JP4283469B2

JP4283469B2 - Compatibility-Liquid Phase Peptide Synthesis Method with Sequential Addition of Amino Acids by Multiphase Organic Solvent System

Info

Publication number: JP4283469B2
Application number: JP2001385493A
Authority: JP
Inventors: 一裕千葉; 悠介河野
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2001-12-19
Filing date: 2001-12-19
Publication date: 2009-06-24
Anticipated expiration: 2021-12-19
Also published as: JP2003183298A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチド、蛋白質、DNA、RNA、多糖類などオリゴマーまたはポリマー類、特にペプチドを、これらを構成する一種類または複数種類のユニット分子、特にアミノ酸を制御された順序で結合させて前記オリゴマーまたはポリマー類の合成法、特に液相ペプチド合成法に関する。特に設計されたオリゴマーまたはポリマー類、特にペプチドの合成の制御が容易であり、反応生成物の回収が容易である溶媒システムを用いた液相ペプチド合成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学反応において、試薬、触媒、反応補助剤、副生成物などと、目的とする生成物を容易に分離することができれば、分離操作を大幅に低減させるだけでなく、工程で使用される薬剤を少なくすることができ、環境に有害な廃棄物を発生させることを極力抑制することができる。ところで、
これまでに、ペプチドやDNAなどのオリゴマーおよびポリマー類は、それを設計に従って複数のユニット化合物を逐次変えながら結合させ伸長して合成されている。該合成には、固体表面に合成すべきオリゴマーおよびポリマー類を形成させる官能基、例えば、ペプチドの場合、不溶性樹脂表面にペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸残基を導入したものを溶媒中に分散させた状態でペプチド類を合成する固相合成法が用いられていた。
しかしながら、この反応系においては、固体表面で化学反応を行わなければならないため、試薬が固体表面に接近しにくく、一般に反応性、反応速度が低い。また、目的の反応が進行したことを簡便に確認することができないという問題点があった。また、固相合成では反応スケールを大きくするとは困難であるとともに、固相担体の価格が高いものが多く、経済性の点でも問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明課題は、前記従来技術の、固相表面反応を液相反応としながら、得られた反応生成物の分離を極めて容易に実現する溶液ペプチド合成法を確立することである。前記問題点を解決すべく鋭意検討する中で、これまで本発明者らが開発した、温度を制御すことにより相溶性の状態と相分離の状態とに可逆的に状態を制御できる溶媒システムを用いてペプチドを合成する方法を確立することを考えた。そのためには従来の固相反応ペプチド合成法におけるペプチドの形成を開始するアミノ酸単位の結合部を有し、アミノ酸単位を順次結合させ伸長させたペプチド鎖を担持する機能と、更に前記ペプチドの合成開始前のアミノ酸単位の結合部を有する化合物および合成中のペプチド鎖の結合した化合物を一方の溶媒または混合溶媒系に溶解させる機能を持つ化合物残基を見出す必要がある。本明細書では該化合物残基に要求される技術的特性から、担体と称する。
そして、一方の溶媒または混合溶媒Ａとして非極性有機溶媒からなるものを用い、前記Ａと組み合わせる他方の溶媒または混合溶媒Ｂとして極性有機溶媒からなる溶媒システムと組み合わせて使用する担体として前記一般式Ａの化合物を用いることにより前記固相反応ペプチド合成法に習った液相ペプチド合成法システムを確立し、前記課題を解決することができた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、温度を制御すことにより相溶性の状態と相分離の状態とに可逆的に状態を制御できる溶媒システムを用いてペプチドを合成する方法において、合成すべきペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸残基を導入する残基として、前記状態を制御できる溶媒システムを構成する一方の溶媒または混合溶媒Ａに対して溶解度を高める化合物から誘導される担体を用い、該溶媒または混合溶媒Ａと該担体との組み合わせにより、該合成すべきペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸残基を担体と結合したペプチド開始化合物および前記ペプチド開始化合物に順次アミノ酸を導入してペプチド鎖を伸長した化合物を該溶媒または混合溶媒Ａへの溶解度を高め、該溶媒または混合溶媒Ａと組み合わせる他方の溶媒または混合溶媒Ｂとして、前記相溶性の状態を形成する温度以下においては前記ペプチド鎖の伸長に用いる種々のアミノ酸を優先的に溶解し、前記相溶性の状態を形成する温度以上では前記Ａと相溶性状態の溶媒を形成して前記ペプチド開始化合物を溶解するものを用いて、種々のα位アミノ基に保護基を結合した保護アミノ酸を溶解した前記Ｂを、相分離の状態において順次設計されたペプチドを合成するアミノ酸を溶解したものと置換し、置換後相溶性状態を呈する温度に加熱することにより、前記アミノ酸を順次結合させることを特徴とする液相ペプチド合成法である。好ましくは、一方の溶媒または混合溶媒Ａが有機溶媒からなり、該溶媒または混合溶媒Ａと組み合わせる他方の溶媒または混合溶媒Ｂも有機溶媒からなることを特徴とする前記液相ペプチド合成法であり、より好ましくは、一方の溶媒または混合溶媒Ａを構成する有機溶媒がシクロアルカン系の化合物からなり、該溶媒または混合溶媒Ａを構成する有機溶媒と組み合わせる他方の溶媒または混合溶媒Ｂを構成する有機溶媒がニトロアルカン、ニトリル、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミド化合物およびスルフスルフォキサイドからなる群から選択される少なくとも一種から構成されたものであることを特徴とする前記液相ペプチド合成法であり、一層好ましくは、ニトロアルカンのアルキル基は炭素数が1、２または３であり、ニトリルのアルキル基の炭素数が1、２または３であり、アミド化合物はＮ−ジアルキルまたはＮ−モノアルキルアミドのアルキル基およびアシル基またはホルミル基の炭素数の合計は６以下であり、アルコールは炭素数が８以下であり、スルフォキサイドのアルキル基は炭素数が1、２または３であり、またハハロゲン化アルキルのアルキル基は炭素数が６以下であることを特徴とする前記液相ペプチド合成法であり、より一層好ましくは、ペプチド開始化合物を形成する担体は、親シクロアルカン系溶媒部分とアミノ酸と結合する官能基を有するものであることを特徴とする前記一般式Ａで表される芳香族炭化水素環または炭素数１０以上の炭化水素基の基本骨格化合物からの残基からなることを特徴とする前記の各液相ペプチド合成法であり、好ましくは前記化合物群Ｂで表されるものであることを特徴とする前記液相ペプチド合成法である。
【０００５】
従来の固相反応ペプチド合成法では、固相にアミノ酸結合基が存在するためアミノ酸との反応性悪く、大過剰量のアミノ酸を反応系に供給することにより、固体表面における反応を完結しなければならないという問題があった。しかし、本発明の液相ペプチド合成法では、ペプチド合成の反応は、相溶状態の均一溶液系で進行するため、反応効率が極めて高く、担体に結合したアミノ酸結合基に対して、外部から添加して反応させるためのアミノ酸分子の量は過剰量必要としない。
【０００６】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ａ．本発明の溶媒システムは、少なくとも、わずかな温度変化により、可逆的に均一相溶混合溶媒系の状態と複数相に分離した分離溶媒系の状態とを取り得る二種以上の単一有機溶媒または混合有機溶媒から成り、かつ、一方の有機溶媒または混合有機溶媒は、分離溶媒系の状態においてペプチド開始化合物およびこれに順次アミノ酸を結合させ伸長したペプチド鎖を結合した化合物を溶解するが、前記結合させるアミノ酸を溶解せず、他方の有機溶媒または混合有機溶媒は、分離溶媒系の状態において前記結合させるアミノ酸を溶解するが、前記ペプチド開始化合物およびこれに順次アミノ酸を結合させ伸長したペプチド鎖を結合した化合物を溶解しない特性を持つことが基本である。
【０００７】
１，一方の単一有機溶媒または混合有機溶媒は、前記基本特性に基づいて選択されるが、基本的には低極性有機溶媒であり、該溶媒を構成する化合物群としては、アルカン、シクロアルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物などを挙げることができ、好ましいものとしては、シクロアルカン系の化合物を挙げることができ、特に好ましいものとしてシクロヘキサンを好ましいものとして挙げることができる。シクロヘキサンのイス型−舟形配座異性体の変換が他の溶媒との関連で温度的に比較的穏やかな条件で起こることに関連して、前記本発明の溶媒システムが実現されていることと推測することができる。シクロヘキサンは融点が６．５℃と比較的高く、反応後の生成物などを固化して分離できるという利点があり、この面からも好ましい溶媒と言うことができる。
【０００８】
２、前記１、と組み合わされる単一有機溶媒または混合有機溶媒としては、１、と同様に前記基本特性に基づいて選択されるが、基本的には、高極性有機溶媒である。好ましくは、ニトロアルカン、ニトリル、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミド化合物およびスルフォキサイドからなる群から選択される。
【０００９】
３、前記溶媒システムと組み合わせて本発明の液相ペプチド合成法を確立するのはペプチド開始化合物に、分離溶媒系の状態において一方の単一の有機溶媒または混合有機溶媒に溶解性を高め、前記一方の単一の有機溶媒または混合有機溶媒と組み合わせる他方の単一の有機溶媒または混合有機溶媒に溶解しないものを選択することが重要であり、このようなものとして下記一般式Ａで表される残基および炭素数１０以上の炭化水素基の基本骨格化合物からの残基から選択される。
【００１０】
【化４】

【００１１】
一般式Ａにおいて、Ｌ₁は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する単結合、該水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する原子団、または点線と結合して２環の縮合芳香族環を形成する原子団であり、点線はＨとの結合または前記Ｌ₁と結合して前記縮合芳香族環を形成する原子団であり、ＸはＯ、Ｓ、Ｎ、エステル基、スルフィド基またはイミノ基であり、Ｒは、シクロアルカン系の溶剤への溶解性を高めるＯ、Ｓ、またはＮを結合原子として含んでいても良い炭素数１０以上の炭化水素基である。ｎは１〜５の整数である。
【００１２】
前記一般式Ａの具体例としては、下記の一般式群Ｂの化合物を挙げることができる。
【００１３】
【化５】

【００１４】
各一般式において、Ｘ、Ｒおよびｎは一般式Ａと同じ。Ｑは、単結合または炭化水素基であり、Ｒ₂はアミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基であり、Ｒ₃およびＲ₄は、下記の一般式Ｃの基である。
【００１５】
【化６】

【００１６】
Ｒ₅は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基である。
【００１７】
４、本発明の液相ペプチド合成法に用いられるアミノ酸は、従来の固相反応ペプチド合成法に用いられる保護アミノ酸、例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−アミノ酸、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）−アミノ酸、Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）−アミノ酸などを用いることができる。
【００１８】
ここでは、更に具体的な例を実施例として示すが、これは本発明をより理解し易くするためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００１９】
実施例１
可溶性担体〔ＳＣ〕−バリン（Ｖａｌ）−グリシン（Ｇｌｙ）−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）−Fmoc 〔（ＳＣ）−Val−Gly−Phe−Fmoc) 〕の液相合成。
可溶性担体〔ＳＣ〕として、一般式群Ｂにおいて、ＲがＣ₁₈Ｈ₃₇−であり、ＸがOであり、ｎが３であり、ＱがＣＨ₂であり、Ｒ₂がＯＨである、
（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール、〔(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl)methan-1-ol 〕を用いる。
【００２０】
工程１）Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ（１７０ｍｇ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、さらにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１２５ｍｇを添加する。本溶液を室温にて１５分間撹拌した後、ろ過。ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した後、得られた残渣をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍＬに溶解する。続いて可溶性担体〔ＳＣ〕を溶解したシクロヘキサン溶液（可溶性担体５０ｍｇ／３ｍＬ）３ｍＬをＤＭＦ溶液に添加する。されに4−ジメチルアミノピリジン（DMAP）６．５ｍｇを添加し、反応溶液を５０℃に加温し、３０分反応を行う。このときシクロヘキサン層とＤＭＦ層に分離していた溶液系は均一溶液系になる。反応終了後、反応溶液を室温に戻し、反応溶液を再び二相に分離させる。下層のDMF相を分離、除去し、１０％ジエチルアミン／DMF溶液を３ｍＬ添加し、５０℃で２０分間攪拌する。反応液を冷却し、シクロヘキサン層を分離する。このシクロヘキサン層には可溶性担体結合バリン−ＮＨ₂(〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ₂) が回収される。（収率９５％）
【００２１】
工程２）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ５７ｍｇ、ＨＯＢｔ５５ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをDMF２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−グリシン−OH／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、工程１）で得た〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ₂／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｆｍｏｃ）を分離する。Fmoc基は同溶液にジエチルアミンを添加することにより、脱離し〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ を得る。
図１に、この合成反応の概略を示す。
【００２２】
工程３）つぎに、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ５７ｍｇ、ＨＯＢｔ５５ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをDMF ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−フェニルアラニ（Ｐｈｅ）−OH／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液2 mlを５℃に冷却後工程２）で得た〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｆｍｏｃ）を分離する。
以上の操作を繰り返すことにより、可溶性担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするオリゴペプチドが合成される。
【００２３】
構造確認
〔ＳＣ〕シクロヘキサン可溶性担体；（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール〔(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl)methan-1-ol 〕。
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）δ；５．５４（２Ｈ、ｓ）、４．５８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ）、３．９６（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．９６（３Ｈ、ｓ）、１．８２−１．７０（６Ｈ、ｍ）、１．５０−１．４１（６Ｈ、ｍ）、１．３８−１．２０（８４Ｈ、ｂｒ）、０．８８（９Ｈ，６，８Ｈｚ）、¹³Ｃ−ＮＭＲ（１００Ｈｚ）；（１００ＭＨｚ δ：１５３．２，１３７．４，１３６．０，１０５．２、７３．４、６９．１、６５．７、３２．０、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２６．２、２２．８、１４．２、；ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）、Ｃ₆₁Ｈ₁₁₆Ｏ₄に対する計算値〔Ｍ＋Ｎａ〕⁺９３５、実験値９３５.
【００２４】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−Ｆｍｏｃ
；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ７．７６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．６０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．４０（２Ｈ、ｄｔ、J=２．６、７．３Ｈｚ）、７．３１（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、６．５３（２Ｈ、ｓ）、５．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、５．０５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、４．３８（２Ｈ、ｍ）、４．２３（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、３．９４（６Ｈ、ｍ）、２．１９（１Ｈ、ｍ）、１．７８（４Ｈ、ｍ）、１．７３（２Ｈ、ｍ）、１．４５（６Ｈ、ｍ）、１．３５−１．２３（８４Ｈ、ｂｒ．）、０．９５（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、０．８８（１２Ｈ、ｍ）、；¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ１７２．０、１５６．２、１５３．２、１４３．９、１４３．８、１４１．３、１３８．４、１３０．２、１２８、３、１２７．７、１２７．１、１２５．１、１２０．０、１０７．１、７３．４、６９．２、６７．４、６７．１、５９．０、４７．２、３２．０、３１．４、３０．３、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．１、２２．７、１４．１；ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）ＭＦ、Ｃ₈₁Ｈ₁₃₅ＮＯ₇〔Ｍ＋Ｎａ〕⁺に対する計算値１２５７、実験値１２５７
【００２５】
〔ＳＣ〕−Ｖａｌ−ＮＨ₂
¹H−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）δ: ６．５４（２Ｈ、ｓ）、５．０７（１Ｈ、ｄ、J＝１２．１Ｈｚ）、５０３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、３．９５（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．９４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．３３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ）、２．０７−２．０１（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７７（４Ｈ、ｍ）、１．７６−１．７１（２Ｈ、ｍ）、１．４９−１．４３（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２３（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、０．８９−０．８６（１２Ｈ、ｍ）、；¹³Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）δ、１７５．４、１５３．２、１３８．３、１３０．７、１０７．１、７３．４、６９．２、６６．８、５９．９、３２．２、３２．０、３０．３、２９．８、２９．７、２９．６、２９．４、２６．１、２２．７、１９．３、１７．１、１４．１；ＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ₆₆Ｈ₁₂₅ＮＯ₅〔Ｍ＋Ｎａ〕⁺に対する計算値１０３４、実験値１０３４
【００２６】
〔SC〕−Val−Gly−Fmoc
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）δ：７．７７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．５９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．４０（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、
７．３１（２Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝０．７、７．３Ｈｚ）、６．５２（２Ｈ、ｓ）、６．３８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．４４−５．３７（１Ｈ、ｂｒ）、５．１０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、４．６２（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．４、４．８Ｈｚ）、４．４２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、４．２４（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、３．９６−３．９２（８Ｈ、ｍ）、２．２１−２．１６（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７６（４Ｈ、ｍ）、１．７５−１．７０（２Ｈ、ｍ）、１．４８−１．４３（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２１（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９１（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、０．８８（９Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、０．８６（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、；¹³Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）δ：１７１．５、１６８．７、１５６．５、１５３．１、１４３．６、１４１．２、１３８．３、１３０．０、１２７．７、１２７．０、１２５．０、１２０．０、１０７．０、７３．４、６９．２、６７．５、６７．４、５７．１、４７．１、３２．０、３１．４、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．１、２２．８、１９．０、１７．７、１４．２、；ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ₈₃Ｈ₁₃₈Ｎ₂Ｏ₈〔Ｍ＋Ｎａ〕⁺に対する計算値１３１４、実験値１３１４
【００２７】
〔SC〕−Val−Gly−NH₂
¹Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）δ：７．７４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．５３（２Ｈ、ｓ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、４．６１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．２、５．１Ｈｚ）、３．９５（４Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．９４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．３９（２Ｈ、ｓ）、２．２４−２．１８（１Ｈ、ｍ）、１．８１−１．７６（４Ｈ、ｍ）、１．７５−１．７１（２Ｈ、ｍ）、１．４９−１．４４（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２０（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９３（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、０．９０−０．８６（１２Ｈ、ｍ）、；¹³Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）δ：１７２．６、１７１．８、１５３．１、１３０．３、１２５．５、１０６．９、７３．４、６９．２、６７．２、５６．６、４４．８、３２．０、３１．３、３０．４、３０．３、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．１、１７．８、１４．２；ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ₆₈Ｈ₁₂₈Ｎ₂Ｏ₆〔Ｍ＋Ｎａ〕⁺に対する計算値１０９１、実験値１０９１
【００２８】
〔SC〕−Val−Gly−Phe−Fmoc
¹Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）δ：７．７５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、７．５３−７．４９（２Ｈ、ｍ）、７．３９（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．３、２．２Ｈｚ）、７．３０−７．２７（４Ｈ、ｍ）、７．２５−７．２１（１Ｈ、ｍ）、７．２０−７．１５（２Ｈ、ｂｒ）、６．７６−６．６９（１Ｈ、ｂｒ）、６．６０−６．５５（１Ｈ、ｂｒ）、６．５０（２Ｈ、ｓ）、５．４０−５．３４（１Ｈ、ｂｒ）、５．０７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、４．９９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、４．５６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．８、４．８Ｈｚ）、４．４６−４．３０（２Ｈ、ｍ）、４．１７（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、４．１０−４．０３（１Ｈ、ｍ）、３．９２（６Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．８３−３．７６（２Ｈ、ｍ）、３．１８−３．１１（１Ｈ、ｍ）、３．１０−３．０２（１Ｈ、ｍ）、２．２０−２．１３（１Ｈ、ｍ）、１．７９−１．６９（６Ｈ、ｍ）、１．４８−１．４１（６Ｈ、ｍ）、１．３５−１．２３（８４Ｈ、ｂｒ．ｍ）、０．９１−０．８５（１５Ｈ、ｍ）；¹³Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）δ：１７１．５、１７１．３、１６８．３、１５６．０、１５３，１、１４３．６、１４１．２、１３８．２、１３６．２、１３０．１、１２９．１、１２８．８、１２７．７、１２７．１、１２７．０、１２５．０、１２４．９、１２０．０、１０７．０、７３．４、６９．２、６７．５、６７．１、５７．３、４７．２、３２．０、３１．３、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．０、１７．８、１４．２；ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ₉₂Ｈ₁₄₇Ｎ₃Ｏ₉〔Ｍ＋Ｎａ〕⁺に対する計算値１４６１、実験値１４６１
【００２９】
〔SC〕−Val−Gly−Phe−NH₂
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）δ：７．９９−７．９３（１Ｈ、ｍ）、７．３５−７．３０（２Ｈ、ｍ）、７．２７−７．２１（３Ｈ、ｍ）、６．６６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ）、６．５２（２Ｈ、ｓ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１）、５．０２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ）、４．５８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．８、４．８Ｈｚ）、４．０５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、minor）、４．０１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、major）、３．９８−３．９１（７Ｈ、ｍ）、３．６６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、３．３２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．６、３．９Ｈｚ）、２．６７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．６、１０．０Ｈｚ）、２．２４−２．１５（１Ｈ、ｍ）、１．８２−１．６９（６Ｈ、ｍ）、１．５０−１．３９（６Ｈ、ｍ）、１．３７−１．２１（８４Ｈ、ｂｒ）、０．９２（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、０．９０−０．８５（１２Ｈ、ｍ）；¹³Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）δ：１７５．２、１７１．５、１６８．９、１５３．１、１５１．４、１３７．７、１２９．２、１２８．８、１２６．９、１２５．５、１０７．０、７３．５、６９．２、６７．５、５７．２、５６．５、４３．４、４０．９、３２．０、３１．３、３０．４、２９．８、２９．７、２９．５、２９．４、２６．２、２２．８、１９．１、１７．７、１４．２；ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ（ｐｏｓ）Ｃ₇₇Ｈ₁₃₇Ｎ₃Ｏ₇〔Ｍ＋Ｎａ〕⁺に対する計算値１２３９、実験値１２３９
【００３０】
実施例２
〔SC〕−バリン−フェニルアラニン−Fmoc（〔SC〕―Val―Phe―Fmoc）の液相合成
Fmoc−Phe ６３ｍｇ、HOBt ６３ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをＤＭＦ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したFmoc−Phe／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、実施例１の工程１）で得た〔SC〕−Ｖａｌ−ＮＨ₂／シクロヘキサン溶液（２ｍＬ）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び２層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔SC〕−Val−Phe−Fmoc）を分離する。
以上の操作を繰り返すことにより、可溶性担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【００３１】
実施例３
〔SC〕−バリン−プロリン−Fmoc（〔SC〕―Val―Pro―Fmoc）
の液相合成
Fmoc−Pro５３ｍｇ、HOBt ５７ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをDMF２ｍＬに溶解し、150分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したFmoc−Pro−OH／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液2 mlを５℃に冷却後、実施例１の１）で得た〔SC〕−Ｖａｌ−ＮＨ₂／シクロヘキサン溶液（２ml）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔SC〕−Val−Pro−Fmoc）を分離する。
以上の操作を繰り返すことにより、可溶性担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【００３２】
実施例4
可溶性担体−バリン−アラニン−Fmoc（〔SC〕−Ｖａｌ−Ａｌａ−Fmoc）
の液相合成
Fmoc−Ala ５０ｍｇ、HOBt５３ｍｇ、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCD）２５ｍｇをＤＭＦ２ｍＬに溶解し、１５０分間室温で攪拌する。この溶液を活性化したＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ／DMF溶液として用いる。すなわち、この溶液２ｍＬを５℃に冷却後、実施例１の工程１）で得た〔SC〕−Ｖａｌ−ＮＨ₂／シクロヘキサン溶液（2 ml）を添加する。反応液は５℃から５０℃まで一時間かけて穏やかに上昇させ、さらに５０℃で３０分放置する。最後に、反応液を室温まで冷却すると、再び2層に分離するので、上層（シクロヘキサン層）から目的の生成物〔SC〕−Val−Ala−Fmoc）を分離する。
以上の操作を繰り返すことにより、可溶性担体に逐次アミノ酸を結合させ、目的とするペプチドが合成される。
【００３３】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の方法により、合成すべきペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸残基を導入した化合物として、それ自身およびペプチドを結合した化合物を反応溶媒システムを構成する一方の溶媒に可溶にする担体と組み合わせることにより、固相反応ペプチド合成に比べて、制御が容易であり、かつ、反応生成物の回収が容易である液相ペプチド合成法が提供されるという、優れた効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液相ペプチド合成法の一態様の概略[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to oligomers or polymers such as peptides, proteins, DNA, RNA, polysaccharides, in particular peptides, by combining one or more types of unit molecules constituting these, particularly amino acids in a controlled order. Alternatively, the present invention relates to a method for synthesizing polymers, particularly a liquid phase peptide synthesis method. In particular, the present invention relates to a liquid phase peptide synthesis method using a solvent system in which synthesis of synthesized oligomers or polymers, particularly peptides, is easily controlled and reaction products can be easily recovered.
[0002]
[Prior art]
In chemical reactions, if the target product can be easily separated from reagents, catalysts, reaction aids, by-products, etc., not only the separation operation is greatly reduced, but also the chemicals used in the process. This can reduce the amount of waste that is harmful to the environment as much as possible. by the way,
So far, oligomers and polymers such as peptides and DNA have been synthesized by combining and extending a plurality of unit compounds while sequentially changing them according to the design. In the synthesis, functional groups that form oligomers and polymers to be synthesized on a solid surface, for example, in the case of a peptide, an amino acid residue at the carboxy terminus of a peptide introduced into the surface of an insoluble resin was dispersed in a solvent. A solid phase synthesis method for synthesizing peptides in a state has been used.
However, in this reaction system, since a chemical reaction must be performed on the solid surface, the reagent is unlikely to approach the solid surface and generally has low reactivity and reaction rate. In addition, there is a problem that it is not possible to easily confirm that the target reaction has progressed. In addition, it is difficult to increase the reaction scale in solid-phase synthesis, and many solid-phase carriers are expensive, and there are problems in terms of economy.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to establish a solution peptide synthesis method of the above prior art that realizes separation of the obtained reaction product very easily while making the solid phase surface reaction a liquid phase reaction. In earnest study to solve the above problems, a solvent system that has been developed by the present inventors so far and that can reversibly control the state between the compatible state and the phase separated state by controlling the temperature. The idea was to establish a method for synthesizing peptides. For this purpose, the conventional solid phase reaction peptide synthesis method has a binding part of an amino acid unit that starts peptide formation, a function of supporting a peptide chain in which amino acid units are sequentially bonded and extended, and further, the synthesis of the peptide is started. It is necessary to find a compound residue having a function of dissolving a compound having a bonding part of the previous amino acid unit and a compound having a peptide chain being synthesized in one solvent or a mixed solvent system. In the present specification, it is referred to as a carrier because of the technical characteristics required for the compound residue.
As a carrier used in combination with a solvent system comprising a non-polar organic solvent as one solvent or mixed solvent A, and a solvent system comprising a polar organic solvent as the other solvent or mixed solvent B combined with A, the general formula A By using this compound, a liquid phase peptide synthesis system learned from the solid phase reaction peptide synthesis method was established, and the above problems could be solved.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to a method for synthesizing a peptide using a solvent system capable of reversibly controlling a compatible state and a phase-separated state by controlling the temperature. A carrier derived from a compound that increases the solubility in one solvent or mixed solvent A constituting the solvent system capable of controlling the state as a residue for introducing a group, and using the solvent or mixed solvent A and the carrier The peptide starting compound in which the carboxy terminal amino acid residue of the peptide to be synthesized is bound to the carrier and the compound in which the peptide chain is extended by sequentially introducing the amino acid into the peptide starting compound are transferred to the solvent or mixed solvent A. As the other solvent or mixed solvent B to be combined with the solvent or mixed solvent A, the compatibility is improved. Below the temperature at which the state is formed, various amino acids used for elongation of the peptide chain are preferentially dissolved, and above the temperature at which the compatible state is formed, a solvent in a compatible state with A is formed to form the peptide Using the compound that dissolves the starting compound, the above-mentioned B in which the protected amino acid having a protective group bonded to the various α-position amino groups is dissolved, and the amino acid that synthesizes the sequentially designed peptides in the phase-separated state, It is a liquid phase peptide synthesis method characterized in that the amino acids are sequentially bound by substitution and heating to a temperature exhibiting a compatible state after substitution. Preferably, in the liquid phase peptide synthesis method, one solvent or mixed solvent A is composed of an organic solvent, and the other solvent or mixed solvent B combined with the solvent or mixed solvent A is also composed of an organic solvent. More preferably, the organic solvent constituting the one solvent or mixed solvent A is a cycloalkane compound, and the other solvent or mixed solvent B combined with the organic solvent constituting the solvent or mixed solvent A is combined. Is a liquid phase peptide synthesis method, characterized in that it is composed of at least one selected from the group consisting of nitroalkanes, nitriles, alcohols, alkyl halides, amide compounds and sulfsulfoxides, More preferably, the alkyl group of the nitroalkane has 1, 2 or 3 carbon atoms, The alkyl group has a carbon number of 1, 2 or 3, the amide compound has a total number of carbon atoms of N-dialkyl or N-monoalkylamide of alkyl group and acyl group or formyl group of 6 or less, and alcohol has carbon In the liquid phase peptide synthesis method, the number of the alkyl group of the sulfoxide is 1, 2 or 3, and the alkyl group of the halogenated alkyl has 6 or less carbon atoms. And more preferably, the carrier for forming the peptide-initiating compound has a functional group that binds to the parent cycloalkane-based solvent moiety and an amino acid, and the aromatic carbonization represented by the above general formula A Each of the liquid phase peptide synthesis methods described above, comprising a residue from a basic skeleton compound of a hydrogen ring or a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms, Properly is the liquid phase peptide synthesis method, wherein the one represented by the compound group B.
[0005]
In the conventional solid phase reaction peptide synthesis method, since the amino acid bonding group exists in the solid phase, the reactivity with the amino acid is poor, and the reaction on the solid surface must be completed by supplying a large excess amount of amino acid to the reaction system. There was a problem of not becoming. However, in the liquid phase peptide synthesis method of the present invention, since the peptide synthesis reaction proceeds in a homogeneous solution system in a compatible state, the reaction efficiency is extremely high, and it is added from the outside to the amino acid binding group bound to the carrier. The amount of amino acid molecules to be reacted is not required to be excessive.
[0006]
[Embodiments of the present invention]
The present invention will be described in more detail.
A. The solvent system of the present invention includes at least two kinds of single organic solvents or a single organic solvent capable of reversibly taking a homogeneous solvent mixture solvent state and a separated solvent system state separated into a plurality of phases by a slight temperature change. It consists of a mixed organic solvent, and one organic solvent or mixed organic solvent dissolves the peptide starting compound in the state of the separation solvent system and the compound in which the amino acid is sequentially bound thereto and bound to the extended peptide chain. The other organic solvent or mixed organic solvent dissolves the amino acid to be bound in the state of the separation solvent system, but binds the peptide starting compound and the peptide chain that has been elongated by sequentially binding the amino acid to the peptide starting compound. It is fundamental to have the property of not dissolving the prepared compound.
[0007]
1, one single organic solvent or mixed organic solvent is selected on the basis of the basic characteristics, and is basically a low polarity organic solvent. Examples of the compounds constituting the solvent include alkanes, cycloalkanes. , Alkenes, alkynes, aromatic compounds and the like, and preferable examples include cycloalkane compounds, and particularly preferable examples include cyclohexane. It is speculated that the solvent system of the present invention has been realized in connection with the conversion of the chair-boat conformer of cyclohexane under relatively mild temperature conditions in relation to other solvents. can do. Cyclohexane has a relatively high melting point of 6.5 ° C., and has an advantage that the product after the reaction can be solidified and separated. From this aspect, it can be said that it is a preferable solvent.
[0008]
2. The single organic solvent or mixed organic solvent combined with 1 is selected based on the basic characteristics in the same manner as 1, but is basically a highly polar organic solvent. Preferably, it is selected from the group consisting of nitroalkane, nitrile, alcohol, alkyl halide, amide compound and sulfoxide.
[0009]
3. In combination with the solvent system, the liquid phase peptide synthesis method of the present invention establishes the peptide-initiating compound, enhances the solubility in one single organic solvent or mixed organic solvent in the state of the separation solvent system, It is important to select one that does not dissolve in one single organic solvent or mixed organic solvent and the other single organic solvent or mixed organic solvent, and is represented by the following general formula A as such It is selected from a residue and a residue from a basic skeleton compound of a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms.
[0010]
[Formula 4]

[0011]
In general formula A, L₁Is bonded to a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group that binds to an amino acid, an atomic group that binds to the hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group, An atomic group forming a condensed aromatic ring, and the dotted line is a bond with H or the L₁And X is O, S, N, an ester group, a sulfide group, or an imino group, and R increases solubility in a cycloalkane-based solvent. A hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms, which may contain O, S, or N as a bonding atom. n is an integer of 1-5.
[0012]
Specific examples of the general formula A include compounds of the following general formula group B.
[0013]
[Chemical formula 5]

[0014]
In each general formula, X, R and n are the same as in the general formula A. Q is a single bond or a hydrocarbon group, and R₂Is a hydroxyl group, thiol group, amino group, or carbonyl group that binds to an amino acid, and R_ThreeAnd R_FourIs a group of general formula C below.
[0015]
[Chemical 6]

[0016]
R_FiveIs a hydroxyl group, thiol group, amino group, or carbonyl group that binds to an amino acid.
[0017]
4. The amino acid used in the liquid phase peptide synthesis method of the present invention is a protected amino acid used in the conventional solid phase reaction peptide synthesis method, such as Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) -amino acid, Boc (t-butoxy). Carbonyl) -amino acid, Cbz (benzyloxycarbonyl) -amino acid and the like can be used.
[0018]
Here, more specific examples will be shown as examples, but this is intended to make the present invention easier to understand, and does not limit the present invention.
[0019]
Example 1
Liquid phase synthesis of soluble carrier [SC] -valine (Val) -glycine (Gly) -phenylalanine (Phe) -Fmoc [(SC) -Val-Gly-Phe-Fmoc)].
As a soluble carrier [SC], in general formula group B, R is C₁₈H₃₇-, X is O, n is 3, and Q is CH₂And R₂Is OH,
(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methane-1-ol, [(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methan-1-ol] is used.
[0020]
Step 1) Fmoc-Val (170 mg) is dissolved in 3 mL of dichloromethane, and 125 mg of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) is further added. The solution was stirred at room temperature for 15 minutes and then filtered. The filtrate is concentrated to dryness on a rotary evaporator, and the resulting residue is dissolved in 3 mL of dimethylformamide (DMF). Subsequently, 3 mL of a cyclohexane solution (soluble carrier 50 mg / 3 mL) in which the soluble carrier [SC] is dissolved is added to the DMF solution. Then, 6.5 mg of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) is added, and the reaction solution is heated to 50 ° C. and reacted for 30 minutes. At this time, the solution system separated into the cyclohexane layer and the DMF layer becomes a homogeneous solution system. After completion of the reaction, the reaction solution is returned to room temperature, and the reaction solution is again separated into two phases. The lower DMF phase is separated and removed, 3 mL of 10% diethylamine / DMF solution is added and stirred at 50 ° C. for 20 minutes. Cool the reaction and separate the cyclohexane layer. This cyclohexane layer contains soluble carrier bound valine-NH₂([SC] -Val-NH₂) Is recovered. (Yield 95%)
[0021]
Step 2) 57 mg of Fmoc-Gly, 55 mg of HOBt, and 25 mg of diisopropylcarbodiimide (DIPCD) are dissolved in 2 mL of DMF and stirred at room temperature for 150 minutes. This solution is used as an activated Fmoc-glycine-OH / DMF solution. That is, 2 mL of this solution was cooled to 5 ° C., and then [SC] -Val-NH obtained in step 1).₂/ Add cyclohexane solution (2 mL). The reaction solution is gently raised from 5 ° C. to 50 ° C. over 1 hour, and further left at 50 ° C. for 30 minutes. Finally, when the reaction solution is cooled to room temperature, it separates into two layers again, so that the desired product [SC] -Val-Gly-Fmoc) is separated from the upper layer (cyclohexane layer). The Fmoc group was eliminated by adding diethylamine to the same solution [SC] -Val-Gly-NH.₂ Get.
FIG. 1 shows an outline of this synthesis reaction.
[0022]
Step 3) Next, 57 mg of Fmoc-Phe, 55 mg of HOBt, and 25 mg of diisopropylcarbodiimide (DIPCD) are dissolved in 2 mL of DMF and stirred at room temperature for 150 minutes. This solution is used as an activated Fmoc-phenylalani (Phe) -OH / DMF solution. That is, 2 ml of this solution was cooled to 5 ° C. and then obtained in step 2) [SC] -Val-Gly-NH.₂/ Add cyclohexane solution (2 mL). The reaction solution is gently raised from 5 ° C. to 50 ° C. over 1 hour, and further left at 50 ° C. for 30 minutes. Finally, when the reaction solution is cooled to room temperature, it separates into two layers again, so that the desired product [SC] -Val-Gly-Phe-Fmoc) is separated from the upper layer (cyclohexane layer).
By repeating the above operation, amino acids are sequentially bound to the soluble carrier, and the desired oligopeptide is synthesized.
[0023]
Structure confirmation
[SC] cyclohexane-soluble carrier; (3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methane-1-ol [(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methan-1-ol].
¹H-NMR (400 MHz) δ; 5.54 (2H, s), 4.58 (2H, d, J = 5.1 Hz), 3.96 (4H, t, J = 6.6 Hz), 3.96 (3H, s), 1.82-1.70 (6H, m), 1.50-1.41 (6H, m), 1.38-1.20 (84H, br), 0.88 (9H) , 6, 8 Hz),¹³C-NMR (100 Hz); (100 MHz δ: 153.2, 137.4, 136.0, 105.2, 73.4, 69.1, 65.7, 32.0, 30.4, 29.8 29.7, 29.5, 26.2, 22.8, 14.2, MALDI TOF-MS (pos), C₆₁H₁₁₆O_FourCalculated value for [M + Na]⁺935, experimental value 935.
[0024]
[SC] -Val-Fmoc
;¹H-NMR (CDCl_Three) Δ 7.76 (2H, d, J = 7.7 Hz), 7.60 (2H, d, J = 7.7 Hz), 7.40 (2H, dt, J = 2.6, 7.3 Hz), 7.31 (2H, t, J = 7.3 Hz), 6.53 (2H, s), 5.31 (1H, d, J = 9.2 Hz), 5.11 (1H, d, J = 12) .1 Hz), 5.05 (1 H, d, J = 12.1 Hz), 4.38 (2 H, m), 4.23 (1 H, t, J = 7.3 Hz), 3.94 (6 H, m ), 2.19 (1H, m), 1.78 (4H, m), 1.73 (2H, m), 1.45 (6H, m), 1.35-1.23 (84H, br. ), 0.95 (3H, d, J = 7.0 Hz), 0.88 (12H, m);¹³C-NMR (CDCl_Three) 172.0, 156.2, 153.2, 143.9, 143.8, 141.3, 138.4, 130.2, 128, 3,127.7, 127.1, 125.1, 120 0.0, 107.1, 73.4, 69.2, 67.4, 67.1, 59.0, 47.2, 32.0, 31.4, 30.3, 29.8, 29.7 29.5, 29.4, 26.1, 22.7, 14.1; TOF-MS (pos) MF, C₈₁H₁₃₅NO₇[M + Na]⁺Calculated value 1257, experimental value 1257
[0025]
[SC] -Val-NH₂
¹H-NMR (400 MHz) δ: 6.54 (2H, s), 5.07 (1H, d, J = 12.1 Hz), 503 (1H, d, J = 12.1 Hz), 3.95 (4H, t, J = 6.6 Hz), 3.94 (2H, t, J = 6.6 Hz), 3.33 (2H, d, J = 5.1 Hz), 2.07-2 .01 (1H, m), 1.81-1.77 (4H, m), 1.76-1.71 (2H, m), 1.49-1.43 (6H, m), 1.37 -1.23 (84H, br), 0.96 (3H, d, J = 7.0 Hz), 0.89-0.86 (12H, m);¹³C-NMR (150 MHz) δ, 175.4, 153.2, 138.3, 130.7, 107.1, 73.4, 69.2, 66.8, 59.9, 32.2, 32 0.0, 30.3, 29.8, 29.7, 29.6, 29.4, 26.1, 22.7, 19.3, 17.1, 14.1; TOF-MS (pos) C₆₆H₁₂₅NO_Five[M + Na]⁺Calculated value 1034, experimental value 1034
[0026]
[SC] -Val-Gly-Fmoc
¹H-NMR (400 MHz) δ: 7.77 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.59 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.40 (2H, t, J = 7.3 Hz),
7.31 (2H, dt, J = 0.7, 7.3 Hz), 6.52 (2H, s), 6.38 (1H, d, J = 8.4 Hz), 5.44-5. 37 (1H, br), 5.10 (1H, d, J = 12.1 Hz), 5.02 (1H, d, J = 12.1 Hz), 4.62 (2H, dd, J = 8) .4, 4.8 Hz), 4.42 (2H, d, J = 7.0 Hz), 4.24 (1H, t, J = 7.0 Hz), 3.96-3.92 (8H M), 2.21-2.16 (1H, m), 1.81-1.76 (4H, m), 1.75-1.70 (2H, m), 1.48-1.43. (6H, m), 1.37-1.21 (84H, br), 0.91 (3H, d, J = 7.0 Hz), 0.88 (9H, t, J = 7.0 Hz) , 0.86 (3H, d, J = 7.0 Hz);¹³C-NMR (150 MHz) δ: 171.5, 168.7, 156.5, 153.1, 143.6, 141.2, 138.3, 130.0, 127.7, 127.0, 125 0.0, 120.0, 107.0, 73.4, 69.2, 67.5, 67.4, 57.1, 47.1, 32.0, 31.4, 30.4, 29.8 29.7, 29.5, 29.4, 26.1, 22.8, 19.0, 17.7, 14.2, MALDI TOF-MS (pos) C₈₃H₁₃₈N₂O₈[M + Na]⁺Calculated value 1314, experimental value 1314 for
[0027]
[SC] -Val-Gly-NH₂
¹H-NMR (600 MHz) δ: 7.74 (1H, d, J = 9.2 Hz), 6.53 (2H, s), 5.11 (1H, d, J = 12.1 Hz), 5.02 (1H, d, J = 12.1 Hz), 4.61 (1H, dd, J = 9.2, 5.1 Hz), 3.95 (4H, t, J = 6.6 Hz) ), 3.94 (2H, t, J = 6.6 Hz), 3.39 (2H, s), 2.24-2.18 (1H, m), 1.81-1.76 (4H, m) 1.75-1.71 (2H, m), 1.49-1.44 (6H, m), 1.37-1.20 (84H, br), 0.93 (3H, d, J = 7.0 Hz), 0.90-0.86 (12H, m);¹³C-NMR (150 MHz) δ: 172.6, 171.8, 153.1, 130.3, 125.5, 106.9, 73.4, 69.2, 67.2, 56.6, 44 .8, 32.0, 31.3, 30.4, 30.3, 29.8, 29.7, 29.5, 29.4, 26.2, 22.8, 19.1, 17.8 14.2; MALDITF-MS (pos) C₆₈H₁₂₈N₂O₆[M + Na]⁺Calculated value 1091 and experimental value 1091
[0028]
[SC] -Val-Gly-Phe-Fmoc
¹H-NMR (600 MHz) δ: 7.75 (2H, d, J = 7.7 Hz), 7.53-7.49 (2H, m), 7.39 (2H, dd, J = 7. 3, 2.2 Hz), 7.30-7.27 (4H, m), 7.25-7.21 (1H, m), 7.20-7.15 (2H, br), 6.76- 6.69 (1H, br), 6.60-6.55 (1H, br), 6.50 (2H, s), 5.40-5.34 (1H, br), 5.07 (1H, d, J = 12.1 Hz), 4.99 (1H, d, J = 12.1 Hz), 4.56 (1H, dd, J = 8.8, 4.8 Hz), 4.46- 4.30 (2H, m), 4.17 (1H, t, J = 7.0 Hz), 4.10-4.03 (1H, m), 3.92 (6H, t, J = 6. 6 Hz), 3.83-3.76 (2H m), 3.18-3.11 (1H, m), 3.10-3.02 (1H, m), 2.20-2.13 (1H, m), 1.79-1.69 ( 6H, m), 1.48-1.41 (6H, m), 1.35-1.23 (84H, br.m), 0.91-0.85 (15H, m);¹³C-NMR (150 MHz) δ: 171.5, 171.3, 168.3, 156.0, 153, 1, 143.6, 141.2, 138.2, 136.2, 130.1, 129 .1, 128.8, 127.7, 127.1, 127.0, 125.0, 124.9, 120.0, 107.0, 73.4, 69.2, 67.5, 67.1 57.3, 47.2, 32.0, 31.3, 30.4, 29.8, 29.7, 29.5, 29.4, 26.2, 22.8, 19.0, 17 .8, 14.2; MALDI TOF-MS (pos) C₉₂H₁₄₇N_ThreeO₉[M + Na]⁺Calculated value 1461, experimental value 1461
[0029]
[SC] -Val-Gly-Phe-NH₂
¹H-NMR (400 MHz) δ: 7.9-7.93 (1H, m), 7.35-7.30 (2H, m), 7.27-7.21 (3H, m), 6. 66 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.52 (2H, s), 5.11 (1H, d, J = 12.1), 5.02 (1H, d, J = 12. 1 Hz), 4.58 (1H, dd, J = 8.8, 4.8 Hz), 4.05 (1H, d, J = 5.9 Hz, minor), 4.01 (1H, d, J = 5.9 Hz, major), 3.98-3.91 (7 H, m), 3.66 (1 H, d, J = 10.0 Hz), 3.32 (1 H, dd, J = 13. 6, 3.9 Hz), 2.67 (1H, dd, J = 13.6, 10.0 Hz), 2.24-2.15 (1H, m), 1.82-1.69 (6H) M), 1.50-1.39 (6H, ), 1.37-1.21 (84H, br), 0.92 (3H, d, J = 6.8 Hz), 0.90-0.85 (12H, m);¹³C-NMR (150 MHz) δ: 175.2, 171.5, 168.9, 153.1, 151.4, 137.7, 129.2, 128.8, 126.9, 125.5, 107 0.0, 73.5, 69.2, 67.5, 57.2, 56.5, 43.4, 40.9, 32.0, 31.3, 30.4, 29.8, 29.7 29.5, 29.4, 26.2, 22.8, 19.1, 17.7, 14.2; MALDI TOF-MS (pos) C₇₇H₁₃₇N_ThreeO₇[M + Na]⁺Calculated value 1239, experimental value 1239
[0030]
Example 2
Liquid phase synthesis of [SC] -valine-phenylalanine-Fmoc ([SC] -Val-Phe-Fmoc)
Fmoc-Phe 63 mg, HOBt 63 mg, and diisopropylcarbodiimide (DIPCD) 25 mg are dissolved in 2 mL of DMF and stirred at room temperature for 150 minutes. This solution is used as an activated Fmoc-Phe / DMF solution. That is, after 2 mL of this solution was cooled to 5 ° C., [SC] -Val-NH obtained in Step 1) of Example 1₂/ Add cyclohexane solution (2 mL). The reaction solution is gently raised from 5 ° C. to 50 ° C. over 1 hour, and further left at 50 ° C. for 30 minutes. Finally, when the reaction solution is cooled to room temperature, it separates into two layers again, so that the desired product [SC] -Val-Phe-Fmoc) is separated from the upper layer (cyclohexane layer).
By repeating the above operation, amino acids are sequentially bound to the soluble carrier, and the target peptide is synthesized.
[0031]
Example 3
[SC] -Valine-Proline-Fmoc ([SC] -Val-Pro-Fmoc)
Liquid phase synthesis
Fmoc-Pro 53 mg, HOBt 57 mg and diisopropylcarbodiimide (DIPCD) 25 mg are dissolved in 2 mL of DMF and stirred at room temperature for 150 minutes. This solution is used as an activated Fmoc-Pro-OH / DMF solution. That is, 2 ml of this solution was cooled to 5 ° C., and then [SC] -Val-NH obtained in 1) of Example 1₂/ Add cyclohexane solution (2 ml). The reaction solution is gently raised from 5 ° C. to 50 ° C. over 1 hour, and further left at 50 ° C. for 30 minutes. Finally, when the reaction solution is cooled to room temperature, it separates into two layers again, so that the desired product [SC] -Val-Pro-Fmoc) is separated from the upper layer (cyclohexane layer).
By repeating the above operation, amino acids are sequentially bound to the soluble carrier, and the target peptide is synthesized.
[0032]
Example 4
Soluble carrier-valine-alanine-Fmoc ([SC] -Val-Ala-Fmoc)
Liquid phase synthesis
Fmoc-Ala 50 mg, HOBt 53 mg, and diisopropylcarbodiimide (DIPCD) 25 mg are dissolved in 2 mL of DMF and stirred at room temperature for 150 minutes. This solution is used as an activated Fmoc-Ala-OH / DMF solution. That is, after 2 mL of this solution was cooled to 5 ° C., [SC] -Val-NH obtained in Step 1) of Example 1₂/ Add cyclohexane solution (2 ml). The reaction solution is gently raised from 5 ° C. to 50 ° C. over 1 hour, and further left at 50 ° C. for 30 minutes. Finally, when the reaction solution is cooled to room temperature, it separates into two layers again, so that the desired product [SC] -Val-Ala-Fmoc) is separated from the upper layer (cyclohexane layer).
By repeating the above operation, amino acids are sequentially bound to the soluble carrier, and the target peptide is synthesized.
[0033]
【The invention's effect】
As described above, according to the method of the present invention, as the compound into which the amino acid residue at the carboxy terminus of the peptide to be synthesized is introduced, the compound bound to itself and the peptide is soluble in one solvent constituting the reaction solvent system. In combination with the carrier, a liquid phase peptide synthesis method that is easier to control and easier to recover the reaction product than the solid phase reaction peptide synthesis is provided. It is.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an outline of one embodiment of the liquid phase peptide synthesis method of the present invention.

Claims

A method of synthesizing a peptide using a solvent system that can reversibly control the state between a compatible state and a phase-separated state by controlling the temperature, wherein the amino acid residue at the carboxy terminus of the peptide to be synthesized is As a residue to be introduced, a combination of a solvent derived from a compound that increases the solubility in one solvent or mixed solvent A constituting the solvent system capable of controlling the state, and the solvent or mixed solvent A and the carrier are used. A peptide starting compound in which the amino acid residue at the carboxy terminus of the peptide to be synthesized is bound to a carrier, and a compound in which an amino acid is sequentially introduced into the peptide starting compound to extend the peptide chain, the solvent or mixed solvent A As the other solvent or mixed solvent B to be combined with the solvent or mixed solvent A, Below the temperature at which the soluble state is formed, various amino acids used for elongation of the peptide chain are preferentially dissolved, and above the temperature at which the compatible state is formed, a solvent in a compatible state with the A is formed. Using what dissolves the peptide starting compound, various amino acids for synthesizing peptides sequentially designed in a phase-separated state were dissolved in B in which protected amino acids having protective groups bonded to α-position amino groups were dissolved. A liquid phase peptide synthesis method, wherein the amino acids are sequentially bonded by substituting them and heating to a temperature at which a post-substitution compatible substance is exhibited.

2. The liquid phase peptide synthesis method according to claim 1, wherein one solvent or mixed solvent A is composed of an organic solvent, and the other solvent or mixed solvent B combined with the solvent or mixed solvent A is also composed of an organic solvent.

The organic solvent constituting one solvent or the mixed solvent A is a cycloalkane compound, and the organic solvent constituting the other solvent or the mixed solvent B combined with the organic solvent constituting the solvent or the mixed solvent A is a nitroalkane, 3. The liquid phase peptide synthesis method according to claim 2, wherein the liquid phase peptide synthesis method is composed of at least one selected from the group consisting of nitrile, alcohol, alkyl halide, amide compound and sulfoxide.

The alkyl group of the nitroalkane has 1, 2 or 3 carbon atoms, the alkyl group of the nitrile has 1, 2 or 3 carbon atoms, and the amide compound is an N-dialkyl or N-monoalkylamide alkyl group and acyl The total number of carbon atoms in the group or formyl group is 6 or less, the alcohol has 8 or less carbon atoms, the alkyl group of the sulfoxide has 1, 2 or 3 carbon atoms, and the alkyl group of the alkyl halide is carbon. The liquid phase peptide synthesis method according to claim 3, wherein the number is 6 or less.

The carrier for forming the peptide starting compound has an aromatic hydrocarbon ring represented by the following general formula A or a carbon number of 10 having a functional group that binds to a parent cycloalkane solvent portion and an amino acid. The method for synthesizing a liquid phase peptide according to any one of claims 1 to 4, comprising a residue from the basic skeleton compound of the above hydrocarbon group.

[In General Formula A, L ₁ represents a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group that binds to an amino acid, an atomic group that binds to the hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group, or An atomic group that is bonded to a dotted line to form a two condensed aromatic ring, a dotted line is a bond to H or an atomic group that is bonded to L ₁ to form the condensed aromatic ring, and X is O , S, N, an ester group, a sulfide group, or an imino group, and R may contain O, S, or N as a bonding atom to enhance solubility in a cycloalkane-based solvent, and has 10 or more carbon atoms. It is a hydrocarbon group. n is an integer of 1-5. ]. In addition, when the hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms enhances the solubility in a parent cycloalkane solvent, it has a branched chain and / or a substituent having a functional group that binds to the amino acid. It is.

6. The liquid phase peptide synthesis method according to claim 5, wherein the compound represented by the general formula A is selected from the following general formula group B.

In each general formula, X, R and n are the same as in the general formula A. Q is a single bond or a hydrocarbon group, R ₂ is a hydroxyl group, thiol group, amino group, or carbonyl group bonded to an amino acid, and R ₃ and R ₄ are groups of the following general formula C.

R ₅ is a hydroxyl group, thiol group, amino group, or carbonyl group that binds to an amino acid.