JP4101835B2 - Method for distinguishing Pseudomonas aeruginosa type and primer set used for the method - Google Patents
Method for distinguishing Pseudomonas aeruginosa type and primer set used for the method Download PDFInfo
- Publication number
- JP4101835B2 JP4101835B2 JP2005320850A JP2005320850A JP4101835B2 JP 4101835 B2 JP4101835 B2 JP 4101835B2 JP 2005320850 A JP2005320850 A JP 2005320850A JP 2005320850 A JP2005320850 A JP 2005320850A JP 4101835 B2 JP4101835 B2 JP 4101835B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- dna
- seq
- pseudomonas aeruginosa
- serotype
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 title claims description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 233
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 233
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 232
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 129
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 46
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 46
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 45
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 38
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 18
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 37
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 16
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 101000702917 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) CDP-abequose synthase Proteins 0.000 description 10
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- YQNRVGJCPCNMKT-JLPGSUDCSA-N 2-(4-benzylpiperazin-1-yl)-n-[(2-hydroxy-3-prop-2-enyl-phenyl)methylideneamino]acetamide Chemical compound OC1=C(CC=C)C=CC=C1\C=N/NC(=O)CN1CCN(CC=2C=CC=CC=2)CC1 YQNRVGJCPCNMKT-JLPGSUDCSA-N 0.000 description 6
- 101001139126 Homo sapiens Krueppel-like factor 6 Proteins 0.000 description 6
- 101001133600 Homo sapiens Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor Proteins 0.000 description 6
- 101001120260 Homo sapiens Polyadenylate-binding protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 101000609211 Homo sapiens Polyadenylate-binding protein 2 Proteins 0.000 description 6
- 101001080401 Homo sapiens Proteasome assembly chaperone 1 Proteins 0.000 description 6
- 101001104570 Homo sapiens Proteasome assembly chaperone 2 Proteins 0.000 description 6
- 101000625842 Homo sapiens Tubulin-specific chaperone E Proteins 0.000 description 6
- 229960005552 PAC-1 Drugs 0.000 description 6
- 102100026090 Polyadenylate-binding protein 1 Human genes 0.000 description 6
- 102100039427 Polyadenylate-binding protein 2 Human genes 0.000 description 6
- 102100027583 Proteasome assembly chaperone 1 Human genes 0.000 description 6
- 102100041008 Proteasome assembly chaperone 2 Human genes 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000960592 Pseudomonas aeruginosa group Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- -1 sequence Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、緑膿菌の型の判別方法及びその方法に用いるプライマーセット、特に新規プライマーを用いた緑膿菌の型の判別方法及びその方法に用いるプライマーセットに関する。 The present invention relates to a method for distinguishing Pseudomonas aeruginosa types and a primer set used for the method, and more particularly to a method for distinguishing Pseudomonas aeruginosa types using a novel primer and a primer set used for the method.
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、自然界に広く存在する偏性好気性のグラム陰性桿菌である。その病原性は通常低いが、癌や糖尿病等の慢性疾患患者、新生児や老人等の感染抵抗が減弱した患者や宿主では、肺炎、中耳炎、髄膜炎、尿路感染症、敗血症等を引き起こして重篤な結果をもたらすことも多い。また、熱傷患者では免疫防御機能の低下した熱傷部位に緑膿菌が増殖して感染症を発症することもある。 Pseudomonas aeruginosa is an obligately aerobic Gram-negative bacilli that exists widely in nature. Although its pathogenicity is usually low, it causes pneumonia, otitis media, meningitis, urinary tract infections, sepsis, etc. in patients with chronic diseases such as cancer and diabetes, and patients and hosts with reduced infection resistance such as newborns and the elderly. Often has serious consequences. In burn patients, Pseudomonas aeruginosa grows at the burn site where the immune defense function has been reduced, and infection may develop.
緑膿菌は多くの薬剤に耐性を示し、病院内でも消毒薬入り溶液やネブライザーから分離されることもある。このため、緑膿菌の日和見感染症や院内感染症の監視及び対策は医療機関では大きな問題である。院内感染等の集団感染では、起因菌を細かく特定することが重要であり、こうした目的を含め、緑膿菌への対策及び研究では、菌種(species)をさらに細分した分類が行われている。一般にこの詳細なタイプ別分類は「型別」と呼ばれる。 Pseudomonas aeruginosa is resistant to many drugs and may be isolated from disinfectant solutions and nebulizers in hospitals. For this reason, monitoring and countermeasures against opportunistic infections and nosocomial infections of Pseudomonas aeruginosa are major problems in medical institutions. In outbreaks such as nosocomial infections, it is important to identify the causative bacteria in detail, and in addition to these purposes, measures and research on Pseudomonas aeruginosa have been further classified into species. . In general, this detailed classification by type is called "type".
緑膿菌の型別は、ベン毛由来のタンパク質抗原による分類もあるが、菌体抗原（Ｏ抗原）によるのが一般的である。日本では緑膿菌研究会血清型別検討委員会で決定された１４群（Ａ〜Ｎ群）の緑膿菌それぞれに相当する市販の緑膿菌群別用免疫血清（デンカ生研）を用いて緑膿菌の群別が行なわれている。国際的にはＩＡＴＳ（International Antigenic Typing Scheme）によるＯ１〜Ｏ２０の２０種類の型に分類されている。 The type of Pseudomonas aeruginosa is generally classified by bacterial cell antigen (O antigen), although there is a classification based on protein hair-derived protein antigens. In Japan, using the commercially available immune sera for Pseudomonas aeruginosa group (Denka Seika) corresponding to each of the Pseudomonas aeruginosa groups 14 (Groups A to N) determined by the Pseudomonas aeruginosa Research Group Serotype Review Committee Pseudomonas aeruginosa is grouped. Internationally, it is classified into 20 types of O1 to O20 by IATS (International Antigenic Typing Scheme).
しかし、緑膿菌研究会による分類は１つの群に複数のＯ抗原型を含む。また、その分類のＭ群およびＮ群には該当するＯ抗原が存在しないなど、ＩＡＴＳによる国際型別と１対１で対応するものではない。このため、国際的なデータとの比較に支障をきたしている。また、いずれにおいても凝集反応がまったくみられない判定不能菌株が比較的多く、例えば、ＩＡＴＳによる型別では９９検体のうち３７検体（３７．４％）がＯ抗原による類別が不能であったという報告例がある（非特許文献１：Wiener-Kronish et al., J. Clin. Microbiol., 41, 2158-2160 (2003)）、また、Ｏ１〜Ｏ２０の２０種類の型に対しＯ１〜Ｏ１７の１７種類に対する検査用血清しか市販されておらず、十分に有効な型の判別方法となっていない。また、最近ではＯ１〜Ｏ１７の１７種類を個別に識別できるモノクローナル抗体も海外において製造販売されているが、高価である上、Ｏ１８〜Ｏ２０抗原を有するか否かは判別できない。 However, the classification by the Pseudomonas aeruginosa study group includes multiple O antigen types in one group. In addition, there is no one-to-one correspondence with the international type by IATS, for example, there is no corresponding O antigen in the M group and N group of the classification. This hinders comparisons with international data. In addition, in all cases, there are relatively many undecidable strains in which no agglutination reaction is observed. For example, according to IATS type classification, 37 out of 99 samples (37.4%) cannot be classified by O antigen. There is a report example (Non-Patent Document 1: Wiener-Kronish et al., J. Clin. Microbiol., 41, 2158-2160 (2003)), and O1-O17 against 20 types of O1-O20. Only 17 test sera are commercially available, and it is not a sufficiently effective type discrimination method. Recently, monoclonal antibodies capable of individually identifying 17 types of O1 to O17 are also manufactured and sold overseas, but they are expensive and it is not possible to determine whether they have O18 to O20 antigens.
凝集反応による型別で分類されない菌株や緑膿菌研究会によるＭ群の菌株は、多くの場合、菌体のＯ抗原の変異によるものと考えられる。これは菌の表現型を同定の基準として用いる場合にしばしばみられる問題点といえる。一方、菌の表現型に比べ、遺伝型の変化は比較的少なく安定した菌の同定マーカーと考えられる。しかし、Ｏ抗原はリポ多糖であるため、それ自体を直接コードする遺伝子はない。Ｏ抗原の合成に関わるタンパク質はいくつか知られているが（例えば、特許文献１：米国特許公開第2003/0124634号）、個々のＯ抗原の識別に有用な塩基配列は知られていない。 In many cases, strains not classified by type due to agglutination reactions and strains of group M by the Pseudomonas aeruginosa study group are thought to be due to mutations in the O antigen of the bacterial cells. This is a problem often seen when the fungal phenotype is used as an identification criterion. On the other hand, compared to the phenotype of the fungus, the change in the genotype is relatively small, and it is considered to be a stable marker for the fungus. However, since the O antigen is a lipopolysaccharide, there is no gene that directly encodes itself. Several proteins involved in the synthesis of O antigen are known (for example, Patent Document 1: US Patent Publication No. 2003/0124634), but a base sequence useful for identifying individual O antigens is not known.
従って、本発明は、国際比較が容易で、かつ確実な緑膿菌の型の判別方法及びそのために用いられる新規プライマー対セットを提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for distinguishing Pseudomonas aeruginosa type that is easy to compare internationally and is reliable, and a novel primer pair set used therefor.
本発明者は、緑膿菌ＤＮＡ上のｒｆｂ領域に着目し、各Ｏ抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡについて比較対照した。その結果、下記のプライマー対を設計し、これらを用いることにより、他の菌種を誤認識することなく、かつ、交差増幅による型別ミス・型別不能を引き起こすことなく、遺伝型による緑膿菌の型別が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventor paid attention to the rfb region on Pseudomonas aeruginosa DNA, and compared and contrasted each O antigen serotype of Pseudomonas aeruginosa DNA. As a result, the following primer pairs were designed and used, so that there was no misrecognition of other bacterial species, and there were no typing errors or inability to type by cross amplification. The present inventors have found that fungal typing is possible and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の緑膿菌血清型の判別方法及びそのために用いられる新規プライマー対のセットを提供する。
１．緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の被検菌株から得たＤＮＡを鋳型とし、各Ｏ抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド対をプライマーとして増幅反応を行ない、増幅産物がいずれのプライマー対に対応するかを識別することにより、被検菌株のＯ抗原血清型を識別することを特徴とする緑膿菌の型の判別方法。
２．Ｏ１、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１５、Ｏ１７、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ１０、Ｏ１９、Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型を識別するために、
１）Ｏ１抗原血清型については配列番号１と配列番号２の塩基配列を含むプライマー対、
２）Ｏ３抗原血清型については配列番号３と配列番号４の塩基配列を含むプライマー対、３）Ｏ４抗原血清型については配列番号５と配列番号６の塩基配列を含むプライマー対、４）Ｏ６抗原血清型については配列番号７と配列番号８の塩基配列を含むプライマー対、
５）Ｏ９抗原血清型については配列番号９と配列番号１０の塩基配列を含むプライマー対、
６）Ｏ１１抗原血清型については配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対、
７）Ｏ１２抗原血清型については配列番号１３と配列番号１４の塩基配列を含むプライマー対、
８）Ｏ１５抗原血清型については配列番号１５と配列番号１６の塩基配列を含むプライマー対、
９）Ｏ１７抗原血清型については配列番号１７と配列番号１８の塩基配列を含むプライマー対、
１０）Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０抗原血清型については配列番号１９と配列番号２０の塩基配列を含むプライマー対、
１１）Ｏ７、Ｏ８抗原血清型については配列番号２１と配列番号２２の塩基配列を含むプライマー対、
１２）Ｏ１０、Ｏ１９抗原血清型については配列番号２３と配列番号２４の塩基配列を含むプライマー対、
１３）Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型については配列番号２５と配列番号２６の塩基配列を含むプライマー対を用いる前記１に記載の緑膿菌の型の判別方法。
３．増幅をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行なう前記１または２に記載の緑膿菌の型の判別方法。
４．増幅産物の識別をアガロースゲル電気泳動により行なう前記１または２に記載の緑膿菌の型の判別方法。
５．１）Ｏ１抗原血清型については配列番号１と配列番号２の塩基配列を含むプライマー対、
２）Ｏ３抗原血清型については配列番号３と配列番号４の塩基配列を含むプライマー対、３）Ｏ４抗原血清型については配列番号５と配列番号６の塩基配列を含むプライマー対、４）Ｏ６抗原血清型については配列番号７と配列番号８の塩基配列を含むプライマー対、
５）Ｏ９抗原血清型については配列番号９と配列番号１０の塩基配列を含むプライマー対、
６）Ｏ１１抗原血清型については配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対、
７）Ｏ１２抗原血清型については配列番号１３と配列番号１４の塩基配列を含むプライマー対、
８）Ｏ１５抗原血清型については配列番号１５と配列番号１６の塩基配列を含むプライマー対、
９）Ｏ１７抗原血清型については配列番号１７と配列番号１８の塩基配列を含むプライマー対、
１０）Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０抗原血清型については配列番号１９と配列番号２０の塩基配列を含むプライマー対、
１１）Ｏ７、Ｏ８抗原血清型については配列番号２１と配列番号２２の塩基配列を含むプライマー対、
１２）Ｏ１０、Ｏ１９抗原血清型については配列番号２３と配列番号２４の塩基配列を含むプライマー対、
１３）Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型については配列番号２５と配列番号２６の塩基配列を含むプライマー対を含む、緑膿菌のＯ１、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１５、Ｏ１７、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ１０、Ｏ１９、Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型を識別するプライマー対を含むことを特徴とする緑膿菌の型別用プライマーセット。
That is, the present invention provides the following method for distinguishing Pseudomonas aeruginosa serotypes and a set of novel primer pairs used therefor.
1. An amplification reaction is carried out using DNA obtained from a test strain of Pseudomonas aeruginosa as a template and using an oligonucleotide pair specific for Pseudomonas aeruginosa DNA of each O antigen serotype as a primer. A method for discriminating the type of Pseudomonas aeruginosa characterized by identifying the O antigen serotype of a test strain by identifying whether it corresponds to a pair.
2. To identify the O1, O3, O4, O6, O9, O11, O12, O15, O17, O2, O5, O16, O18, O20, O7, O8, O10, O19, O13, O14 antigen serotypes,
1) For the O1 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2,
2) For the O3 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, 3) For the O4 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, 4) O6 antigen For serotypes, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8,
5) For the O9 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10,
6) For the O11 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12,
7) For the O12 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14,
8) For the O15 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16,
9) For the O17 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18,
10) For the O2, O5, O16, O18, and O20 antigen serotypes, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20,
11) For the O7 and O8 antigen serotypes, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22,
12) For the O10 and O19 antigen serotypes, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24,
13) The method for distinguishing Pseudomonas aeruginosa types according to 1 above, using a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 for the O13 and O14 antigen serotypes.
3. 3. The method for determining the type of Pseudomonas aeruginosa according to 1 or 2 above, wherein amplification is performed by polymerase chain reaction (PCR).
4). 3. The method for discriminating the type of Pseudomonas aeruginosa according to 1 or 2 above, wherein amplification products are identified by agarose gel electrophoresis.
5.1) For the O1 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2,
2) For the O3 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, 3) For the O4 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, 4) O6 antigen For serotypes, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8,
5) For the O9 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10,
6) For the O11 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12,
7) For the O12 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14,
8) For the O15 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16,
9) For the O17 antigen serotype, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18,
10) For the O2, O5, O16, O18, and O20 antigen serotypes, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20,
11) For the O7 and O8 antigen serotypes, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22,
12) For the O10 and O19 antigen serotypes, a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24,
13) For the O13 and O14 antigen serotypes, the primer pairs including the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 are used. , O5, O16, O18, O20, O7, O8, O10, O19, O13, O14 A primer set for typing of Pseudomonas aeruginosa, characterized by comprising a primer pair that distinguishes serotypes.
本発明の方法によれば、各Ｏ抗原に関連する遺伝子に特異的な塩基配列によりＯ抗原を識別するため、表現型の変異に影響されることなく緑膿菌の類別ができる。また、Ｏ抗原の型別に依拠した識別方法であるため、国際型別との統一的な対比が可能である。 According to the method of the present invention, since the O antigen is identified by the base sequence specific to the gene associated with each O antigen, Pseudomonas aeruginosa can be classified without being affected by the phenotypic variation. In addition, since the identification method is based on the type of O antigen, a uniform comparison with the international type is possible.
本発明の方法によれば、検体から採取した緑膿菌を培養してＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して配列番号１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６、１７と１８、１９と２０、２１と２２、２３と２４、２５と２６をそれぞれ含む塩基配列対をプライマー対を用いて増幅反応を行ない、これにより緑膿菌のｒｆｂ領域の一部（以下、Ｏ抗原関連遺伝子領域という。）を増幅させ、各増幅断片の有無を確認することにより緑膿菌の型別を行なう。プライマー対は典型的には、それぞれ配列番号１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６、１７と１８、１９と２０、２１と２２、２３と２４、２５と２６からなる塩基配列対であるが、Ｏ抗原関連遺伝子領域の増幅に影響しない範囲において、プライマーとハイブリダイズする領域の前後に伸長してもよいし、あるいは短縮してもよい。 According to the method of the present invention, Pseudomonas aeruginosa collected from a specimen is cultured to isolate DNA, and SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 and 9, , 11 and 12, 13 and 14, 15 and 16, 17 and 18, 19 and 20, 21 and 22, 23 and 24, and 25 and 26, respectively. By amplifying a part of the rfb region of Pseudomonas aeruginosa (hereinafter referred to as O antigen-related gene region), the presence or absence of each amplified fragment is confirmed to perform typing of Pseudomonas aeruginosa. The primer pairs are typically SEQ ID NOS: 1 and 2, 3 and 4, 5 and 6, 7 and 8, 9 and 10, 11 and 12, 13 and 14, 15 and 16, 17 and 18, 19 and 20, respectively. , 21 and 22, 23 and 24, 25 and 26, in a range that does not affect the amplification of the O antigen-related gene region, may extend before and after the region that hybridizes with the primer, Or you may shorten.
それぞれ、配列番号１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６、１７と１８、１９と２０、２１と２２、２３と２４、２５と２６からなる（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）、（ＰＡ３Ａ，ＰＡ３Ｂ）、（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）、（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）、（ＰＡ９Ａ，ＰＡ９Ｂ）、（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）、（ＰＡ１２Ａ，ＰＡ１２Ｂ）、（ＰＡ１５Ａ，ＰＡ１５Ｂ）、（ＰＡ１７Ａ，ＰＡ１７Ｂ）、（ＰＡＢ１，ＰＡＢ２）、（ＰＡＣ１，ＰＡＣ２）、（ＰＡ１０Ａ，ＰＡ１０Ｂ）、（ＰＡ１３Ａ，ＰＡ１３Ｂ）の各プライマー対について、対応するＯ抗原、配列、プライマー長さ（ｍｅｒ）、ＧＣ％、融点（Ｔｍ／℃）、増幅されるＯ抗原関連遺伝子領域の大きさ（ｂｐ）を下表に示す。 SEQ ID NOs: 1 and 2, 3 and 4, 5 and 6, 7 and 8, 9 and 10, 11 and 12, 13 and 14, 15 and 16, 17 and 18, 19 and 20, 21 and 22, 23 and 24, 25 and 26 (PA1A, PA1B), (PA3A, PA3B), (PA4A, PA4B), (PA6A, PA6B), (PA9A, PA9B), (PA11A, PA11B), (PA12A, PA12B), ( PA15A, PA15B), (PA17A, PA17B), (PAB1, PAB2), (PAC1, PAC2), (PA10A, PA10B), (PA13A, PA13B) for each primer pair, the corresponding O antigen, sequence, primer length The following table shows (mer), GC%, melting point (Tm / ° C.), and size (bp) of the O antigen-related gene region to be amplified.
なお、(a)Ｏ２抗原型、Ｏ５抗原型、Ｏ１６抗原型、Ｏ１８抗原型及びＯ２０抗原型、(b)Ｏ７抗原型及びＯ８抗原型、(c) Ｏ１０抗原型及びＯ１９抗原型、並びに(d)Ｏ１３抗原型及びＯ１４抗原型は、それぞれ複数のＯ抗原血清抗原型を含むが、これらは緑膿菌研究会血清抗原型別検討委員会の群別においてそれぞれＢ群、Ｃ群、Ｈ群、Ｋ群を構成するものであり、本発明の方法は、この群別による分類を完全にカバーする。また、本発明により個別に識別可能なＯ１抗原型、Ｏ３抗原型、Ｏ４抗原型、Ｏ６抗原型、Ｏ９抗原型、Ｏ１１抗原型、Ｏ１２抗原型及びＯ１５抗原型は、これらは緑膿菌の出現頻度の大半（９５％以上）を占めており、本発明の方法は、わが国で一般に使用されている血清型別すべてを血清凝集反応法を用いずに高い正確性をもって識別可能としたものである。 (A) O2 antigen type, O5 antigen type, O16 antigen type, O18 antigen type and O20 antigen type, (b) O7 antigen type and O8 antigen type, (c) O10 antigen type and O19 antigen type, and (d ) The O13 antigen type and the O14 antigen type each include a plurality of O antigen serotypes, which are group B, C group, H group, It constitutes the K group, and the method of the present invention completely covers this classification by group. In addition, the O1 antigen type, the O3 antigen type, the O4 antigen type, the O6 antigen type, the O9 antigen type, the O11 antigen type, the O12 antigen type, and the O15 antigen type that can be individually identified according to the present invention are the appearance of Pseudomonas aeruginosa. Most of the frequency (95% or more) accounted for, and the method of the present invention makes it possible to distinguish all serotypes commonly used in Japan with high accuracy without using the serum agglutination method. .
以下に、ＩＡＴＳによる型別、本発明による型別で用いるプライマー対、緑膿菌研究会血清型別検討委員会の群別（デンカ生研血清型別（群））を対照して示す。 In the following, the IATS type classification, the primer pairs used by type according to the present invention, and the Pseudomonas aeruginosa study group serotype study group group (Denka Seiken serotype (group)) are shown in contrast.
ＤＮＡの増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることができる。
ＰＣＲ条件は、上記プライマーを用いてＯ抗原関連遺伝子領域を検出可能な程度まで増幅するものであればよい。例えば、９０〜９５℃で５分間保った後、９０〜９５℃での熱変性と５５〜７２℃（好ましくは６０℃）でのアニーリング処理と伸長反応からなるサイクルを繰返し、その後７２℃で５〜１０分間保持する。繰返し回数としては、２５〜３５回、通常は３０回前後である。ＤＮＡポリメラーゼその他の条件は常法と同様である。
As a DNA amplification reaction, a polymerase chain reaction (PCR) can be used.
The PCR conditions may be those that amplify the O antigen-related gene region to a detectable level using the primers. For example, after being kept at 90 to 95 ° C. for 5 minutes, a cycle comprising heat denaturation at 90 to 95 ° C., annealing treatment at 55 to 72 ° C. (preferably 60 ° C.) and extension reaction is repeated, and then 5 ° C. at 72 ° C. Hold for 10 minutes. The number of repetitions is 25 to 35 times, usually around 30 times. DNA polymerase and other conditions are the same as in the conventional method.
増幅したＤＮＡ断片の有無は、周知の手法で確認できる。
このような周知の例としては、電気泳動法等が挙げられる。
本発明の方法により増幅されるＯ抗原関連遺伝子領域は約５００〜１０００ｂｐの領域である。従って、電気泳動法ではアガロースゲル電気泳動が好ましい。電気泳動は、通常、３０〜６０分かけて行ない、エチジウムブロマイド等の慣用の染料で染色する。ゲル中のバンドの確認は写真から目視確認してもよいし、ゲル写真を映像データとしてコンピュータに入力し、写真の濃淡を解析することにより確認してもよい。さらにこの分画を分取して紫外線透過量を測定し、それを予め増幅が予想されるＤＮＡの紫外線透過量と比較することにより、Ｏ抗原関連遺伝子領域を識別することもできる。
The presence or absence of the amplified DNA fragment can be confirmed by a known method.
Examples of such well-known examples include electrophoresis.
The O antigen-related gene region amplified by the method of the present invention is a region of about 500 to 1000 bp. Therefore, agarose gel electrophoresis is preferable for the electrophoresis method. Electrophoresis is usually performed for 30 to 60 minutes and dyed with a conventional dye such as ethidium bromide. Confirmation of the band in the gel may be confirmed visually from a photograph, or may be confirmed by inputting the gel photograph as video data into a computer and analyzing the density of the photograph. Further, this fraction is collected, the amount of ultraviolet light transmitted is measured, and compared with the amount of ultraviolet light transmitted through DNA that is expected to be amplified in advance, the O antigen-related gene region can be identified.
例えば、Ｏ１抗原血清型に対応するプライマーを用いて上記増幅を行ない、Ｏ１抗原関連遺伝子領域の分子量に相当する位置にバンドが検出された場合、検査した菌の血清型はＯ１抗原血清型であると同定される。該当する増幅が見られなければ陰性と判定する。以下、他の抗原血清型に対応するプライマーを用いて同様の操作を行なう。なお、検査の順番は任意であるが、出現頻度が高い順番に行なうのが効率的である。被検試料の由来にもよるが、通常は、検出頻度からＯ６、Ｏ１１、Ｏ４、Ｏ１の抗原血清型の検査を先に行なうのがよい。もっとも、検査の正確を期すために、ある抗原血清型で陽性と判定されてもさらに検査を続け、他の抗原血清型検査での陰性を確認してもよい。 For example, when the amplification is performed using a primer corresponding to the O1 antigen serotype and a band is detected at a position corresponding to the molecular weight of the O1 antigen-related gene region, the serotype of the tested bacterium is the O1 antigen serotype Identified. If no relevant amplification is found, it is determined as negative. Thereafter, the same operation is performed using primers corresponding to other antigen serotypes. In addition, although the order of inspection is arbitrary, it is efficient to carry out in order of appearance frequency. Although it depends on the origin of the test sample, it is usually preferable to first test the antigen serotypes of O6, O11, O4, and O1 based on the detection frequency. However, in order to ensure the accuracy of the test, the test may be continued even if it is determined to be positive in a certain antigen serotype, and negative in another antigen serotype test may be confirmed.
本発明の方法は、種々の試料について適用可能であり、例えば、患者の痰、血液、血漿、唾液、尿、粘膜等の生体試料、汚染が考えられる包帯、寝具、寝間着等のリネン類、手術器具その他の器具、家具、建具等から採取した試料、洗浄水、飲料水等（但し、これらに限定されない）の検査に適用できる。 The method of the present invention can be applied to various samples, for example, biological samples such as patient's sputum, blood, plasma, saliva, urine, mucous membrane, bandages that may be contaminated, bedding, linens such as bedding, surgery It can be applied to the inspection of samples collected from instruments and other instruments, furniture, fittings, etc., washing water, drinking water, etc. (but not limited to them).
以下、本発明を実施例、比較例によってより詳細に説明する。なお、以下の実施例及び参考例において、各プライマーは、それぞれ本発明者の設計した配列に従って、オリゴヌクレオチド対を合成（つくばオリゴサービス株式会社、茨城県つくば市）して用いた。
また、緑膿菌試料は、American Type Culture Collection (ATCC)から入手したＯ抗原型が既知の以下の菌株を用いた（括弧内はＯ抗原型）：ＡＴＣＣ３３３４８（Ｏ１）、ＡＴＣＣ３３３４９（Ｏ２）、ＡＴＣＣ３３３５０（Ｏ３）、ＡＴＣＣ３３３５１（Ｏ４）、ＡＴＣＣ３３３５２（Ｏ５）、ＡＴＣＣ３３３５４（Ｏ６）、ＡＴＣＣ３３３５３（Ｏ７）、ＡＴＣＣ３３３５５（Ｏ８）、ＡＴＣＣ３３３５６（Ｏ９）、ＡＴＣＣ３３３５７（Ｏ１０）、ＡＴＣＣ３３３５８（Ｏ１１）、ＡＴＣＣ３３３５９（Ｏ１２）、ＡＴＣＣ３３３６０（Ｏ１３）、ＡＴＣＣ３３３６１（Ｏ１４）、ＡＴＣＣ３３３６２（Ｏ１５）、ＡＴＣＣ３３３６３（Ｏ１６）、ＡＴＣＣ３３３６４（Ｏ１７）、ＡＴＣＣ４３３９０（Ｏ１８）、ＡＴＣＣ４３７３１（Ｏ１９）、ＡＴＣＣ４３７３２（Ｏ２０）。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples. In the following Examples and Reference Examples, each primer was used by synthesizing an oligonucleotide pair (Tsukuba Oligo Service Co., Ltd., Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) according to the sequence designed by the present inventors.
As the Pseudomonas aeruginosa samples, the following strains obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) with known O antigen types were used (O antigen types in parentheses): ATCC 33348 (O1), ATCC 33349 (O2), ATCC 33350. (O3), ATCC 33351 (O4), ATCC 33352 (O5), ATCC 33354 (O6), ATCC 33353 (O7), ATCC 33355 (O8), ATCC 33356 (O9), ATCC 33357 (O10), ATCC 33358 (O11), ATCC 33359 (33 2), ATCC (O13), ATCC 33361 (O14), ATCC 33362 (O15), ATCC 33363 (O16), ATCC 33364 (O17), ATCC 43390 (O18), ATCC 43731 (O19), TCC43732 (O20).
実施例１：プライマー対（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）によるＯ１抗原血清型の識別
（１）被験菌株の培養
前記抗原血清型緑膿菌菌株（Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８、Ｏ１９、Ｏ２０抗原血清型）をトリプトソイ寒天培地で３７℃で１８時間培養した。
（２）鋳型ＤＮＡの作成
次いで、細菌を熱処理して各ＤＮＡを抽出した。すなわち、前記培養菌株を、径約１ｍｍの白金耳で１白金耳分を取り、蒸留水１ｍｌに浮遊させ、１００℃で５分煮沸処理した。菌浮遊液を１４０００ｒｐｍで５分遠心し、上清をそれぞれの鋳型ＤＮＡとして使用した。
（３）増幅
増幅はＰＣＲによって行なった。すなわち、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ、ＴａＫａＲａ Ｒ００１Ａ）０．１μｌ、ｄＮＴＰ混合物２μｌ、１０×ＰＣＲバッファー２μｌ（Ｍｇ2+添加）を（２）で調製したＤＮＡ鋳型２μｌ、プライマー各２μｌ、滅菌蒸留水９．９μｌとともにＰＣＲチューブ内に入れた（反応液全量：２０μｌ）。なお、ｄＮＴＰとバッファーはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ添付のものを用いた。
ＰＣＲは遺伝子増幅装置（ＴａＫａＲａ ＴＰ−６００）を使用し、９４℃５分の熱変性を１サイクル行なった後、９４℃３０秒の熱変性−６０℃１分のアニーリング−７２℃２分のＤＮＡ伸長反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分、１サイクルの伸長反応を行なった。
（４）検出
上記ＰＣＲ産物とＤＮＡ分子量マーカー（φＸ１７４ＨｉｎｃＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０６Ａ））各１０μｌを２％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ ３：１ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｔａｋａｒａ）に添加し、Ｍｕｐｉｄ−２泳動装置（コスモ・バイオ株式会社）を用いて、１００Ｖで５０分泳動した。アガロースゲルはエチジウムブロマイドで染色し、３０２ｎｍのトランスイルミネータ（フナコシ株式会社ＴＭ−３６）で紫外線照射し、検出されたＤＮＡ泳動像を６６５フィルム（Ｐｏｌａｒｏｉｄ）で写真撮影した。
結果を図１に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ２〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）を用いた場合、Ｏ１抗原血清型の被験細菌株でのみ４９５ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）によれば、Ｏ１抗原型が有効に判別できる。
Example 1: Identification of O1 antigen serotype by primer pair (PA1A, PA1B) (1) Culture of test strain The antigen serotype Pseudomonas aeruginosa strains (O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, and O20 antigen serotypes) were cultured on tryptic soy agar at 37 ° C. for 18 hours.
(2) Preparation of template DNA Next, bacteria were heat-treated to extract each DNA. That is, the above-mentioned cultured strain was taken with a platinum loop having a diameter of about 1 mm, suspended in 1 ml of distilled water, and boiled at 100 ° C. for 5 minutes. The bacterial suspension was centrifuged at 14000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was used as each template DNA.
(3) Amplification Amplification was performed by PCR. That is, Taq DNA polymerase (5 U / μl, TaKaRa R001A) 0.1 μl,
PCR uses a gene amplification device (TaKaRa TP-600), and after one cycle of heat denaturation at 94 ° C for 5 minutes, heat denaturation at 94 ° C for 30 seconds-60 ° C for 1 minute annealing-72 ° C for 2 minutes of DNA The extension reaction was performed for 30 cycles, and finally, one cycle of extension reaction was performed at 72 ° C. for 5 minutes.
(4)
The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PA1A, PA1B) was used, amplification of 495 bp was observed only in the test bacterial strain of the O1 antigen serotype, and this primer pair was observed in the test bacterial strains of other antigen serotypes. Amplification by is not allowed. Therefore, according to the primer pair (PA1A, PA1B) of the present invention, the O1 antigen type can be effectively distinguished.
実施例２：プライマー対（ＰＡ３Ａ，ＰＡ３Ｂ）によるＯ３抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ３ＡとＰＡ３Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図２に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ３抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ３）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ３Ａ，ＰＡ３Ｂ）を用いた場合、Ｏ３抗原血清型の被験細菌株でのみ６５５ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ３Ａ，ＰＡ３Ｂ）によれば、Ｏ３抗原型が有効に判別できる。
Example 2: Same as Example 1 except that PA3A and PA3B were used as a primer pair for discrimination of O3 antigen serotype by primer pair (PA3A, PA3B) and the molecular weight marker was changed to pBR322 DNA / Alu I) (Fermentas SM0121) Then, culturing of bacteria, PCR, and electrophoresis were performed. The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PA3A, PA3B) was used, amplification of 655 bp was observed only in the test bacterial strain of the O3 antigen serotype, and this primer pair was observed in the test bacterial strains of other antigen serotypes. Amplification by is not allowed. Therefore, according to the primer pair (PA3A, PA3B) of the present invention, the O3 antigen type can be effectively distinguished.
実施例３：プライマー対（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）によるＯ４抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ４ＡとＰＡ４Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＵＣ１９ＤＮＡ／ＭｓｐＩ（ＨｐａＩＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０２２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図３に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ４抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ４）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）を用いた場合、Ｏ４抗原血清型の被験細菌株でのみ５５０ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）によれば、Ｏ４抗原型が有効に判別できる。
Example 3: Primer pairs (PA4A, PA4B) using PA4A and PA4B as identification primer pairs O4 antigen serotypes by the molecular weight marker pUC19DNA / MspI (Hpa II) except that instead of (Fermentas SM0221) Example 1 In the same manner as above, culturing of bacteria, PCR, and electrophoresis were performed. The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PA4A, PA4B) was used, amplification of 550 bp was observed only in the test bacterial strain of the O4 antigen serotype, and this primer pair was observed in the test bacterial strains of other antigen serotypes. Amplification by is not allowed. Therefore, according to the primer pair (PA4A, PA4B) of the present invention, the O4 antigen type can be effectively distinguished.
実施例４：プライマー対（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）によるＯ６抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ６ＡとＰＡ６Ｂを使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図４に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ６抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ６）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）を用いた場合、Ｏ６抗原血清型の被験細菌株でのみ８９６ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）によれば、Ｏ６抗原型が有効に判別できる。
Example 4: Similar to Example 1 except that PA6A and PA6B were used as a primer pair for discrimination of O6 antigen serotype by primer pair (PA6A, PA6B) and the molecular weight marker was changed to φX174 Hae III digest (TaKaRa3405A). Bacterial culture, PCR, and electrophoresis were performed. The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PA6A, PA6B) was used, amplification of 896 bp was observed only in the test bacterial strain of the O6 antigen serotype, and this primer pair was observed in the test bacterial strains of other antigen serotypes. Amplification by is not allowed. Therefore, according to the primer pair (PA6A, PA6B) of the present invention, the O6 antigen type can be effectively distinguished.
実施例５：プライマー対（ＰＡ９Ａ，ＰＡ９Ｂ）によるＯ９抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ９ＡとＰＡ９Ｂを使用した他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図５に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ９抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ９）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ９Ａ，ＰＡ９Ｂ）を用いた場合、Ｏ９抗原血清型の被験細菌株でのみ４２８ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ９Ａ，ＰＡ９Ｂ）によれば、Ｏ９抗原型が有効に判別できる。
Example 5: Bacterial culture, PCR, and electrophoresis were carried out in the same manner as in Example 1 except that PA9A and PA9B were used as a primer pair for distinguishing the O9 antigen serotype by the primer pair (PA9A, PA9B) . The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PA9A, PA9B) was used, amplification of 428 bp was observed only in the test bacterial strain of the O9 antigen serotype, and this primer pair was observed in the test bacterial strains of other antigen serotypes. Amplification by is not allowed. Therefore, according to the primer pair (PA9A, PA9B) of the present invention, the O9 antigen type can be effectively distinguished.
実施例６：プライマー対（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）によるＯ１１抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１１ＡとＰＡ１１Ｂを使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図６に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１１抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１２〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）を用いた場合、Ｏ１１抗原血清型の被験細菌株でのみ１０６９ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）によれば、Ｏ１１抗原型が有効に判別できる。
Example 6: In the same manner as in Example 1 except that PA11A and PA11B were used as a primer pair for identifying the O11 antigen serotype by the primer pair (PA11A, PA11B), and the molecular weight marker was changed to φX174 Hae III digest (TaKaRa3405A). Bacterial culture, PCR, and electrophoresis were performed. The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PA11A, PA11B) was used, amplification of 1069 bp was observed only in the test bacterial strain of the O11 antigen serotype, and this primer pair was observed in the test bacterial strains of other antigen serotypes. Amplification by is not allowed. Therefore, according to the primer pair (PA11A, PA11B) of the present invention, the O11 antigen type can be distinguished effectively.
実施例７：プライマー対（ＰＡ１２Ａ，ＰＡ１２Ｂ）によるＯ１２抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１２ＡとＰＡ１２Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図７に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１２抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０（除くＯ１２）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１２Ａ，ＰＡ１２Ｂ）を用いた場合、Ｏ１２抗原血清型の被験細菌株でのみ５６３ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１２Ａ，ＰＡ１２Ｂ）によれば、Ｏ１２抗原型が有効に判別できる。
Example 7: Same as Example 1 except that PA12A and PA12B were used as a primer pair for distinguishing O12 antigen serotype by primer pair (PA12A, PA12B), and the molecular weight marker was changed to pBR322 DNA / Alu I) (Fermentas SM0121). Then, culturing of bacteria, PCR, and electrophoresis were performed. The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PA12A, PA12B) was used, amplification of 563 bp was observed only in the test bacterial strain of the O12 antigen serotype, and this primer pair was observed in the test bacterial strains of other antigen serotypes. Amplification by is not allowed. Therefore, according to the primer pair (PA12A, PA12B) of the present invention, the O12 antigen type can be distinguished effectively.
実施例８：プライマー対（ＰＡ１５Ａ，ＰＡ１５Ｂ）によるＯ１５抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１５ＡとＰＡ１５Ｂを使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図８に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１５抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０（除くＯ１５）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１５Ａ，ＰＡ１５Ｂ）を用いた場合、Ｏ１５抗原血清型の被験細菌株でのみ１０１８ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１５Ａ，ＰＡ１５Ｂ）によれば、Ｏ１５抗原型が有効に判別できる。
Example 8: Same as Example 1 except that PA15A and PA15B were used as a primer pair for distinguishing O15 antigen serotype by primer pair (PA15A, PA15B) and the molecular weight marker was changed to φX174 Hae III digest (TaKaRa3405A). Bacterial culture, PCR, and electrophoresis were performed. The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PA15A, PA15B) was used, amplification of 1018 bp was observed only in the test bacterial strain of the O15 antigen serotype, and this primer pair was observed in the test bacterial strains of other antigen serotypes. Amplification by is not allowed. Therefore, according to the primer pair (PA15A, PA15B) of the present invention, the O15 antigen type can be effectively distinguished.
実施例９：本発明のプライマー対による群別血清型の型別
デンカ生研血清凝集反応によりＭ群と判定された試料７菌株について、前記実施例と同様に本発明のプライマーを順次用いてＰＣＲ法による型別を試みた。その結果、（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）、（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）、（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）、（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）による型別を行なった段階で、これらはＯ１抗原型１株、Ｏ４抗原型１株、Ｏ６抗原型２株、Ｏ１１抗原型３株であることが判明した。これらの菌株について念のため、残りのプライマーを用いた試験も行なったがいずれも増幅はみられなかった。
Example 9: PCR method using the primers of the present invention sequentially in the same manner as in the above Example for the seven strains of the samples determined as group M by type-specific Denka Seiken serum agglutination reaction of the grouped serotypes using the primer pairs of the present invention I tried to type by. As a result, at the stage of typing by (PA6A, PA6B), (PA11A, PA11B), (PA4A, PA4B), (PA1A, PA1B), these were
実施例１０：判定不能株の本発明のプライマー対による型別
デンカ生研血清凝集反応で凝集が見られず判定不能菌とされた試料９菌株について、前記実施例と同様に本発明のプライマーを順次用いてＰＣＲ法による型別を試みた。その結果、（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）、（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）、（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）、（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）による型別を行なった段階で、これらはＯ１抗原型２株、Ｏ４抗原型１株、Ｏ６抗原型３株、Ｏ１１抗原型３株であることが判明した。これらの菌株について念のため、残りのプライマーを用いた試験も行なったがいずれも増幅はみられなかった。
Example 10: For the nine strains of samples which were determined to be non-determinable by the type-specific Denka Seiken serum agglutination reaction using the primer pair of the present invention of undecidable strains, the primers of the present invention were sequentially applied in the same manner as in the above example. The type | mold classification by PCR method was tried using it. As a result, at the stage of typing by (PA6A, PA6B), (PA11A, PA11B), (PA4A, PA4B), (PA1A, PA1B), these were
実施例１１：プライマー対（ＰＡ１７Ａ，ＰＡ１７Ｂ）によるＯ１７抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１７ＡとＰＡ１７Ｂを使用した他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図９に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１７抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０（除くＯ１７）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１７Ａ，ＰＡ１７Ｂ）を用いた場合、Ｏ１７抗原血清型の被験細菌株でのみ７４８ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１７Ａ，ＰＡ１７Ｂ）によれば、Ｏ１７抗原型が有効に判別できる。
Example 11: Discrimination of O17 antigen serotype by primer pair (PA17A, PA17B) Culture of bacteria, PCR, and electrophoresis were performed in the same manner as in Example 1 except that PA17A and PA17B were used as a primer pair. The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PA17A, PA17B) was used, amplification of 748 bp was observed only in the test bacterial strain of the O17 antigen serotype, and this primer pair was observed in the test bacterial strains of other antigen serotypes. Amplification by is not allowed. Therefore, according to the primer pair (PA17A, PA17B) of the present invention, the O17 antigen type can be distinguished effectively.
実施例１２：プライマー対（ＰＡＢ１，ＰＡＢ２）によるＯ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、及びＯ２０抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡＢ１とＰＡＢ２を使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１０に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ２抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ２）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡＢ１，ＰＡＢ２）を用いた場合、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、及びＯ２０抗原血清型の被験細菌株でのみ６３９ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡＢ１，ＰＡＢ２）によれば、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、及びＯ２０抗原型が有効に判別できる。
Example 12: Discrimination of O2, O5, O16, O18, and O20 antigen serotypes with primer pairs (PAB1, PAB2) PAB1 and PAB2 were used as primer pairs and the molecular weight marker was changed to pBR322 DNA / AluI) (Fermentas SM0121) In the same manner as in Example 1, bacterial culture, PCR, and electrophoresis were performed. The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PAB1, PAB2) was used, amplification of 639 bp was observed only in the test bacterial strains of the O2, O5, O16, O18, and O20 antigen serotypes, and other antigen sera No amplification by this primer pair is observed in the test bacterial strain of the type. Therefore, according to the primer pair (PAB1, PAB2) of the present invention, the O2, O5, O16, O18, and O20 antigen types can be effectively distinguished.
実施例１３：プライマー対（ＰＡＣ１，ＰＡＣ２）によるＯ７及びＯ８抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡＣ１とＰＡＣ２を使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１１に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ７抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３と１５はＯ８抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン４〜１２、１６〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１１（除くＯ７、Ｏ８）、Ｏ１２〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡＣ１，ＰＡＣ２）を用いた場合、Ｏ７及びＯ８抗原血清型の被験細菌株でのみ８１５ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡＣ１，ＰＡＣ２）によれば、Ｏ７及びＯ８抗原型が有効に判別できる。
Example 13: Discrimination of O7 and O8 antigen serotypes by primer pair (PAC1, PAC2) As in Example 1, except that PAC1 and PAC2 were used as a primer pair and the molecular weight marker was changed to φX174HaeIII digest (TaKaRa3405A). Bacterial culture, PCR, and electrophoresis were performed. The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PAC1, PAC2) was used, amplification of 815 bp was observed only in the test bacterial strains of the O7 and O8 antigen serotypes, and in the test bacterial strains of other antigen serotypes, No amplification by the primer pair is observed. Therefore, according to the primer pair (PAC1, PAC2) of the present invention, the O7 and O8 antigen types can be distinguished effectively.
実施例１４：プライマー対（ＰＡ１０Ａ，ＰＡ１０Ｂ）によるＯ１０及びＯ１９抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１０ＡとＰＡ１０Ｂを使用した他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１２に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１０抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ９、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１０Ａ，ＰＡ１０Ｂ）を用いた場合、Ｏ１０及びＯ１９抗原血清型の被験細菌株でのみ６２７ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１０Ａ，ＰＡ１０Ｂ）によれば、Ｏ１０及びＯ１９抗原型が有効に判別できる。
Example 14: Discrimination of O10 and O19 antigen serotypes by primer pair (PA10A, PA10B) Culture of bacteria, PCR, and electrophoresis were performed in the same manner as in Example 1 except that PA10A and PA10B were used as a primer pair. . The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PA10A, PA10B) was used, amplification of 627 bp was observed only in the test bacterial strains of the O10 and O19 antigen serotypes, and in the test bacterial strains of the other antigen serotypes, No amplification by the primer pair is observed. Therefore, according to the primer pair (PA10A, PA10B) of the present invention, the O10 and O19 antigen types can be effectively distinguished.
実施例１５：プライマー対（ＰＡ１３Ａ，ＰＡ１３Ｂ）によるＯ１３及びＯ１４抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１３ＡとＰＡ１３Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１３に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１３抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３と１５はＯ１４抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン４〜１２、１６〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ９、Ｏ１０〜Ｏ２０（除くＯ１３、Ｏ１４）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１３Ａ，ＰＡ１３Ｂ）を用いた場合、Ｏ１３及びＯ１４抗原血清型の被験細菌株でのみ５２１ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１３Ａ，ＰＡ１３Ｂ）によれば、Ｏ１３及びＯ１４抗原型が有効に判別できる。
Example 15: Discrimination of O13 and O14 antigen serotypes with primer pair (PA13A, PA13B) Example 13 except that PA13A and PA13B were used as a primer pair and the molecular weight marker was changed to pBR322 DNA / AluI) (Fermentas SM0121). In the same manner, bacterial culture, PCR, and electrophoresis were performed. The results are shown in FIG. In the figure,
As shown in this result, when the primer pair (PA13A, PA13B) was used, amplification of 521 bp was observed only in the test bacterial strains of the O13 and O14 antigen serotypes, and in the test bacterial strains of other antigen serotypes, No amplification by the primer pair is observed. Therefore, according to the primer pair (PA13A, PA13B) of the present invention, the O13 and O14 antigen types can be effectively distinguished.
本発明によれば、従来、血清凝集反応により識別されてきた菌株についてＰＣＲ法により明確に識別できる。また、従来の血清凝集反応によりＭ群とのみ判定されている菌株や従来のデンカ生研血清凝集反応では型別凝集反応が起こらないため判別ができなかった菌株についても判定することができる。また、国際的な型に準拠した詳細な型別が可能であるとともに、高価なモノクローナル抗体を用いることなく正確性の高い識別が可能となるため、従来日本国内で行なわれている緑膿菌研究会法に代わる標準法として高い有用性を有し、幅広く応用が可能である。 According to the present invention, strains that have been conventionally identified by serum agglutination can be clearly identified by the PCR method. In addition, it is possible to determine strains that have been determined only as the M group by the conventional serum agglutination reaction or strains that cannot be distinguished because the type-specific agglutination reaction does not occur in the conventional Denka Seiken serum agglutination reaction. In addition, detailed classification according to international patterns is possible, and high-accuracy identification is possible without using expensive monoclonal antibodies. It has high utility as a standard method that replaces the association method and can be widely applied.
Claims (6)
Ｏ１１抗原血清型を識別するために、Ｏ１１抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対を用いて増幅反応を行なうことを特徴とする緑膿菌の型の判別方法。 An amplification reaction is carried out using DNA obtained from a test strain of Pseudomonas aeruginosa as a template and using an oligonucleotide pair specific for Pseudomonas aeruginosa DNA of each O antigen serotype as a primer. A method for determining the type of Pseudomonas aeruginosa that identifies the O antigen serotype of a test strain by identifying whether it corresponds to a pair,
In order to identify the O11 antigen serotype, an amplification reaction was carried out using a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, which is an oligonucleotide pair specific only to the O11 antigen serotype Pseudomonas aeruginosa DNA. A method for determining the type of Pseudomonas aeruginosa, which is performed.
Ｏ１１抗原血清型を識別するために、
Ｏ１１抗原血清型については、Ｏ１１抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対を用いて増幅反応を行ない、
Ｏ３、Ｏ１２、Ｏ１５、および／またはＯ１７抗原血清型を識別するために、
１）Ｏ３抗原血清型については、Ｏ３抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号３と配列番号４の塩基配列を含むプライマー対、
２）Ｏ１２抗原血清型については、Ｏ１２抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１３と配列番号１４の塩基配列を含むプライマー対、
３）Ｏ１５抗原血清型については、Ｏ１５抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１５と配列番号１６の塩基配列を含むプライマー対、
４）Ｏ１７抗原血清型については、Ｏ１７抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１７と配列番号１８の塩基配列を含むプライマー対を用いて増幅反応を行なう請求項１に記載の緑膿菌の型の判別方法。 An amplification reaction is performed using DNA obtained from a test strain of Pseudomonas aeruginosa as a template, and using an oligonucleotide pair specific to Pseudomonas aeruginosa DNA of each O antigen serotype as a primer. A method for determining the type of Pseudomonas aeruginosa that identifies the O antigen serotype of a test strain by identifying whether it corresponds to a pair,
To identify the O11 antigen serotype,
For the O11 antigen serotype, an amplification reaction is carried out using a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, which is an oligonucleotide pair specific only to the O11 antigen serotype Pseudomonas aeruginosa DNA.
To identify O3, O12, O15, and / or O17 antigen serotypes,
1) For the O3 antigen serotype , a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, which is an oligonucleotide pair specific only to the O3 antigen serotype DNA of Pseudomonas aeruginosa,
2) For the O12 antigen serotype , a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, which is an oligonucleotide pair specific only to the O12 antigen serotype DNA of Pseudomonas aeruginosa,
3) For the O15 antigen serotype , a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, which is an oligonucleotide pair specific only to the P15 aeruginosa DNA of the O15 antigen serotype,
4) For the O17 antigen serotype, an amplification reaction is carried out using a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, which is an oligonucleotide pair specific to only the O17 antigen serotype DNA of Pseudomonas aeruginosa. The method for determining the type of Pseudomonas aeruginosa according to claim 1.
Ｏ１１抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対を含む、緑膿菌のＯ１１抗原血清型を識別するプライマー対を含むことを特徴とする緑膿菌の型別用プライマーセット。 An amplification reaction is carried out using DNA obtained from a test strain of Pseudomonas aeruginosa as a template and using an oligonucleotide pair specific for Pseudomonas aeruginosa DNA of each O antigen serotype as a primer. A primer pair used in a method for determining the type of Pseudomonas aeruginosa that identifies an O antigen serotype of a test strain by identifying whether it corresponds to a pair,
A primer pair that distinguishes the O11 antigen serotype of Pseudomonas aeruginosa, including a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, which is an oligonucleotide pair specific only to the O11 antigen serotype Pseudomonas aeruginosa DNA A primer set for typing Pseudomonas aeruginosa characterized by comprising:
Ｏ１１抗原血清型については、Ｏ１１抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対を含む、緑膿菌のＯ１１抗原血清型を識別するプライマー対を含み、
１）Ｏ３抗原血清型については、Ｏ３抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号３と配列番号４の塩基配列を含むプライマー対、
２）Ｏ１２抗原血清型については、Ｏ１２抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１３と配列番号１４の塩基配列を含むプライマー対、
３）Ｏ１５抗原血清型については、Ｏ１５抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１５と配列番号１６の塩基配列を含むプライマー対、
４）Ｏ１７抗原血清型については、Ｏ１７抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１７と配列番号１８の塩基配列を含むプライマー対を含む、緑膿菌のＯ３、Ｏ１２、Ｏ１５、および／またはＯ１７抗原血清型を識別するプライマー対を含む請求項５に記載の緑膿菌の型別用プライマーセット。 An amplification reaction is performed using DNA obtained from a test strain of Pseudomonas aeruginosa as a template, and using an oligonucleotide pair specific to Pseudomonas aeruginosa DNA of each O antigen serotype as a primer. A primer pair used in a method for determining the type of Pseudomonas aeruginosa that identifies an O antigen serotype of a test strain by identifying whether it corresponds to a pair,
For the O11 antigen serotype, an O11 antigen of Pseudomonas aeruginosa comprising a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, which is an oligonucleotide pair specific only to the P11 aeruginosa DNA of the O11 antigen serotype A primer pair that identifies the serotype,
1) For the O3 antigen serotype , a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, which is an oligonucleotide pair specific only to the O3 antigen serotype DNA of Pseudomonas aeruginosa,
2) For the O12 antigen serotype , a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, which is an oligonucleotide pair specific to only the O12 antigen serotype DNA of Pseudomonas aeruginosa,
3) For the O15 antigen serotype , a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, which is an oligonucleotide pair specific only to the P15 aeruginosa DNA of the O15 antigen serotype,
4) For the O17 antigen serotype, a Pseudomonas aeruginosa strain comprising a primer pair comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, which is an oligonucleotide pair specific only to the P17 aeruginosa DNA of the O17 antigen serotype. The primer set for typing Pseudomonas aeruginosa according to claim 5, comprising a primer pair that distinguishes O3, O12, O15, and / or O17 antigen serotypes.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005320850A JP4101835B2 (en) | 2004-12-28 | 2005-11-04 | Method for distinguishing Pseudomonas aeruginosa type and primer set used for the method |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004378848 | 2004-12-28 | ||
| JP2005320850A JP4101835B2 (en) | 2004-12-28 | 2005-11-04 | Method for distinguishing Pseudomonas aeruginosa type and primer set used for the method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006204288A JP2006204288A (en) | 2006-08-10 |
| JP4101835B2 true JP4101835B2 (en) | 2008-06-18 |
Family
ID=36961763
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005320850A Expired - Fee Related JP4101835B2 (en) | 2004-12-28 | 2005-11-04 | Method for distinguishing Pseudomonas aeruginosa type and primer set used for the method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4101835B2 (en) |
-
2005
- 2005-11-04 JP JP2005320850A patent/JP4101835B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2006204288A (en) | 2006-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Czajkowski et al. | Detection, identification and differentiation of Pectobacterium and Dickeya species causing potato blackleg and tuber soft rot: a review | |
| Sjoling et al. | Comparative analyses of phenotypic and genotypic methods for detection of enterotoxigenic Escherichia coli toxins and colonization factors | |
| Kudinha et al. | Multiplex PCR-based reverse line blot assay for simultaneous detection of 22 virulence genes in uropathogenic Escherichia coli | |
| Murdoch et al. | Evaluation of a PCR assay for detection of Streptococcus pneumoniae in respiratory and nonrespiratory samples from adults with community-acquired pneumonia | |
| Baddour et al. | Evaluation of three polymerase chain reaction techniques for detection of Brucella DNA in peripheral human blood | |
| Aranda et al. | Single multiplex assay to identify simultaneously enteropathogenic, enteroaggregative, enterotoxigenic, enteroinvasive and Shiga toxin-producing Escherichia coli strains in Brazilian children | |
| Kumar et al. | Detection of Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) by selective amplification of invA, viaB, fliC‐d and prt genes by polymerase chain reaction in mutiplex format | |
| Lang et al. | Sensitive detection of Xanthomonas oryzae pathovars oryzae and oryzicola by loop-mediated isothermal amplification | |
| Chen et al. | Development of O-serogroup specific PCR assay for detection and identification of Vibrio parahaemolyticus | |
| García et al. | Usefulness of PCR and antigen latex agglutination test with samples obtained by transthoracic needle aspiration for diagnosis of pneumococcal pneumonia | |
| Oyama et al. | Identification of and screening for human Helicobacter cinaedi infections and carriers via nested PCR | |
| Blackburn et al. | Distribution of the Escherichia coli common pilus among diverse strains of human enterotoxigenic E. coli | |
| Mandakovic et al. | Genomic-based restriction enzyme selection for specific detection of Piscirickettsia salmonis by 16S rDNA PCR-RFLP | |
| Kanamaru et al. | Subtyping of uropathogenic Escherichia coli according to the pathogenicity island encoding uropathogenic‐specific protein: Comparison with phylogenetic groups | |
| CN102947467A (en) | Assays and kits for serotyping pseudomonas aeruginosa and oligonucleotide sequences useful in such methods and kits | |
| Payne et al. | High-resolution melt PCR analysis for genotyping of Ureaplasma parvum isolates directly from clinical samples | |
| CN114657272B (en) | Primer-probe combination for RPA-LFS detection of Streptococcus pneumoniae and its application | |
| Lynn et al. | Genetic typing of the porin protein of Neisseria gonorrhoeae from clinical noncultured samples for strain characterization and identification of mixed gonococcal infections | |
| Siu et al. | Development of a colloidal gold-based immunochromatographic strip for rapid detection of Klebsiella pneumoniae serotypes K1 and K2 | |
| Dhakal et al. | Novel multiplex PCR assay for identification and subtyping of enteroinvasive Escherichia coli and differentiation from Shigella based on target genes selected by comparative genomics | |
| Vuong et al. | Absence of high molecular weight proteins 1 and/or 2 is associated with decreased adherence among non-typeable Haemophilus influenzae clinical isolates | |
| Nagarajan et al. | Reliable means of diagnosis and serovar determination of blood-borne Salmonella strains: quick PCR amplification of unique genomic loci by novel primer sets | |
| Huber et al. | Independent loss of immunogenic proteins in Mycobacterium ulcerans suggests immune evasion | |
| Johnson et al. | Novel molecular variants of allele I of the Escherichia coli P fimbrial adhesin gene papG | |
| JP5727255B2 (en) | Rapid and simple discrimination method of Salmonella serotype by multiplex PCR and its primer set |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070529 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20070529 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20070705 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070808 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071004 |
|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20070806 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071213 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080207 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080307 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080319 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110328 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130328 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140328 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |