JP4219748B2 - プローブの蛍光標識化方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バルジ塩基が存在するＤＮＡプローブを蛍光標識化する方法、及びこれを用いてバルジ塩基の有無を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ及びＲＮＡ中に存在するバルジ構造は、蛋白質による核酸の認識に重要な役割を果たしている。これらの構造に特異的に結合する分子は、バルジ構造を認識する蛋白質の阻害剤としての可能性を有しているため、医薬開発の見地からも注目されている。
バルジＤＮＡ認識分子は、二本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子である。この認識分子が標的とするバルジＤＮＡは、ＤＮＡの複製エラーや、ＤＮＡ損傷の結果として生じる。また、遺伝子の異常であるバルジ塩基の有無は、遺伝病などの診断に利用されている。従って、このバルジＤＮＡ認識分子は、１）遺伝子欠損の有無を調べる診断薬、２）ＤＮＡ損傷の検出薬、３）遺伝子損傷の安定化剤、４）ＤＮＡ修復酵素の阻害剤などへの利用が期待されているのみならず、遺伝子の損傷や遺伝子の複製ミスなどの研究開発において重要な物質である。
【０００３】
本発明者らは先に、バルジ塩基と特異的に水素結合を形成することができ、かつバルジ塩基の近隣に存在する塩基対によりスタックされ二本鎖内に安定に取り込まれ得るバルジ塩基認識分子において、当該バルジ認識分子がさらにバルジ塩基と共有結合を形成し得る官能基を有しているバルジ認識分子を見出した（特許文献１）。
【０００４】
このバルジ認識分子は、２本鎖ＤＮＡのバジル塩基を認識し、次いでこれと共有結合して安定な複合体を形成することから、このバルジ認識分子を固定化することによりバルジ塩基を含んでいるＤＮＡのみを選択的に固定化することができ、チップなどの担体を用いて固定化したＤＮＡとして検出、同定又は定量化することが可能となった。
【０００５】
しかしながら、実際にバルジ塩基を測定するには、バルジ認識分子をチップなどの担体に固定化すること、検定するＤＮＡのいずれかを標識化することなどの煩雑な工程がが必要となり、コストもかかるものであった。
【０００６】
【特許文献１】
特願２００２−６２８８３号
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、バルジ塩基の存在している二本鎖ＤＮＡと、上記のバルジ塩基認識分子を反応させて複合体を形成し、これを化学処理することによってプローブを蛍光標識化する方法およびこれを用いて容易に、バルジ塩基を検出、同定する方法を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、バルジ塩基の存在している二本鎖ＤＮＡと、上記のバルジ塩基認識分子を反応させて得られる複合体を酸で処理したところ、蛍光物質が生成されること、バルジ塩基が存在しない二本鎖ＤＮＡと、上記のバルジ塩基認識分子を反応させても生成物が得られないのでこれを酸で処理しても、蛍光物質が生成されないことを見出した。
【０００９】
即ち、本発明は、正常な塩基配列を有するＤＮＡ及び被検体のＤＮＡをハイブリダイズし、これにバルジ塩基認識分子を反応させ、得られる複合体を酸で処理して蛍光標識化する方法、この方法によって被検体がバルジ塩基を形成するか否かを判定する方法に関する。
【００１０】
本発明で用いられるバルジ塩基認識分子は、特願２０００−６２８８３号に記載のとおり、次の一般式（Ｉ）、
【００１１】
【化２】

【００１２】
（式中、Ａは、＝Ｃ−又は＝Ｎ−を示し、
Ｚは、−ＣＨ_２−又は−ＮＨ−を示し、
Ｒ_１は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｒ_２は、バルジ塩基と共有結合を形成し得る官能基を置換基として有する炭素数１〜２０のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基を示し、ｎは０もしくは１である。）
で表される化合物である。
【００１３】
本発明のバルジ塩基認識分子として、例えば、グアニンのバルジ塩基を認識するものとして、１，８−ナフチリジン誘導体から誘導された、次式（II）、
【００１４】
【化３】

【００１５】
で表される２−（β−（Ｎ−エポキシメチル−アミノ）−プロピオニルアミノ）−７−メチル−１，８−ナフチリジンに基づいて図１を参照して本発明を説明する。
【００１６】
ターゲット遺伝子（一本鎖）にグアニン一塩基多い配列を持つプローブをハイブリダイズすると、グアニンバルジを持つ二本鎖が生成する（工程２）。このグアニンバルジ二本鎖ＤＮＡと式（ＩＩ）化合物を反応させると２−アシルナフチリジンがグアニンバルジを認識する（工程２）。次いで、式（ＩＩ）化合物の側鎖にあるエポキシドがターゲット及び／又はプローブのＤＮＡと共有結合（ラベル化）する（工程３）。この時点で二本鎖に２−アシルアミノナフチリジンが共有結合しているが、２−アシルアミノナフチリジンの蛍光は弱いので、検出することは難しい。次に、反応系より過剰の修飾分子（バルジ塩基認識分子）を除去し、２−アシルアミノナフチリジンで修飾された二本鎖ＤＮＡを酸で処理すると、２−アシルアミノナフチリジンのアミド結合が加水分解され、蛍光性の２−アミノナフチルジンが生成する（工程４）。
【００１７】
この蛍光を観測することにより、グアニンバルジの存在を判定することができる。ＤＮＡが修飾されていない場合、即ち、グアニンバルジが二本鎖ＤＮＡ上にない場合には、２−アミノナフチリジンが生成しないので、蛍光は観察されない。
【発明の実施の形態】
【００１８】
本発明のバルジ認識分子は、バルジ塩基認識部及びバルジ塩基修飾部を含有し、この両部が適当な炭素鎖、好ましくは当該炭素鎖中の１個又はそれ以上の炭素原子は酸素原子又は窒素原子で置換されていてもよい炭素鎖によって結合されていることを特徴とするものであり、かかる特徴を有するものであれば特に制限はない。本発明のバルジ認識分子の好ましいものとして一般式（Ｉ）で表される物質を挙げることができる。一般式（Ｉ）における置換基Ｒ_１は無くてもよいが（置換基Ｒ_１とが水素原子の場合）、置換基Ｒ_１としてはバルジ塩基を認識するために障害にならないものであれば特に制限はなく、例えば、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基からなるアルコキシ基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基でモノ又はジ置換されているモノ若しくはジアルキルアミノ基などが挙げられる。これらのアルキル基、アルコキシ基又はモノ若しくはジアルキルアミノ基における１個又はそれ以上の炭素原子は、酸素原子又は窒素原子で置換されていてもよい。置換基Ｒ_１は、ナフチリジン又はキノリン骨格のいずれの位置に存在してもよく、またこのような置換基が２個以上存在していてもよい。
【００１９】
本発明の一般式（Ｉ）で表されるバルジ認識分子における置換基Ｒ_２は、バルジ塩基と共有結合を形成し得る官能基を置換基として有する炭素数１〜２０、好ましくは炭素数３〜２０、炭素数３〜１０、又は炭素数３〜７のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基を示し、好ましくは当該アルキル基中の少なくとも１個の炭素原子が窒素原子（−ＮＨ−）で置換された構造を有するものである。当該アルキル基は、さらに必要ならば、例えば分子の親水性を上げるためや、ＤＮＡなどとの親和性のためにある程度の極性を有する置換基を有してもよく、このような置換基は当該アルキル基の末端に位置していてもよいし、アルキル基の他の位置に存在していてもよいし、また２個以上の置換基が存在していてもよい。このような置換基としては、例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基などが挙げられる。本発明のバルジ認識分子をチップなどの担体に固定化する場合には、当該アルキル基の任意の位置から担体に固定用のリンカー基を有してもよい。このようなリンカー基としては、アルキレン鎖や当該アルキレン鎖中の１個以上の炭素原子が窒素原子、酸素原子、硫黄原子、又はアミド結合などで置換されたものであってもよい。このようなリンカーの長さは特に制限はなく、担体に安定に固定するために必要な長さとすることができる。
【００２０】
また、一般式（Ｉ）における置換基Ｒ_２のバルジ塩基と共有結合を形成し得る官能基としては、室温または加温状態においてバルジ塩基と反応することができる反応性の基であれば特に制限はないが、エポキシ基、アジリジニル基、シクロプロピル基などの３員環の基が好ましい例として挙げられるが、他の反応性に基であってもよい。
さらに、一般式（Ｉ）におけるＡが窒素原子であるナフチリジン誘導体が好ましいが、Ａが炭素原子であるキノリン誘導体であってもよい。一般式（Ｉ）におけるＺがメチレン基の場合のアミド型であってもよいし、Ｚが窒素原子（−ＮＨ−）の場合の尿素型であってもよい。
本発明の一般式（Ｉ）で表されるバルジ認識分子の好ましい例としては、一般式（II）で表されるエポキシナフチリジンが挙げられる。
【００２１】
本発明のバルジ認識分子、好ましくは一般式（Ｉ）で表されるバルジ塩基認識分子は低分子有機化合物であり、通常の有機合成法により適宜製造することができる。例えば、アミノナフチリジンやアミノキノリン誘導体のアミノ基をカルボン酸類や置換基を有するカルボン酸又はその反応性誘導体を用いてアミド化し、次いでカルボン酸部分にバルジ塩基と反応性の官能基を導入する方法により製造することができる。例えば、前記した一般式（II）で表されるエポキシナフチリジンは、２−アミノ−１，８−ナフチリジン又は２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジンとＮ−保護−４−アミノ−酪酸又はＮ−保護−３−アミノ−プロピオン酸とを反応させてアミド誘導体とし、ついで末端のアミノ基の保護基を脱保護した後、エポキシ基を導入して製造することができる。
【００２２】
工程１における、グアニンバルジ形成は、一本鎖のターゲット遺伝子とグアニン一塩基多いプローブを通常の方法でハイブリダイズすればよい。例えば、ターゲット遺伝子とプローブを緩衝液中９５℃で短時間（５分）加熱後、ゆっくりと放冷することにより、グアニンバルジを形成することができる。
【００２３】
工程２及び３におけるグアニンバルジ二本鎖ＤＮＡとバルジ認識分子との反応は、緩衝溶液中で、二本鎖ＤＮＡとバルジ認識分子を反応させればよい。緩衝液としては、例えばカコジル緩衝液などが挙げられ、これらのｐＨは６．０〜８．０が好ましく、中性付近が特に好ましい。バルジ認識分子の使用量はは二本鎖ＤＮＡに対して１〜１００倍であり、好ましくは１０倍程度である。反応は、０〜６０℃、好ましくは４〜５０℃で、１０〜２４時間程度で終了する。
【００２４】
工程４における化学処理は、加溶媒分解が好ましく、特に酸による加水分解が特に好ましい。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸などの無機酸、酢酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸が挙げられるが、濃塩酸の使用が特に好ましい。反応は例えば、工程３終了後に過剰のバルジ認識分子を例えば、エタノール沈殿、液体クロマトグラフィーや分子サイズ排除型のメンブランフィルターなどで除去し、次いで例えば濃塩酸を加えて、５０〜９５℃、好ましくは６０〜９０℃で、０．５〜３時間加熱することにより終了する。
【００２５】
上記の反応によって生成した２−アミノナフチリジンの濃度は例えば、蛍光スペクトルを励起波長３５２ｎｍで測定し、濃度既知の２−アミノナフチリジンを対照として用い、それらの強度比から求めることができる。
【００２６】
本発明の方法は、任意の配列のラベル化が可能であり、蛍光ラベルしたＤＮＡの合成が不要であるためコストが安くなり、さらに、ある条件に合致したＤＮＡ（グアニンバルジが形成されたＤＮＡ）のみがラベル化されるなどの特徴を有する、有用な方法である。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１（エポキシナフチリジンの製造法）
エポキシナフチリジンの製造における反応式を次に示す。
【００２９】
【化４】

【００３０】
（１）３−アミノ−Ｎ−（７−メチルピリジノ［３，２−ｅ］ピリジン−２−イル）プロパンアミド（１．２３ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）の無水ＣＨＣｌ_３（１５ｍＬ）溶液に（Ｓ）−（＋）−エピクロルヒドリン（０．６ｍＬ、７．６５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２７．５時間撹件した。溶媒を濃縮留去した後、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ＝１０：１）により精製し、目的の付加体（９５．４ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、５．５％）を白色固体として得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤ_３ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ：
11.1 (br, 1H), 8.43 (d, 1H, J=8.8Hz), 8.11 (d, 1H, J=8.8Hz),
8.00 (d, 1H, J=8.0Hz), 7.27 (d, 1H, J=8.0Hz), 4.13 (m, 1H),
3.64 (m, 2H), 3.08 (m, 2H), 2.98 (dd, 1H, J=12.8,3.2Hz)．
【００３１】
（２）続いて、水素化ナトリウム（６０％油分散液）（１９．８ｍｇ、０．４９５ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（０．６ｍＬ）溶液に、前記（１）で得た付加体（１２．５ｍｇ、３８．７μｍｏｌ）を加え、室温で１０分間撹件した。混合物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液で希釈した後、ＣＨＣｌ_３で抽出した。有機層を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ＝１０：１）により精製し、目的のエポキシナフチリジン（８．６ｍｇ、３０．０μｍｏｌ、７８％）を白色固体として得た。
^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤ_３ＯＤ，４００ＭＨｚ） δ：
8.45 (d, 1H, J=8.8Hz), 8.10 (d, 1H, J=8.8Hz),
7.98 (d, 1H, J=8.0Hz), 7.25(d, 1H, J=8.0Hz), 3.22 (m, 1H),
3.15-3.07 ( 3H), 2.81 (m, 1H), 2.74 (s, 3H), 2.68-2.65 ( 2H),
2.60 (m, 2H)
【００３２】
実施例２ （グアニンバルジＤＮＡとエボキシナフチリジンの反応）
実験に用いたオリゴマー（１）及びオリゴマー（２）の塩基配列を次に示す。
＊
オリゴマー（１） ５’−ＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＡ−３’
オリゴマー（２） ３’−ＣＡＡＣＡ ＡＡＣＣＴ−５’
このオリゴマー（２）は、オリゴマー（１）のグアニン（Ｇ）の位置（＊印を付した部分）の塩基が欠損しており、オリゴマー（１）のグアニン（Ｇ）がバルジ塩基となっている。
このオリゴマー（１）とオリゴマー（２）とをハイブリダイズさせたｄ（５’−ＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＡ−３’）／ｄ（３’−ＣＡＡＣＡ ＡＡＣＣＴ−５’）（６２.５μＭ，標準濃度）および内部標準としてｄＴ（１００μＭ）を含むカコジル酸緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）に、実施例１で製造したエポキシナフチリジン（１２５μＭ）を加え、４℃で１８時間反応させた。反応混合物をＨＰＬＣにより分析した。
分析条件：カラム ＣｈｃｍｃｏＢｏｎｄ ５−ＯＤＳ−Ｈ（４．６ｘ１５０ｍｍ）、溶出 ０．１Ｍ ＴＥＡＡバッファー、７−３０％アセトニトリル直線勾配、０−３０分、溶出速度 １．０ｍＬ／分。
生成物のＨＰＬＣピークは２５４ｎｍで観測した。２０時間後付加体を分取し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ測定により分析した。
オリゴマー（２）（Ａ Ａ）とオリゴマー（１）（ＴＧＴ）からなるグアニンバルジをエポキシナフチリジン（図中の２）と反応させ４℃１８時間後のＨＰＬＣ分析結果を図２に示す。オリゴマー（１）と２の付加体（２−ＴＧＴ）の生成と共にＴＧＴの減少が認められた。カッコ内の数字は反応スタート時における各オリゴマーの内部標準ｄＴ（デオキシチミジン）に対するＨＰＬＣのピーク面積との差を％で表示している。オリゴマー（２）はほとんど減少していない。
【００３３】
実施例３ （加水分解）
実施例２で得られた反応混合物をＨＰＬＣで過剰のバルジ認識分子を除き精製、濃縮し、これに濃塩酸１ｍｌを加え、１５℃で４０分間加熱し、濃縮した。
【００３４】
実施例４ （蛍光スペクトルの測定）
（ａ）実施例３で得られた粗組成物を７５０ｍｌのバッファーに溶解した溶液、（ｂ）同緩衝液に溶解した２−アミノナフチリジン（１０μＭ）及び（ｃ）化合物（ＩＩ）（１０μＭ）をカコジル酸緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）中で励起波長３５３ｎｍで測定した。結果を図３に示す。
（ａ）と（ｂ）の蛍光強度比から２−アミノナフチリジンの濃度が３７μＭ（２７ｎｍｏｌ）と計算された。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の蛍光標識化方法は、蛍光標識化したＤＮＡを用いずにバルジが形成されたＤＮＡのみを標識化するもので、操作が容易で、安価な方法である。この方法を用いることにより、遺伝子の欠損の有無や、欠損した塩基の種類を高感度で、大量かつ迅速に検出、同定又は定量することができることになり、ＤＮＡの損傷に伴う各種疾患の治療、予防又は診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明方法の概要を模式的に示したものである。
【図２】図２は、実施例２で得られた複合体のＨＰＬＣのチャートを示す。
【図３】図３は、実施例４で得られた蛍光スペクトルを示す。

Claims (10)

1. バルジ塩基を有する２本鎖ＤＮＡに、次の一般式（Ｉ）、
   

   

   （式中、Ａは、＝Ｃ−又は＝Ｎ−を示し、
   Ｚは、−ＣＨ _２ −又は−ＮＨ−を示し、
   Ｒ _１ は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、
   Ｒ _２ は、エポキシ基、アジリジニル基、又はシクロプロピル基を置換基として有する炭素数３〜７のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基を示し、
   ｎは１である。）
   で表されるバルジ塩基認識分子を反応させて複合体を形成し、これを加水分解することを特徴とする、グアニンであるバルジ塩基を有する２本鎖ＤＮＡの蛍光標識化方法。
2. バルジ塩基認識分子が、１，８−ナフチリジン誘導体である、請求項１に記載の蛍光標識化方法。
3. バルジ塩基認識分子を表す一般式（Ｉ）のＲ _２ が、エポキシ基である、請求項１又は２に記載の蛍光標識化方法。
4. バルジ塩基認識分子が、２−（β−（Ｎ−エポキシメチル−アミノ）−プロピオニルアミノ）−７−メチル−１，８−ナフチリジンである、請求項１〜３のいずれかに記載の蛍光標識化方法。
5. ２本鎖ＤＮＡが、被検体のＤＮＡ及びこのＤＮＡよりグアニン一塩基多いプローブＤＮＡをハイブリダイズさせたグアニンバルジをもつものである、請求項１〜４のいずれかに記載の蛍光標識化方法。
6. バルジ塩基を有する２本鎖ＤＮＡに、次の一般式（Ｉ）、
   

   

   （式中、Ａは、＝Ｃ−又は＝Ｎ−を示し、
   Ｚは、−ＣＨ _２ −又は−ＮＨ−を示し、
   Ｒ _１ は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシ基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいアルコキシ基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいモノ若しく はジアルキルアミノ基を示し、
   Ｒ _２ は、エポキシ基、アジリジニル基、又はシクロプロピル基を置換基として有する炭素数３〜７のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、イオウ原子又は窒素原子で置換されてもよいアルキル基を示し、
   ｎは１である。）
   で表されるバルジ塩基認識分子を反応させて複合体を形成し、これを加水分解して、バルジ塩基を有する２本鎖ＤＮＡを蛍光標識化したのち蛍光を測定することを特徴とする、グアニンであるバルジ塩基を検出、同定又は定量する方法。
7. バルジ塩基認識分子が、１，８−ナフチリジン誘導体である、請求項６に記載の方法。
8. バルジ塩基認識分子を表す一般式（Ｉ）のＲ _２ が、エポキシ基である、請求項６又は７に記載の方法。
9. バルジ塩基認識分子が、２−（β−（Ｎ−エポキシメチル−アミノ）−プロピオニルアミノ）−７−メチル−１，８−ナフチリジンである、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
10. ２本鎖ＤＮＡが、被検体のＤＮＡ及びこのＤＮＡよりグアニン一塩基多いプローブＤＮＡをハイブリダイズさせたグアニンバルジをもつものである、請求項６〜９のいずれかに記載の方法。

Images