JP4101835B2 - 緑膿菌の型の判別方法及びその方法に用いるプライマーセット - Google Patents
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Description
本発明は、緑膿菌の型の判別方法及びその方法に用いるプライマーセット、特に新規プライマーを用いた緑膿菌の型の判別方法及びその方法に用いるプライマーセットに関する。
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、自然界に広く存在する偏性好気性のグラム陰性桿菌である。その病原性は通常低いが、癌や糖尿病等の慢性疾患患者、新生児や老人等の感染抵抗が減弱した患者や宿主では、肺炎、中耳炎、髄膜炎、尿路感染症、敗血症等を引き起こして重篤な結果をもたらすことも多い。また、熱傷患者では免疫防御機能の低下した熱傷部位に緑膿菌が増殖して感染症を発症することもある。
緑膿菌は多くの薬剤に耐性を示し、病院内でも消毒薬入り溶液やネブライザーから分離されることもある。このため、緑膿菌の日和見感染症や院内感染症の監視及び対策は医療機関では大きな問題である。院内感染等の集団感染では、起因菌を細かく特定することが重要であり、こうした目的を含め、緑膿菌への対策及び研究では、菌種(species)をさらに細分した分類が行われている。一般にこの詳細なタイプ別分類は「型別」と呼ばれる。
緑膿菌の型別は、ベン毛由来のタンパク質抗原による分類もあるが、菌体抗原（Ｏ抗原）によるのが一般的である。日本では緑膿菌研究会血清型別検討委員会で決定された１４群（Ａ〜Ｎ群）の緑膿菌それぞれに相当する市販の緑膿菌群別用免疫血清（デンカ生研）を用いて緑膿菌の群別が行なわれている。国際的にはＩＡＴＳ（International Antigenic Typing Scheme）によるＯ１〜Ｏ２０の２０種類の型に分類されている。
しかし、緑膿菌研究会による分類は１つの群に複数のＯ抗原型を含む。また、その分類のＭ群およびＮ群には該当するＯ抗原が存在しないなど、ＩＡＴＳによる国際型別と１対１で対応するものではない。このため、国際的なデータとの比較に支障をきたしている。また、いずれにおいても凝集反応がまったくみられない判定不能菌株が比較的多く、例えば、ＩＡＴＳによる型別では９９検体のうち３７検体（３７．４％）がＯ抗原による類別が不能であったという報告例がある（非特許文献１：Wiener-Kronish et al., J. Clin. Microbiol., 41, 2158-2160 (2003)）、また、Ｏ１〜Ｏ２０の２０種類の型に対しＯ１〜Ｏ１７の１７種類に対する検査用血清しか市販されておらず、十分に有効な型の判別方法となっていない。また、最近ではＯ１〜Ｏ１７の１７種類を個別に識別できるモノクローナル抗体も海外において製造販売されているが、高価である上、Ｏ１８〜Ｏ２０抗原を有するか否かは判別できない。
凝集反応による型別で分類されない菌株や緑膿菌研究会によるＭ群の菌株は、多くの場合、菌体のＯ抗原の変異によるものと考えられる。これは菌の表現型を同定の基準として用いる場合にしばしばみられる問題点といえる。一方、菌の表現型に比べ、遺伝型の変化は比較的少なく安定した菌の同定マーカーと考えられる。しかし、Ｏ抗原はリポ多糖であるため、それ自体を直接コードする遺伝子はない。Ｏ抗原の合成に関わるタンパク質はいくつか知られているが（例えば、特許文献１：米国特許公開第2003/0124634号）、個々のＯ抗原の識別に有用な塩基配列は知られていない。
従って、本発明は、国際比較が容易で、かつ確実な緑膿菌の型の判別方法及びそのために用いられる新規プライマー対セットを提供することを目的とする。
本発明者は、緑膿菌ＤＮＡ上のｒｆｂ領域に着目し、各Ｏ抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡについて比較対照した。その結果、下記のプライマー対を設計し、これらを用いることにより、他の菌種を誤認識することなく、かつ、交差増幅による型別ミス・型別不能を引き起こすことなく、遺伝型による緑膿菌の型別が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の緑膿菌血清型の判別方法及びそのために用いられる新規プライマー対のセットを提供する。
１．緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の被検菌株から得たＤＮＡを鋳型とし、各Ｏ抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド対をプライマーとして増幅反応を行ない、増幅産物がいずれのプライマー対に対応するかを識別することにより、被検菌株のＯ抗原血清型を識別することを特徴とする緑膿菌の型の判別方法。
２．Ｏ１、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１５、Ｏ１７、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ１０、Ｏ１９、Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型を識別するために、
１）Ｏ１抗原血清型については配列番号１と配列番号２の塩基配列を含むプライマー対、
２）Ｏ３抗原血清型については配列番号３と配列番号４の塩基配列を含むプライマー対、３）Ｏ４抗原血清型については配列番号５と配列番号６の塩基配列を含むプライマー対、４）Ｏ６抗原血清型については配列番号７と配列番号８の塩基配列を含むプライマー対、
５）Ｏ９抗原血清型については配列番号９と配列番号１０の塩基配列を含むプライマー対、
６）Ｏ１１抗原血清型については配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対、
７）Ｏ１２抗原血清型については配列番号１３と配列番号１４の塩基配列を含むプライマー対、
８）Ｏ１５抗原血清型については配列番号１５と配列番号１６の塩基配列を含むプライマー対、
９）Ｏ１７抗原血清型については配列番号１７と配列番号１８の塩基配列を含むプライマー対、
１０）Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０抗原血清型については配列番号１９と配列番号２０の塩基配列を含むプライマー対、
１１）Ｏ７、Ｏ８抗原血清型については配列番号２１と配列番号２２の塩基配列を含むプライマー対、
１２）Ｏ１０、Ｏ１９抗原血清型については配列番号２３と配列番号２４の塩基配列を含むプライマー対、
１３）Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型については配列番号２５と配列番号２６の塩基配列を含むプライマー対を用いる前記１に記載の緑膿菌の型の判別方法。
３．増幅をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行なう前記１または２に記載の緑膿菌の型の判別方法。
４．増幅産物の識別をアガロースゲル電気泳動により行なう前記１または２に記載の緑膿菌の型の判別方法。
５．１）Ｏ１抗原血清型については配列番号１と配列番号２の塩基配列を含むプライマー対、
２）Ｏ３抗原血清型については配列番号３と配列番号４の塩基配列を含むプライマー対、３）Ｏ４抗原血清型については配列番号５と配列番号６の塩基配列を含むプライマー対、４）Ｏ６抗原血清型については配列番号７と配列番号８の塩基配列を含むプライマー対、
５）Ｏ９抗原血清型については配列番号９と配列番号１０の塩基配列を含むプライマー対、
６）Ｏ１１抗原血清型については配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対、
７）Ｏ１２抗原血清型については配列番号１３と配列番号１４の塩基配列を含むプライマー対、
８）Ｏ１５抗原血清型については配列番号１５と配列番号１６の塩基配列を含むプライマー対、
９）Ｏ１７抗原血清型については配列番号１７と配列番号１８の塩基配列を含むプライマー対、
１０）Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０抗原血清型については配列番号１９と配列番号２０の塩基配列を含むプライマー対、
１１）Ｏ７、Ｏ８抗原血清型については配列番号２１と配列番号２２の塩基配列を含むプライマー対、
１２）Ｏ１０、Ｏ１９抗原血清型については配列番号２３と配列番号２４の塩基配列を含むプライマー対、
１３）Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型については配列番号２５と配列番号２６の塩基配列を含むプライマー対を含む、緑膿菌のＯ１、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１５、Ｏ１７、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ１０、Ｏ１９、Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型を識別するプライマー対を含むことを特徴とする緑膿菌の型別用プライマーセット。
１．緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の被検菌株から得たＤＮＡを鋳型とし、各Ｏ抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド対をプライマーとして増幅反応を行ない、増幅産物がいずれのプライマー対に対応するかを識別することにより、被検菌株のＯ抗原血清型を識別することを特徴とする緑膿菌の型の判別方法。
２．Ｏ１、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１５、Ｏ１７、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ１０、Ｏ１９、Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型を識別するために、
１）Ｏ１抗原血清型については配列番号１と配列番号２の塩基配列を含むプライマー対、
２）Ｏ３抗原血清型については配列番号３と配列番号４の塩基配列を含むプライマー対、３）Ｏ４抗原血清型については配列番号５と配列番号６の塩基配列を含むプライマー対、４）Ｏ６抗原血清型については配列番号７と配列番号８の塩基配列を含むプライマー対、
５）Ｏ９抗原血清型については配列番号９と配列番号１０の塩基配列を含むプライマー対、
６）Ｏ１１抗原血清型については配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対、
７）Ｏ１２抗原血清型については配列番号１３と配列番号１４の塩基配列を含むプライマー対、
８）Ｏ１５抗原血清型については配列番号１５と配列番号１６の塩基配列を含むプライマー対、
９）Ｏ１７抗原血清型については配列番号１７と配列番号１８の塩基配列を含むプライマー対、
１０）Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０抗原血清型については配列番号１９と配列番号２０の塩基配列を含むプライマー対、
１１）Ｏ７、Ｏ８抗原血清型については配列番号２１と配列番号２２の塩基配列を含むプライマー対、
１２）Ｏ１０、Ｏ１９抗原血清型については配列番号２３と配列番号２４の塩基配列を含むプライマー対、
１３）Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型については配列番号２５と配列番号２６の塩基配列を含むプライマー対を用いる前記１に記載の緑膿菌の型の判別方法。
３．増幅をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行なう前記１または２に記載の緑膿菌の型の判別方法。
４．増幅産物の識別をアガロースゲル電気泳動により行なう前記１または２に記載の緑膿菌の型の判別方法。
５．１）Ｏ１抗原血清型については配列番号１と配列番号２の塩基配列を含むプライマー対、
２）Ｏ３抗原血清型については配列番号３と配列番号４の塩基配列を含むプライマー対、３）Ｏ４抗原血清型については配列番号５と配列番号６の塩基配列を含むプライマー対、４）Ｏ６抗原血清型については配列番号７と配列番号８の塩基配列を含むプライマー対、
５）Ｏ９抗原血清型については配列番号９と配列番号１０の塩基配列を含むプライマー対、
６）Ｏ１１抗原血清型については配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対、
７）Ｏ１２抗原血清型については配列番号１３と配列番号１４の塩基配列を含むプライマー対、
８）Ｏ１５抗原血清型については配列番号１５と配列番号１６の塩基配列を含むプライマー対、
９）Ｏ１７抗原血清型については配列番号１７と配列番号１８の塩基配列を含むプライマー対、
１０）Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０抗原血清型については配列番号１９と配列番号２０の塩基配列を含むプライマー対、
１１）Ｏ７、Ｏ８抗原血清型については配列番号２１と配列番号２２の塩基配列を含むプライマー対、
１２）Ｏ１０、Ｏ１９抗原血清型については配列番号２３と配列番号２４の塩基配列を含むプライマー対、
１３）Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型については配列番号２５と配列番号２６の塩基配列を含むプライマー対を含む、緑膿菌のＯ１、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ９、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１５、Ｏ１７、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２０、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ１０、Ｏ１９、Ｏ１３、Ｏ１４抗原血清型を識別するプライマー対を含むことを特徴とする緑膿菌の型別用プライマーセット。
本発明の方法によれば、各Ｏ抗原に関連する遺伝子に特異的な塩基配列によりＯ抗原を識別するため、表現型の変異に影響されることなく緑膿菌の類別ができる。また、Ｏ抗原の型別に依拠した識別方法であるため、国際型別との統一的な対比が可能である。
本発明の方法によれば、検体から採取した緑膿菌を培養してＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して配列番号１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６、１７と１８、１９と２０、２１と２２、２３と２４、２５と２６をそれぞれ含む塩基配列対をプライマー対を用いて増幅反応を行ない、これにより緑膿菌のｒｆｂ領域の一部（以下、Ｏ抗原関連遺伝子領域という。）を増幅させ、各増幅断片の有無を確認することにより緑膿菌の型別を行なう。プライマー対は典型的には、それぞれ配列番号１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６、１７と１８、１９と２０、２１と２２、２３と２４、２５と２６からなる塩基配列対であるが、Ｏ抗原関連遺伝子領域の増幅に影響しない範囲において、プライマーとハイブリダイズする領域の前後に伸長してもよいし、あるいは短縮してもよい。
それぞれ、配列番号１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６、１７と１８、１９と２０、２１と２２、２３と２４、２５と２６からなる（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）、（ＰＡ３Ａ，ＰＡ３Ｂ）、（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）、（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）、（ＰＡ９Ａ，ＰＡ９Ｂ）、（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）、（ＰＡ１２Ａ，ＰＡ１２Ｂ）、（ＰＡ１５Ａ，ＰＡ１５Ｂ）、（ＰＡ１７Ａ，ＰＡ１７Ｂ）、（ＰＡＢ１，ＰＡＢ２）、（ＰＡＣ１，ＰＡＣ２）、（ＰＡ１０Ａ，ＰＡ１０Ｂ）、（ＰＡ１３Ａ，ＰＡ１３Ｂ）の各プライマー対について、対応するＯ抗原、配列、プライマー長さ（ｍｅｒ）、ＧＣ％、融点（Ｔｍ／℃）、増幅されるＯ抗原関連遺伝子領域の大きさ（ｂｐ）を下表に示す。
なお、(a)Ｏ２抗原型、Ｏ５抗原型、Ｏ１６抗原型、Ｏ１８抗原型及びＯ２０抗原型、(b)Ｏ７抗原型及びＯ８抗原型、(c) Ｏ１０抗原型及びＯ１９抗原型、並びに(d)Ｏ１３抗原型及びＯ１４抗原型は、それぞれ複数のＯ抗原血清抗原型を含むが、これらは緑膿菌研究会血清抗原型別検討委員会の群別においてそれぞれＢ群、Ｃ群、Ｈ群、Ｋ群を構成するものであり、本発明の方法は、この群別による分類を完全にカバーする。また、本発明により個別に識別可能なＯ１抗原型、Ｏ３抗原型、Ｏ４抗原型、Ｏ６抗原型、Ｏ９抗原型、Ｏ１１抗原型、Ｏ１２抗原型及びＯ１５抗原型は、これらは緑膿菌の出現頻度の大半（９５％以上）を占めており、本発明の方法は、わが国で一般に使用されている血清型別すべてを血清凝集反応法を用いずに高い正確性をもって識別可能としたものである。
以下に、ＩＡＴＳによる型別、本発明による型別で用いるプライマー対、緑膿菌研究会血清型別検討委員会の群別（デンカ生研血清型別（群））を対照して示す。
ＤＮＡの増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることができる。
ＰＣＲ条件は、上記プライマーを用いてＯ抗原関連遺伝子領域を検出可能な程度まで増幅するものであればよい。例えば、９０〜９５℃で５分間保った後、９０〜９５℃での熱変性と５５〜７２℃（好ましくは６０℃）でのアニーリング処理と伸長反応からなるサイクルを繰返し、その後７２℃で５〜１０分間保持する。繰返し回数としては、２５〜３５回、通常は３０回前後である。ＤＮＡポリメラーゼその他の条件は常法と同様である。
ＰＣＲ条件は、上記プライマーを用いてＯ抗原関連遺伝子領域を検出可能な程度まで増幅するものであればよい。例えば、９０〜９５℃で５分間保った後、９０〜９５℃での熱変性と５５〜７２℃（好ましくは６０℃）でのアニーリング処理と伸長反応からなるサイクルを繰返し、その後７２℃で５〜１０分間保持する。繰返し回数としては、２５〜３５回、通常は３０回前後である。ＤＮＡポリメラーゼその他の条件は常法と同様である。
増幅したＤＮＡ断片の有無は、周知の手法で確認できる。
このような周知の例としては、電気泳動法等が挙げられる。
本発明の方法により増幅されるＯ抗原関連遺伝子領域は約５００〜１０００ｂｐの領域である。従って、電気泳動法ではアガロースゲル電気泳動が好ましい。電気泳動は、通常、３０〜６０分かけて行ない、エチジウムブロマイド等の慣用の染料で染色する。ゲル中のバンドの確認は写真から目視確認してもよいし、ゲル写真を映像データとしてコンピュータに入力し、写真の濃淡を解析することにより確認してもよい。さらにこの分画を分取して紫外線透過量を測定し、それを予め増幅が予想されるＤＮＡの紫外線透過量と比較することにより、Ｏ抗原関連遺伝子領域を識別することもできる。
このような周知の例としては、電気泳動法等が挙げられる。
本発明の方法により増幅されるＯ抗原関連遺伝子領域は約５００〜１０００ｂｐの領域である。従って、電気泳動法ではアガロースゲル電気泳動が好ましい。電気泳動は、通常、３０〜６０分かけて行ない、エチジウムブロマイド等の慣用の染料で染色する。ゲル中のバンドの確認は写真から目視確認してもよいし、ゲル写真を映像データとしてコンピュータに入力し、写真の濃淡を解析することにより確認してもよい。さらにこの分画を分取して紫外線透過量を測定し、それを予め増幅が予想されるＤＮＡの紫外線透過量と比較することにより、Ｏ抗原関連遺伝子領域を識別することもできる。
例えば、Ｏ１抗原血清型に対応するプライマーを用いて上記増幅を行ない、Ｏ１抗原関連遺伝子領域の分子量に相当する位置にバンドが検出された場合、検査した菌の血清型はＯ１抗原血清型であると同定される。該当する増幅が見られなければ陰性と判定する。以下、他の抗原血清型に対応するプライマーを用いて同様の操作を行なう。なお、検査の順番は任意であるが、出現頻度が高い順番に行なうのが効率的である。被検試料の由来にもよるが、通常は、検出頻度からＯ６、Ｏ１１、Ｏ４、Ｏ１の抗原血清型の検査を先に行なうのがよい。もっとも、検査の正確を期すために、ある抗原血清型で陽性と判定されてもさらに検査を続け、他の抗原血清型検査での陰性を確認してもよい。
本発明の方法は、種々の試料について適用可能であり、例えば、患者の痰、血液、血漿、唾液、尿、粘膜等の生体試料、汚染が考えられる包帯、寝具、寝間着等のリネン類、手術器具その他の器具、家具、建具等から採取した試料、洗浄水、飲料水等（但し、これらに限定されない）の検査に適用できる。
以下、本発明を実施例、比較例によってより詳細に説明する。なお、以下の実施例及び参考例において、各プライマーは、それぞれ本発明者の設計した配列に従って、オリゴヌクレオチド対を合成（つくばオリゴサービス株式会社、茨城県つくば市）して用いた。
また、緑膿菌試料は、American Type Culture Collection (ATCC)から入手したＯ抗原型が既知の以下の菌株を用いた（括弧内はＯ抗原型）：ＡＴＣＣ３３３４８（Ｏ１）、ＡＴＣＣ３３３４９（Ｏ２）、ＡＴＣＣ３３３５０（Ｏ３）、ＡＴＣＣ３３３５１（Ｏ４）、ＡＴＣＣ３３３５２（Ｏ５）、ＡＴＣＣ３３３５４（Ｏ６）、ＡＴＣＣ３３３５３（Ｏ７）、ＡＴＣＣ３３３５５（Ｏ８）、ＡＴＣＣ３３３５６（Ｏ９）、ＡＴＣＣ３３３５７（Ｏ１０）、ＡＴＣＣ３３３５８（Ｏ１１）、ＡＴＣＣ３３３５９（Ｏ１２）、ＡＴＣＣ３３３６０（Ｏ１３）、ＡＴＣＣ３３３６１（Ｏ１４）、ＡＴＣＣ３３３６２（Ｏ１５）、ＡＴＣＣ３３３６３（Ｏ１６）、ＡＴＣＣ３３３６４（Ｏ１７）、ＡＴＣＣ４３３９０（Ｏ１８）、ＡＴＣＣ４３７３１（Ｏ１９）、ＡＴＣＣ４３７３２（Ｏ２０）。
また、緑膿菌試料は、American Type Culture Collection (ATCC)から入手したＯ抗原型が既知の以下の菌株を用いた（括弧内はＯ抗原型）：ＡＴＣＣ３３３４８（Ｏ１）、ＡＴＣＣ３３３４９（Ｏ２）、ＡＴＣＣ３３３５０（Ｏ３）、ＡＴＣＣ３３３５１（Ｏ４）、ＡＴＣＣ３３３５２（Ｏ５）、ＡＴＣＣ３３３５４（Ｏ６）、ＡＴＣＣ３３３５３（Ｏ７）、ＡＴＣＣ３３３５５（Ｏ８）、ＡＴＣＣ３３３５６（Ｏ９）、ＡＴＣＣ３３３５７（Ｏ１０）、ＡＴＣＣ３３３５８（Ｏ１１）、ＡＴＣＣ３３３５９（Ｏ１２）、ＡＴＣＣ３３３６０（Ｏ１３）、ＡＴＣＣ３３３６１（Ｏ１４）、ＡＴＣＣ３３３６２（Ｏ１５）、ＡＴＣＣ３３３６３（Ｏ１６）、ＡＴＣＣ３３３６４（Ｏ１７）、ＡＴＣＣ４３３９０（Ｏ１８）、ＡＴＣＣ４３７３１（Ｏ１９）、ＡＴＣＣ４３７３２（Ｏ２０）。
実施例１：プライマー対（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）によるＯ１抗原血清型の識別
（１）被験菌株の培養
前記抗原血清型緑膿菌菌株（Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８、Ｏ１９、Ｏ２０抗原血清型）をトリプトソイ寒天培地で３７℃で１８時間培養した。
（２）鋳型ＤＮＡの作成
次いで、細菌を熱処理して各ＤＮＡを抽出した。すなわち、前記培養菌株を、径約１ｍｍの白金耳で１白金耳分を取り、蒸留水１ｍｌに浮遊させ、１００℃で５分煮沸処理した。菌浮遊液を１４０００ｒｐｍで５分遠心し、上清をそれぞれの鋳型ＤＮＡとして使用した。
（３）増幅
増幅はＰＣＲによって行なった。すなわち、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ、ＴａＫａＲａ Ｒ００１Ａ）０．１μｌ、ｄＮＴＰ混合物２μｌ、１０×ＰＣＲバッファー２μｌ（Ｍｇ2+添加）を（２）で調製したＤＮＡ鋳型２μｌ、プライマー各２μｌ、滅菌蒸留水９．９μｌとともにＰＣＲチューブ内に入れた（反応液全量：２０μｌ）。なお、ｄＮＴＰとバッファーはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ添付のものを用いた。
ＰＣＲは遺伝子増幅装置（ＴａＫａＲａ ＴＰ−６００）を使用し、９４℃５分の熱変性を１サイクル行なった後、９４℃３０秒の熱変性−６０℃１分のアニーリング−７２℃２分のＤＮＡ伸長反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分、１サイクルの伸長反応を行なった。
（４）検出
上記ＰＣＲ産物とＤＮＡ分子量マーカー（φＸ１７４ＨｉｎｃＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０６Ａ））各１０μｌを２％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ ３：１ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｔａｋａｒａ）に添加し、Ｍｕｐｉｄ−２泳動装置（コスモ・バイオ株式会社）を用いて、１００Ｖで５０分泳動した。アガロースゲルはエチジウムブロマイドで染色し、３０２ｎｍのトランスイルミネータ（フナコシ株式会社ＴＭ−３６）で紫外線照射し、検出されたＤＮＡ泳動像を６６５フィルム（Ｐｏｌａｒｏｉｄ）で写真撮影した。
結果を図１に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ２〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）を用いた場合、Ｏ１抗原血清型の被験細菌株でのみ４９５ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）によれば、Ｏ１抗原型が有効に判別できる。
（１）被験菌株の培養
前記抗原血清型緑膿菌菌株（Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８、Ｏ１９、Ｏ２０抗原血清型）をトリプトソイ寒天培地で３７℃で１８時間培養した。
（２）鋳型ＤＮＡの作成
次いで、細菌を熱処理して各ＤＮＡを抽出した。すなわち、前記培養菌株を、径約１ｍｍの白金耳で１白金耳分を取り、蒸留水１ｍｌに浮遊させ、１００℃で５分煮沸処理した。菌浮遊液を１４０００ｒｐｍで５分遠心し、上清をそれぞれの鋳型ＤＮＡとして使用した。
（３）増幅
増幅はＰＣＲによって行なった。すなわち、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ、ＴａＫａＲａ Ｒ００１Ａ）０．１μｌ、ｄＮＴＰ混合物２μｌ、１０×ＰＣＲバッファー２μｌ（Ｍｇ2+添加）を（２）で調製したＤＮＡ鋳型２μｌ、プライマー各２μｌ、滅菌蒸留水９．９μｌとともにＰＣＲチューブ内に入れた（反応液全量：２０μｌ）。なお、ｄＮＴＰとバッファーはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ添付のものを用いた。
ＰＣＲは遺伝子増幅装置（ＴａＫａＲａ ＴＰ−６００）を使用し、９４℃５分の熱変性を１サイクル行なった後、９４℃３０秒の熱変性−６０℃１分のアニーリング−７２℃２分のＤＮＡ伸長反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分、１サイクルの伸長反応を行なった。
（４）検出
上記ＰＣＲ産物とＤＮＡ分子量マーカー（φＸ１７４ＨｉｎｃＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０６Ａ））各１０μｌを２％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ ３：１ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｔａｋａｒａ）に添加し、Ｍｕｐｉｄ−２泳動装置（コスモ・バイオ株式会社）を用いて、１００Ｖで５０分泳動した。アガロースゲルはエチジウムブロマイドで染色し、３０２ｎｍのトランスイルミネータ（フナコシ株式会社ＴＭ−３６）で紫外線照射し、検出されたＤＮＡ泳動像を６６５フィルム（Ｐｏｌａｒｏｉｄ）で写真撮影した。
結果を図１に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ２〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）を用いた場合、Ｏ１抗原血清型の被験細菌株でのみ４９５ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）によれば、Ｏ１抗原型が有効に判別できる。
実施例２：プライマー対（ＰＡ３Ａ，ＰＡ３Ｂ）によるＯ３抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ３ＡとＰＡ３Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図２に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ３抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ３）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ３Ａ，ＰＡ３Ｂ）を用いた場合、Ｏ３抗原血清型の被験細菌株でのみ６５５ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ３Ａ，ＰＡ３Ｂ）によれば、Ｏ３抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡ３ＡとＰＡ３Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図２に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ３抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ３）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ３Ａ，ＰＡ３Ｂ）を用いた場合、Ｏ３抗原血清型の被験細菌株でのみ６５５ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ３Ａ，ＰＡ３Ｂ）によれば、Ｏ３抗原型が有効に判別できる。
実施例３：プライマー対（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）によるＯ４抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ４ＡとＰＡ４Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＵＣ１９ＤＮＡ／ＭｓｐＩ（ＨｐａＩＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０２２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図３に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ４抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ４）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）を用いた場合、Ｏ４抗原血清型の被験細菌株でのみ５５０ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）によれば、Ｏ４抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡ４ＡとＰＡ４Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＵＣ１９ＤＮＡ／ＭｓｐＩ（ＨｐａＩＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０２２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図３に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ４抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ４）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）を用いた場合、Ｏ４抗原血清型の被験細菌株でのみ５５０ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）によれば、Ｏ４抗原型が有効に判別できる。
実施例４：プライマー対（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）によるＯ６抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ６ＡとＰＡ６Ｂを使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図４に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ６抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ６）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）を用いた場合、Ｏ６抗原血清型の被験細菌株でのみ８９６ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）によれば、Ｏ６抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡ６ＡとＰＡ６Ｂを使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図４に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ６抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ６）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）を用いた場合、Ｏ６抗原血清型の被験細菌株でのみ８９６ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）によれば、Ｏ６抗原型が有効に判別できる。
実施例５：プライマー対（ＰＡ９Ａ，ＰＡ９Ｂ）によるＯ９抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ９ＡとＰＡ９Ｂを使用した他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図５に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ９抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ９）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ９Ａ，ＰＡ９Ｂ）を用いた場合、Ｏ９抗原血清型の被験細菌株でのみ４２８ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ９Ａ，ＰＡ９Ｂ）によれば、Ｏ９抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡ９ＡとＰＡ９Ｂを使用した他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図５に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ９抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ９）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ９Ａ，ＰＡ９Ｂ）を用いた場合、Ｏ９抗原血清型の被験細菌株でのみ４２８ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ９Ａ，ＰＡ９Ｂ）によれば、Ｏ９抗原型が有効に判別できる。
実施例６：プライマー対（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）によるＯ１１抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１１ＡとＰＡ１１Ｂを使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図６に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１１抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１２〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）を用いた場合、Ｏ１１抗原血清型の被験細菌株でのみ１０６９ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）によれば、Ｏ１１抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡ１１ＡとＰＡ１１Ｂを使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図６に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１１抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１２〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）を用いた場合、Ｏ１１抗原血清型の被験細菌株でのみ１０６９ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）によれば、Ｏ１１抗原型が有効に判別できる。
実施例７：プライマー対（ＰＡ１２Ａ，ＰＡ１２Ｂ）によるＯ１２抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１２ＡとＰＡ１２Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図７に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１２抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０（除くＯ１２）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１２Ａ，ＰＡ１２Ｂ）を用いた場合、Ｏ１２抗原血清型の被験細菌株でのみ５６３ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１２Ａ，ＰＡ１２Ｂ）によれば、Ｏ１２抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡ１２ＡとＰＡ１２Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図７に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１２抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０（除くＯ１２）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１２Ａ，ＰＡ１２Ｂ）を用いた場合、Ｏ１２抗原血清型の被験細菌株でのみ５６３ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１２Ａ，ＰＡ１２Ｂ）によれば、Ｏ１２抗原型が有効に判別できる。
実施例８：プライマー対（ＰＡ１５Ａ，ＰＡ１５Ｂ）によるＯ１５抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１５ＡとＰＡ１５Ｂを使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図８に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１５抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０（除くＯ１５）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１５Ａ，ＰＡ１５Ｂ）を用いた場合、Ｏ１５抗原血清型の被験細菌株でのみ１０１８ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１５Ａ，ＰＡ１５Ｂ）によれば、Ｏ１５抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡ１５ＡとＰＡ１５Ｂを使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図８に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１５抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０（除くＯ１５）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１５Ａ，ＰＡ１５Ｂ）を用いた場合、Ｏ１５抗原血清型の被験細菌株でのみ１０１８ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１５Ａ，ＰＡ１５Ｂ）によれば、Ｏ１５抗原型が有効に判別できる。
実施例９：本発明のプライマー対による群別血清型の型別
デンカ生研血清凝集反応によりＭ群と判定された試料７菌株について、前記実施例と同様に本発明のプライマーを順次用いてＰＣＲ法による型別を試みた。その結果、（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）、（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）、（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）、（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）による型別を行なった段階で、これらはＯ１抗原型１株、Ｏ４抗原型１株、Ｏ６抗原型２株、Ｏ１１抗原型３株であることが判明した。これらの菌株について念のため、残りのプライマーを用いた試験も行なったがいずれも増幅はみられなかった。
デンカ生研血清凝集反応によりＭ群と判定された試料７菌株について、前記実施例と同様に本発明のプライマーを順次用いてＰＣＲ法による型別を試みた。その結果、（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）、（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）、（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）、（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）による型別を行なった段階で、これらはＯ１抗原型１株、Ｏ４抗原型１株、Ｏ６抗原型２株、Ｏ１１抗原型３株であることが判明した。これらの菌株について念のため、残りのプライマーを用いた試験も行なったがいずれも増幅はみられなかった。
実施例１０：判定不能株の本発明のプライマー対による型別
デンカ生研血清凝集反応で凝集が見られず判定不能菌とされた試料９菌株について、前記実施例と同様に本発明のプライマーを順次用いてＰＣＲ法による型別を試みた。その結果、（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）、（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）、（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）、（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）による型別を行なった段階で、これらはＯ１抗原型２株、Ｏ４抗原型１株、Ｏ６抗原型３株、Ｏ１１抗原型３株であることが判明した。これらの菌株について念のため、残りのプライマーを用いた試験も行なったがいずれも増幅はみられなかった。
デンカ生研血清凝集反応で凝集が見られず判定不能菌とされた試料９菌株について、前記実施例と同様に本発明のプライマーを順次用いてＰＣＲ法による型別を試みた。その結果、（ＰＡ６Ａ，ＰＡ６Ｂ）、（ＰＡ１１Ａ，ＰＡ１１Ｂ）、（ＰＡ４Ａ，ＰＡ４Ｂ）、（ＰＡ１Ａ，ＰＡ１Ｂ）による型別を行なった段階で、これらはＯ１抗原型２株、Ｏ４抗原型１株、Ｏ６抗原型３株、Ｏ１１抗原型３株であることが判明した。これらの菌株について念のため、残りのプライマーを用いた試験も行なったがいずれも増幅はみられなかった。
実施例１１：プライマー対（ＰＡ１７Ａ，ＰＡ１７Ｂ）によるＯ１７抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１７ＡとＰＡ１７Ｂを使用した他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図９に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１７抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０（除くＯ１７）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１７Ａ，ＰＡ１７Ｂ）を用いた場合、Ｏ１７抗原血清型の被験細菌株でのみ７４８ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１７Ａ，ＰＡ１７Ｂ）によれば、Ｏ１７抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡ１７ＡとＰＡ１７Ｂを使用した他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図９に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１７抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１２、１５〜２３はそれぞれＯ１〜Ｏ１０、Ｏ１１〜Ｏ２０（除くＯ１７）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン２４にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１７Ａ，ＰＡ１７Ｂ）を用いた場合、Ｏ１７抗原血清型の被験細菌株でのみ７４８ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１７Ａ，ＰＡ１７Ｂ）によれば、Ｏ１７抗原型が有効に判別できる。
実施例１２：プライマー対（ＰＡＢ１，ＰＡＢ２）によるＯ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、及びＯ２０抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡＢ１とＰＡＢ２を使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１０に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ２抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ２）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡＢ１，ＰＡＢ２）を用いた場合、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、及びＯ２０抗原血清型の被験細菌株でのみ６３９ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡＢ１，ＰＡＢ２）によれば、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、及びＯ２０抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡＢ１とＰＡＢ２を使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１０に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ２抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１０（除くＯ２）、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡＢ１，ＰＡＢ２）を用いた場合、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、及びＯ２０抗原血清型の被験細菌株でのみ６３９ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡＢ１，ＰＡＢ２）によれば、Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１６、Ｏ１８、及びＯ２０抗原型が有効に判別できる。
実施例１３：プライマー対（ＰＡＣ１，ＰＡＣ２）によるＯ７及びＯ８抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡＣ１とＰＡＣ２を使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１１に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ７抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３と１５はＯ８抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン４〜１２、１６〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１１（除くＯ７、Ｏ８）、Ｏ１２〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡＣ１，ＰＡＣ２）を用いた場合、Ｏ７及びＯ８抗原血清型の被験細菌株でのみ８１５ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡＣ１，ＰＡＣ２）によれば、Ｏ７及びＯ８抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡＣ１とＰＡＣ２を使用し、分子量マーカーをφＸ１７４ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ（ＴａＫａＲａ３４０５Ａ）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１１に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ７抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３と１５はＯ８抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン４〜１２、１６〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ１１（除くＯ７、Ｏ８）、Ｏ１２〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡＣ１，ＰＡＣ２）を用いた場合、Ｏ７及びＯ８抗原血清型の被験細菌株でのみ８１５ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡＣ１，ＰＡＣ２）によれば、Ｏ７及びＯ８抗原型が有効に判別できる。
実施例１４：プライマー対（ＰＡ１０Ａ，ＰＡ１０Ｂ）によるＯ１０及びＯ１９抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１０ＡとＰＡ１０Ｂを使用した他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１２に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１０抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ９、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１０Ａ，ＰＡ１０Ｂ）を用いた場合、Ｏ１０及びＯ１９抗原血清型の被験細菌株でのみ６２７ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１０Ａ，ＰＡ１０Ｂ）によれば、Ｏ１０及びＯ１９抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡ１０ＡとＰＡ１０Ｂを使用した他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１２に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１０抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３〜１１、１５〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ９、Ｏ１１〜Ｏ２０抗原血清型由来のＤＮＡに対応する（レーン１２にはいずれのＤＮＡも加えていない）。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１０Ａ，ＰＡ１０Ｂ）を用いた場合、Ｏ１０及びＯ１９抗原血清型の被験細菌株でのみ６２７ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１０Ａ，ＰＡ１０Ｂ）によれば、Ｏ１０及びＯ１９抗原型が有効に判別できる。
実施例１５：プライマー対（ＰＡ１３Ａ，ＰＡ１３Ｂ）によるＯ１３及びＯ１４抗原血清型の識別
プライマー対としてＰＡ１３ＡとＰＡ１３Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１３に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１３抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３と１５はＯ１４抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン４〜１２、１６〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ９、Ｏ１０〜Ｏ２０（除くＯ１３、Ｏ１４）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１３Ａ，ＰＡ１３Ｂ）を用いた場合、Ｏ１３及びＯ１４抗原血清型の被験細菌株でのみ５２１ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１３Ａ，ＰＡ１３Ｂ）によれば、Ｏ１３及びＯ１４抗原型が有効に判別できる。
プライマー対としてＰＡ１３ＡとＰＡ１３Ｂを使用し、分子量マーカーをｐＢＲ３２２ＤＮＡ／ＡｌｕＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＳＭ０１２１）に代えた他は実施例１と同様にして、菌の培養、ＰＣＲ、電気泳動を行なった。結果を図１３に示す。図中、レーン１と１３はマーカー、レーン２と１４はＯ１３抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン３と１５はＯ１４抗原血清型由来のＤＮＡに対応し、レーン４〜１２、１６〜２４はそれぞれＯ１〜Ｏ９、Ｏ１０〜Ｏ２０（除くＯ１３、Ｏ１４）抗原血清型由来のＤＮＡに対応する。
この結果に示されるように、プライマー対（ＰＡ１３Ａ，ＰＡ１３Ｂ）を用いた場合、Ｏ１３及びＯ１４抗原血清型の被験細菌株でのみ５２１ｂｐの増幅が見られ、他の抗原血清型の被験細菌株ではこのプライマー対による増幅は認められない。従って、本発明のプライマー対（ＰＡ１３Ａ，ＰＡ１３Ｂ）によれば、Ｏ１３及びＯ１４抗原型が有効に判別できる。
本発明によれば、従来、血清凝集反応により識別されてきた菌株についてＰＣＲ法により明確に識別できる。また、従来の血清凝集反応によりＭ群とのみ判定されている菌株や従来のデンカ生研血清凝集反応では型別凝集反応が起こらないため判別ができなかった菌株についても判定することができる。また、国際的な型に準拠した詳細な型別が可能であるとともに、高価なモノクローナル抗体を用いることなく正確性の高い識別が可能となるため、従来日本国内で行なわれている緑膿菌研究会法に代わる標準法として高い有用性を有し、幅広く応用が可能である。
Claims (6)
- 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の被検菌株から得たＤＮＡを鋳型とし、各Ｏ抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド対をプライマーとして増幅反応を行ない、増幅産物がいずれのプライマー対に対応するかを識別することにより、被検菌株のＯ抗原血清型を識別する緑膿菌の型の判別方法であって、
Ｏ１１抗原血清型を識別するために、Ｏ１１抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対を用いて増幅反応を行なうことを特徴とする緑膿菌の型の判別方法。 - 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の被検菌株から得たＤＮＡを鋳型とし、各Ｏ抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド対をプライマーとして増幅反応を行ない、増幅産物がいずれのプライマー対に対応するかを識別することにより、被検菌株のＯ抗原血清型を識別する緑膿菌の型の判別方法であって、
Ｏ１１抗原血清型を識別するために、
Ｏ１１抗原血清型については、Ｏ１１抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対を用いて増幅反応を行ない、
Ｏ３、Ｏ１２、Ｏ１５、および／またはＯ１７抗原血清型を識別するために、
１）Ｏ３抗原血清型については、Ｏ３抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号３と配列番号４の塩基配列を含むプライマー対、
２）Ｏ１２抗原血清型については、Ｏ１２抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１３と配列番号１４の塩基配列を含むプライマー対、
３）Ｏ１５抗原血清型については、Ｏ１５抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１５と配列番号１６の塩基配列を含むプライマー対、
４）Ｏ１７抗原血清型については、Ｏ１７抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１７と配列番号１８の塩基配列を含むプライマー対を用いて増幅反応を行なう請求項１に記載の緑膿菌の型の判別方法。 - 増幅をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行なう請求項１または２に記載の緑膿菌の型の判別方法。
- 増幅産物の識別をアガロースゲル電気泳動により行なう請求項１または２に記載の緑膿菌の型の判別方法。
- 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の被検菌株から得たＤＮＡを鋳型とし、各Ｏ抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド対をプライマーとして増幅反応を行ない、増幅産物がいずれのプライマー対に対応するかを識別することにより、被検菌株のＯ抗原血清型を識別する緑膿菌の型の判別方法で用いるプライマー対であって、
Ｏ１１抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対を含む、緑膿菌のＯ１１抗原血清型を識別するプライマー対を含むことを特徴とする緑膿菌の型別用プライマーセット。 - 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の被検菌株から得たＤＮＡを鋳型とし、各Ｏ抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド対をプライマーとして増幅反応を行ない、増幅産物がいずれのプライマー対に対応するかを識別することにより、被検菌株のＯ抗原血清型を識別する緑膿菌の型の判別方法で用いるプライマー対であって、
Ｏ１１抗原血清型については、Ｏ１１抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１１と配列番号１２の塩基配列を含むプライマー対を含む、緑膿菌のＯ１１抗原血清型を識別するプライマー対を含み、
１）Ｏ３抗原血清型については、Ｏ３抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号３と配列番号４の塩基配列を含むプライマー対、
２）Ｏ１２抗原血清型については、Ｏ１２抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１３と配列番号１４の塩基配列を含むプライマー対、
３）Ｏ１５抗原血清型については、Ｏ１５抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１５と配列番号１６の塩基配列を含むプライマー対、
４）Ｏ１７抗原血清型については、Ｏ１７抗原血清型の緑膿菌ＤＮＡにのみ特異的なオリゴヌクレオチド対である、配列番号１７と配列番号１８の塩基配列を含むプライマー対を含む、緑膿菌のＯ３、Ｏ１２、Ｏ１５、および／またはＯ１７抗原血清型を識別するプライマー対を含む請求項５に記載の緑膿菌の型別用プライマーセット。
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