JP4243387B2

JP4243387B2 - 肥満細胞表面抗原のｄｎａ

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Publication number: JP4243387B2
Application number: JP19923099A
Authority: JP
Inventors: 信川井; 忠岡田; ふき子渥美; 昌夫柴田; 基樹久原
Original assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Priority date: 1999-07-13
Filing date: 1999-07-13
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2019-07-13
Also published as: JP2001025388A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肥満細胞表面抗原のＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
気管支喘息やスギ花粉症などのアレルギー疾患は、まず抗原に特異的なＩｇＥの産生の誘導が起こり、この誘導されたＩｇＥに活性化された肥満細胞や好塩基球からヒスタミン・好酸球遊走因子（ＥＣＦ−Ａ）やロイコトリエン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、トロンボキサンなどの各種ケミカルメディエーターが産生、遊離されることによってアレルギー性炎症が誘発される。特に組織内においては肥満細胞がこれらのケミカルメディエーターを放出することによって、アレルギー性病変の形成に重要な役割を担っている。
【０００３】
ヒトの肥満細胞は、肥満細胞中の顆粒に含まれる蛋白分解酵素の組成により、トリプターゼ陽性細胞（以下ＭＣ−Ｔという）と、トリプターゼ及びキマーゼの両者陽性細胞（以下ＭＣ−ＴＣという）に分けられる。ＭＣ−Ｔは主に肺や消化管粘膜組織に分布するのに対し、ＭＣ−ＴＣは主に皮膚組織に分布する。これらの肥満細胞は他の血液細胞と異なり、多能性幹細胞として骨髄を出て、末梢の環境に至り、肺又は皮膚の繊維芽細胞への接着の後、ＭＣ−Ｔ又はＭＣ−ＴＣとなる。このような肥満細胞はアレルギー疾患の病態形成において主要な役割を演じていると考えられることから、肥満細胞の生理的役割の解明において、肥満細胞を特異的に検出、分離することが必要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来、肥満細胞に特異的な細胞表面抗原は知られていなかった。また、肥満細胞に特異的な細胞表面抗原に対する抗体を用いれば、肥満細胞を特異的に除去あるいは消滅させることが可能となることから、これら肥満細胞に特異的な細胞表面抗原を明らかにすることはアレルギー疾患の病態の解明のみでなく、治療においても重要な意味を持つものである。
【０００５】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、肥満細胞表面抗原のＤＮＡを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
肥満細胞表面抗原は、配列番号１のアミノ酸配列を含むものである。このアミノ酸配列は、肥満細胞表面抗原のＤＮＡのコーディング領域を翻訳したものである。肥満細胞表面抗原のＤＮＡは、以下の手順によりその塩基配列を明らかにした。即ち、実施例の欄で詳述するように、臍帯血単核球から肥満細胞を得た後、この肥満細胞の細胞抽出液からｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製し、抗血清を用いてイムノスクリーニングを行い、得られた陽性クローンにつきＤＮＡシークエンサを用いてその塩基配列を確認した。なお、配列番号２の塩基配列のうち塩基番号３６〜３８の配列即ちＡＴＧが開始コドンであり、塩基番号２３９４〜２３９６の配列即ちＴＧＡがストップコドンである。つまり、塩基番号３６〜２３９６がコーディング領域であり、この区間の塩基配列が配列番号１のアミノ酸配列をコードしている。この肥満細胞抗原のアミノ酸配列が明らかになったことにより、アレルギー疾患の病態形成における肥満細胞の役割を解明することが可能となり、また、肥満細胞と特異的に反応する抗体を容易に入手可能となった。
【０００７】
肥満細胞表面抗原に対する抗体は、例えば配列番号１のアミノ酸配列を含む肥満細胞表面抗原を用いて哺乳動物（ヒトを除く）を免疫感作し、この免疫感作した哺乳動物から得られる抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して融合細胞を作製し、この融合細胞の中から肥満細胞表面抗原と特異的に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することにより、得ることができる。この抗体を用いれば、肥満細胞を特異的に除去したり消滅させたりすることが可能となることから、アレルギー疾患の治療が可能となる。つまり、この抗体はアレルギー疾患治療薬として期待される。
【０００８】
この抗体を産生する細胞は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む肥満細胞表面抗原を用いて哺乳動物（ヒトを除く）を免疫感作し、この免疫感作した哺乳動物から得られる抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合して融合細胞を作製し、この融合細胞の中から肥満細胞表面抗原と特異的に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養することにより、得ることができる。
【０００９】
【実施例】
［１］ＭＣ−ＴＣの培養
ヘパリン処理した臍帯血をフィコール・ハイパック液（比重１．０７７、シグマ社）に重層して３００×ｇで３０分間室温で遠心して単核球を分離し、１０％のＦＢＳ（ギブコ社）、５０μＭの２−メルカプトエタノール、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）に懸濁した。懸濁液の単核球数濃度を５×１０⁶／ｍｌに調整して、コラーゲンコートした１０ｃｍ培養シャーレ（イワキガラス）に蒔き、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、ペプロテック社）とＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ、ペプロテック社）を加えて２週間培養し、好中球系細胞、リンパ球、マクロファージ、好塩基球や肥満細胞の前駆細胞を含む２週間培養細胞を得た。なお、ＳＣＦは繊維芽細胞上に発現される肥満細胞の分化・増殖に関与する因子であり、ステム・セル・ファクタの略である。
【００１０】
上記で得られた臍帯血単核球をＳＣＦ１００ｎｇ／ｍｌとＩＬ−６５０ｎｇ／ｍｌの存在下で６週間培養し、ヒト肥満細胞が過半数を占めたところで、すなわち１０⁶個のオーダーのヒト肥満細胞が得られたところで、ヒトの繊維芽細胞の初代培養細胞との共生培養を行った。すなわち、ヒトの皮膚由来もしくは肺由来の繊維芽細胞の単層培養にこのヒト肥満細胞を移し、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦの存在下で２カ月間培養した。
【００１１】
共生培養前後の肥満細胞について、キマーゼ陽性の肥満細胞の割合と、トリプターゼ濃度を測定した。その結果を図１に示す。この図１において、共生培養前の肥満細胞すなわちＳＣＦとＩＬ−６の存在下で１０〜１６週間培養したヒト肥満細胞（図１のグラフの左端）ではキマーゼ陽性の肥満細胞の割合、トリプターゼ濃度ともにわずかしか認められなかった。これに対して皮膚繊維芽細胞と６〜８週間の共生培養後（図１のグラフの中央）及び肺繊維芽細胞との共生培養後（図１のグラフの右端）のヒト肥満細胞ではともに明らかな増加が認められ、特に皮膚繊維芽細胞と共生培養したヒト肥満細胞の場合に著しい増加が認められた。
【００１２】
ＳＣＦとＩＬ−６の存在下で１５週間培養した肥満細胞と、６週間の培養の後皮膚繊維芽細胞と共に２ヶ月間培養した肥満細胞について、トリプターゼに対する抗体及びキマーゼに対する抗体を用いて細胞を染色したところ、トリプターゼに対する染色ではどちらの細胞も全体に染色が認められたのに対し、キマーゼに対する染色では、繊維芽細胞と共生培養した細胞では殆どの細胞に染色が認められたのに対し、共生培養を行わなかった細胞では一部にしか染色が認められなかった。この結果、共生培養によってＭＣ−ＴがＭＣ−ＴＣに分化していることが判明した。
【００１３】
以上のように、結合組織型ヒト肥満細胞であるＭＣ−ＴＣは、臍帯血単核球をＳＣＦ、ＩＬ−６の存在下で培養後、さらにヒト皮膚繊維芽細胞の初代細胞と共生培養を行うことにより得た。
［２］ｍＲＮＡの調製
ファルマシア社の「クイック−プレプ・マイクロ・ｍＲＮＡ・ピュアリフィケーション・キット（Quick-Prep Micro mRNA Purification Kit）」の使用説明書に従い、上記ＭＣ−ＴＣの細胞抽出液よりポリＡの付いたｍＲＮＡを次の手順で抽出した。
１）２×１０⁶個のＭＣ−ＴＣを遠心してＰＢＳで２回洗浄した後、前出のキットに添付の溶出バッファ４００μＬを加えてボルテックスミキサー（回転式攪拌器）で良く攪拌したのち、さらに８００μＬの溶出バッファを加えてボルテックスミキサーで攪拌し、ポリプロピレン製チューブであるアシストチューブ（アシスト社）に移して、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿を除いた。
２）一方、１ｍＬのオリゴｄＴセルロースを１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清を除いた。
３）１）の細胞抽出液と２）のオリゴｄＴセルロースを混合し、３分間アシストチューブを転倒して良く混合した後、１４，０００ｒｐｍで５秒間遠心して上清を除き、１ｍＬの高塩濃度バッファ１ｍＬで５回洗浄した後、低塩濃度バッファで２回洗浄した。
４）沈殿物は３００μＬの低塩濃度バッファに懸濁し、前出のキットに添付のマイクロスピンカラムに入れて５秒間遠心し、５００μＬの低塩濃度バッファで３回洗浄した。
５）６５℃に温めた溶出バッファ２００μＬを加え、さらに１０μＬのグリコーゲン溶液と４００μＬの酢酸カリウム溶液を加え、９５％エタノール１ｍＬを加えた後、４℃で１４，０００ｒｐｍ、１時間遠心し、減圧乾燥した。
【００１４】
［３］ｃＤＮＡライブラリの作製
ストラッタジーン社の「ザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット(Zap-cDNA synthesis kit）」を用い、このキットの使用説明書に従って、上記［２］で得たｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製した。サイズフラクショネーションはこのキットに添付のＣＬ−２Ｂゲルを用いて行った。
【００１５】
［４］イムノスクリーニング
上記［３］で作製したｃＤＮＡライブラリのファージ液をＳＭバッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と、１００ｍＭのＮａＣｌと、１０ｍＭのＭｇＳＯ₄・Ｈ₂Ｏと、０．０１％ゼラチンとを含む）で希釈して２．５〜４×１０⁵ｐｆｕファージ／ｍＬに調整した。この液を１０本の遠心管に１００μＬずつ分注し、大腸菌（ＸＬ−１ｂｌｕｅ）の終夜培養液（５ｍＬのＮＺＹ培地で一晩培養し、Ｏ．Ｄ．₆₀₀＝１．５に調整したもの）５００μＬを加え、ボルテックスミキサーで攪拌し、３７℃で１５分間インキュベートした。これに７ｍＬのソフトアガロース（電気泳動用アガロースを培地に溶解して０．６％としたもの）を加えてボルテックスミキサーで攪拌し、１４×１０ｃｍの角シャーレに広げた。アガロースが固まった後、２０ｍＭのＩＰＴＧに浸して、乾燥させたニトロセルロースフィルタを載せ、３７℃で４時間インキュベートした。なお、ＮＺＹ培地は、１Ｌ中に５ｇのＮａＣｌと、２ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂０と、５ｇのイースト抽出物（ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ）と、５ｇのＮＺａｍｉｎｅ（ガゼイン加水分解物）とを加え、ＮａＯＨにてｐＨ７．５に調整した後、１５ｇの寒天を加えてオートクレーブで滅菌熔解したものである。
【００１６】
インキュベート後、フィルタを除き、３００ｍＬのＰＢＳ中で１５分間振盪して洗浄し、これを２回繰り返した後ＰＢＳを捨て、０．５％スキムミルクを添加したＰＢＳ（ＰＢＳ−ＳＭ）３００ｍＬを入れて室温で１時間振盪し、ブロッキングした。ＰＢＳ−ＳＭで４００倍希釈したラット抗血清（後述の融合細胞ａｈＭＣ５Ｃ１２（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６０７０）の作製に当たり脾臓細胞を提供したラットの抗血清）を加え、室温で１時間振盪し、抗血清液を捨て、５００ｍＬの０．０５％ツイーン２０を加えたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で室温５分間振盪洗浄し、これを４回繰り返した。次いでＰＢＳ−ＳＭで１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ（医学生物学研究所）２００ｍＬを加えて室温で１時間振盪した後、５００ｍＬのＰＢＳ−Ｔで４回振盪洗浄し、さらに１００ｍＬのＰＢＳで２回振盪洗浄した。
【００１７】
フィルタの水気を切り、発色基質液（ジアミノベンチジン１２ｍｇ／ＰＢＳ２５ｍＬに２．５％塩化コバルト及び２％硫酸ニッケル各５０μＬを加えた液）に浸した後、さらに８０μＬの３０％過酸化水素水を加えて発色させ、発色の位置から対応するクローンを選択した。
【００１８】
［５］塩基配列の確認
イムノスクリーニングで得られた陽性クローン２クローンを前出の「ザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット」（ストラッタジーン社）の使用説明書に従い、Ｕｎｉ−ＺＡＰＸＲベクターからｉｎｖｉｖｏでの切り出しを行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドにサブクローニングして大腸菌で増殖させた後、それぞれのクローンについてパーキンエルマー社のＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７
ＤＮＡシークエンサを用いて塩基配列を確認した。
【００１９】
ここで得られた塩基配列をデータベースからＢＬＡＳＴによりホモロジーサーチしたところ、１クローンはトリプターゼIII（ＴｒｙｐｔａｓｅIII）とほぼ一致し、他の１クローンはブレスト・キャンサー・サプレッサー・キャンディデート−１（Ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｃａｎｄｉｄａｔｅ−１、以下Ｂｃｓｃ−１という）と命名された遺伝子にほぼ一致した（図２）。図２において、１’〜２５５２’の配列がＢｃｓｃ−１を表し、１”〜２５７１”の配列が今回得られたクローンを表し、「＊」は一致点を表す。なお、ＢＬＡＳＴとは、ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツールの略である。
【００２０】
トリプターゼIIIとほぼ一致したクローンについては、トリプターゼIIIが肥満細胞の顆粒中に存在する良く知られた酵素であることから、目的とする細胞表面抗原とは無関係であると判断した。そこで、Ｂｃｓｃ−１とほぼ一致したクローンについて、目的とする細胞表面タンパク質であるかどうかを検討した。
【００２１】
［６］ＢＨＫ細胞へのトランスフェクション
上記で得られたｃＤＮＡのうち、データベースに登録されたＢｃｓｃ−１の蛋白質をコードする領域と指定指定された部分を烏山らの方法に従って作製した発現ベクターＢＣＭＧＳＮｅｏ（図３参照、Ｋａｒａｓｕｙａｍａ，Ｈ．＆Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｆ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８，９７−１０４，１９８８、Ｋａｒａｓｕｙａｍａ，Ｈ．，Ｔｏｈｙａｍａ，Ｎ．＆Ｔａｄａ，Ｔ．：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９，１３−３５，１９８９、Ｙａｇｉｔａ，Ｈ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｋａｒａｓｕｙａｍａ，Ｈ．＆Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｋ．，：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，６４５−６４９，１９８９，Ｋａｒａｓｕｙａｍａ，Ｈ．，Ｋｕｄｏ，Ａ．＆Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｆ．：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７２，９６９−９７２，１９９０）に組み込んだ。具体的には、Ｂｃｓｃ−１へのＸｈｏＩ及びＮｏｔＩの制限酵素切断部位の導入は、５’ＸｈｏＩプライマーとしてｃａｇＣＴＣＧＡＧａｔｇｇａｇｇａｇｇｃｔｃｔｇｇｇｇ(配列番号３）を用い、３’ＮｏｔＩプライマーとしてｔｃｔｇｇａｔＧＣＧＧＣＣＧＣｔｃａａａｇｇｃａａａｇａｔ（配列番号４）を用い、ＰＣＲ条件として９４℃で４分間加熱した後、９５℃で１分１５秒、６０℃で１分１０秒、７２℃で３分反応させ、これを３９回繰り返した後、７２℃で５分間反応させることにより行った。そして、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩサイトを導入したＢｃｓｃ−１をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで処理した後、同じくＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで処理したＢＣＭＧＳＮｅｏに組み込んだ。
【００２２】
ＢＨＫ細胞はリポフェクション法によりＢｃｓｃ−１に導入し、形質転換した。即ち、１０％ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ培地（日水製薬）で５０％〜７０％の密度となるようにＢＨＫ細胞を播き、一晩培養した後、新鮮な培地に交換して３７℃で２時間培養した。セラムフリーＤＭＥＭで３回洗浄した後、セラムフリーＤＭＥＭ８００μＬに、２．５μＬ（２．５μｇ）のＢｃｓｃ−１を導入したＢＣＭＧＳＮｅｏを含むセラムフリーＤＭＥＭ１００μＬと、１００μＬのリポフェクタミンを含むセラムフリーＤＭＥＭ１００μＬとの当量混液２００μＬを加えて、３７℃で３時間培養した。
【００２３】
［７］抗Ｂｃｓｃ−１抗体の作製
Ｂｃｓｃ−１を導入したｐＥＴ−２８ａベクターを大腸菌にてＨｉｓ−ｔａｇとの融合蛋白質として発現させ、この融合蛋白質をニッケルキレートカラムを用いて精製し、これを常法に従ってウサギに免役し、抗血清即ち抗Ｂｃｓｃ−１ポリクローナル抗体を得た。ｐＥＴ−２８ａベクターへのＢｃｓｃ−１の導入は以下のように実施した。即ち、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩの制限酵素切断部位をＢｃｓｃ−１へ導入し、次いでこのＢｃｓｃ−１をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで処理した後、同じくＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで処理したｐＥＴ−２８ａベクターに組み込んだ。なお、Ｂｃｓｃ−１へのＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩの制限酵素切断部位の導入は、５’ＥｃｏＲＩプライマーとしてｔｃａｇＧＡＡＴＴＣａｔｇｇａｇｇａｇｇｃｔｃｔ（配列番号５）を用い、３’ＸｈｏＩプライマーとしてｇｇｔａＣＴＣＧＡＧａａａｇｇｃａａａｇａｔａｇｃ（配列番号６）を用いてＰＣＲ法にて増幅することにより行った。
【００２４】
［８］細胞の染色及びウエスターンブロット
上記［６］で得たＢＨＫ細胞（Ｂｃｓｃ−１遺伝子を組み込んで発現させたもの）を１０％ＦＣＳＤＭＥＭに５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を加えた培養液中で一晩培養し、培養液を除き、上記［７］で得た抗Ｂｃｓｃ−１ポリクローナル抗体（１０³倍希釈）をのせて３７℃で１時間反応させたのち、ＰＢＳですすぎ、ＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（医学生物学研究所）（１００倍希釈）を３７℃で１時間反応させて、蛍光顕微鏡で細胞内の局在を確認した。
【００２５】
また、同じく抗原として、肥満細胞抽出物、Ｂｃｓｃ−１を導入したＢＨＫ細胞の抽出物、ＩＬ−５を用いて分化を誘導した好酸球の抽出物、末梢血細胞の抽出物、末梢血系の株化細胞であるＨＬ−６０の抽出物、ＨＬ−６０から分化した好酸球の抽出物を用いて、ウエスターンブロットにより、この抗Ｂｃｓｃ−１ポリクローナル抗体によって認識される蛋白質を検索した。
【００２６】
その結果、肥満細胞抽出物を染色した場合には、細胞質全体にびまん性の蛍光を認めた。このことから、Ｂｃｓｃ−１遺伝子は肥満細胞表面抗原に対するものではないと思われた。また、ウエスターンブロットでは、Ｂｃｓｃ−１を導入したＢＨＫ細胞を抗原とした場合には約４５ｋＤにバンドが検出され、これは挿入したＢｃｓｃ−１から予想される分子量とほぼ一致していたが、肥満細胞を抗原とした場合には、約９０ｋＤの位置にバンドが認められ、二つの細胞抽出物の間で結果が異なった。このことは、Ｂｃｓｃ−１遺伝子が肥満細胞表面抗原に対するものではないことを支持している。
【００２７】
［９］塩基配列の確認
本発明者らによって見いだされた遺伝子配列と、データベース上に登録されたＢｃｓｃ−１の遺伝子配列を比較検討した（図２参照）。その結果、本発明者らが得た塩基配列では、Ｂｃｓｃ−１の開始コドン（図２の塩基番号１０５５’〜１０５７’のＡＴＧ）の上流１４０ｂｐ付近に塩基Ａ（図２の塩基番号９４３”又は配列番号２の塩基番号９４３）が一つ余分にあった。それにより、本発明者らが得た塩基配列の開始コドン（図２の塩基番号３６”〜３８”又は配列番号２の塩基番号３６〜３８）は、Ｂｃｓｃ−１の開始コドンよりも約１０００ｂｐ上流に遡ることが明らかになった。さらに、ここで見いだされた新たな開始コドンを含む領域は、典型的な転写開始配列（ＡＣＣＡＴＧＧ）であった。なお、本発明者らによって得られた塩基配列によりコードされる蛋白質をＭＡＳＡ−１と命名した。
【００２８】
［１０］ＢＨＫ細胞へのＭＡＳＡ−１の導入
ＭＡＳＡ−１によるＢＨＫ細胞のトランスフェクションは上記［６］と同様に行った。但し、５’ＸｈｏＩプライマーとしてｔｃｔｔｇｃＣＴＣＧＡＧａｔｇｇｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇ（配列番号７）を用いた。
【００２９】
［１１］ＭＡＳＡ−１の特性の確認
Ｂｃｓｃ−１を導入したＢＨＫ細胞の代わりにＭＡＳＡ−１を導入したＢＨＫ細胞を用いて、上記［８］とほぼ同様にして、細胞の染色及びウエスターンブロットを行った。ただし、細胞染色には一次抗体として、以下に述べる融合細胞ａｈＭＣ５Ｃ１２によって産生されるモノクローナル抗体５Ｃ１２を用いて行った。その結果、ＭＡＳＡ−１を導入したＢＨＫ細胞を抗原としてウエスターンブロットを行った場合には、肥満細胞を用いた場合と同じく約９０ｋＤの位置にバンドが認められ、細胞染色でも細胞表面への発現が認められた。また、ラットの肥満細胞であるＲＢＬ−２Ｈ３にも発現が認められたが、臍帯血、好酸球、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、末梢血系細胞株であるＨＬ−６０には発現が認められなかった。これらのことから、ＭＡＳＡ−１がコードする蛋白質が、肥満細胞表面の特異的な蛋白質であることが確認された。
【００３０】
［１２］融合細胞ａｈＭＣ５Ｃ１２（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６０７０）
ここで融合細胞ａｈＭＣ５Ｃ１２の作製法の一例を説明する。まず、生後４日目のラット乳児に、上記実施例１で得た臍帯血の２週間培養細胞（１０⁶ｃｅｌｌ／０．１ｍｌ）を腹腔内注射して、免疫学習中のラットにこの細胞の全抗原に対する抗体産生誘導能を失わしめた。１．５ヶ月後に上記［１］で得たＭＣ−ＴＣ（１０⁶ｃｅｌｌ／０．１０ｍｌ）を、コンプリートアジュバントと共に腹腔内注射して感作免疫した。さらに、以後２週間ごとに２回、同細胞を単独で腹腔内注射した。最終免疫後、４日目に脾臓を取り出し、以下に示すように細胞融合を行った。
【００３１】
摘出したラットの脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞とを１０：１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００を融合促進剤として細胞融合を行った。融合後の細胞は脾臓細胞当り５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞濃度となるように１０％ウシ血清を含むＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウエルのマイクロタイタープレート（ヌンク社）に１ウエル当たり２００μｌずつ分注した。融合細胞はＣＯ₂インキュベータ（５％ＣＯ₂、３７℃）中で培養し、ＨＡＴ培地で培地交換を行い増殖させて、脾臓細胞と骨髄腫細胞からなる融合細胞のスクリーニングを行った。ついでＨＡＴ培地中で順化し、さらに１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）ＩｓｃｏｖｅのＩＭＤＭ培地で順化した。融合細胞培養上清中の抗体は、マストサイトーマの皮膚病巣より分離したＭＣ−ＴＣを抗原に用い、これと反応する抗体を産生するクローンを、蛍光抗体法により選別し、ａｈＭＣ５Ｃ１２と名付けた。得られたクローンの細胞はそれぞれ１０％のＤＭＳＯを含む９０％ウシ血清中に懸濁させ、液体窒素中に保存した。なお、クローンの産生する抗肥満細胞表面抗原モノクローナル抗体は、ａｈＭＣ５Ｃ１２をヌードマウスの腹腔内で増殖させ、その腹水から精製した。
【００３２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】共生培養前後の肥満細胞についてキマーゼ陽性の肥満細胞の割合とトリプターゼ濃度を測定した結果を表すグラフである。
【図２】Ｂｃｓｃ−１とＭＡＳＡ−１との塩基配列を比較した説明図である。
【図３】ｃＤＮＡ発現ベクターＢＣＭＧＳＮｅｏの構造説明図である。

Claims

配列番号１のアミノ酸配列を含む肥満細胞表面抗原をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
配列番号２の塩基配列、又は、配列番号２の塩基配列のうち塩基番号３６〜２３９６で表される塩基配列を有する請求項１記載のＤＮＡ。