed in the liquid food is measured (measurement step).
[0030]
First, the pretreatment process for producing the extract is performed in the same manner as in the first embodiment. Next, as a method of measuring the spectrum of the extract, a method of measuring the absorption intensity or fluorescence intensity from the ultraviolet region to the visible light region can be mentioned. Among absorption spectra, a method for measuring a visible light absorption spectrum is more preferable because it can be measured relatively easily with a relatively inexpensive apparatus (spectrophotometer).
[0031]
By measuring the absorption or fluorescence spectrum of a predetermined component of the extract, the content of the predetermined component and / or the composition ratio of a plurality of predetermined components can be determined from the spectrum waveform. Further, the content of the predetermined component can be determined by calculating the peak intensity of the measured spectrum or the integrated value of the peak intensity. That is, by comparing the measured absorption or fluorescence spectrum waveform with the comparative spectrum waveform obtained based on the correlation obtained in advance between the elapsed time since the sample insect was immersed in the liquid food. to decide.
[0032]
Subsequently, on the basis of the correlation obtained in advance between the measured absorption or fluorescence spectrum and the elapsed time since the sample insect was immersed in the liquid food, Determining when the worms were mixed into the liquid food. As the correlation, it is preferable to use the correlation between the peak intensity at a predetermined wavelength of the spectrum or the integrated value of the peak intensity and the immersion period, or the correlation between the waveform of the spectrum and the immersion period.
[0033]
As a method for obtaining the correlation, for example, there are the following methods. Sample insect extracts extracted from liquid food for a predetermined period are prepared, and the spectra of these insect extracts are measured. If the measurement is performed for various immersion periods, the correlation between the peak intensity or the peak intensity integral value and the immersion period, and the correlation between the absorption or fluorescence spectrum waveform and the immersion period can be obtained. By comparing the spectrum of the test insects with the peak intensity or peak intensity integrated value and waveform of each sample insect, the immersion period can be known for the test insects whose immersion period is unknown.
[0034]
Based on the correlation between the absorption or fluorescence spectrum obtained as described above and the immersion period, the liquid food is based on the correlation by measuring the spectrum for the test insects whose mixing time in the liquid food is unknown. The soaking period can be known, and the mixed time can be determined.
[0035]
If the correlation obtained in advance as described above is used, the measured values of the in vivo components of the reptiles (including the content of the predetermined components and the content of the predetermined components) of the reptiles are also unknown for the liquid food. By determining the rate, the composition ratio of a plurality of predetermined components) and the waveform of the visible absorption spectrum, the immersion period in the liquid food can be known based on the above correlation, and the mixing time can be determined.
[0036]
According to the method for determining the insect contamination time, it is possible to directly determine the period of immersion in liquid food, that is, the period of contamination, rather than the insect death time. However, it is possible to accurately determine the mixing time. In addition, since it is possible to determine if there is a part of the mixed insects (for example, limbs), it is not necessary to greatly destroy the insects, and it is possible to respond to a request to return the sample.
[0037]
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated more concretely based on an Example, this invention is not limited to a following example.
[0038]
Example 1
The first embodiment is a method for determining the mixing time based on the visible light absorption spectrum of the extract extracted from black cockroaches mixed in beer. That is, an anthrone-sulfuric acid reagent was added to the extract to cause a color reaction with glucose in the extract, and a visible light absorption spectrum was measured. Details will be described below.
[0039]
(Preparation of sample black cockroach)
The black cockroach (larvae) obtained from Earth Environment Service Co., Ltd. was used with a body length of about 1.5 cm to 2 cm frozen in a freezer. The black cockroaches that died in the large beer were put one by one, stoppered and stored at 20 ° C. One sample was taken out after 1 day, 4 days, 1 week, 2 weeks, 4 weeks, 8 weeks, 12 weeks, and 20 weeks after immersion. For comparison, a black cockroach (control sample) not immersed in beer was also produced. The dead black cockroach was placed in a desiccator containing granular silica gel, stored at 20 ° C., and taken out at the same time as the sample immersed in beer to serve as a control sample.
[0040]
(Preparation of insect extract)
The limb of the black cockroach as a sample was taken in an Eppendorf tube and washed with distilled water to remove the dirt on the surroundings. Washing was performed by exchanging distilled water three times because the contents might melt. Next, it was dried for about half a day under reduced pressure. The dried black-legged cockroach limb was taken as a sample and its weight was measured with a precision balance. Next, in order to prevent the change of the composition during the operation, 200 μL of distilled water was added and boiled in a boiling water bath for 3 minutes to deactivate the enzymes. Next, the limb was homogenized with a homogenizer until the exoskeleton was shattered (the homogenizer used was a type that can be homogenized in an Eppendorf tube). When the limbs were well homogenized, they were centrifuged at about 10,000 × g for 10 minutes. The supernatant was filtered through a 0.45 μm membrane filter, and the filtrate was used as an insect extract.
[0041]
(Preparation of anthrone-sulfuric acid reagent)
10 mg of Anthrone (Wako Pure Chemical Industries) dissolved in 5 mL of 95% sulfuric acid was used. However, 95% sulfuric acid can be stored, but the reagent in which anthrone is dissolved in 95% sulfuric acid deteriorates.
[0042]
(Color and measurement by anthrone-sulfuric acid method)
50 μL of the adjusted worm extract and 250 μL of the anthrone-sulfuric acid reagent were put in a test tube with a cap of about 10 mL, mixed well, and lightly centrifuged to collect the mixed solution at the bottom of the test tube. React in a boiling water bath for 10 minutes, immediately cool with ice water prepared in advance to stop the reaction, and absorb visible light from 400 to 800 nm using a spectrophotometer (U3310 spectrophotometer manufactured by Hitachi, Ltd.) The spectrum was measured.
[0043]
(Judgment of mixing time)
The visible light absorption spectrum data in each immersion period was obtained by performing the above measurement on each black cockroach sample immersed in beer for each period. 1 day after immersion (FIG. 1 (a)), 4 days (FIG. 1 (b)), 1 week (FIG. 1 (c)), 2 weeks (FIG. 2 (a)), 4 weeks later (FIG. 2) (B)) After 8 weeks (FIG. 2 (c)), 12 weeks (FIG. 3 (a)), and 20 weeks later (FIG. 3 (b)), the visible light absorption spectrum measurement results are shown in the figure. Indicated. For comparison, a spectrum of a control sample stored in a desiccator and a spectrum of 200-fold diluted beer are also shown for comparison. Thus, the correlation between the black cockroach immersion period and the visible absorption spectrum waveform could be obtained. The spectral data in each figure shows the average value of three samples in each period, and the vertical axis is corrected to the absorbance per unit weight of the limb so that the variation between black cockroach individuals can be ignored. It is a thing.
[0044]
Since there is the above correlation between the immersion period and the visible absorption spectrum, we measured the visible light absorption spectrum for black cockroaches with an unknown immersion period and compared them with the waveform of these spectral data. It was possible to determine the time of mixing easily and with good reproducibility.
[0045]
The reason why it can be determined as described above is as follows. When the black cockroach is immersed in beer, the components contained in the black cockroach and the beer mutually diffuse and penetrate each other, and until the equilibrium is reached, the components of the beer in the black cockroach increase over time. The ingredients in the cockroaches approach the beer ingredients. That is, the sugar composition in black cockroaches approaches the sugar composition of beer (mostly glucose). FIG. 4 (a) shows data obtained by measuring the spectrum of a 100 ppm glucose solution and a black cockroach sample extract not immersed in beer by the measurement method of this example. FIG. 4 (b) shows data obtained by measuring the spectrum of a 100 ppm glucose solution and 200-fold diluted beer. According to FIGS. 4 (a) and 4 (b), the visible light absorption spectrum of the black liquor (black roach not immersed in beer) extract has a peak near 670 nm (FIG. 4 (a)), There is no peak in the spectrum of beer (the waveform that is almost the same as the spectrum of glucose), and the waveform has a waveform that gradually decreases in the wavelength region of 590 nm or more (FIG. 4B).
[0046]
That is, it can be seen that the black cockroach extract not immersed in beer has a visible light absorption spectrum waveform that is clearly different from beer (almost the same as glucose). In addition, the spectrum of black cockroach extract soaked in beer approaches the waveform of the spectrum of beer as the soaking period progresses, and the waveform of the visible light absorption spectrum changes over time, so the soaking period is unknown For the black cockroach, the immersion period can be determined by comparing the waveform of the visible light absorption spectrum with the spectral waveform of the sample for each immersion period.
[0047]
Example 2
The second embodiment is a method for determining the mixing time based on the content of amino acids in the extract extracted from black cockroaches mixed in beer. The contents of arginine, histidine, and glycine in the extract were separated and detected by a fluorescence detection method using HPLC, and the contents were measured by quantification by an internal standard method.
[0048]
(Creating a sample black cockroach)
In the same manner as in the first example, black cockroaches were immersed in beer, and on the day of immersion (after 6 to 10 hours), 1 day, 4 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 6 Four weeks later, 8 weeks later, 10 weeks later, 12 weeks later, 16 weeks later, 20 weeks later, and 30 weeks later, 4 mice were taken out and used as samples.
[0049]
(Adjustment of insect extract)
In this example, since it is necessary to measure the amount of amino acids contained per unit volume of the reptile, the limb volume was measured before taking out the limb from the sample, washing and drying the limb, and before homogenizing. First, the length and width between each joint of the limb were measured using a digital microscope (Keyence VH-6300). The volume was calculated as a cylindrical approximation between each joint. The volume of the limb was approximately determined by assuming 1/2 of the value determined in consideration of the fact that each part is flatter than the cylindrical shape. Thereafter, the same procedure as in the first example was performed to prepare an insect extract.
[0050]
(Measurement by HPLC)
Analysis of each amino acid contained in the worm extract was performed using HPLC (high precision liquid chromatography). The extract was separated using HPLC, detected by a fluorescence detection method, and amino acids (arginine, histidine, glycine) were quantified by an internal standard method. The measurement conditions are as follows.
HPLC: Agilent 1100, AminoQuant fluorescence detection method (OPA and FMOC derivatization, internal standard method)
Column: Hypersil AA-ODS, 5μm, 2.1 x 200mm
Column temperature: 40 ° C
[0051]
[Table 1]

[0052]
The content of each amino acid per unit volume was calculated from the content of each amino acid obtained by measurement and the volume of the measured limb. Fig. 5 (a) shows the amount of arginine per unit volume in black beetle immersed in beer, Fig. 5 (b) shows the amount of histidine, and Fig. 5 (c) shows the change over time of the amount of glycine. Yes, the horizontal axis represents the immersion period, and the vertical axis represents the number of moles contained per unit volume of the limb. The analytical results for the control samples stored in the desiccator for each period are also shown for comparison. Thus, the correlation (calibration curve) between the immersion period after the insects were immersed in beer and the content per unit volume of each amino acid could be obtained.
[0053]
Since there is the above correlation between the soaking period and each amino acid content, the soaking period can be determined based on the above correlation by measuring each amino acid content even for black cockroaches whose soaking period is unknown, The mixing time could be easily judged with good reproducibility.
[0054]
The reason why it can be determined as described above is as follows. In the black cockroach left in the atmosphere, each amino acid is present in a relatively high concentration by autolysis and does not decrease so much over time (FIGS. 5A, 5B, and 5C). (See data for control sample in). However, when black cockroaches are immersed in beer, the free amino acids in the surrounding beer (except proline, which is difficult for yeast), are low in concentration. It diffuses into beer and is lost, and the content of each amino acid in the black cockroach is reduced. For example, according to the present example, the amount of each amino acid per unit volume in the black cockroach in about 2 weeks after being immersed in beer is 10 pmol / mm.^ThreeIt turns out that it becomes the following. Conversely, the amount of each amino acid is 10 pmol / mm^ThreeIf it is below, it can be determined that two weeks or more have passed since immersion. For example, in the case of sealed liquid foods (for example, beer, sparkling liquor, etc.), there is no possibility of insects mixing between the time of sealing and the opening of the bottle. When it is determined, it can be determined that it has been mixed during the manufacturing process rather than after opening.
[0055]
Example 3
The third embodiment is a method of determining the mixing time based on the composition ratio of amino acids in the extract extracted from black cockroach mixed in beer. The contents of arginine, histidine, glycine, serine and proline in the extract were separated using HPLC, detected by a fluorescence detection method, and the content was measured by quantification using an internal standard method. Moreover, the composition ratio of serine and proline, the composition ratio of glycine and proline, and the composition ratio of arginine and proline were calculated from the measured contents.
[0056]
(Creating a sample black cockroach)
The procedure was the same as in the second example.
(Adjustment of insect extract)
The procedure was the same as in the second example. However, the step of measuring the volume of the limb is not necessary because it is unnecessary.
(Measurement by HPLC)
Analysis of amino acids (arginine, histidine, glycine, serine, proline) contained in the insect extract was carried out using HPLC (high precision liquid chromatography) in the same manner as in the second example. The composition ratio of serine and proline, the composition ratio of glycine and proline, and the composition ratio of arginine and proline were calculated from the obtained content of each amino acid.
[0057]
Fig. 6 (a) is the molar ratio of serine and proline in black cockroach limbs immersed in beer, Fig. 6 (b) is the molar ratio of glycine and proline, and Fig. 6 (c) is the molar ratio of arginine and proline. The change is shown, with the horizontal axis plotting the immersion period and the vertical axis plotting the molar ratio. In addition, the data about the control sample preserve | saved in the desiccator for each period were also shown for the comparison. In this way, the correlation (calibration curve) between the immersion period of reptiles in beer and the composition ratio of each amino acid could be obtained.
[0058]
Since there is the above correlation between the soaking period and each amino acid composition ratio, it is possible to determine the soaking period based on the above correlation by measuring the amino acid composition ratio even for black cockroaches whose soaking period is unknown. It was possible to easily and accurately determine the time when the process was performed.
[0059]
The reason why it can be determined as described above is as follows. A large amount of proline, an amino acid that is not easily assimilated by yeast, remains in beer, but other amino acids (for example, serine, glycine, and arginine) are extremely small, and the amino acid of beer has a composition rich in proline. . On the other hand, amino acids are produced by autolysis in the dead black cockroach, and the composition ratio of each other amino acid to proline is about 1-2. When the dead black cockroach is in the atmosphere, the composition ratio does not change much over time (see data of the control sample in FIGS. 6A, 6B, and 6C). However, when black cockroaches are immersed in beer, the components of beer permeate and diffuse into the black cockroach, and the amino acid composition in the black cockroach approaches the amino acid composition of beer, and the composition ratio of each amino acid to proline gradually increases. It gets smaller. For example, according to the present example, it can be seen that the composition ratio of each other amino acid and proline in the black cockroach is about 0.5 or less in about two weeks after being immersed. Conversely, if the composition ratio is 0.5, it can be determined that two weeks or more have passed since the immersion. In the case of sealed liquid foods (eg beer, sparkling liquor, etc.), it is determined that two weeks have passed since the insect was immersed because there is no possibility of insects mixing between the time of sealing and opening. In this case, it can be determined that the product has been mixed during the manufacturing process, not after opening.
[0060]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it becomes possible to provide the method of determining easily the mixture time of the insect mixed in the liquid food with sufficient reproducibility.
[Brief description of the drawings]
FIGS. 1A, 1B, and 1C are graphs showing visible absorption spectra of beer (diluted 200 times), a sample immersed in beer for a predetermined period, and a control sample.
FIGS. 2A, 2B, and 2C are graphs showing visible absorption spectra of beer (diluted 200 times), a sample immersed in beer for a predetermined period, and a control sample.
FIGS. 3A and 3B are graphs showing visible absorption spectra of beer (diluted 200 times), a sample immersed in beer for a predetermined period, and a control sample.
FIGS. 4A and 4B are graphs showing visible absorption spectra of beer (diluted 200 times), a sample immersed in beer for a predetermined period, and a control sample.
FIG. 5 is data showing the content of each amino acid in a sample immersed in beer for a predetermined period and a control sample, where (a) shows arginine, (b) shows histidine, and (c) shows the content of glycine.
FIG. 6 is a data showing the composition ratio of each amino acid of a sample immersed in beer for a predetermined period and a control sample, where (a) is serine for proline, (b) is glycine for proline, and (c) is arginine for proline. The composition ratio is shown.

Claims

A measuring step for measuring the content of the predetermined component and / or the composition ratio of the predetermined plural components in the test insect mixed in the liquid food;
The content of the predetermined component and / or the composition ratio of the predetermined plural components in the sample insect of the same kind as the test insects immersed in the liquid food, and the sample insect are immersed in the liquid food From the measured value of the content of the predetermined component and / or the composition ratio of the predetermined multiple components obtained in the measurement step, based on the correlation obtained in advance with the elapsed time since A determination step of determining when the test insects are mixed in the liquid food ,
The method for determining an insect mixture time , wherein the predetermined component is at least one component selected from the group consisting of sugars and amino acids .

The liquid food is a malt alcoholic beverage,
2. The method for determining an insect contamination time according to claim 1 , wherein the predetermined component is at least one component selected from the group consisting of sugars, amino acids, and isoalpha acids.

In the measurement step,
The absorption intensity or fluorescence intensity of a predetermined region from the ultraviolet region to the visible light region of the extract extracted from the test insects is measured, and the content of the predetermined component and / or based on the obtained absorption intensity or fluorescence intensity 3. The method for determining the insect contamination time according to claim 1 or 2 , wherein a composition ratio of the predetermined plural components is obtained.

In the measurement step,
Measure the absorption spectrum or fluorescence spectrum of a predetermined region from the ultraviolet region to the visible light region of the extract extracted from the test insects, and based on the obtained absorption spectrum or fluorescence spectrum, the content of the predetermined component and / or 3. The method for determining the insect contamination time according to claim 1 or 2 , wherein a composition ratio of the predetermined plural components is obtained.