JP4248765B2

JP4248765B2 - Method for detecting sample substance using biochemical specific binding reaction

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Publication number: JP4248765B2
Application number: JP2001150020A
Authority: JP
Inventors: 恵子 ▲錬▼石
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2001-05-18
Publication date: 2009-04-02
Anticipated expiration: 2021-05-18
Also published as: JP2002340893A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体起因物質もしくはその複製物などの試料物質を分析する方法に関し、特に放射性物質で標識した試料物質を、生化学的特異的結合反応を介して多孔性検出用シートに結合固定させ、その結合固定された放射性標識を蓄積性蛍光体シートを用いて検出する操作を利用する試料物質の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生物学や医学の分野において遺伝子解析を行うために、マクロアレイおよびマイクロアレイが広範に用いられている。いずれも生化学的特異的結合の一種であるハイブリダイゼーションを利用して、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸もしくはその断片あるいはそれらの複製物を検出して解析するための分析用具である。従来より一般に、前者のマクロアレイは、ポリアミド樹脂などを材料とする多孔性のシートからなり、それを用いた検出解析は、多数のＤＮＡ断片などの核酸断片（プローブ分子）を多孔性シートの細孔に絡ませるようにして固定し、解析対象（ターゲット分子）としてラジオアイソトープ（ＲＩ）などの放射性物質で標識した試料核酸断片を用いて行われる。一方、後者のマイクロアレイは、表面処理されたスライドガラスなどの固相担体からなり、その検出解析は通常、固相担体表面にプローブ分子を固定し、ターゲット分子として蛍光物質で標識した試料核酸断片を用いて行われる。ただし、マクロアレイの名称とマイクロアレイの名称との使い分けは、一般には、必ずしも厳密になされてはいないようである。
【０００３】
マクロアレイによる遺伝子解析は、従来のオートラジオグラフィー技術を利用して簡便に実施することができるところに利点がある。
【０００４】
上記マクロアレイを用いるＤＮＡなどの核酸の解析は通常、下記の方法により実施される。
（１）まず、複数種の核酸断片について、多数の一本鎖核酸断片（プローブ分子；通常は、その塩基配列が既知であるものを用いる）を用意し、それぞれを含む水溶液を、スポッタを用いてマクロアレイ上に、高密度かつマトリックス状に順次点着することにより、プローブ分子を多孔性シートの点着位置の細孔に絡ませるように付着させ、ドット状の多数のプローブ分子スポットを形成させる。
（２）次に、解析対象の核酸断片試料について放射性同位元素（ＲＩ：³²Ｐ、³³Ｐなど）で標識して調製した放射性標識一本鎖核酸断片試料を、このマクロアレイに液相にて接触させて（例えば、特定の容器を用いて放射性標識核酸断片試料の水溶液中にマクロアレイを浸漬する）、検出対象のターゲット分子をプローブ分子とハイブリダイゼーションさせて結合固定させる。すなわち、核酸断片試料中の、プローブ分子と相補的な塩基配列をもつターゲット分子を、スポットのプローブ分子と相補的に結合（ハイブリダイズ）させる。
（３）次いで、マクロアレイから、ハイブリダイズしなかった放射性標識核酸断片試料を洗浄除去する。
（４）洗浄乾燥したマクロアレイを放射線感受性写真フィルムと重ね合わせ、オートラジオグラフィーを利用して、放射性標識ターゲット分子からの放射線を検出することにより、各プローブ分子についてのハイブリダイゼーションによるターゲット分子の結合情報（結合の有無や強度など）を検出する。
（５）ターゲット分子が結合したプローブ分子の塩基配列が既知であれば、相補性の原理を利用することによりターゲット分子の少なくとも一部の塩基配列が決定される。
すなわち、このような技術を利用して、特定の遺伝子の発現、変異、多型性などを多数の遺伝子について同時に解析することができる。
【０００５】
これまでに、放射性標識した生物試料や生体高分子を対象とする一般的なオートラジオグラフィーにおいて、放射線写真フィルムを用いる方法の代わりに、放射線像変換パネル（イメージングプレート、あるいは蓄積性蛍光体シートともいう）を用いる放射線画像記録再生方法が開発されている。この放射線画像記録再生方法は、Ｘ線などの放射線の照射を受けると放射線エネルギーの一部を吸収蓄積し、そののち可視光線や赤外線などの電磁波（励起光）の照射を受けると蓄積した放射線エネルギーに応じて輝尽発光を示す性質を有する輝尽性蛍光体（蓄積性蛍光体）を使用するものであり、輝尽性蛍光体を含有するシート状の放射線像変換パネルに、被検体を透過したあるいは被検体から発せられた放射線を照射して被検体の放射線画像情報を一旦蓄積記録した後、パネルにレーザ光などの励起光を走査して順次輝尽発光光として放出させ、そしてこの輝尽発光光を光電的に読み取って電気的画像信号（デジタル信号）を得、次いで得られたデジタル信号を、そのままで、あるいは種々の信号処理を施した後、可視画像化するなどして再生したり、適当な記録媒体に保存することからなる。
【０００６】
上記放射線画像記録再生方法を利用するオートラジオグラフィーは、試料からの放射線量が極微量であっても、高感度でその放射線画像を得ることができる、画像情報がデジタル信号として得られるので画像処理や保存が容易となる、など数々の利点があるため、現在では重要なオートラジオグラフィー技術となっている。
【０００７】
放射性標識したターゲット分子からの放射線を測定する方法としては、放射線像変換パネルを用いる方法も提案されている。例えば、Human Molecular Genetics, 1999, Vol.8, No.9, 1715-1722には、多孔性シートの表面にＤＮＡ断片（プローブ分子）を多数個のスポットとして固定し、このＤＮＡ断片と相補性を有する放射性標識試料ＤＮＡ断片とを多孔性シート上でハイブリダイズさせ、そののち、この多孔性シートと蓄積性蛍光体を用いた放射線像変換パネルとを積層し、放射線画像情報読取装置を用いてオートラジオグラフィーを行うことによって、ターゲット分子を検出できることが記載されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記のマクロアレイなどの多孔性シートを用いる遺伝子解析では、蓄積性蛍光体を含む放射線像変換パネルを用いるオートラジオグラフィーを利用することにより、高い感度で放射性標識した試料物質（ターゲット分子）を検出することが可能となる。
【０００９】
しかしながら、本発明者の検討によると、多孔性シートのプローブ分子との生化学特異的反応により多孔性シートに結合した放射性標識試料物質（ターゲット分子）を上記の蓄積性蛍光体シートを用いたオートラジオグラフィーによって検出することによって、放射線検出材料として放射線写真フィルムを用いる方法よりも高感度とはなるが、得られる放射性標識試料物質が結合固定された多孔性シートにおける当該放射性標識試料物質の位置を示す画像情報が充分な解像度あるいは鮮鋭度を示さないことが多いことが判明した。
【００１０】
本発明者は、上記の不充分な解像度あるいは鮮鋭度の原因を研究した結果、多孔性シートに重ね合わされた蓄積性蛍光体シートの蓄積性蛍光体層に、該多孔性シートに結合した放射性標識試料物質のスポットから発生する放射線エネルギーが到達する過程で広がり、多孔性シート上の当該放射性標識試料物質のスポットに隣接する放射性標識試料物質のスポットから発生する放射線エネルギーとの分離が充分でなくなること、そして隣接するスポット間の中間領域に少量付着した放射性標識試料物質からの放射線エネルギーもまた蓄積性蛍光体層に到達してノイズとなることなどが、その主要な原因であることを見出した。
【００１１】
従って、本発明の目的は、多孔性シート上に生化学特異的反応により結合した放射性標識試料物質を蓄積性蛍光体シートを用いたオートラジオグラフィーによって検出する方法であって、得られる放射性標識試料物質が結合固定された多孔性シートの当該放射性標識試料物質のスポットの位置を示す画像情報を、より正確に、かつ高い解像度と鮮鋭度をもって得ることのできる方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、多孔性シートに生化学特異的反応により結合した放射性標識を付した試料物質の検出を、蓄積性蛍光体層を海島状に互いに分離して構成した蓄積性蛍光体シートを用いるオートラジオグラフィーを利用して行なうことにより、多孔性シートの多孔性構造体の所定位置に生化学特異的反応により結合した試料物質の存在位置及び／又は存在量を示す放射線画像を高感度かつ高精度に得ることができ、これによりプローブ分子に生化学特異的に結合する試料物質を容易かつ確実に検出できることを見出した。
【００１３】
従って、本発明は、多孔性シートの所定の位置に試料物質と生化学特異的反応に結合し得るプローブ分子を付着（固定ともいえる）させてなる多孔性シート、そして該多孔性シートのプローブ分子付着位置のそれぞれに対応する位置に互いに独立して設けられた複数の蓄積性蛍光体層を有する蓄積性蛍光体シートとを用意する工程；該多孔性シートと放射性標識を持つ試料物質とを、水性媒体の存在下にて接触させて、該試料物質を多孔性シートのプローブ分子に生化学特異的に結合させる工程；該多孔性シートと上記蓄積性蛍光体シートとを、多孔性シートのプローブ分子付着位置と蓄積性蛍光体シートの各蓄積性蛍光体層とが対向する位置関係となる配置にて重ね合せ、この重ね合せた状態にて放置することによって、多孔性シートの多孔性構造体領域に結合した試料物質の放射性標識より発せられる放射線エネルギーを蓄積性蛍光体シートの蓄積性蛍光体層に吸収蓄積させる工程；放射線エネルギーを吸収蓄積した蓄積性蛍光体シートに励起光を照射して、該蓄積性蛍光体シートの蓄積性蛍光体層のそれぞれから輝尽発光光を発生させる工程；該輝尽発光光を集光し、この集光光を光電変換により電気信号に変換する工程；そして該電気信号を処理する工程からなる、生化学的特異的結合反応を利用する試料物質の検出方法にある。
【００１４】
本明細書はまた、多孔性シート、そして互いに独立して設けられた複数の蓄積性蛍光体層を有する蓄積性蛍光体シートからなる試料物質検出キットも記載する。
【００１５】
本発明はまた、試料物質と生化学特異的反応に結合し得るプローブ分子を付着させてなる多孔性シート、そして該多孔性シートのプローブ分子の存在位置のそれぞれに対応する位置に互いに独立して設けられた複数の蓄積性蛍光体層を有する蓄積性蛍光体シートからなる検出キットにもある。
【００１６】
本発明において、多孔性シートの解析対象となる試料物質は、好ましくは生体に起因する物質であり、生体からの抽出、単離などにより直接採取されたもの、これに更に化学的処理や化学修飾などが施されたもの、およびこれら生体由来の物質のＰＣＲ法などの複製技術を利用して得た複製物が含まれ、その代表的な例としては、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）などの核酸もしくはその断片；抗原、抗体、腫瘍マーカ、酵素、アブザイム、ホルモン類およびその他の蛋白質を挙げることができる。
【００１７】
また、本発明で利用できる生化学特異的結合には、前述した塩基配列の相補性によって生じるハイブリダイゼーション、および抗原−抗体反応などの免疫特異的結合が含まれ、更に特定の蛋白質間における立体構造などに基づく蛋白質特異的結合も含まれる。
【００１８】
本発明の蓄積性蛍光体シートは、点状に形成された蓄積性蛍光体層が平均密度が０．６ｇ／ｃｍ³以上の隔壁で互いに隔離されていることが望ましい。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明で用いる多孔性シートは、プローブ分子を結合固定することのできる微細な細孔を多数有する多孔性フィルムであって、この目的のためには、既に各種の多孔性フィルムが市販されている。多孔性フィルムを形成しうる材料の例としては、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどのセルロース誘導体；６−ナイロン、６，６−ナイロンなどのポリアミド（ナイロン）；ポリテトラフルオロエチレン、ポリ弗化ビニリデンなどの弗素系ポリマー；およびポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンからなる有機高分子材料；並びにセラミックなどの無機材料を挙げることができる。また、所望により、これらの材料を併用することもできる。
【００２０】
本発明の多孔性シートに固定されるプローブ分子としては、例えば、従来よりマクロアレイのプローブ分子として使用可能な各種のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを用いることができる。例えば、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型にして合成した相補的ＤＮＡ）、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴなどのＰＣＲ法によって増幅して調製したポリヌクレオチド（「ＰＣＲ産物」）、および合成したオリゴヌクレオチドを挙げることができる。また、ＤＮＡのホスホジエステル結合をペプチド結合に変換した人工核酸、すなわちペプチド核酸（ＰＮＡ）、もしくはそれらの誘導体であってもよい。さらに、抗原、抗体など生化学的特異的結合を生じうる蛋白質も用いることが可能である。
【００２１】
プローブ分子とターゲット分子との具体的な組合せの例としては、ＤＮＡ（ＤＮＡ、もしくはその断片、またはオリゴＤＮＡ）とＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡ、ＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡ、ＰＮＡとＰＮＡ、抗原と抗体、アビジンとビオチンなどを挙げることができる。
【００２２】
本発明の多孔性シートを検出用シートとして用い、生体高分子物質あるいはその断片、もしくはその複製物などの検出する方法としては、通常、多孔性シートの所定位置にプローブ分子を点着付着させた放射性標識多孔性シートを調製し、この放射性標識多孔性シートを、検出対象の物質に放射性標識を付けて得た放射性標識ターゲット分子（試料物質）に水の存在下で接触させて該多孔性シート上でハイブリダイゼーションを実施した後、該多孔性シートと蓄積性蛍光体シート（放射線像変換パネル）と重ね合わせて、オートラジオグラフィーを行なう方法が利用される。この蓄積性蛍光体シートを用いるオートラジオグラフィーは、検出操作が室温で実施可能で、かつ検出感度が高いことなどの利点を持つ。
【００２３】
蓄積性蛍光体シートの一般的構成については、前述のように、すでに各種の刊行物に記載されており、また蓄積性蛍光体シートを用いるオートラジオグラフィーについても実用化されている。
【００２４】
蓄積性蛍光体シートは通常、支持体の上に、蓄積性蛍光体粒子（例、輝尽性蛍光体粒子）と結合剤とからなる蛍光体層形成用の分散液を塗布乾燥して蓄積性蛍光体層を形成し、次いでその蓄積性蛍光体層の上に保護層を設ける方法によって製造される。なお、蓄積性蛍光体層は、別に独立して蓄積性蛍光体シートを製造し、これを支持体の上に貼りつける方法によっても、支持体上に形成することができる。
【００２５】
本発明において用いる蓄積性蛍光体シートは、多孔性シートのプローブ分子の所定の結合固定位置のそれぞれに対応する位置に、互いに独立して設けられた複数の蓄積性蛍光体層を有する蓄積性蛍光体シートである。すなわち、蓄積性蛍光体層は連続層として形成されるのではなく、支持体の上に、一般的に海島構造とよばれるような、微小の点状の蓄積性蛍光体層として、互いに分離独立した状態で存在する。
【００２６】
図１と図２に、本発明で用いる蓄積性蛍光体シートの代表的構造の断面図を示す。図１と図２において、蓄積性蛍光体シート１３は、支持体１４と、互いに独立して支持体１４の表面に形成された複数の点状の蓄積性蛍光体層１５とから構成されている。
【００２７】
本発明で用いる蓄積性蛍光体シートは、特に図３に示すように、支持体２４の上の複数の点状の蓄積性蛍光体層１５が放射線を透過しないような高密度（たとえば、０．６ｇ／ｃｍ²以上）の隔壁１６によって互いに隔離されて配置され、さらにカバーシート１７が保護層として付設されていることが望ましい。
【００２８】
なお、本発明で用いる蓄積性蛍光体シートにおける蓄積性蛍光体層の点在構造（海島構造）は、必ずしも蓄積性蛍光体シートの全体にわたって設けられる必要はなく、部分的にそのような海島構造の蓄積性蛍光体層が形成されているものであってもよい。
【００２９】
蓄積性蛍光体としては、波長が４００〜９００ｎｍの範囲の励起光の照射により、３００〜５００ｎｍの波長範囲に輝尽発光を示す輝尽性蛍光体が好ましい。そのような輝尽性蛍光体の例は、特開平２−１９３１００号公報及び特開平４−３１０９００号公報に詳しく記載されている。好ましい輝尽性蛍光体としては、ユーロピウムあるいはセリウムによって付活されているアルカリ土類金属ハロゲン化物系蛍光体（例、ＢａＦＢｒ：Ｅｕ、およびＢａＦ（Ｂｒ，Ｉ）：Ｅｕ）、そしてセリウム付活希土類オキシハロゲン化物系輝尽性蛍光体を挙げることができる。
【００３０】
これらのうちでも、基本組成式（Ｉ）：
Ｍ^IIＦＸ：ｚＬｎ ‥‥（Ｉ）
で代表される希土類付活アルカリ土類金属弗化ハロゲン化物系輝尽性蛍光体は特に好ましい。ただし、Ｍ^IIはＢａ、Ｓｒ及びＣａからなる群より選ばれる少なくとも一種のアルカリ土類金属を表し、ＬｎはＣｅ、Ｐｒ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｎｄ、Ｅｒ、Ｔｍ及びＹｂからなる群より選ばれる少なくとも一種の希土類元素を表す。Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群より選ばれる少なくとも一種のハロゲンを表す。ｚは、０＜ｚ≦０．２の範囲内の数値を表す。
【００３１】
上記基本組成式（Ｉ）中のＭ^IIとしては、Ｂａが半分以上を占めることが好ましい。Ｌｎとしては、特にＥｕ又はＣｅであることが好ましい。また、基本組成式（Ｉ）では表記上Ｆ：Ｘ＝１：１のように見えるが、これはＢａＦＸ型の結晶構造を持つことを示すものであり、最終的な組成物の化学量論的組成を示すものではない。一般に、ＢａＦＸ結晶においてＸ^-イオンの空格子点であるＦ⁺（Ｘ^-）中心が多く生成された状態が、６００〜７００ｎｍの光に対する輝尽効率を高める上で好ましい。このとき、ＦはＸよりもやや過剰にあることが多い。
【００３２】
なお、基本組成式（Ｉ）では省略されているが、必要に応じて下記のような添加物を基本組成式（Ｉ）に加えてもよい。
ｂＡ，ｗＮ^I，ｘＮ^II，ｙＮ^III
ただし、ＡはＡｌ₂Ｏ₃、ＳｉＯ₂及びＺｒＯ₂などの金属酸化物を表す。Ｍ^IIＦＸ粒子同士の焼結を防止する上では、一次粒子の平均粒径が０．１μｍ以下の超微粒子でＭ^IIＦＸとの反応性が低いものを用いることが好ましい。Ｎ^Iは、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ及びＣｓからなる群より選ばれる少なくとも一種のアルカリ金属の化合物を表し、Ｎ^IIは、Ｍｇ及び／又はＢｅからなるアルカリ土類金属の化合物を表し、Ｎ^IIIは、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｃ、Ｙ、Ｌａ、Ｇｄ及びＬｕからなる群より選ばれる少なくとも一種の三価金属の化合物を表す。これらの金属化合物としては、特開昭５９−７５２００号公報に記載のようなハロゲン化物を用いることが好ましいが、それらに限定されるものではない。
【００３３】
また、ｂ、ｗ、ｘ及びｙはそれぞれ、Ｍ^IIＦＸのモル数を１としたときの仕込み添加量であり、０≦ｂ≦０．５、０≦ｗ≦２、０≦ｘ≦０．３、０≦ｙ≦０．３の各範囲内の数値を表す。これらの数値は、焼成やその後の洗浄処理によって減量する添加物に関しては最終的な組成物に含まれる元素比を表しているわけではない。また、上記化合物には最終的な組成物において添加されたままの化合物として残留するものもあれば、Ｍ^IIＦＸと反応する、あるいは取り込まれてしまうものもある。
【００３４】
その他、上記基本組成式（Ｉ）には更に、必要に応じて、特開昭５５−１２１４５号公報に記載のＺｎ及びＣｄ化合物；特開昭５５−１６００７８号公報に記載の金属酸化物であるＴｉＯ₂、ＢｅＯ、ＭｇＯ、ＣａＯ、ＳｒＯ、ＢａＯ、ＺｎＯ、Ｙ₂Ｏ₃、Ｌａ₂Ｏ₃、Ｉｎ₂Ｏ₃、ＧｅＯ₂、ＳｎＯ₂、Ｎｂ₂Ｏ₅、Ｔａ₂Ｏ₅、ＴｈＯ₂；特開昭５６−１１６７７７号公報に記載のＺｒ及びＳｃ化合物；特開昭５７−２３６７３号公報に記載のＢ化合物；特開昭５７−２３６７５号公報に記載のＡｓ及びＳｉ化合物；特開昭５９−２７９８０号公報に記載のテトラフルオロホウ酸化合物；特開昭５９−４７２８９号公報に記載のヘキサフルオロケイ酸、ヘキサフルオロチタン酸、及びヘキサフルオロジルコニウム酸の１価もしくは２価の塩からなるヘキサフルオロ化合物；特開昭５９−５６４８０号公報に記載のＶ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ及びＮｉなどの遷移金属の化合物などを添加してもよい。さらに、本発明においては上述した添加物を含む蛍光体に限らず、基本的に希土類付活アルカリ土類金属弗化ハロゲン化物系輝尽性蛍光体とみなされる組成を有するものであれば如何なるものであってもよい。
【００３５】
上記基本組成式（Ｉ）で表される希土類付活アルカリ土類金属弗化ハロゲン化物系輝尽性蛍光体は、通常は、アスペクト比が１．０乃至５．０の範囲にある。本発明の蓄積性蛍光体シートに用いる輝尽性蛍光体粒子は一般に、アスペクト比が１．０乃至２．０（好ましくは、１．０乃至１．５）の範囲にあり、粒子サイズのメジアン径（Ｄｍ）が１μｍ乃至１０μｍ（好ましくは、２〜７μｍ）の範囲にあり、そして粒子サイズ分布の標準偏差をσとしたときのσ／Ｄｍが５０％以下（好ましくは、４０％以下）のものである。また、粒子形状としては、直方体型、正六面体型、正八面体型、１４面体型、これらの中間多面体型および不定型粉砕粒子などがあるが、それらのうちでは１４面体型が好ましい。但し、上記アスペクト比、粒子サイズおよび粒子サイズ分布を満たす蓄積性蛍光体粒子であれば、必ずしも１４面体型でなくとも用いることができる。
【００３６】
本発明で用いる蓄積性蛍光体シートは、前述のように、点在する蓄積性蛍光体層のそれぞれが放射線エネルギー不透過性の材料（例、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮などの金属材料、酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、窒化ケイ素、カーボン等のセラミック材料、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリウレタン樹脂、アクリル樹脂などの高分子材料）からなる壁が設けられていることが好ましく、あるいは蓄積性蛍光体が放射線エネルギー不透過性の材料からなるシートにドット状に分離して埋設されているような構成であることが好ましい。
【００３７】
また、本発明の蓄積性蛍光体シートと共に、多孔性シートのプローブ分子結合固定位置に対応する位置に透孔を有する薄いフィルムもしくはシートから構成されるスペーサを用いることも好ましい。
【００３８】
本発明で用いる蓄積性蛍光体シートは、蓄積性蛍光体層が多孔性シートのプローブ分子結合固定位置に対応する位置に蓄積性蛍光体層が存在し、該多孔性シートのプローブ分子結合固定位置間の領域に対応する領域には蓄積性蛍光体層が存在しないように構成した海島構造に構成されていることが好ましい。このような海島構造の蓄積性蛍光体層は、例えば、支持体表面に、蓄積性蛍光体層材料塗布液をスクリーン印刷などによって海島状に印刷し、印刷された塗布液を乾燥する方法、表面に凹部を形成した支持体を用意し、その支持体表面に蓄積性蛍光体層材料塗布液を塗布した後、凹部にのみ塗布液が残るように、支持体表面を拭き取り、次いで、塗布液を乾燥させる方法、多数の透孔を有するシートの透孔に蓄積性蛍光体を埋め込み、これを支持体に貼りつける方法などを利用して製造することができる。
【００３９】
蓄積性蛍光体シートの一方の側の表面には、励起光および／または輝尽発光光を反射する材料からなる光反射層を設けることもできる。なお、蓄積性蛍光体シートに支持体が設けられる場合には、光反射層は通常、支持体と蓄積性シートとの間に設けられる。光反射層の付設により、励起光率および発光光の取り出し効率を高めることができ、結果として更に高感度であって高画質とすることができる。
【００４０】
蓄積性蛍光体シートは、必ずしも支持体や保護膜を備えている必要はないが、蓄積性蛍光体シートの搬送や取扱い上の便宜や特性変化の回避のために、すなわち耐水性、耐久性、耐候性、そして耐汚れ性を高めるために、支持体と保護膜とを備えていてもよい。さらに、支持体は透明であってもよく、その場合には輝尽発光光の取り出しを蓄積性蛍光体シートの両側から行う両面集光方式による読取方法に適している。
【００４１】
支持体は通常、柔軟な樹脂材料からなる厚みが５０μｍ乃至１ｍｍのシートあるいはフィルムである。支持体は透明であってもよく、あるいは支持体に、励起光もしくは輝尽発光光を反射させるための光反射性材料（例、アルミナ粒子、二酸化チタン粒子、硫酸バリウム粒子）を充填してもよく、あるいは空隙を設けてもよい。または、支持体に励起光もしくは輝尽発光光を吸収させるため光吸収性材料（例、カーボンブラック）を充填してもよい。支持体の形成に用いることのできる樹脂材料の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、アラミド樹脂、ポリイミド樹脂などの各種樹脂材料を挙げることができる。必要に応じて、支持体は金属シート、セラミックシート、ガラスシート、石英シートなどであってもよい。
【００４２】
保護膜は、励起光の入射や輝尽発光光の出射に殆ど影響を与えないように、透明であることが望ましく、また外部から与えられる物理的衝撃や化学的影響（例えば、水分の接触）から、蓄積性蛍光体シートを充分に保護することができるように、化学的に安定でかつ高い物理的強度を持つことが望ましい。保護膜としては、セルロース誘導体、ポリメチルメタクリレート、有機溶媒可溶性フッ素系樹脂などのような透明な有機高分子物質を適当な溶媒に溶解して調製した溶液を蛍光体層の上に塗布することで形成されたもの、あるいはポリエチレンテレフタレートなどの有機高分子フィルムや透明なガラス板などの保護膜形成用シートを別に形成して蛍光体層の表面に適当な接着剤を用いて設けたもの、あるいは無機化合物を蒸着などによって蛍光体層上に成膜したものなどが用いられる。また、保護膜中には酸化マグネシウム、酸化亜鉛、二酸化チタン、アルミナ等の光散乱性微粒子、パーフルオロオレフィン樹脂粉末、シリコーン樹脂粉末等の滑り剤、およびポリイソシアネート等の架橋剤など各種の添加剤が分散含有されていてもよい。保護膜の膜厚は一般に約０．１μｍ乃至２０μｍの範囲にある。
【００４３】
保護膜の表面にはさらに、保護膜の耐汚染性を高めるためにフッ素樹脂塗布層を設けてもよい。フッ素樹脂塗布層は、フッ素樹脂を有機溶媒に溶解（または分散）させて調製したフッ素樹脂溶液を保護膜の表面に塗布し、乾燥することにより形成することができる。フッ素樹脂は単独で使用してもよいが、通常はフッ素樹脂と膜形成性の高い樹脂との混合物として使用する。また、ポリシロキサン骨格を持つオリゴマーあるいはパーフルオロアルキル基を持つオリゴマーを併用することもできる。フッ素樹脂塗布層には、干渉むらを低減させて更に放射線画像の画質を向上させるために、微粒子フィラーを充填することもできる。フッ素樹脂塗布層の層厚は通常は０．５μｍ乃至２０μｍの範囲にある。フッ素樹脂塗布層の形成に際しては、架橋剤、硬膜剤、黄変防止剤などのような添加成分を用いることができる。特に架橋剤の添加は、フッ素樹脂塗布層の耐久性の向上に有利である。
【００４４】
蓄積性蛍光体シートの構成としては多様な構成が知られており、例えば、接着層、着色層、帯電防止層、励起光反射層、輝尽発光光反射層などの補助層を設ける構成も知られている。本発明において用いる蓄積静蛍光体シートは、必要に応じて、それらの補助層を付設してもよい。
【００４５】
蓄積性蛍光体シートは一般に、上述のように、その下側表面に支持体が設けられ、上側表面に保護膜が設けられた基本構成を有する。また、蓄積性蛍光体シートは通常、輝尽性蛍光体粒子と、これを分散状態で含有支持する結合剤とからなる。ただし、蓄積性蛍光体シートとしては、蒸着法や焼結法などによって形成される結合剤を含まないで蓄積性蛍光体の凝集体からなるものや、この蓄積性蛍光体の凝集体の間隙に高分子物質を浸透させたものも知られている。
【００４６】
次に、多孔性シートに結合固定するプローブ分子として合成オリゴヌクレオチドを用い、試料物質してＤＮＡ断片を用いる検出方法を例にして、本発明の検出方法を説明する。
【００４７】
蓄積性蛍光体シートを用いるオートラジオグラフィーは、たとえば、放射性標識を付した試料物質（ターゲット分子）がハイブリダイゼーションにより結合固定された多孔性シートと蓄積性蛍光体シートとを、図４に示すように、検出用シート（多孔性シート）１０のプローブ分子付着領域１２と蓄積性蛍光体シート１３の点状蓄積性蛍光体層１５とが対向するような配置にて、かつ互いに密着するように積層し、この積層状態で、例えば、０〜３０℃にて一定時間（例、１時間〜１２０時間）保存することにより行なう。この保存処理により、蓄積性蛍光体シートに、多孔性シートに結合固定された放射性物質から発せられる放射線エネルギーがその位置情報と共に吸収記録（蓄積）される。このようなオートラジオグラフィー操作により多孔性シートからの放射線エネルギーを位置情報とともに吸収蓄積して内部に潜像が形成された蓄積性蛍光体シートは、次に放射線画像形成工程を経て、目的の画像の可視化（あるいはデジタル画像情報のデータ形成）ができる。
【００４８】
図５は、上記のオートラジオグラフィー操作を行なった蓄積性蛍光体シートを用いた本発明の放射線画像形成方法について説明するための概略図である。
【００４９】
まず、放射性標識ターゲット分子が固定された多孔性シートと蓄積性蛍光体シートとの積層体（図４参照）から蓄積性蛍光体シートを引き剥がし、これを図５の放射線画像読取装置に装填する。
【００５０】
図５において、蓄積性蛍光体シート１３は、二組のニップローラからなる移送手段４１、４２により矢印の方向に移送される。一方、レーザビーム等の励起光４３は、蓄積性蛍光体シート１３の保護層側表面（蓄積性蛍光体層側表面）より照射される。励起光４３の照射を受けた蓄積性蛍光体シート１３の蓄積性蛍光体層内の領域からは、蓄積されたエネルギーレベルに応じた（すなわち、潜像として記録された放射線のエネルギー分布情報を持った）輝尽発光光４４が発せられる。輝尽発光光４４は、直接あるいはミラー４９で反射されて、上方に設けられた集光ガイド４５により集光され、その集光ガイド４５の基部に備えられた光電変換装置（フォトマルチプライヤ）４６にて電気信号に変換され、増幅器４７で増幅され信号処理装置４８に送られる。
【００５１】
信号処理装置４８では、増幅器４７から送られてきた電気信号について、目的とする放射線画像の種類や放射線像変換パネルの特性に基づいて予め決められている加算、減算などの適当な演算処理を行い、処理後の信号を画像信号として送り出す。
【００５２】
送り出された画像信号は画像再生装置（図示なし）にて可視画像として再生され、これによりＤＮＡ多孔性シートに関する放射線の空間的エネルギー分布に対応した画像が再構成される。再生装置は、ＣＲＴ等のディスプレイ手段であってもよいし、感光フィルムに光走査記録を行う記録装置であってもよいし、あるいはまた、そのために画像信号を一旦光ディスク、磁気ディスク等の画像ファイルに記憶させる装置に置き換えられてもよい。
【００５３】
一方、蓄積性蛍光体シート１３は、ニップローラ４１、４２により矢印の方向にさらに移動していき、読取工程に供されたシートの領域は、次いで、ナトリウムランプ、蛍光灯、赤外線ランプ等の消去光源（図示なし）を利用する消去工程に供される。これにより、読取工程の後なおパネルに残存している蓄積エネルギーが放出除去され、次回の放射線画像の記録（撮影）工程において、残存エネルギーによる潜像が悪影響を及ぼすことがないようにされる。この残存エネルギーの除去は、放射線画像の記録（撮影）工程の直前に行なってもよく、あるいは放射線画像の記録（撮影）工程の前後の両時点で実施してもよい。
【００５４】
なお、蓄積性蛍光体シートとして、励起光照射側表面に、該励起光に対する反射率がその入射角増大に応じて増大し、一方では輝尽発光光に対する反射率がその入射角に依存することない多層膜フィルタが付設されているものを用いて、放射線のエネルギー分布情報が潜像として蓄積記録された蓄積性蛍光体シートをその平面方向に移送しながら、もしくは励起光照射装置を蛍光体シートの平面方向に移動させながら、蛍光体シートに対して、励起光を、ＬＤアレイ、ＬＥＤアレイ、蛍光導光シート等を用いて移送方向と直交する方向に線状に照射し、蛍光体シートの励起光照射部分の潜像から放出される輝尽発光光を、多数の固体光電変換素子を線状に配置してなるラインセンサ等を用いて逐次一次元的に光電検出して、その放射線エネルギー分布情報を電気的画像信号として得る放射線画像情報読取方法を利用することもできる。
【００５５】
【実施例】
［実施例１］
市販のナイロン６製の多孔性シートの所定位置に、常法に従って一本鎖核酸断片（プローブ分子）を点着により付着させた後、この多孔性シートを、該プローブ分子に相補性を示す一本鎖核酸ターゲット分子に放射性標識を付けた試料分子の水溶液に浸漬し、ハイブリダイゼーションを行なった。
次いで、多孔性シートを水溶液から取り出し、水洗し、乾燥させ、次に、支持体上に点状に形成された蓄積性蛍光体層とカバーシートを有する蓄積性蛍光体シート（図３参照）と該多孔性シートとを、多孔性シートのプローブ分子固定領域と蓄積性蛍光体層領域とが対向する位置関係になるように位置合せして積層し、室温でのオートラジオグラフィー操作を行なった（図４参照）。
オートラジオグラフィー操作後の蓄積性蛍光体シートについて、図５の放射線像再生装置を用いて放射線像再生処理を施したところ、多孔性シートの多孔性領域（プローブ分子に放射性標識試料分子がハイブリダイゼーションにより結合固定された領域）の放射線画像が、高感度かつ高精度にて得られた。
【００５６】
［実施例２］
酢酸セルロース（酢化度：６０％）を原料として多孔性フィルム（多孔性シート）を製造し、所定位置に、常法に従って一本鎖核酸断片（プローブ分子）を点着により付着させた後、この多孔性シートを、該プローブ分子に相補性を示す一本鎖核酸ターゲット分子に放射性標識を付けた試料分子の水溶液に浸漬し、ハイブリダイゼーションを行なった。
次いで、多孔性シートを水溶液から取り出し、水洗乾燥させ、次に、支持体上に点状に形成された蓄積性蛍光体層とカバーシートを有する蓄積性蛍光体シート（図３参照）と該多孔性シートとを、多孔性シートのプローブ分子付着領域と蓄積性蛍光体層領域とが対向する位置関係になるように位置合せして積層し、室温でのオートラジオグラフィー操作を行なった（図４参照）。オートラジオグラフィー操作後の蓄積性蛍光体シートについて、図５の放射線像再生装置を用いて放射線像再生処理を施したところ、多孔性シートの多孔性領域（プローブ分子に放射性標識試料分子がハイブリダイゼーションにより結合した領域）の放射線画像が、高感度かつ高精度にて得られた。
【００５７】
【発明の効果】
本発明の多孔性シートと、蓄積性蛍光体層が該多孔性シートのプローブ分子の付着領域に対応する位置に点在するように構成した蓄積性蛍光体シートと組合せて用いることにより、分解能が更に高められた放射線画像を得ることができるため、生体物質の検出および解析の精度を顕著に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いる蓄積性蛍光体シートの一例を示す概略斜視図である。
【図２】図１におけるＩ−Ｉ線に沿った拡大部分断面図である。
【図３】本発明で用いる蓄積性蛍光体シートの別の例の部分断面図である。
【図４】本発明の検出操作における多孔性シートと蓄積性蛍光体シートとの積層状態の例を示す断面図である。
【図５】オートラジオグラフィー操作を実施した後の蓄積性蛍光体シートから放射線像を再生するための装置の概念図である。
【符号の説明】
１０多孔性シート（検出用シート）
１１プローブ分子非存在領域
１２プローブ分子結合固定領域
１３蓄積性蛍光体シート
１４蓄積性蛍光体シートの支持体
１５点状蓄積性蛍光体層
１６蓄積性蛍光体シートの隔壁
４１ニップローラ
４２ニップローラ
４３励起光
４４輝尽発光光
４５集光ガイド
４６光電変換装置（フォトマルチプライヤ）
４７増幅器
４８信号処理装置
４９ミラー[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for analyzing a sample substance such as a biological substance or a duplicate thereof, and in particular, a sample substance labeled with a radioactive substance is bound and fixed to a porous detection sheet through a biochemical specific binding reaction. The present invention also relates to a method for detecting a sample substance using an operation of detecting the bound and immobilized radioactive label using a stimulable phosphor sheet.
[0002]
[Prior art]
In recent years, macroarrays and microarrays have been widely used to perform gene analysis in the fields of biology and medicine. Both are analytical tools for detecting and analyzing nucleic acids such as DNA and RNA or fragments thereof or replicas thereof using hybridization, which is a kind of biochemical specific binding. In general, the former macroarray is composed of a porous sheet made of polyamide resin or the like, and detection analysis using the macroarray is a method of analyzing nucleic acid fragments (probe molecules) such as many DNA fragments. It is carried out using a sample nucleic acid fragment that is fixed so as to be entangled with the hole and labeled with a radioactive substance such as a radioisotope (RI) as an analysis target (target molecule). On the other hand, the latter microarray consists of a solid support such as a glass slide that has been surface-treated, and its detection analysis usually involves immobilizing a probe molecule on the surface of the solid support and using a sample nucleic acid fragment labeled with a fluorescent substance as a target molecule. Is done using. However, it seems that the use of the names of the macroarray and the microarray is not always strictly performed.
[0003]
Gene analysis using a macroarray is advantageous in that it can be easily performed using conventional autoradiography techniques.
[0004]
Analysis of nucleic acids such as DNA using the macroarray is usually carried out by the following method.
(1) First, for a plurality of types of nucleic acid fragments, a large number of single-stranded nucleic acid fragments (probe molecules; usually those whose base sequences are known) are prepared, and an aqueous solution containing each is used with a spotter. By sequentially spotting in high density and matrix on the macroarray, probe molecules are attached so as to be entangled with the pores at the spotting positions of the porous sheet, thereby forming a large number of dot-like probe molecule spots. Let
(2) Next, the radiolabeled single-stranded nucleic acid fragment sample prepared by labeling the nucleic acid fragment sample to be analyzed with a radioisotope (RI: ³² P, ³³ P, etc.) By contacting (for example, immersing the macroarray in an aqueous solution of a radiolabeled nucleic acid fragment sample using a specific container), the target molecule to be detected is hybridized with the probe molecule and bound and fixed. That is, a target molecule having a base sequence complementary to a probe molecule in a nucleic acid fragment sample is complementarily bound (hybridized) with a spot probe molecule.
(3) Next, the radiolabeled nucleic acid fragment sample that has not been hybridized is washed away from the macroarray.
(4) Binding the target molecule by hybridization for each probe molecule by superimposing the washed and dried macroarray with a radiation-sensitive photographic film and detecting the radiation from the radiolabeled target molecule using autoradiography. Detect information (such as binding and strength).
(5) If the base sequence of the probe molecule to which the target molecule is bound is known, the base sequence of at least a part of the target molecule is determined by utilizing the principle of complementarity.
That is, using such a technique, the expression, mutation, polymorphism and the like of a specific gene can be analyzed simultaneously for a large number of genes.
[0005]
So far, in general autoradiography for radiolabeled biological samples and biopolymers, instead of using a radiographic film, a radiation image conversion panel (imaging plate or storage phosphor sheet) is used. A radiation image recording / reproducing method using the above has been developed. This radiation image recording / reproducing method absorbs and accumulates a part of radiation energy when irradiated with radiation such as X-rays, and then accumulates radiation energy when irradiated with electromagnetic waves (excitation light) such as visible light and infrared light. The stimulable phosphor (accumulative phosphor) having the property of exhibiting stimulating luminescence is used, and the specimen is transmitted through the sheet-shaped radiation image conversion panel containing the stimulable phosphor. After the radiation image information of the subject is irradiated and irradiated and the radiation image information of the subject is once accumulated and recorded, the panel is scanned with excitation light such as laser light and sequentially emitted as stimulated emission light. The exhaust light is photoelectrically read to obtain an electrical image signal (digital signal), and then the obtained digital signal is converted into a visible image as it is or after being subjected to various signal processing. It consists of storing the play or a suitable recording medium.
[0006]
Autoradiography using the radiographic image recording / reproducing method can obtain a radiographic image with high sensitivity even when the radiation dose from the sample is extremely small, and image information is obtained as a digital signal. It has become an important autoradiography technology because of its many advantages such as ease of storage and storage.
[0007]
As a method for measuring radiation from a radiolabeled target molecule, a method using a radiation image conversion panel has also been proposed. For example, in Human Molecular Genetics, 1999, Vol. 8, No. 9, 1715-1722, DNA fragments (probe molecules) are immobilized on the surface of a porous sheet as a large number of spots, and complementation with the DNA fragments is achieved. The radiolabeled sample DNA fragment is hybridized on the porous sheet, and then the porous sheet and the radiation image conversion panel using the storage phosphor are laminated, and the radiation image information reader is used to automate It is described that a target molecule can be detected by performing radiography.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
In gene analysis using a porous sheet such as the macroarray described above, highly radiolabeled sample substances (target molecules) can be detected by using autoradiography using a radiation image conversion panel containing a stimulable phosphor. It becomes possible to do.
[0009]
However, according to the study by the present inventor, the radiolabeled sample substance (target molecule) bound to the porous sheet by a biochemical specific reaction with the probe molecule of the porous sheet is converted into the auto-synthesizer using the above-described stimulable phosphor sheet. Detection by radiography is more sensitive than a method using a radiographic film as a radiation detection material, but the position of the radiolabeled sample substance in the porous sheet to which the radiolabeled sample substance obtained is bound and fixed is determined. It has been found that the image information shown often does not show sufficient resolution or sharpness.
[0010]
As a result of studying the cause of the above-mentioned insufficient resolution or sharpness, the present inventor has found that the radioactive label bonded to the porous sheet on the stimulable phosphor layer of the stimulable phosphor sheet superimposed on the porous sheet. The radiation energy generated from the spot of the sample substance spreads in the process of reaching, and the radiation energy generated from the spot of the radiolabeled sample substance adjacent to the spot of the radiolabeled sample substance on the porous sheet is not sufficient. It was also found that the radiation energy from the radioactively labeled sample material adhering in a small amount in the intermediate region between adjacent spots also reaches the stimulable phosphor layer and becomes noise, and so on.
[0011]
Accordingly, an object of the present invention is a method for detecting a radiolabeled sample substance bound by a biochemical specific reaction on a porous sheet by autoradiography using a stimulable phosphor sheet, and the resulting radiolabeled sample An object of the present invention is to provide a method capable of obtaining image information indicating the position of the spot of the radiolabeled sample substance on the porous sheet to which the substance is bound and fixed more accurately, with high resolution and sharpness.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor uses a stimulable phosphor sheet configured by separating a stimulable phosphor layer into a sea-island shape for detection of a sample substance attached with a radioactive label bound to a porous sheet by a biochemical specific reaction. By using autoradiography, a radiographic image showing the presence position and / or amount of the sample substance bound to a predetermined position of the porous structure of the porous sheet by a biochemical specific reaction is highly sensitive and highly effective. It was found that the sample substance that can be obtained with high accuracy and that binds biochemically specifically to the probe molecule can be detected easily and reliably.
[0013]
Accordingly, the present invention provides a porous sheet in which a probe molecule capable of binding to a sample substance and a biochemical-specific reaction is attached (also called immobilization) to a predetermined position of the porous sheet, and the probe molecule of the porous sheet Providing a stimulable phosphor sheet having a plurality of stimulable phosphor layers provided independently of each other at a position corresponding to each of the attachment positions; the porous sheet and a sample substance having a radioactive label; Contacting in the presence of an aqueous medium to biochemically bind the sample material to the probe molecules of the porous sheet; the porous sheet and the stimulable phosphor sheet are connected to the probe of the porous sheet; By stacking the molecular adhesion position and each storage phosphor layer of the storage phosphor sheet so that the storage phosphor layers face each other, and allowing them to stand in this stacked state, Absorbing and storing the radiation energy emitted from the radioactive label of the sample substance bound to the active structure region in the stimulable phosphor layer of the stimulable phosphor sheet; exciting light is absorbed into the stimulable phosphor sheet that absorbed and accumulated the radiation energy Irradiating and generating photostimulated luminescence from each of the stimulable phosphor layers of the stimulable phosphor sheet; condensing the photostimulated luminescence and converting the collected light into an electrical signal by photoelectric conversion And a method for detecting a sample substance using a biochemical specific binding reaction, comprising the step of processing the electrical signal.
[0014]
The present specification also describes a sample substance detection kit comprising a porous sheet and a stimulable phosphor sheet having a plurality of stimulable phosphor layers provided independently of each other.
[0015]
The present invention also provides a porous sheet formed by attaching probe molecules capable of binding to a sample substance and biochemical-specific reaction, and independently of each other at positions corresponding to the positions of the probe molecules on the porous sheet. There is also a detection kit comprising a stimulable phosphor sheet having a plurality of stimulable phosphor layers provided.
[0016]
In the present invention, the sample substance to be analyzed by the porous sheet is preferably a substance derived from a living body, which is directly collected by extraction or isolation from a living body, and further subjected to chemical treatment or chemical modification. And replicas obtained by using replication techniques such as PCR of these biological substances, and typical examples thereof include nucleic acids such as polynucleotides (DNA, RNA). Or fragments thereof; antigens, antibodies, tumor markers, enzymes, abzymes, hormones and other proteins.
[0017]
The biochemical-specific binding that can be used in the present invention includes the above-described hybridization caused by complementarity of base sequences, and immunospecific binding such as antigen-antibody reaction, and further, the three-dimensional structure between specific proteins. Protein-specific binding based on the above is also included.
[0018]
In the stimulable phosphor sheet of the present invention, it is desirable that the stimulable phosphor layers formed in the shape of dots are separated from each other by barrier ribs having an average density of 0.6 g / cm ³ or more.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The porous sheet used in the present invention is a porous film having many fine pores capable of binding and fixing probe molecules. For this purpose, various porous films are already on the market. . Examples of materials that can form a porous film include cellulose derivatives such as cellulose acetate and nitrocellulose; polyamides such as 6-nylon and 6,6-nylon (nylon); polytetrafluoroethylene and polyvinylidene fluoride Mention may be made of fluorine-based polymers; and organic polymer materials made of polyvinyl chloride, polycarbonate, polysulfone, polyethersulfone; and inorganic materials such as ceramics. Moreover, these materials can also be used together if desired.
[0020]
As the probe molecules fixed to the porous sheet of the present invention, for example, various polynucleotides and oligonucleotides that can be conventionally used as probe molecules for macroarrays can be used. Examples include cDNA (complementary DNA synthesized using mRNA as a template), part of cDNA, polynucleotide prepared by PCR method such as EST (“PCR product”), and synthesized oligonucleotide. it can. Moreover, the artificial nucleic acid which converted the phosphodiester bond of DNA into the peptide bond, ie, peptide nucleic acid (PNA), or those derivatives may be sufficient. Furthermore, proteins capable of causing biochemical specific binding such as antigens and antibodies can also be used.
[0021]
Examples of specific combinations of probe molecules and target molecules include DNA (DNA or a fragment thereof, or oligo DNA) and DNA, DNA and RNA, PNA and DNA or RNA, PNA and PNA, antigen and antibody, avidin And biotin.
[0022]
Using the porous sheet of the present invention as a detection sheet, as a method for detecting a biopolymer substance or a fragment thereof, or a duplicate thereof, probe molecules are usually spotted and adhered to predetermined positions of the porous sheet. A radiolabeled porous sheet is prepared, and the radiolabeled porous sheet is brought into contact with a radiolabeled target molecule (sample substance) obtained by attaching a radiolabel to a substance to be detected in the presence of water. After performing the above hybridization, a method of performing autoradiography by superposing the porous sheet and the stimulable phosphor sheet (radiation image conversion panel) is used. Autoradiography using this stimulable phosphor sheet has advantages such that the detection operation can be performed at room temperature and the detection sensitivity is high.
[0023]
As described above, the general configuration of the stimulable phosphor sheet has already been described in various publications, and autoradiography using the stimulable phosphor sheet has been put into practical use.
[0024]
The stimulable phosphor sheet is usually accumulated on a support by applying and drying a dispersion for forming a phosphor layer composed of stimulable phosphor particles (eg, stimulable phosphor particles) and a binder. It is manufactured by a method of forming a phosphor layer and then providing a protective layer on the stimulable phosphor layer. The stimulable phosphor layer can also be formed on the support by a method in which a stimulable phosphor sheet is separately produced and affixed on the support.
[0025]
The stimulable phosphor sheet used in the present invention has a plurality of stimulable phosphor layers provided independently of each other at positions corresponding to the predetermined binding and fixing positions of the probe molecules of the porous sheet. It is a body sheet. That is, the stimulable phosphor layer is not formed as a continuous layer, but is separated and independent from each other as a minute dot-like stimulable phosphor layer generally called a sea-island structure on a support. Exists in the state.
[0026]
1 and 2 are cross-sectional views of typical structures of the stimulable phosphor sheet used in the present invention. 1 and 2, the stimulable phosphor sheet 13 is composed of a support 14 and a plurality of dot-like stimulable phosphor layers 15 formed on the surface of the support 14 independently of each other. .
[0027]
As shown in FIG. 3, the stimulable phosphor sheet used in the present invention has a high density (for example, 0. 0) so that the plurality of dot-like stimulable phosphor layers 15 on the support 24 do not transmit radiation. 6 g / cm ² or more) are preferably separated from each other by a partition wall 16 and a cover sheet 17 is preferably provided as a protective layer.
[0028]
In addition, the interspersed structure (sea-island structure) of the stimulable phosphor layer in the stimulable phosphor sheet used in the present invention is not necessarily provided over the entire stimulable phosphor sheet. The storage phosphor layer may be formed.
[0029]
The stimulable phosphor is preferably a stimulable phosphor that exhibits stimulated emission in a wavelength range of 300 to 500 nm when irradiated with excitation light having a wavelength of 400 to 900 nm. Examples of such photostimulable phosphors are described in detail in JP-A-2-193100 and JP-A-4-310900. Preferred stimulable phosphors include alkaline earth metal halide phosphors activated by europium or cerium (eg, BaFBr: Eu and BaF (Br, I): Eu), and cerium activated rare earths. Examples thereof include oxyhalide-based stimulable phosphors.
[0030]
Among these, basic composition formula (I):
M ^II FX: zLn (I)
Rare earth activated alkaline earth metal fluoride halide photostimulable phosphors represented by M ^II represents at least one alkaline earth metal selected from the group consisting of Ba, Sr and Ca, and Ln represents Ce, Pr, Sm, Eu, Tb, Dy, Ho, Nd, Er, Tm and Yb. Represents at least one rare earth element selected from the group consisting of X represents at least one halogen selected from the group consisting of Cl, Br and I. z represents a numerical value within the range of 0 <z ≦ 0.2.
[0031]
As M ^II in the basic composition formula (I), Ba preferably occupies half or more. Ln is particularly preferably Eu or Ce. Further, in the basic composition formula (I), it appears as F: X = 1: 1 on the notation, but this indicates that it has a BaFX-type crystal structure, and the stoichiometric property of the final composition. It does not indicate composition. In general, a state in which many F ⁺ (X ⁻ ) centers, which are X ⁻ ion vacancies, are generated in a BaFX crystal is preferable in order to increase the photostimulation efficiency with respect to light of 600 to 700 nm. At this time, F is often slightly more excessive than X.
[0032]
Although omitted in the basic composition formula (I), the following additives may be added to the basic composition formula (I) as necessary.
bA, wN ^I , xN ^II , yN ^III
However, A represents a metal oxide such as Al ₂ O _3, SiO ₂ and ZrO _2. In preventing sintering between M ^II FX particles, it is preferable to use an average particle size of the primary particles has low reactivity with M ^II FX in the following ultrafine particles 0.1 [mu] m. N ^I represents at least one alkali metal compound selected from the group consisting of Li, Na, K, Rb and Cs, N ^II represents an alkaline earth metal compound composed of Mg and / or Be, N ^III represents a compound of at least one trivalent metal selected from the group consisting of Al, Ga, In, Tl, Sc, Y, La, Gd, and Lu. As these metal compounds, halides as described in JP-A-59-75200 are preferably used, but are not limited thereto.
[0033]
In addition, b, w, x, and y are the amounts added to the feed when the number of moles of M ^II FX is 1, and 0 ≦ b ≦ 0.5, 0 ≦ w ≦ 2, 0 ≦ x ≦ 0. 3 represents a numerical value within each range of 0 ≦ y ≦ 0.3. These numerical values do not represent the ratio of elements contained in the final composition with respect to the additive that is reduced by firing or subsequent cleaning treatment. Some of the compounds remain as added in the final composition, while others react with or be taken up by M ^II FX.
[0034]
In addition, the basic composition formula (I) further includes Zn and Cd compounds described in JP-A No. 55-12145, and metal oxides described in JP-A No. 55-160078 as required. TiO ₂ , BeO, MgO, CaO, SrO, BaO, ZnO, Y ₂ O ₃ , La ₂ O ₃ , In ₂ O ₃ , GeO ₂ , SnO ₂ , Nb ₂ O ₅ , Ta ₂ O ₅ , ThO ₂ ; Zr and Sc compounds described in JP-A-56-116777; B compounds described in JP-A-57-23673; As and Si compounds described in JP-A-57-23675; Tetrafluoroboric acid compounds described in Japanese Patent No. 27980; monovalent or divalent hexafluorosilicic acid, hexafluorotitanic acid, and hexafluorozirconic acid described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-47289 Hexafluoro compounds consists; V described in JP-59-56480 Publication, Cr, Mn, Fe, and the like may be added a compound of a transition metal such as Co and Ni. Furthermore, in the present invention, not only the phosphor containing the above-mentioned additives, but any material having a composition basically regarded as a rare earth activated alkaline earth metal fluoride halide stimulable phosphor. It may be.
[0035]
The rare earth activated alkaline earth metal fluoride halide stimulable phosphor represented by the basic composition formula (I) usually has an aspect ratio in the range of 1.0 to 5.0. The stimulable phosphor particles used in the stimulable phosphor sheet of the present invention generally have an aspect ratio in the range of 1.0 to 2.0 (preferably 1.0 to 1.5) and have a median particle size. The diameter (Dm) is in the range of 1 μm to 10 μm (preferably 2 to 7 μm), and σ / Dm is 50% or less (preferably 40% or less) when the standard deviation of the particle size distribution is σ Is. Examples of the particle shape include a rectangular parallelepiped type, a regular hexahedron type, a regular octahedron type, a tetrahedron type, an intermediate polyhedron type, and irregular pulverized particles, among which a tetrahedron type is preferable. However, the stimulable phosphor particles satisfying the aspect ratio, the particle size, and the particle size distribution may be used even if they are not necessarily a tetrahedron type.
[0036]
As described above, the stimulable phosphor sheet used in the present invention is a material in which each of the scattered stimulable phosphor layers is opaque to radiation energy (eg, a metal material such as stainless steel, aluminum, copper, brass, etc.) Preferably, a wall made of a ceramic material such as aluminum, magnesium oxide, silicon nitride, or carbon, or a polymer material such as polyethylene terephthalate, polyethylene naphthalate, polyurethane resin, or acrylic resin) is provided, or the storage phosphor is It is preferable that the configuration is such that the dots are separated and embedded in a sheet made of a material that is opaque to radiation energy.
[0037]
Moreover, it is also preferable to use the spacer comprised from the thin film or sheet | seat which has a through-hole in the position corresponding to the probe molecule bond fixing position of a porous sheet with the storage phosphor sheet | seat of this invention.
[0038]
In the stimulable phosphor sheet used in the present invention, the stimulable phosphor layer is present at a position corresponding to the probe molecule binding and fixing position of the porous sheet, and the probe molecule binding and fixing position of the porous sheet. It is preferable that the region corresponding to the intermediate region is configured to have a sea-island structure configured such that the stimulable phosphor layer does not exist. Such a storage phosphor layer having a sea-island structure is, for example, a method in which a storage phosphor layer material coating solution is printed on a support surface in a sea-island shape by screen printing or the like, and the printed coating solution is dried. After preparing a support having a recess formed thereon, applying the stimulable phosphor layer material coating solution to the support surface, wiping the support surface so that the coating solution remains only in the recess, and then applying the coating solution. It can be manufactured using a method of drying, a method of embedding a stimulable phosphor in a through hole of a sheet having a large number of through holes, and affixing this to a support.
[0039]
A light reflecting layer made of a material that reflects excitation light and / or stimulated emission light may be provided on the surface of one side of the stimulable phosphor sheet. In the case where the support is provided on the stimulable phosphor sheet, the light reflection layer is usually provided between the support and the stimulable sheet. By providing the light reflecting layer, it is possible to increase the excitation light rate and the extraction efficiency of the emitted light, and as a result, it is possible to achieve higher sensitivity and higher image quality.
[0040]
The stimulable phosphor sheet is not necessarily provided with a support or a protective film, but for the convenience of transporting and handling the stimulable phosphor sheet and avoiding property changes, that is, water resistance, durability, In order to improve weather resistance and dirt resistance, a support and a protective film may be provided. Further, the support may be transparent, and in that case, the support is suitable for a reading method by a double-sided condensing method in which the photostimulated luminescent light is extracted from both sides of the stimulable phosphor sheet.
[0041]
The support is usually a sheet or film made of a flexible resin material and having a thickness of 50 μm to 1 mm. The support may be transparent, or the support may be filled with a light reflective material (eg, alumina particles, titanium dioxide particles, barium sulfate particles) for reflecting excitation light or stimulated emission light. Alternatively, a gap may be provided. Alternatively, the support may be filled with a light-absorbing material (eg, carbon black) in order to absorb excitation light or stimulated emission light. Examples of resin materials that can be used to form the support include various resin materials such as polyethylene terephthalate, polyethylene naphthalate, aramid resin, and polyimide resin. If necessary, the support may be a metal sheet, a ceramic sheet, a glass sheet, a quartz sheet, or the like.
[0042]
The protective film is preferably transparent so as not to affect the incident of excitation light and the emission of photostimulated luminescence, and physical impacts and chemical influences applied from the outside (for example, contact with moisture). Therefore, it is desirable to have a chemically stable and high physical strength so that the stimulable phosphor sheet can be sufficiently protected. As a protective film, a solution prepared by dissolving a transparent organic polymer substance such as cellulose derivative, polymethyl methacrylate, or organic solvent-soluble fluorine resin in an appropriate solvent is applied on the phosphor layer. Formed, or separately formed a protective film forming sheet such as an organic polymer film such as polyethylene terephthalate or a transparent glass plate, and provided with an appropriate adhesive on the surface of the phosphor layer, or inorganic A compound formed on the phosphor layer by vapor deposition or the like is used. In addition, various additives such as light-scattering fine particles such as magnesium oxide, zinc oxide, titanium dioxide, and alumina, slipping agents such as perfluoroolefin resin powder and silicone resin powder, and crosslinking agents such as polyisocyanate are contained in the protective film. May be dispersed and contained. The thickness of the protective film is generally in the range of about 0.1 μm to 20 μm.
[0043]
A fluororesin coating layer may be further provided on the surface of the protective film in order to increase the stain resistance of the protective film. The fluororesin coating layer can be formed by coating a fluororesin solution prepared by dissolving (or dispersing) a fluororesin in an organic solvent on the surface of the protective film and drying. Although the fluororesin may be used alone, it is usually used as a mixture of a fluororesin and a resin having a high film forming property. In addition, an oligomer having a polysiloxane skeleton or an oligomer having a perfluoroalkyl group can be used in combination. The fluororesin coating layer can be filled with a fine particle filler in order to reduce interference unevenness and further improve the image quality of the radiation image. The thickness of the fluororesin coating layer is usually in the range of 0.5 μm to 20 μm. In forming the fluororesin coating layer, additive components such as a cross-linking agent, a hardener, and a yellowing inhibitor can be used. In particular, the addition of a crosslinking agent is advantageous for improving the durability of the fluororesin coating layer.
[0044]
A variety of configurations are known for the storage phosphor sheet. For example, an auxiliary layer such as an adhesive layer, a colored layer, an antistatic layer, an excitation light reflection layer, or a stimulated emission light reflection layer is also known. It has been. The storage static phosphor sheet used in the present invention may be provided with an auxiliary layer thereof as necessary.
[0045]
As described above, the stimulable phosphor sheet generally has a basic configuration in which a support is provided on the lower surface and a protective film is provided on the upper surface. The stimulable phosphor sheet is usually composed of stimulable phosphor particles and a binder containing and supporting the phosphor particles in a dispersed state. However, as the stimulable phosphor sheet, the stimulable phosphor sheet does not include a binder formed by a vapor deposition method, a sintering method, or the like and is composed of the aggregate of the stimulable phosphor, Also known are those infiltrated with polymeric substances.
[0046]
Next, the detection method of the present invention will be described by taking as an example a detection method using a synthetic oligonucleotide as a probe molecule to be bound and fixed to a porous sheet and using a DNA fragment as a sample material.
[0047]
In the autoradiography using the stimulable phosphor sheet, for example, as shown in FIG. 4, a porous sheet and a stimulable phosphor sheet on which a radioactively labeled sample substance (target molecule) is bound and fixed by hybridization. In addition, the probe molecule adhesion region 12 of the detection sheet (porous sheet) 10 and the dot-like storage phosphor layer 15 of the storage phosphor sheet 13 are arranged so as to face each other and so as to be in close contact with each other. In this laminated state, for example, it is performed by storing at 0 to 30 ° C. for a certain time (eg, 1 hour to 120 hours). By this storage process, radiation energy emitted from the radioactive substance bonded and fixed to the porous sheet is absorbed and recorded (accumulated) together with the position information on the stimulable phosphor sheet. The storage phosphor sheet in which a latent image is formed by absorbing and accumulating radiation energy from the porous sheet together with position information by such an autoradiographic operation is then subjected to a radiographic image forming process, and then a target image is obtained. Can be visualized (or data formation of digital image information).
[0048]
FIG. 5 is a schematic view for explaining the radiation image forming method of the present invention using the stimulable phosphor sheet subjected to the above autoradiography operation.
[0049]
First, the stimulable phosphor sheet is peeled off from the laminate (see FIG. 4) of the porous sheet and the stimulable phosphor sheet on which the radiolabeled target molecules are fixed, and this is loaded into the radiographic image reading apparatus of FIG. .
[0050]
In FIG. 5, the stimulable phosphor sheet 13 is transferred in the direction of the arrow by transfer means 41 and 42 comprising two sets of nip rollers. On the other hand, the excitation light 43 such as a laser beam is irradiated from the protective layer side surface (storable phosphor layer side surface) of the stimulable phosphor sheet 13. From the region in the stimulable phosphor layer of the stimulable phosphor sheet 13 that has been irradiated with the excitation light 43 , there is radiation energy distribution information recorded as a latent image according to the accumulated energy level. E) Stimulated emission light 44 is emitted. The photostimulated emission light 44 is reflected directly or by a mirror 49 and collected by a light collecting guide 45 provided above, and a photoelectric conversion device (photomultiplier) 46 provided at the base of the light collecting guide 45. Is converted into an electric signal, amplified by an amplifier 47 and sent to a signal processing device 48 .
[0051]
The signal processing device 48 performs appropriate arithmetic processing such as addition and subtraction determined in advance on the basis of the type of the intended radiographic image and the characteristics of the radiographic image conversion panel for the electrical signal sent from the amplifier 47. The processed signal is sent out as an image signal.
[0052]
The sent image signal is reproduced as a visible image by an image reproducing device (not shown), thereby reconstructing an image corresponding to the spatial energy distribution of the radiation relating to the DNA porous sheet. The playback device may be a display means such as a CRT, or a recording device that performs optical scanning recording on a photosensitive film, or for this purpose, an image signal is temporarily stored in an image file such as an optical disk or a magnetic disk. It may be replaced with a device for storing the data.
[0053]
On the other hand, the stimulable phosphor sheet 13 is further moved in the direction of the arrow by the nip rollers 41 and 42 , and the area of the sheet subjected to the reading process is an erasing light source such as a sodium lamp, a fluorescent lamp, or an infrared lamp. It is subjected to an erasing process using (not shown). As a result, the accumulated energy remaining on the panel after the reading process is released and removed, so that the latent image due to the residual energy is not adversely affected in the next radiographic image recording (imaging) process. The removal of the residual energy may be performed immediately before the radiographic image recording (imaging) step, or may be performed at both time points before and after the radiographic image recording (imaging) step.
[0054]
In addition, as the stimulable phosphor sheet, the reflectivity with respect to the excitation light on the excitation light irradiation side surface increases as the incident angle increases, while the reflectivity with respect to the stimulated emission light depends on the incident angle. Using a non-multi-layer filter attached, transfer the stimulable phosphor sheet in which the radiation energy distribution information is accumulated and recorded as a latent image in the plane direction, or use the excitation light irradiation device as the phosphor sheet. The phosphor sheet is irradiated with excitation light linearly in a direction perpendicular to the transfer direction using an LD array, an LED array, a fluorescent light guide sheet, etc. The stimulated emission light emitted from the latent image of the excitation light irradiated portion is subjected to sequential one-dimensional photoelectric detection using a line sensor or the like in which a large number of solid photoelectric conversion elements are arranged in a line, and the radiation energy is detected. It is also possible to utilize the radiation image information reading method for obtaining over distribution information as an electrical image signal.
[0055]
【Example】
[Example 1]
After a single-stranded nucleic acid fragment (probe molecule) is attached to a predetermined position of a commercially available nylon 6 porous sheet by spotting according to a conventional method, this porous sheet is complementary to the probe molecule. Hybridization was performed by immersing in an aqueous solution of a sample molecule in which a single-stranded nucleic acid target molecule was radioactively labeled.
Next, the porous sheet is taken out of the aqueous solution, washed with water, dried, and then a stimulable phosphor sheet (see FIG. 3) having a stimulable phosphor layer and a cover sheet formed in a dot shape on the support. The porous sheet was laminated so that the probe molecule-fixed region and the stimulable phosphor layer region of the porous sheet face each other, and an autoradiographic operation was performed at room temperature ( (See FIG. 4).
When the stimulable phosphor sheet after the autoradiography operation was subjected to a radiation image regeneration process using the radiation image regeneration device of FIG. 5, the porous region of the porous sheet (radiolabeled sample molecules were hybridized to the probe molecules). The radiation image of the region fixed and bonded by the above method was obtained with high sensitivity and high accuracy.
[0056]
[Example 2]
After manufacturing a porous film (porous sheet) using cellulose acetate (acetylation degree: 60%) as a raw material, and attaching a single-stranded nucleic acid fragment (probe molecule) to a predetermined position by spotting according to a conventional method, The porous sheet was immersed in an aqueous solution of a sample molecule in which a single-stranded nucleic acid target molecule complementary to the probe molecule was radiolabeled, and hybridization was performed.
Next, the porous sheet is taken out from the aqueous solution, washed with water and dried. Next, the stimulable phosphor sheet (see FIG. 3) having the stimulable phosphor layer and the cover sheet formed in a dot shape on the support, and the porous sheet. The sheet was aligned and laminated so that the probe molecule adhesion region and the stimulable phosphor layer region of the porous sheet face each other, and an autoradiographic operation at room temperature was performed (FIG. 4). reference). When the stimulable phosphor sheet after the autoradiography operation was subjected to a radiation image regeneration process using the radiation image regeneration device of FIG. 5, the porous region of the porous sheet (radiolabeled sample molecules were hybridized to the probe molecules). The radiographic image of the region combined by (2) was obtained with high sensitivity and high accuracy.
[0057]
【The invention's effect】
By using the porous sheet of the present invention in combination with the stimulable phosphor sheet configured such that the stimulable phosphor layer is scattered at positions corresponding to the adhesion regions of the probe molecules of the porous sheet, the resolution is improved. Furthermore, since an enhanced radiographic image can be obtained, the accuracy of detection and analysis of biological materials can be significantly improved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic perspective view showing an example of a stimulable phosphor sheet used in the present invention.
FIG. 2 is an enlarged partial cross-sectional view taken along the line II in FIG.
FIG. 3 is a partial cross-sectional view of another example of the stimulable phosphor sheet used in the present invention.
FIG. 4 is a cross-sectional view showing an example of a laminated state of a porous sheet and a stimulable phosphor sheet in the detection operation of the present invention.
FIG. 5 is a conceptual diagram of an apparatus for reproducing a radiation image from a stimulable phosphor sheet after performing an autoradiographic operation.
[Explanation of symbols]
10 Porous sheet (sheet for detection)
DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 Probe molecule non-existence area | region 12 Probe molecule coupling | bonding fixation area | region 13 Storage phosphor sheet 14 Storage phosphor sheet support 15 Point storage phosphor layer 16 Partition of storage phosphor sheet
41 nip roller
42 nip roller
43 excitation light
44 photostimulated light
45 condensing guide
46 photoelectric conversion device (photomultiplier)
47 amplifier
48 signal processor
49 mirrors

Claims

A porous sheet to which probe molecules capable of binding to a sample substance and biochemical specific reaction are attached at predetermined positions, and provided independently of each other at positions corresponding to the probe molecule attachment positions of the porous sheet. Providing a stimulable phosphor sheet having a plurality of stimulable phosphor layers; contacting the porous sheet with a sample substance having a radioactive label in the presence of an aqueous medium to make the sample substance porous A step of biochemically binding to the probe molecules of the porous sheet; the porous sheet and the stimulable phosphor sheet, the probe molecule adhesion position of the porous sheet and each of the stimulable phosphor layers of the stimulable phosphor sheet Is emitted from the radioactive label of the sample substance bound to the porous structure region of the porous sheet. A step of absorbing and accumulating radiation energy in the stimulable phosphor layer of the stimulable phosphor sheet; irradiating the stimulable phosphor sheet absorbing and accumulating radiation energy with excitation light, and the stimulable phosphor of the stimulable phosphor sheet Generating photostimulated luminescence from each of the layers; collecting the photostimulated luminescence and converting the collected light into an electrical signal by photoelectric conversion; and processing the electrical signal to produce a radioactive label A method for detecting a sample substance using a biochemical specific binding reaction, which comprises a step of detecting the position of a porous structure region to which the sample substance having a bond is fixed.

The detection method according to claim 1, wherein each of the stimulable phosphor layers uses a stimulable phosphor sheet that is separated from each other by a partition wall having an average density of 0.6 g / cm ³ or more.

A porous sheet formed by attaching probe molecules that can bind to a sample substance through a biochemical-specific reaction, and provided independently of each other at positions corresponding to the positions of the probe molecules on the porous sheet. A detection kit comprising a stimulable phosphor sheet having a plurality of stimulable phosphor layers.