JP4300031B2

JP4300031B2 - Cloning vector

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Publication number: JP4300031B2
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Inventors: 直人根本; 洋一郎伊藤
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Priority date: 2001-05-09
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Publication date: 2009-07-22
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Description

技術分野
本発明は、緑色蛍光蛋白質の遺伝子等のような宿主の選択のための遺伝子を用いたクローニングベクター及びそれを利用したシステムに関する。より詳細には、本発明は、緑色蛍光蛋白質が発する蛍光又は薬剤耐性等のような宿主の選択のための指標を用いてインサートの挿入の有無を簡単に判別することができるクローニングベクター及びそれを利用したシステムに関する。
背景技術
近年、国際ヒトゲノムプロジェクト及びセレーラ社に代表される研究機関において、ゲノムサイズでの大規模シーケンスの需要が世界的に広がっている。さらに今後は疾患遺伝病同定を目的にＳＮＰ（点突然変異多型）解析が盛んになり、それに伴いシーケンスの需要が急速に高まると考えられている。ゲノム（ＤＮＡ）断片のクローン化は、このような配列決定方法においても、また一般的な遺伝子工学においても、極めて重要な基盤技術である。
一般にＤＮＡのクローン化はＤＮＡ断片をベクターに挿入、大腸菌に導入後、プレート上で大腸菌コロニーを作成させて目的断片を持つコロニーを得る。挿入ＤＮＡ配列（インサート）のベクターへの導入の確認は、現在のところ、β−ガラクトシターゼやＧＦＰ遺伝子の挿入失活により判別する方法が報告されている（ｂｌｕｅ−ｗｈｉｔｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｒｇｒｅｅｎ−ｗｈｉｔｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ３３１０３−１１９（１９８５）；Ｉｔｏｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ２４５５９−６３（２０００））。しかし、この方法による判別では、インサート配列が導入される遺伝子配列（β−ガラクトシターゼ遺伝子またはＧＦＰ遺伝子）やその転写開始部位となるプロモーター配列などに有害突然変異が生じることにより、その蛋白質の機能を示さなくなるため、大腸菌コロニーの色や蛍光性を選別基準としてインサートの有無を判別する場合に、判別の効率が低くなるという問題点があった（Ｉｔｏｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ２４５５９−６３（２０００））。また、このような従来法においては、プレート上で大腸菌コロニーを形成させてインサートの有無を判別しなければならないため、機械的システムを採用してハイスループット化する上で極めて難しい制約があった。
発明の開示
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、挿入ＤＮＡ配列（インサート）の導入の有無の判別を効率よく行うことができるクローニングベクター及びそれを用いたシステムを提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、プレート上で形質転換体のコロニーを形成させることなく、インサートの導入の有無を確認することができるクローニングベクター及びそれを用いたシステムを提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、蛍光セルソーター等の装置を使用することによりインサートを有する形質転換体のみを回収して、目的ＤＮＡ配列のクローン化をハイスループット化することができるクローニングベクター及びそれを用いたシステムを提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＤＮＡ断片（インサート）が挿入されたベクターを有する形質転換体のみがＧＦＰの蛍光を発することができるクローニングベクターを開発した。また、このクローニングベクターを使用することによりインサートの導入の有無を効率よく判別できることが分かった。またこの方法はクローニングマシンとしての蛍光セルソーター等と組み合わせることで、９６穴マイクロプレートへの直接クローニングを可能にした。その結果、上記クローニングベクターを用いたクローニング操作では、従来のクローニング操作に必要であったプレートを用いたコロニー形成の工程を省くことができ、クローニング操作に要する時間を約１６時間から約３時間へと大幅に短縮することができた。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、５’から３’方向に、１以上の制限酵素部位を有するクローニング部位、リボソーム結合配列、及び宿主の選択のための遺伝子を順番に有するクローニングベクターが提供される。
好ましくは、宿主の選択のための遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、生合成経路の遺伝子、蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子、又は基質の存在下で発色、蛍光発光もしくは化学発光できる蛋白質の遺伝子から選択される遺伝子である。
さらに好ましくは、薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子、カナマイシン（Ｋａｎ）耐性遺伝子、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性遺伝子、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子、又はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子であり、生合成経路の遺伝子は、グルタミン合成遺伝子又はプロリン合成酵素遺伝子であり、蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子は、緑色蛍光蛋白質又はその変異体、又はばさんご由来のＤｓＲｅｄ遺伝子であり、基質の存在下で発色、蛍光発光もしくは化学発光できる蛋白質の遺伝子は、β−ガラクトシターゼ遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子である。
特に好ましくは、宿主の選択のための遺伝子は、緑色蛍光蛋白質又はその変異体をコードする遺伝子である。
好ましくは、リボソーム結合配列はＳＤ配列又はコザック配列である。
好ましくは、宿主の選択のための遺伝子として、可視光下で蛍光を発する蛍光蛋白質の遺伝子を使用する。
好ましくは、宿主の選択のための遺伝子として、野生型緑色蛍光蛋白質のアミノ酸配列において６４番目のアミノ酸がＬｅｕであり、６５番目のアミノ酸がＴｈｒであり、９９番目のアミノ酸がＳｅｒであり、１５３番目のアミノ酸がＴｈｒであり、１６３番目のアミノ酸がＡｌａであり、２０８番目のアミノ酸がＬｅｕであるアミノ酸配列をコードする遺伝子を使用する。
好ましくは、本発明のクローニングベクターは、さらに複製起点を有する。
好ましくは、本発明のクローニングベクターは、さらに抗生物質耐性遺伝子を有する。
本発明の一例としては、配列番号５に記載の塩基配列を有するクローニングベクターが提供される。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のクローニングベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のクローニングベクターのクローニング部位に、末端にプロモーター配列を有するＤＮＡ断片を挿入して得られる、組み換えベクターが提供される。
好ましくは、プロモーター配列はＴ７プロモーター配列である。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の組み換えベクターを用いて形質転換した宿主について、宿主の選択のための遺伝子の発現に基づく指標を判別することを含む、該ベクターのクローニング部位へのインサートの挿入の有無を判別する方法が提供される。
好ましくは、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用して作製した組み換えベクターを用いる。
本発明のさらに別の側面によれば、（Ａ）本発明のクローニングベクターのクローニング部位に、末端にプロモーター配列を有するＤＮＡ断片を挿入して組み換えベクターを作成する工程；
（Ｂ）得られた組み換えベクターを宿主に形質転換して形質転換体を作成する工程；及び
（Ｃ）得られた形質転換体中に導入されている宿主の選択のための遺伝子の発現に基づく指標を判別することにより、組み換えベクターを有する形質転換体を選別する工程；
を含む遺伝子のクローニング方法が提供される。
上記のクローニング方法において好ましくは、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用して作製したクローニングベクターを使用する。また、上記のクローニング方法において好ましくは、工程（Ｃ）を蛍光セルソーター又はマイクロチップセルソーターにより行う。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のクローニングベクターは、５’から３’方向に、１以上の制限酵素部位を有するクローニング部位、リボソーム結合配列、及び宿主の選択のための遺伝子を順番に有することを特徴とする。
宿主の選択のための遺伝子の具体例としては以下のものが挙げられる。
（１）薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子、カナマイシン（Ｋａｎ）耐性遺伝子、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性遺伝子、クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子、又はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子など）
宿主の選択のための遺伝子として薬剤耐性遺伝子を使用する場合、インサートが挿入されたクローンのみ、その薬剤の入っている培地上でコロニーを形成できるために宿主を判別することができる。
（２）生合成経路の遺伝子（例えば、グルタミン合成遺伝子又はプロリン合成酵素遺伝子など）
宿主の選択のための遺伝子として生合成経路の遺伝子を使用する場合、形質転換に用いる大腸菌を選ぶことにより（即ち、その合成酵素の欠損株を選ぶ）、インサート有りのクローンはＭ９などの合成培地上でコロニーを形成できる。
（３）蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子（例えば、緑色蛍光蛋白質又はその変異体、又はばさんご由来のＤｓＲｅｄ遺伝子など）
宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用する場合、クローンの蛍光性の有無によりインサート挿入の有無を確認することができる。
（４）基質の存在下で発色、蛍光発光もしくは化学発光できる蛋白質の遺伝子（例えば、β−ガラクトシターゼ遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子など）
宿主の選択のための遺伝子として基質の存在下で発色、蛍光発光もしくは化学発光できる蛋白質の遺伝子を使用する場合、例えばｂｌｕｅ−ｗｈｉｔｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇで使用されているｂｅｔａ−ガラクトシターゼとＸ−ｇａｌ、ルシフェラーゼとルシフェリン（＋ＡＴＰ）などの組み合わせを使用することにより、インサート挿入の有無を確認することができる。
本発明においては、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異、体の遺伝子を使用することが好ましく、緑色蛍光蛋白質又はその変異体をコードする遺伝子を使用することが特に好ましい。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、クラゲの１種のエクオリア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ）（オワンクラゲ）に由来する蛍光タンパク質である。エクオリア・ビクトリアにおいてＧＦＰは、カルシウムにより刺激されたエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）により産生されたエネルギーを吸収し、緑色光を発する。近紫外線または青色光により励起されると、原核細胞および真核細胞中において発現したＧＦＰは、強い緑色蛍光を発光する。
ＧＦＰのアミノ酸配列は公知である（Ｐｒａｃｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．，他、（１９９２）Ｇｅｎｅ，１１１，２２９−２３３）。アミノ酸残基は通常複数のＤＮＡトリプレットによってコードされているので、野生型ＧＦＰ又は変異型ＧＦＰのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は多数存在する。本発明のクローニングベクター中のＧＦＰ遺伝子はこれらのＤＮＡ配列の何れでもよい。本発明では、可視光下で蛍光を発する、又はレーザーによって励起できる各種のタンパク質発光体（例えば、緑色蛍光蛋白質又はその変異体）を使用することが好ましい。
また、本発明では変異体ＧＦＰを用いることができ、特に、緑色蛍光の強度が野生型ＧＦＰよりも高まっている変異体ＧＦＰを用いることが好ましい。そのような変異体ＧＦＰの例としては、野生型ＧＦＰのアミノ酸配列中に１個以上（例えば、１〜数個、具体的には１から３０個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。本明細書で緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰとも略記する）という場合には、緑色蛍光性を有する変異体ＧＦＰの全てを包含するものとする。
変異体ＧＦＰ遺伝子を得る方法としては、化学合成法、遺伝子工学的手法、突然変異誘発法などの当分野で既知の任意の方法を用いることができる。入手可能なＧＦＰ遺伝子を得て、これを基にして変異体ＧＦＰのＤＮＡを得ることができる。ある遺伝子への変異導入は多くの方法により行うことができる。例えば、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。
遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の方法に準じて行うことができる。
本発明で用いるのに好適な変異体ＧＦＰの例としては、例えば、Ｉｔｏｅｔａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６４，５５６−５６０に記載されているＧＦＰの変異体が挙げられ、具体的にはＧＦＰｕｖ（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ）、ＧＦＰｕｖ２（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｓ２０８Ｌ）、ＧＦＰｕｖ３（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ）、およびＧＦＰｕｖ４（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ２０８Ｌ）などどが挙げられる（上記において、括弧内は野生型ＧＦＰに対するアミノ酸変異を示し、例えば、Ｆ９９Ｓは９９番目のアミノ酸がＦからＳに置換されていることを示す）。上記の変異体ＧＦＰの中でも、ＧＦＰｕｖ２（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｓ２０８Ｌ）、ＧＦＰｕｖ３（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ）、およびＧＦＰｕｖ４（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ２０８Ｌ）がより好ましく、ＧＦＰｕｖ４（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ２０８Ｌ）が特に好ましい。
例えば、宿主の選択のための遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を使用する場合、従来法の場合のようにインサートがＧＦＰ遺伝子に挿入することによりＧＦＰの蛍光を失活させる方法では、ベクター中にインサートが挿入された場合にのみ、ＧＦＰ由来の緑色蛍光が発するようにすることはできない。そこで、本発明者らは、ベクター中に挿入するＤＮＡ配列に注目し、インサート配列の末端にプロモーター配列を付加させることとした。このようなプロモーター配列を末端に有するインサート配列をベクターに挿入した場合、インサート配列の末端のプロモーター配列の下流に存在するＧＦＰ遺伝子が発現することになり、発現したＧＦＰの蛍光を指標とすることにより、インサートのベクターへの挿入の有無を判別することが可能となる。
本発明で用いるリボソーム結合配列は、宿主の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、宿主が大腸菌などの原核細胞の場合にはＳＤ配列を選択することができ、宿主が酵母や動物細胞などの真核細胞の場合にはコザック配列を選択することができる。
本発明のクローニングベクターは、１以上の制限酵素部位を有するクローニング部位を有する。クローニング部位を構成する制限酵素部位の種類は特に限定されず、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＫｐｎＩ等のような複数の制限酵素部位を含むマルチクローニングサイトでもよい。なお、クローニング部位は、本発明のクローニングベクターの構築の際に出発材料として用いるベクター中に予め存在するものを利用してもよいし、組み換え遺伝子技術を用いてＧＦＰベクター中に導入することもできる。
本発明のクローニングベクターは複製起点を含むことが好ましい。例えば、宿主が大腸菌である場合には、ｐＢＲ３２２由来の複製起点、宿主が酵母である場合にはＡＲＳなどを選択することができる。
本発明のクローニングベクターは抗生物質耐性遺伝子を含むことが好ましい。抗生物質耐性遺伝子をベクター中に含めることにより、形質転換操作後の形質転換体を抗生物質含有培地で培養することにより形質転換されていない（ベクターを保持しない）宿主細胞を排除することができる。
抗生物質耐性遺伝子の種類は特に限定されず、例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などが挙げられる。
なお、宿主の選択のための遺伝子として薬剤耐性遺伝子を使用する場合は、当該薬剤耐性遺伝子とは異なる抗生物質耐性遺伝子を含むことが好ましい。
本発明のクローニングベクターの一例としては以下の実施例で作成したプラスミドｐＧＦＰｃｌｎが挙げられる。ｐＧＦＰｃｌｎでは、ＧＦＰ遺伝子の上流に、ＳＤ配列、マルチクローニングサイトを配置している（ｐＧＦＰｃｌｎの構造の概略を図１に示し、ｐＧＦＰｃｌｎの塩基配列を配列番号５に記載）。
本発明のクローニングベクターは、当業者により適宜製造することができる。例えば、当業者に入手可能なＧＦＰベクターを用いてＧＦＰ遺伝子の上流にクローニング部位とリボソーム結合配列（例えば、ＳＤ配列など）を配置することにより製造することができる。
本発明はさらに、上記したクローニングベクターのクローニング部位に、末端にプロモーター配列を有するＤＮＡ断片を挿入して得られる、組み換えベクターにも関する。
インサートへ付加するプロモーター配列はその末端に外側方向へ向くように導入する。即ち、インサートの３’末端にプロモーター配列を付加する場合には、プロモーター配列の５’末端をインサートの３’末端に連結し、インサートの５’末端にプロモーター配列を付加する場合には、プロモーター配列の５’末端をインサートの５’末端に連結すればよい。
プロモーター配列とインサート配列との連結方法は特に限定されないが、例えば、プロモーター配列は以下の方法によりインサート配列に付加できる（図２）。
（１）挿入配列をＰＣＲで増幅する際に、プライマー配列にあらかじめ導入する方法；又は
（２）挿入配列が制限酵素で切断された断片の際には、アダプター配列に導入する方法：
特にＰＣＲによりプロモーター配列を付加する方法では、片方のみに導入することでインサートの挿入方向を決めることができる（図２）。
本発明で用いるプロモーターとしては、宿主細胞中で機能できるものであればいかなるものでもよい。例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター、Ｐ_ＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔ１プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
酵母で機能するプロモーターとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
動物細胞で機能するプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
他の宿主を使用する場合にも、該宿主において機能する調節配列（プロモーター等）を適宜選択することができる。
上記したようにプロモーター配列を付加された目的挿入配列は、本発明のクローニングベクター中に、（Ｉ）マルチクローニング部位内の制限酵素部位、（ＩＩ）Ｔ−拡張ベクター法、（ＩＩＩ）平滑末端法を利用して連結することができる。
本発明はさらに、上記したクローニングベクター又は組み換えベクターを有する形質転換体に関する。即ち、本発明によれば、上記したクローニングベクター又は組み換えベクターを宿主に形質転換して得られる形質転換体が提供される。
本発明で用いる宿主の種類は特に限定されないが、好ましくは、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞または動物細胞から選択される。
細菌細胞、真菌細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属等に属する微生物を挙げることができ、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の具体例として、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ、同ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、同ＤＨ１、同ＤＨ５α、同ＭＣ１０００、同ＫＹ３２７６、同Ｗ１４８５、同ＪＭ１０９、同ＨＢ１０１、同Ｎｏ４９、同Ｗ３１１０、同ＮＹ４９、同ＭＰ３４７、同ＮＭ５２２などが挙げられる。
酵母細胞としては、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、シゾサッカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、クリュイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シュワニオミセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ）等が挙げられる。
動物細胞としては、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞、ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞、ＣＶ１細胞、ナマルバ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、並びに様々な脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物の細胞が含まれる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（ＮｅｗＹｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
本発明のクローニングベクター又は組み換えベクターを宿主に導入する方法としては、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などを適宜選択してベクターを宿主に導入することができる。
上記方法により組み換えベクターが導入された形質転換体を用いて、宿主の選択のための遺伝子の発現に基づく指標を判別することにより、該ベクターのクローニング部位にインサートを有しているかどうかを判別することができる。
本明細書で言う「指標」とは、宿主の選択のための遺伝子として薬剤耐性遺伝子を使用する場合には、その薬剤の入っている培地上でコロニーを形成できるかどうかを言い、宿主の選択のための遺伝子として生合成経路の遺伝子を使用する場合には、合成培地上でコロニーを形成できるかどうかを言い、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用する場合には、クローンの蛍光性の有無を言い、宿主の選択のための遺伝子として基質の存在下で発色、蛍光発光もしくは化学発光できる蛋白質の遺伝子を使用する場合には、該基質の存在下で呈する発色、蛍光発光もしくは化学発光の有無を言う。
即ち、本発明によれば、本発明の組み換えベクターを用いて形質転換した宿主について、宿主の選択のための遺伝子の発現に基づく指標を判別することを含む、該ベクターのクローニング部位へのインサートの挿入の有無を判別する方法が提供される。本発明の好ましい態様では、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用して作製した組み換えベクターを用いて形質転換した宿主について、該宿主が発する蛍光の有無を判別することにより、該ベクターのクローニング部位へのインサートの挿入の有無を判別する。
さらに、本発明によれば、
（Ａ）本発明のクローニングベクターのクローニング部位に、末端にプロモーター配列を有するＤＮＡ断片を挿入して組み換えベクターを作成する工程；
（Ｂ）得られた組み換えベクターを宿主に形質転換して形質転換体を作成する工程；及び
（Ｃ）得られた形質転換体中に導入されている宿主の選択のための遺伝子の発現に基づく指標を判別することにより、組み換えベクターを有する形質転換体を選別する工程；
を含む遺伝子のクローニング方法が提供される。
上記クローニング方法において、好ましくは、宿主の選択のための遺伝子として蛍光蛋白質又はその変異体の遺伝子を使用して作製したクローニングベクターを使用し、工程（Ｃ）を蛍光セルソーター又はマイクロチップセルソーターにより行う。
本発明の一例としてＧＦＰベクターを用いたハイスループットシステムの構成図を図３に示す。本発明のＧＦＰベクターを用いたハイスループットシステムおいては、１日で２〜３，０００個のクローンを処理することが可能であり、従来法と比較して処理効率を著しく向上させることができる。
インサートの有無に関わらず、ＧＦＰ遺伝子の発現に関わる配列への有害突然変異を持つクローンは蛍光性を持たない。そのためインサートを持つクローンのみが蛍光発光する本発明の判別方法は、従来法とは異なり、アーティファクト（ここではインサートを持たないクローンが蛍光発光する）が現れにくい。
また蛍光セルソーターの使用により、インサートを持つ蛍光性大腸菌クローンのみを回収することができる。さらに、このような蛍光性の大腸菌一個ずつ９６穴マイクロプレートの各ウェルにソートすることで簡単にそれらをクローン化することができる（直接クローニング）。この方法は従来法のようなプレート上でのコロニー形成にかかる時間を省くことができ、かつ目的ＤＮＡ配列のクローン化をハイスループットに行うことができる。
発現ＧＦＰベクターと蛍光セルソーターを用いた遺伝子クローニングについてより具体的に記載する。
先ずシーケンスしたいＤＮＡ配列の片方にＴ７プロモーターをもつプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐＧＦＰｃｌｎベクター（以下の実施例に記載）とライゲーションする。ライゲーション産物をＤＨ５α（ＤＥ３）株へトランスフォーメーションする（エレクトロポレーション、ケミカル法のどちらでもよい）。これをＳＯＢ５ｍｌに移し、３７℃で３０分間振とうさせたのち、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように加え誘導する。
その後、３７℃で３時間インキュベートした後、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＥＰＩＣＳＡＬＴＲＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、ＧＦＰが発現している大腸菌をソートし、９６穴プレートのウエルそれぞれに一つの大腸菌を分注する。この際、アルゴンイオンレーザーを用いて励起し、ＦＩＴＣ用のフィルターを用いて蛍光を測定する。上記したＧＦＰ発現ベクターを選択するためのマイクロチップセルソーターの概念図を図４に示す。大腸菌１個が流れる５０μｍ径の流路に、蛍光検出器を設け、蛍光の強度で挿入の有無を識別する。この結果によって、２つの弁のうちの一方を開閉し、挿入された大腸菌のみを９６穴プレートに分注する。９６穴プレートに分注された大腸菌は、３７℃で１６時間インキュベーションし、ミニプレップ後、シーケンスする。
本出願の優先権主張の基礎となる出願である特願２００１−１３８２１４号の明細書に開示した内容は全て引用により本明細書に開示したものとする。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例
実施例１
方法：
（１）プラスミドベクターの構築
プラスミドｐＧＦＰｃｌｎは、ｐＧＦＰｇｃｎ４（Ｉｔｏｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ２６４５５６−５６０８（１９９９））を用いて以下の通り作製した。即ち、ｐＧＦＰｇｃｎ４のマルチクローニング部位とＧＦＰ遺伝子の間へＳＤ配列を導入し、ｌａｃプロモーター及びＳＤ配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｍＢＩ間を欠失させ、さらにＧＦＰ遺伝子のＮ末端へＴ７ｔａｇを導入することにより作製した。図１にプラスミドｐＧＦＰｃｌｎの構造を示す。プラスミドｐＧＦＰｃｌｎの塩基配列を配列表の配列番号５に示す。
（２）ＰＣＲによりプロモーター配列を付加したインサートのベクターへの挿入モデル挿入配列として、ＥＹＦＰ遺伝子、及びプライマー間に６０ｂｐのランダムヌクレオチドを持つ１００ｂｐをそれぞれＰＣＲ産物として使用した。
ＥＹＦＰ遺伝子は、ｐＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレート配列とし、ＤＮＡオリゴマー１（５’−ＴＣＡＧＣＧＧＧＴＡＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＴＮＮＮＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ−３’（配列番号１））及びＤＮＡオリゴマー２（５’−ＴＧＡＣＴＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ−３’（配列番号２））をプライマー（下線は制限酵素部位を示す。ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴの何れかの塩基を示す）として用いて、ＥｘＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ、下記方法１及び２にの場合）またはＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ、下記方法３の場合）を用いてＰＣＲを行うことにより作製した。なお、配列番号１の中の１３番目から３０番目のＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡはＴ７プロモーター配列を示す。
ランダム配列を持つ１００ｂｐはＥｌｉらの方法により得た（ＥｌｉＰ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２５７９０−７９４（１９９９））。
インサートのベクターへの挿入は以下の３通りで行った。
１．制限酵素部位を利用した場合
プラスミドｐＧＦＰｃｌｎ及び上記ＰＣＲ産物をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩで切断し、それぞれアガロース電気泳動による分離をしてＤＮＡを抽出した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。
２．平滑末端法
プラスミドｐＧＦＰｃｌｎをＳｍａＩで切断、大腸菌由来のアルカリホスファターゼ処理後、上記ＰＣＲ産物と連結した。
３．Ｔ−拡張ベクター法
Ｔ−拡張ベクターの作成は平滑末端に切断する制限酵素をＳｍａＩとした以外は、Ｉｔｏｅｔａｌ．：Ｇｅｎｅ２４５５９−６３（２０００）と同様の方法で行った。
ＰＣＲ法を用いたプロモーター配列のインサートへの付加方法を図２の上段に示す。
（３）形質転換及びインサート有無の確認
上記（２）で作製した連結産物を、ＪＭ１０９（ＤＥ３）株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、またはλＤＥ３ＬｙｓｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して作成した大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株に形質転換し、７５μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢプレートへまき、３７℃で１８時間インキュベートした。コロニーの蛍光性の有無は自然光下で判定した。自然光照射における蛍光性及び非蛍光性大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を図５に示す。
蛍光性クローンのインサート有無の確認は、マルチクローニング部位を挟むオリゴマー５（５’−ＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＴＧＧＧＡＣＡ−３’（配列番号３））及びオリゴマー６（５’−ＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＡＴＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＧＣＧＧＡＴ−３’（配列番号４））をプライマーとしたコロニーＰＣＲ法（Ｉｔｏｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ２４５５９−６３（２０００））、並びにミニプレップ法によるプラスミドを抽出し、制限酵素処理によりインサートを回収することにより行った。得られた断片は１％または１．５％アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色で確認した。インサート配列決定はＤＮＡシーケンサー（ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ３１０，ＡＢＩ）により行った。
（４）蛍光セルソーターを用いた直接クローニングの確認
上記した平滑末端法により作成したＥＹＦＰ導入プラスミド１００ｎｇとプラスミドｐＧＦＰｃｌｎ１００ｎｇを混合し、ＤＨ５ａｌｐｈａ（ＤＥ３）株へケミカル法にてトランスフォーメーションした。７５μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地を加え、３７℃にて１６時間、振蕩培養を行った。サンプルはＰＢＳで希釈後、蛍光セルソーター（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅＳＥ，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定した。Ａｒイオンレーザーは波長４８８ｎｍを使用し、蛍光フィルターはＦｉＴＣ用のものを使用した。蛍光性大腸菌のソーティング方法はベクトンディキンソん社のマニュアルに従った。９６穴プレートへのソーティング条件は一個／ウェルで行った。９６穴プレートの各ウェルの蛍光性の有無はイメージアナライザー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒＦＸ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により評価した。
結果及び考察：
（１）プラスミドベクターについて
ベクター内のインサートの有無は大腸菌のＧＦＰの蛍光性の有無により判断する。そこで、本実施例では、蛍光性の有無の判断を行いやすくするために、大腸菌内でのＧＦＰの蛍光強度が高いＧＦＰｕｖ４（Ｉｔｏｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ２６４５５６−５６０８（１９９９））を利用した。今回はＮ末端のマルチクローニングサイトを持つＬａｃＺ由来の２４アミノ酸に代わりＴ７ｔａｇ配列（ＮＨ_２−ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＡ−ＣＯＯＨ）を使用した。インサートに導入するプロモーター配列は、その配列長が短くかつプロモーター強度の高いＴ７プロモーター配列（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ５６１２５−１３５（１９８７））を用いた。作成したクローニングベクターをキャリブレーションするため、ＥＹＦＰ遺伝子をモデル挿入配列として、ＰＣＲ法によりプロモーターをそれに付加し、（Ｉ）マルチクローニング部位内の制限酵素部位（今回はＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩを使用した。）、（ＩＩ）Ｔ−拡張ベクター法、（ＩＩＩ）平滑末端法により、クローニングベクターと連結、そして大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株またはＤＨ５α（ＤＥ３）株に形質転換した。
（２）コロニーの蛍光性について
インサートの連結産物を形質転換した大腸菌コロニーを図５に示す。ＧＦＰｕｖ４のＴ拡張ベクターを用いた方法（Ｉｔｏｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ２４５５９−６３（２０００））と同様に、緑色蛍光性及び非蛍光性の２種類のコロニーが現れた。それぞれは自然光照射でさえ簡単に区別することができた。また蛍光性コロニーのＰＢＳ懸濁液の蛍光スペクトルはＧＦＰの形のみを示し、ＥＹＦＰ由来のピークは現れなかった。このことは緑色蛍光コロニーの蛍光性は大腸菌内のＧＦＰの発現によるものであることを示す。プラスミドｐＧＦＰｃｌｎを形質転換した大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株またはＪＭ１０９（ＤＥ３）株のコロニーは緑色蛍光を示さなかった。
本来大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株またはＪＭ１０９（ＤＥ３）株ではＩＰＴＧによりＴ７ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは発現を誘導されるべきであるが、微量に発現することが知られている。しかしＩＰＴＧ無添加条件下にもかかわらず、肉眼で大腸菌コロニーの蛍光性の有無を区別できた。また、液体培地を用いた培養後の結果もコロニーと同様に、ＩＰＴＧ無添加条件でも蛍光性の有無が確認できた。
（３）蛍光性クローンのインサート確認について
得られた蛍光性クローンとインサート配列の有無との関係を確認した。ランダムに選んだ各インサート導入方法により得られた蛍光性の形質転換クローンの各４８個はすべてインサートを持っていた。
Ｔ−拡張ベクター法及び平滑末端法により連結されたインサートの挿入方向は２種類存在し、その確率は１／２であると期待される。ランダムに選んだクローン１６個を配列決定したインサートはすべて同方向であった。以上の結果より、本システムではインサートを方向づけてベクターに導入することが示された。
（４）挿入失活による従来法との判別効率の比較
従来の挿入失活によるシステムと本システムとの判別効率を比較した。ランダム配列を含む１００ｂｐをテスト配列として使用し、Ｔ−拡張ベクター法により形質転換産物を得た。ＥＹＦＰ遺伝子を導入した際と同様に、蛍光性及び非蛍光性の２種類の大腸菌クローンが得られた。ランダムにサンプリングした１１０個の蛍光性クローンはすべてインサートを持っていた（図６）。同様の実験をＧＦＰ遺伝子の挿入失活により判別した報告では判別効率は９４％であった（Ｉｔｏｅｔａｌ．：Ｇｅｎｅ２４５５９−６３（２０００））。このことは本システムの非常に高い判別効率を持つことを示している。
（５）蛍光セルソーターを用いた直接クローン化について
蛍光性及び非蛍光性大腸菌の混合集団より、蛍光性クローンを９６穴プレートへ一個／ウェルの条件でソートした。ソートした大腸菌がクローンであることを確認するため、各ウェル上にて７５μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地を作成し、使用した。蛍光性クローンのみを９６穴プレートへソートした結果、５ウェルに各一個ずつ蛍光性コロニーが現れた（図７）。また、そのコロニーの形は、それらがクローンであることを示した。
実施例２：発現用プラスミドｐＧＦＰＥｘ
方法
（１）プラスミドの構築
発現用プラスミドｐＧＦＰＥｘはｐＧＦＰｇｃｎ４（Ｉｔｏｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ２６４，５５６−５６０８（１９９９））の（１）ＧＦＰ遺伝子上流へのマルチクローニング部位とＳＤ配列の導入、（２）ｌａｃプロモーター及びＳＤ配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ間へプラスミドｐＢＡＤ２２由来のＡｒａＣ遺伝子及びＰ_ＢＡＤプロモーター配列の導入、（３）ＧＦＰ遺伝子のＮ末端へＴ７ｔａｇ配列、Ｃ末端へ分解用タグ配列（ＮＨ２−ＡＡＮＤＥＮＹＡＬＡＡ−ＣＯＯＨ，Ａｎｄｅｒｓｅｎｅｔａｌ．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６４，２２４０−２２４６（１９９８））の導入、により作成した（図８）。
（２）挿入したＥＹＦＰ遺伝子の発現
ＥＹＦＰ遺伝子を含むＰＣＲ産物はｐＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレート配列に、オリゴマー（配列番号１および配列番号７）をプライマーに、ＥｘＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ法により得た。プラスミドｐＧＦＰＥｘ及びＥＹＦＰ遺伝子のＰＣＲ産物をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩで切断し、それぞれをアガロース電気泳動による分離そしてＤＮＡ抽出後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。この連結産物を大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株またはＤＨ５α（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株へ形質転換、７５μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢプレートへまき、３７℃で１８時間インキュベートした。
緑色コロニーを７５μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ培地で３７℃培養した。６６０ｎｍでの濁度が０．３の時、アラビノース（最終濃度０．２％）またはＩＰＴＧ（最終濃度０．１ｍＭ）を加え、さらに２時間培養した。
培養液をＰＢＳにより置換、６６０ｎｍでの濁度を０．１へ希釈後、励起波長４８８ｎｍにより、蛍光波長４５０−６００ｎｍ間の蛍光スペクトルを測定した（Ｆ２０００，ＨＩＴＡＣＨＩ）。
オリゴマー配列；イタリック太文字はＳＤ配列、開始コドン部位（ＡＴＧ）を示す。

結果及び考察；
（１）クローニング・発現用プラスミドｐＧＦＰＥｘに関して
挿入する遺伝子の蛋白質発現を行うため、マルチクローニングサイトの上流にプロモーター配列を導入した。今回は大腸菌内での挿入遺伝子の発現を確認するため、転写調節をコントロールできるＰ_ＢＡＤプロモーター配列（Ｇｕｚｍａｎｅｔａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，４１２１−４１３０（１９９５））を使用した。
ＧＦＰは一度フォールディングすると、大腸菌内においても、安定に存在することが知られている。しかし本発現ベクターによる緑白スクリーニング後は、大腸菌内にＧＦＰがない方が望ましい。そこで発現したＧＦＰの分解を促進するため、ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｔａｇ配列をＧＦＰのＣ末端に導入した。
（２）プラスミドｐＧＦＰＥｘを用いたＥＹＦＰ遺伝子のクローニングとその発現
ＥＹＦＰ遺伝子をオリゴマー（配列番号１及び配列番号７）を用いてＰＣＲを行い、インサートとした。このインサートにはＨｉｎｄＩＩＩ認識部位方向（翻訳開始コドンの上流）にＳＤ配列、Ｋｐｎｌ認識部位にＴ７プロモーター配列を有している（図９）。このインサートを用いてｐＧＦＰＥｘベクターに導入し、大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株またはＤＨ５α（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を形質転換した。
プラミスドｐＧＦＰｃｌｎを用いたシステムと同様に、インサートの連結産物を形質転換した大腸菌コロニーは蛍光、非蛍光の２種類であった。またその蛍光発光した大腸菌２３クローンを無作為に選び、コロニーＰＣＲ法によりインサートの有無を確認した。その結果、選んだすべての蛍光性クローンはインサートを有していた。また上記とは別に無作為に選んだ８クローンの塩基配列解析結果は、すべてのクローンに関してインサートは同一方向、すなわち構築通りにＰ_ＢＡＤプロモーターの下流にＳＤ配列そして翻訳開始コドンがみられたことを示した。
これらのクローンを、７５μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ培地による液体培養を行い、６６０ｎｍにおける濁度が０．３の時にＩＰＴＧまたはアラビノースを添加し（それぞれ最終濃度０．１ｍＭ，０．２％）、さらに２時間蛋白質を誘導発現した。またコントロール実験として、誘導なしの条件でも行った。それらの培養液をＰＢＳで置換後、励起波長４８８ｎｍにおける蛍光スペクトルを測定した結果を図に示す。ＩＰＴＧ誘導した場合はＧＦＰ特有の５１０ｎｍのみにピークがみられ、アラビノース誘導した場合はＹＦＰ特有の５２６ｎｍのみにピークがみられた。また誘導なし条件ではＧＦＰ、ＹＦＰのどちらのピークも示さなかった（図１０）。
以上の結果は、プラスミドｐＧＦＰＥｘに挿入したＥＹＦＰ遺伝子が上流のＰＢＡＤプロモーターにより誘導発現されたことを示している。
産業上の利用の可能性
本発明により、挿入ＤＮＡ配列（インサート）の導入の有無の判別を効率よく行うことができるクローニングベクターを提供することが可能になった。本発明のクローニングベクターは、プレート上で形質転換体のコロニーを形成させることなく、インサートの導入の有無を確認することができ、また蛍光セルソーター等の装置を使用することによりインサートを有する形質転換体のみを回収して、目的ＤＮＡ配列のクローン化をハイスループット化することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１はプラスミドｐＧＦＰｃｌｎの構造を示す。
図２は、プロモーター配列のインサートへの付加方法を示す。上図はＰＣＲ法を示し、下図はアダプター法を示す。
図３は、ＧＦＰベクターを用いたハイスループットシステムを示す。
図４は、ＧＦＰ発現ベクターを選択するためのマイクロチップセルソーターの概念図を示す。大腸菌１個が流れる５０μｍ径の流路に、蛍光検出器を設け蛍光の強度で挿入の有無を識別する。この結果によって、２つの弁のうち一方を開閉し、挿入された大腸菌のみを９６穴プレートに分注する。
図５は、自然光照射における蛍光性及び非蛍光性大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株を示す。大腸菌は、Ｔ７プロモーターを付加したＥＹＦＰのＰＣＲ産物をＴ拡張ベクター法によりライゲーションした形質転換産物である。アンピシリンを添加したＬＢプレートを３７℃１８時間培養した。左の矢印はＤＮＡが挿入されたベクターをもつ大腸菌コロニーを示し、右の矢印はＤＮＡが挿入されていないベクターをもつ大腸菌コロニーを示す。
図６は、蛍光コロニーをコロニーＰＣＲしてインサートを確認した結果を示す。
図７は、セルソーターによってＧＦＰ発現大腸菌が選択されたことを示す。矢印はＬＢ寒天培地を加えた９６穴プレート内にセルソーター（ＦＡＣＳ）で選択されたＧＦＰ発現コロニーを示す。選択されたコロニーは全てＧＦＰが発現している（インサートＤＮＡが挿入されている）。
図８はプラスミドｐＧＦＰＥｘの構造を示す。
図９は、ＥＹＦＰ遺伝子を含むインサート配列の構造を示す。
図１０は、ＥＹＦＰ遺伝子を挿入したｐＧＦＰＥｘベクターを持つ大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株の４８８ｎｍ励起での蛍光スペクトルを示す。ＩＰＴＧ誘導ではＧＦＰのピークが、アラビノース誘導ではＥＹＦＰのピークがそれぞれ見られる。Technical field
The present invention relates to a cloning vector using a gene for selecting a host such as a gene of green fluorescent protein and a system using the same. More specifically, the present invention relates to a cloning vector that can easily determine whether or not an insert has been inserted using an indicator for selection of a host such as fluorescence emitted from a green fluorescent protein or drug resistance, and the like. It relates to the system used.
Background art
In recent years, the demand for large-scale sequencing at the genome size is expanding worldwide in research institutions represented by the International Human Genome Project and Celera. In the future, SNP (point mutation polymorphism) analysis will become popular for the purpose of disease genetic identification, and it is considered that the demand for sequences will increase rapidly. Cloning of genomic (DNA) fragments is an extremely important basic technology in such sequencing methods and general genetic engineering.
In general, DNA cloning is performed by inserting a DNA fragment into a vector, introducing it into E. coli, and then making an E. coli colony on a plate to obtain a colony having the desired fragment. As for confirmation of introduction of an inserted DNA sequence (insert) into a vector, a method of discriminating by insertion inactivation of β-galactosidase or GFP gene is currently reported (blue-white screening or green-white screening). Yansch-Perron et al. Gene 33 103-119 (1985); Ito et al. Gene 245 59-63 (2000)). However, in this method, the mutation of the gene sequence (β-galactosidase gene or GFP gene) into which the insert sequence is introduced or the promoter sequence that serves as the transcription start site causes a function of the protein. Therefore, when determining the presence or absence of an insert using the color and fluorescence of an E. coli colony as a selection criterion, there is a problem that the efficiency of the determination is low (Ito et al. Gene 245 59-63 (2000) ). In addition, in such a conventional method, since it is necessary to form E. coli colonies on a plate and determine the presence or absence of an insert, there is an extremely difficult limitation in adopting a mechanical system to achieve high throughput.
Disclosure of the invention
The present invention has been made to solve the above-described problems of the prior art. That is, an object of the present invention is to provide a cloning vector capable of efficiently determining whether or not an inserted DNA sequence (insert) is introduced and a system using the same. Another object of the present invention is to provide a cloning vector and a system using the same that can confirm the presence or absence of introduction of an insert without forming a colony of a transformant on a plate. The present invention further provides a cloning vector capable of recovering only a transformant having an insert by using an apparatus such as a fluorescent cell sorter, and achieving high-throughput cloning of a target DNA sequence, and a system using the same. It was set as a problem to be solved.
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have developed a cloning vector in which only a transformant having a vector having a DNA fragment (insert) inserted therein can emit GFP fluorescence. It was also found that the presence or absence of the insertion of the insert can be efficiently determined by using this cloning vector. In addition, this method, when combined with a fluorescent cell sorter as a cloning machine, enables direct cloning into a 96-well microplate. As a result, in the cloning operation using the above cloning vector, the colony formation step using the plate necessary for the conventional cloning operation can be omitted, and the time required for the cloning operation can be reduced from about 16 hours to about 3 hours. And was able to greatly shorten. The present invention has been completed based on these findings.
That is, according to the present invention, there is provided a cloning vector having a cloning site having one or more restriction enzyme sites, a ribosome binding sequence, and a gene for host selection in order from 5 'to 3'.
Preferably, the host selection gene is selected from a drug resistance gene, a biosynthetic pathway gene, a fluorescent protein or a mutant gene thereof, or a gene of a protein capable of color development, fluorescence emission or chemiluminescence in the presence of a substrate. Gene.
More preferably, the drug resistance gene is an ampicillin (Amp) resistance gene, a kanamycin (Kan) resistance gene, a tetracycline (Tet) resistance gene, a chloramphenicol (Cm) resistance gene, or a dihydrofolate reductase (DHFR) gene. The gene of the biosynthetic pathway is a glutamine synthesis gene or a proline synthase gene, and the fluorescent protein or a mutant gene thereof is a green fluorescent protein or a mutant thereof or a DsRed gene derived from coral, The gene of a protein capable of color development, fluorescence emission or chemiluminescence in the presence thereof is a β-galactosidase gene or a luciferase gene.
Particularly preferably, the gene for host selection is a gene encoding a green fluorescent protein or a variant thereof.
Preferably, the ribosome binding sequence is an SD sequence or a Kozak sequence.
Preferably, a fluorescent protein gene that emits fluorescence under visible light is used as a gene for host selection.
Preferably, as a gene for host selection, the 64th amino acid is Leu, the 65th amino acid is Thr, the 99th amino acid is Ser, and the 153rd in the amino acid sequence of the wild-type green fluorescent protein. A gene encoding an amino acid sequence in which the amino acid is Thr, the 163rd amino acid is Ala, and the 208th amino acid is Leu is used.
Preferably, the cloning vector of the present invention further has an origin of replication.
Preferably, the cloning vector of the present invention further has an antibiotic resistance gene.
As an example of the present invention, a cloning vector having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is provided.
According to another aspect of the present invention, a transformant having the above-described cloning vector of the present invention is provided.
According to still another aspect of the present invention, there is provided a recombinant vector obtained by inserting a DNA fragment having a promoter sequence at the end into the cloning site of the above-described cloning vector of the present invention.
Preferably, the promoter sequence is a T7 promoter sequence.
According to still another aspect of the present invention, a transformant having the above-described recombinant vector of the present invention is provided.
According to still another aspect of the present invention, for a host transformed with the above-described recombinant vector of the present invention, cloning of the vector comprising discriminating an indicator based on gene expression for host selection A method for determining whether or not an insert has been inserted into a site is provided.
Preferably, a recombinant vector prepared using a fluorescent protein or a mutant gene thereof as a gene for host selection is used.
According to still another aspect of the present invention, (A) a step of creating a recombinant vector by inserting a DNA fragment having a promoter sequence at the end into the cloning site of the cloning vector of the present invention;
(B) transforming the resulting recombinant vector into a host to produce a transformant; and
(C) selecting a transformant having a recombinant vector by discriminating an indicator based on expression of a gene for selection of a host introduced into the obtained transformant;
A method for cloning a gene comprising
In the cloning method described above, a cloning vector prepared using a fluorescent protein or a mutant gene thereof is preferably used as a host selection gene. In the above cloning method, the step (C) is preferably performed with a fluorescent cell sorter or a microchip cell sorter.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
The cloning vector of the present invention is characterized by having a cloning site having one or more restriction enzyme sites, a ribosome binding sequence, and a gene for host selection in order from 5 'to 3'.
Specific examples of genes for host selection include the following.
(1) Drug resistance gene (for example, ampicillin (Amp) resistance gene, kanamycin (Kan) resistance gene, tetracycline (Tet) resistance gene, chloramphenicol (Cm) resistance gene, or dihydrofolate reductase (DHFR) gene)
When a drug resistance gene is used as a gene for host selection, only the clone into which the insert is inserted can form a colony on the medium containing the drug, so that the host can be identified.
(2) Biosynthetic pathway genes (eg, glutamine synthesis gene or proline synthase gene)
When a biosynthetic pathway gene is used as a host selection gene, E. coli used for transformation is selected (ie, a synthase-deficient strain is selected), and clones with inserts are synthetic media such as M9. Colonies can be formed above.
(3) Fluorescent protein or mutant gene thereof (for example, green fluorescent protein or mutant thereof, or DsRed gene derived from coral)
When a fluorescent protein or a mutant gene thereof is used as a host selection gene, the presence or absence of insert insertion can be confirmed by the presence or absence of fluorescence of the clone.
(4) Gene of a protein capable of color development, fluorescence emission or chemiluminescence in the presence of a substrate (for example, β-galactosidase gene or luciferase gene)
When using a gene of a protein capable of color development, fluorescence emission or chemiluminescence in the presence of a substrate as a gene for host selection, for example, beta-galactosidase and X-gal, luciferase used in blue-white screening By using a combination of luciferin and luciferin (+ ATP), the presence or absence of insert insertion can be confirmed.
In the present invention, it is preferable to use a fluorescent protein or a mutant or body gene thereof as a gene for host selection, and it is particularly preferable to use a gene encoding a green fluorescent protein or a mutant thereof.
Green fluorescent protein (GFP) is a fluorescent protein derived from a kind of jellyfish, Aequorea victoria (Owan jellyfish). In Aequoria Victoria, GFP absorbs the energy produced by calcium-stimulated aequorin and emits green light. When excited by near ultraviolet or blue light, GFP expressed in prokaryotic and eukaryotic cells emits strong green fluorescence.
The amino acid sequence of GFP is known (Pracer, DC, et al. (1992) Gene, 111, 229-233). Since amino acid residues are usually encoded by a plurality of DNA triplets, there are many DNA sequences that encode the amino acid sequence of wild-type GFP or mutant GFP. The GFP gene in the cloning vector of the present invention may be any of these DNA sequences. In the present invention, it is preferable to use various protein light emitters (eg, green fluorescent protein or variants thereof) that emit fluorescence under visible light or can be excited by a laser.
Moreover, mutant GFP can be used in the present invention, and it is particularly preferable to use mutant GFP in which the intensity of green fluorescence is higher than that of wild-type GFP. Examples of such mutant GFP include one or more (for example, 1 to several, specifically 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 in the amino acid sequence of wild-type GFP). To 10 (particularly preferably 1 to 5) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added. In the present specification, the term “green fluorescent protein” (abbreviated as GFP) includes all mutant GFPs having green fluorescence.
As a method for obtaining a mutant GFP gene, any method known in the art such as a chemical synthesis method, a genetic engineering method, and a mutagenesis method can be used. An available GFP gene can be obtained, and based on this, mutant GFP DNA can be obtained. Mutation can be introduced into a gene by many methods. For example, it can be carried out using a method of contacting with a drug that becomes a mutagen, a method of irradiating with ultraviolet rays, a genetic engineering method, or the like.
Site-directed mutagenesis, which is one of genetic engineering techniques, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position, and is useful in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) and the like.
Examples of mutant GFP suitable for use in the present invention include, for example, Ito et al. 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. And GFPuv (F99S, M153T, V163A), GFPuv2 (F99S, M153T, V163A, S208L), GFPuv3 (F99S, M153T, V163A), and the like. F64L, S65T), and GFPuv4 (F99S, M153T, V163A, F64L, S65T, S208L), etc. (in the above, parentheses indicate amino acid mutations relative to wild-type GFP, for example, F99S has the 99th amino acid) It indicates that F is substituted with S). Among the above mutant GFPs, GFPuv2 (F99S, M153T, V163A, S208L), GFPuv3 (F99S, M153T, V163A, F64L, S65T), and GFPuv4 (F99S, M153T, V163A, F64L, S65T, S208L) are preferable. GFPuv4 (F99S, M153T, V163A, F64L, S65T, S208L) is particularly preferable.
For example, when a GFP gene is used as a gene for host selection, in the method of inactivating GFP fluorescence by inserting the GFP gene as in the conventional method, the insert is inserted into the vector. It is not possible to emit green fluorescence derived from GFP only when Therefore, the present inventors paid attention to the DNA sequence to be inserted into the vector and decided to add a promoter sequence to the end of the insert sequence. When an insert sequence having such a promoter sequence at the end is inserted into the vector, the GFP gene existing downstream of the promoter sequence at the end of the insert sequence is expressed, and the fluorescence of the expressed GFP is used as an index. It becomes possible to determine whether or not the insert is inserted into the vector.
The ribosome binding sequence used in the present invention can be appropriately selected according to the type of host. For example, when the host is a prokaryotic cell such as Escherichia coli, an SD sequence can be selected. In the case of eukaryotic cells such as, a Kozak sequence can be selected.
The cloning vector of the present invention has a cloning site having one or more restriction enzyme sites. The type of restriction enzyme site constituting the cloning site is not particularly limited, and may be, for example, a multiple cloning site containing a plurality of restriction enzyme sites such as HindIII, SphI, XbaI, BamHI, SmaI, KpnI and the like. The cloning site may be a pre-existing vector used as a starting material in the construction of the cloning vector of the present invention, or can be introduced into a GFP vector using a recombinant gene technique. .
The cloning vector of the present invention preferably contains an origin of replication. For example, when the host is Escherichia coli, a replication origin derived from pBR322 can be selected, and when the host is yeast, ARS or the like can be selected.
The cloning vector of the present invention preferably contains an antibiotic resistance gene. By including the antibiotic resistance gene in the vector, host cells that are not transformed (that do not hold the vector) can be eliminated by culturing the transformant after transformation in an antibiotic-containing medium.
The kind of antibiotic resistance gene is not particularly limited, and examples thereof include an ampicillin resistance gene and a tetracycline resistance gene.
In addition, when using a drug resistance gene as a gene for host selection, it is preferable to include an antibiotic resistance gene different from the drug resistance gene.
An example of the cloning vector of the present invention is the plasmid pGFPcln prepared in the following examples. In pGFPcln, an SD sequence and a multiple cloning site are arranged upstream of the GFP gene (the outline of the structure of pGFPcln is shown in FIG. 1, and the base sequence of pGFPcln is described in SEQ ID NO: 5).
The cloning vector of the present invention can be appropriately produced by those skilled in the art. For example, it can be produced by arranging a cloning site and a ribosome binding sequence (for example, an SD sequence) upstream of the GFP gene using a GFP vector available to those skilled in the art.
The present invention further relates to a recombinant vector obtained by inserting a DNA fragment having a promoter sequence at the end into the cloning site of the above-described cloning vector.
A promoter sequence to be added to the insert is introduced at the end so as to face outward. That is, when a promoter sequence is added to the 3 ′ end of the insert, the 5 ′ end of the promoter sequence is linked to the 3 ′ end of the insert, and a promoter sequence is added to the 5 ′ end of the insert. The 5 ′ end of each may be linked to the 5 ′ end of the insert.
The method for linking the promoter sequence and the insert sequence is not particularly limited. For example, the promoter sequence can be added to the insert sequence by the following method (FIG. 2).
(1) A method of introducing the inserted sequence into the primer sequence in advance when the inserted sequence is amplified by PCR; or
(2) When the inserted sequence is a fragment cleaved with a restriction enzyme, a method for introducing the fragment into the adapter sequence:
In particular, in the method of adding a promoter sequence by PCR, the insertion direction of the insert can be determined by introducing it into only one (FIG. 2).
The promoter used in the present invention may be any promoter that can function in the host cell. For example, T7 promoter, trp promoter (P trp), lac promoter (P lac), P_LPromoter, P_RPromoter, P_SEExamples include promoters derived from Escherichia coli, phages, and the like, SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter, and the like. In addition, artificially designed and modified promoters such as a promoter in which two P trps are connected in series (P trp × 2), a tac promoter, a let1 promoter, and a lacT7 promoter can be used.
Examples of promoters that function in yeast include promoters such as PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, and CUP1 promoter.
Examples of promoters that function in animal cells include cytomegalovirus (human CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, SRα promoter, and the like. be able to. In addition, an enhancer of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
Even when other hosts are used, regulatory sequences (promoter and the like) that function in the host can be appropriately selected.
As described above, the target insertion sequence to which the promoter sequence has been added is used in the cloning vector of the present invention: (I) a restriction enzyme site in the multicloning site, (II) T-extension vector method, (III) blunt end method Can be linked together.
The present invention further relates to a transformant having the above-described cloning vector or recombinant vector. That is, according to the present invention, a transformant obtained by transforming the above-described cloning vector or recombinant vector into a host is provided.
The type of host used in the present invention is not particularly limited, but is preferably selected from bacterial cells, yeast cells, fungal cells, insect cells, nematode cells, plant cells or animal cells.
The bacterial cells and fungal cells include Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, Agrobacterium, Agrobacterium, Erwinia genus, Methylobacterium genus, Rhodium genus, Rhodobacter genus, Rhodopseudomonas genus, Rhodospirillum genus, Scenedesmon genus, Streptomyces genus, Synnecoccus genus Mention may be made of a microorganism belonging to the genus s and the like, preferably a microorganism belonging to the genus Escherichia. Specific examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli XL1-Blue, XL2-Blue, DH1, DH5α, MC1000, KY3276, W1485, JM109, HB101, No49, W3110, NY49, MP347, NM522, and the like.
Examples of yeast cells include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveroses lucis puls, Lances Etc.
Animal cells include Vero cells, HeLa cells, CV1 cells, Namalba cells, COS1 cells, COS7 cells, CHO cells, and various vertebrate, invertebrate, and mammalian cells.
Insect cells include Spodoptera frugiperda ovarian cells Sf9, Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York ( New York) (1992)], Trichoplusia ni ovary cells High5 (manufactured by Invitrogen), and the like can be used.
The method for introducing the cloning vector or recombinant vector of the present invention into a host can be appropriately selected according to the type of the host. For example, the vector can be introduced into the host by appropriately selecting calcium phosphate method, protoplast method, electroporation method, spheroblast method, lithium acetate method, lipofection method, microinjection method and the like.
By using the transformant into which the recombinant vector has been introduced by the above-described method, by determining the index based on the expression of the gene for host selection, it is determined whether or not the vector has an insert at the cloning site. be able to.
The term “indicator” as used herein refers to whether or not colonies can be formed on a medium containing a drug when a drug resistance gene is used as a gene for host selection. When using a gene of the biosynthetic pathway as a gene for the above, it says whether colonies can be formed on a synthetic medium, and when using a fluorescent protein or its mutant gene as a gene for host selection Is the presence or absence of fluorescence of the clone, and when a gene of a protein capable of color development, fluorescence emission or chemiluminescence in the presence of a substrate is used as a gene for host selection, it is exhibited in the presence of the substrate. The presence or absence of color development, fluorescence emission or chemiluminescence.
That is, according to the present invention, for a host transformed with the recombinant vector of the present invention, the method comprises the step of discriminating an index based on the expression of a gene for host selection, and inserting an insert into the cloning site of the vector. A method for determining the presence or absence of insertion is provided. In a preferred embodiment of the present invention, for a host transformed with a recombinant vector prepared using a fluorescent protein or a mutant gene thereof as a host selection gene, the presence or absence of fluorescence emitted by the host is determined. Thus, it is determined whether or not the insert is inserted into the cloning site of the vector.
Furthermore, according to the present invention,
(A) a step of creating a recombinant vector by inserting a DNA fragment having a promoter sequence at the end into the cloning site of the cloning vector of the present invention;
(B) transforming the resulting recombinant vector into a host to produce a transformant; and
(C) selecting a transformant having a recombinant vector by discriminating an indicator based on expression of a gene for selection of a host introduced into the obtained transformant;
A method for cloning a gene comprising
In the above cloning method, preferably, a cloning vector prepared using a fluorescent protein or a mutant gene thereof is used as a host selection gene, and step (C) is performed by a fluorescent cell sorter or a microchip cell sorter.
FIG. 3 shows a configuration diagram of a high-throughput system using a GFP vector as an example of the present invention. In the high-throughput system using the GFP vector of the present invention, it is possible to process 2 to 3,000 clones in one day, and the processing efficiency can be remarkably improved as compared with the conventional method. .
Regardless of the presence or absence of an insert, clones with deleterious mutations to sequences involved in GFP gene expression are not fluorescent. Therefore, unlike the conventional method, the discrimination method of the present invention in which only clones having an insert emit fluorescence emits less artifacts (here, clones having no insert emit fluorescence).
In addition, by using a fluorescent cell sorter, only a fluorescent Escherichia coli clone having an insert can be recovered. Furthermore, by sorting such fluorescent E. coli one by one into each well of a 96-well microplate, they can be easily cloned (direct cloning). This method can save time for colony formation on a plate as in the conventional method, and can clone the target DNA sequence with high throughput.
The gene cloning using an expression GFP vector and a fluorescent cell sorter will be described more specifically.
First, PCR is performed using a primer having a T7 promoter on one side of a DNA sequence to be sequenced, and ligated with a pGFPcln vector (described in the following examples). The ligation product is transformed into the DH5α (DE3) strain (either electroporation or chemical method may be used). This is transferred to 5 ml of SOB, shaken at 37 ° C. for 30 minutes, and then induced by adding IPTG to a final concentration of 0.1 mM.
Then, after incubating at 37 ° C. for 3 hours, E. coli expressing GFP was sorted using FACS Vantage SE (Becton Dickinson) EPICS ALTRA (Beckman-Coulter), and one E. coli was added to each well of a 96-well plate. To dispense. At this time, excitation is performed using an argon ion laser, and fluorescence is measured using a filter for FITC. A conceptual diagram of a microchip cell sorter for selecting the above-described GFP expression vector is shown in FIG. A fluorescence detector is provided in a 50 μm diameter channel through which one E. coli flows, and the presence or absence of insertion is identified by the intensity of fluorescence. According to this result, one of the two valves is opened and closed, and only the inserted E. coli is dispensed into a 96-well plate. E. coli dispensed in 96-well plates are incubated at 37 ° C. for 16 hours, sequenced after miniprep.
All the contents disclosed in the specification of Japanese Patent Application No. 2001-138214, which is the application on which the priority of the present application is claimed, are disclosed in this specification by reference.
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
Example
Example 1
Method:
(1) Construction of plasmid vector
Plasmid pGFPcln was prepared as follows using pGFPgcn4 (Ito et al. Biochem. Biophys. Res. Commun 264 556-5608 (1999)). That is, it was prepared by introducing an SD sequence between the multicloning site of pGFPgcn4 and the GFP gene, deleting the HindIII / BsmBI containing the lac promoter and SD sequence, and introducing T7tag to the N-terminus of the GFP gene. . FIG. 1 shows the structure of plasmid pGFPcln. The base sequence of the plasmid pGFPcln is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
(2) Insertion of Insert with Addition of Promoter Sequence by PCR into a Vector As a model insertion sequence, 100 bp having a random nucleotide of 60 bp between primers was used as a PCR product.
The EYFP gene uses pEYFP (Clontech) as a template sequence and DNA oligomer 1 (5'-TCAGCG).GGTACCCTATAGTGAGTCGTATTATTNNNTACTTTGTACAGCTCGTCCAT-3 '(SEQ ID NO: 1)) and DNA oligomer 2 (5'-TGACTG)AAGCTTExTaq DNA polymerase (TAKARA, the following method) using ATGGTGAGCAAGGGCGGAGAGA-3 ′ (SEQ ID NO: 2)) as a primer (underline indicates a restriction enzyme site; N indicates any base of A, G, C, or T) (In the case of 1 and 2) or Taq DNA polymerase (TAKARA, in the case of the following method 3), it produced by performing PCR. The 13th to 30th CTATAGTGAGTCGTATTA in SEQ ID NO: 1 represents the T7 promoter sequence.
100 bp having a random sequence was obtained by the method of Eli et al. (Eli P. et al, J. Biochem. 125 790-794 (1999)).
The insert was inserted into the vector in the following three ways.
1. When using restriction enzyme sites
The plasmid pGFPcln and the PCR product were cleaved with HindIII and KpnI, respectively, separated by agarose electrophoresis to extract DNA, and then ligated with T4 DNA ligase.
2. Blunt end method
Plasmid pGFPcln was digested with SmaI, treated with E. coli-derived alkaline phosphatase, and ligated with the PCR product.
3. T-extended vector method
The T-extension vector was prepared using the same procedure as that of Ito et al. : Performed in the same manner as in Gene 245 59-63 (2000).
A method for adding a promoter sequence to the insert using the PCR method is shown in the upper part of FIG.
(3) Confirmation of transformation and insertion
The ligation product prepared in (2) above was transformed into E. coli DH5α (DE3) strain prepared using JM109 (DE3) strain (Stratagene) or λDE3 Lysogenization Kit (Novagen), and 75 μg / ml ampicillin was added. The LB plate was plated and incubated at 37 ° C. for 18 hours. The presence or absence of fluorescence of the colony was determined under natural light. Fluorescent and non-fluorescent E. coli JM109 (DE3) strains under natural light irradiation are shown in FIG.
The presence or absence of the insert of the fluorescent clone was confirmed by using oligomer 5 (5′-ATTCAACAAGAATTGGGACA-3 ′ (SEQ ID NO: 3)) and oligomer 6 (5′-CATTTTTATTCATAGAGAATAGTAGCGGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 4)) sandwiching the multiple cloning site as primers. The plasmid was extracted by the colony PCR method (Ito et al. Gene 245 59-63 (2000)) and the miniprep method, and the insert was recovered by restriction enzyme treatment. The resulting fragments were confirmed by 1% or 1.5% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. Insert sequencing was performed with a DNA sequencer (Genetic Analyzer 310, ABI).
(4) Confirmation of direct cloning using a fluorescent cell sorter
100 ng of the EYFP-introduced plasmid prepared by the blunt end method described above and 100 ng of the plasmid pGFPcln were mixed, and transformed into the DH5alpha (DE3) strain by the chemical method. LB medium supplemented with 75 μg / ml ampicillin was added, and shaking culture was performed at 37 ° C. for 16 hours. The sample was diluted with PBS and then measured with a fluorescent cell sorter (FACS Vantage SE, Becton Dickinson). The Ar ion laser used a wavelength of 488 nm, and the fluorescent filter used for FiTC. The fluorescent Escherichia coli sorting method followed the Becton Dickinson manual. The condition for sorting into a 96-well plate was 1 piece / well. The presence or absence of fluorescence in each well of the 96-well plate was evaluated by an image analyzer (Molecular Imager FX, Bio-Rad).
Results and discussion:
(1) About plasmid vectors
The presence or absence of an insert in the vector is determined by the presence or absence of fluorescence of GFP from E. coli. Therefore, in this example, in order to facilitate the determination of the presence or absence of fluorescence, GFPuv4 (Ito et al. Biochem. Biophys. Res. Commun 264 556-5608 (1999), which has high fluorescence intensity of GFP in E. coli. ) Was used. This time, instead of 24 amino acids derived from LacZ having an N-terminal multicloning site, a T7 tag sequence (NH₂-MASMTGGGQQMGA-COOH). The T7 promoter sequence (Rosenberg, AH et al. Gene 56 125-135 (1987)) having a short sequence length and high promoter strength was used as the promoter sequence to be introduced into the insert. In order to calibrate the created cloning vector, a promoter was added to the EYFP gene as a model insertion sequence by the PCR method, and (I) restriction enzyme sites in the multiple cloning site (HindIII and KpnI were used this time), (II) A ligation with a cloning vector and a transformation into E. coli JM109 (DE3) strain or DH5α (DE3) strain by T-extension vector method and (III) blunt end method.
(2) Colony fluorescence
FIG. 5 shows an E. coli colony transformed with the insert ligation product. Similar to the method using the GFPuv4 T expansion vector (Ito et al. Gene 245 59-63 (2000)), two types of colonies, green fluorescent and non-fluorescent, appeared. Each could be easily distinguished even by natural light irradiation. Moreover, the fluorescence spectrum of the PBS suspension of the fluorescent colony showed only the GFP form, and no EYFP-derived peak appeared. This indicates that the fluorescence of the green fluorescent colony is due to the expression of GFP in E. coli. Colonies of E. coli DH5α (DE3) strain or JM109 (DE3) strain transformed with plasmid pGFPcln did not show green fluorescence.
Originally, in E. coli DH5α (DE3) strain or JM109 (DE3) strain, expression of T7 RNA polymerase should be induced by IPTG, but it is known that it is expressed in a trace amount. However, despite the absence of IPTG, the presence or absence of fluorescence of the E. coli colony could be distinguished with the naked eye. Moreover, the result after culture | cultivation using a liquid culture medium has also confirmed the presence or absence of the fluorescence also on IPTG additive-free conditions similarly to a colony.
(3) Confirmation of fluorescent clone insert
The relationship between the obtained fluorescent clone and the presence or absence of the insert sequence was confirmed. Each of 48 fluorescently transformed clones obtained by each randomly selected insert introduction method had an insert.
There are two types of insertion directions of inserts linked by the T-extension vector method and the blunt end method, and the probability is expected to be ½. All inserts that sequenced 16 randomly selected clones were in the same orientation. From the above results, it was shown that the insert is oriented and introduced into the vector in this system.
(4) Comparison of discrimination efficiency with conventional methods due to insertion inactivation
The discrimination efficiency between the conventional system due to insertion deactivation and this system was compared. 100 bp containing a random sequence was used as a test sequence, and a transformation product was obtained by the T-expansion vector method. As with the introduction of the EYFP gene, two types of E. coli clones, fluorescent and non-fluorescent, were obtained. All 110 randomly sampled fluorescent clones had an insert (FIG. 6). In a report in which the same experiment was discriminated by inactivating GFP gene, the discrimination efficiency was 94% (Ito et al .: Gene 245 59-63 (2000)). This indicates that the system has a very high discrimination efficiency.
(5) About direct cloning using a fluorescent cell sorter
From a mixed population of fluorescent and non-fluorescent E. coli, fluorescent clones were sorted into 96-well plates at 1 / well. In order to confirm that the sorted Escherichia coli was a clone, an LB agar medium supplemented with 75 μg / ml ampicillin was prepared and used on each well. As a result of sorting only fluorescent clones into a 96-well plate, one fluorescent colony appeared in each of the 5 wells (FIG. 7). The colony shape also indicated that they were clones.
Example 2: Expression plasmid pGFPEX
Method
(1) Plasmid construction
The expression plasmid pGFPEX is (1) introduction of the multicloning site and SD sequence upstream of the GFP gene of pGFPgcn4 (Ito et al. Biochem. Biophys. Res. Commun 264, 556-5608 (1999)), (2) lac promoter AraC gene from plasmid pBAD22 and P between HindIII / PvuII containing SD and SD sequences_BADIntroduction of promoter sequence, (3) Introduction of T7tag sequence to N-terminus of GFP gene, tag sequence for degradation to C-terminus (NH2-AANDENALAA-COOH, Andersen et al. Applied and Environmental Microbiology 64, 2240-2246 (1998)) (Fig. 8).
(2) Expression of inserted EYFP gene
A PCR product containing the EYFP gene was obtained by the PCR method using ExTaq DNA polymerase (TAKARA) with pEYFP (Clontech) as a template sequence, oligomers (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 7) as primers. The PCR products of plasmid pGFPEX and EYFP gene were cleaved with HindIII and KpnI, respectively, separated by agarose electrophoresis and extracted with DNA, and then ligated with T4 DNA ligase. This ligated product was transformed into E. coli DH5α (DE3) strain or DH5α (DE3) pLysS strain, plated on an LB plate supplemented with 75 μg / ml ampicillin, and incubated at 37 ° C. for 18 hours.
Green colonies were cultured at 37 ° C. in LB medium supplemented with 75 μg / ml ampicillin. When the turbidity at 660 nm was 0.3, arabinose (final concentration 0.2%) or IPTG (final concentration 0.1 mM) was added and further cultured for 2 hours.
The culture medium was replaced with PBS, the turbidity at 660 nm was diluted to 0.1, and the fluorescence spectrum between fluorescence wavelengths 450-600 nm was measured at an excitation wavelength of 488 nm (F2000, HITACHI).
Oligomer sequence; italic bold letters indicate SD sequence, start codon site (ATG).

Results and discussion;
(1) Regarding the cloning and expression plasmid pGFPEX
In order to perform protein expression of the gene to be inserted, a promoter sequence was introduced upstream of the multiple cloning site. This time, to confirm the expression of the inserted gene in Escherichia coli, P_BADThe promoter sequence (Guzman et al. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995)) was used.
GFP is known to exist stably in E. coli once folded. However, it is desirable that GFP is not present in E. coli after green-white screening with this expression vector. Therefore, a degradation tag sequence was introduced into the C-terminus of GFP in order to promote degradation of the expressed GFP.
(2) Cloning and expression of EYFP gene using plasmid pGFPEx
PCR was performed on the EYFP gene using oligomers (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 7) to obtain inserts. This insert has an SD sequence in the HindIII recognition site direction (upstream of the translation initiation codon) and a T7 promoter sequence in the Kpnl recognition site (FIG. 9). Using this insert, it was introduced into a pGFPEx vector, and Escherichia coli DH5α (DE3) strain or DH5α (DE3) pLysS strain was transformed.
In the same manner as in the system using plamised pGFPcln, E. coli colonies transformed with the insert ligation product were of two types, fluorescent and non-fluorescent. In addition, the E. coli 23 clones that emitted fluorescence were randomly selected, and the presence or absence of an insert was confirmed by colony PCR. As a result, all selected fluorescent clones had an insert. In addition, the results of the base sequence analysis of 8 clones randomly selected apart from the above show that the inserts are in the same direction for all clones, that is, P as constructed._BADIt was shown that an SD sequence and a translation initiation codon were found downstream of the promoter.
These clones were subjected to liquid culture in LB medium supplemented with 75 μg / ml ampicillin, and when turbidity at 660 nm was 0.3, IPTG or arabinose was added (final concentrations of 0.1 mM and 0.2%, respectively) Furthermore, the protein was induced and expressed for 2 hours. In addition, as a control experiment, the experiment was also performed without induction. The results of measuring the fluorescence spectrum at an excitation wavelength of 488 nm after replacing those culture solutions with PBS are shown in the figure. When IPTG was induced, a peak was observed only at 510 nm peculiar to GFP, and when arabinose was induced, a peak was observed only at 526 nm peculiar to YFP. Further, neither GFP nor YFP peaks were shown in the condition without induction (FIG. 10).
The above results indicate that the EYFP gene inserted into the plasmid pGFPEX was induced and expressed by the upstream PBAD promoter.
Industrial applicability
According to the present invention, it has become possible to provide a cloning vector capable of efficiently determining whether or not an inserted DNA sequence (insert) has been introduced. The cloning vector of the present invention can confirm the presence or absence of the insertion of the transformant without forming a colony of the transformant on the plate. Also, the transformant having the insert can be obtained by using a device such as a fluorescent cell sorter. Only the DNA can be recovered, and the cloning of the target DNA sequence can be made high-throughput.
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the structure of plasmid pGFPcln.
FIG. 2 shows a method for adding a promoter sequence to an insert. The upper figure shows the PCR method, and the lower figure shows the adapter method.
FIG. 3 shows a high-throughput system using a GFP vector.
FIG. 4 shows a conceptual diagram of a microchip cell sorter for selecting a GFP expression vector. A fluorescence detector is provided in a 50 μm diameter channel through which one E. coli flows, and the presence or absence of insertion is identified by the intensity of fluorescence. Based on this result, one of the two valves is opened and closed, and only the inserted E. coli is dispensed into a 96-well plate.
FIG. 5 shows fluorescent and non-fluorescent E. coli JM109 (DE3) strains under natural light irradiation. E. coli is a transformation product obtained by ligating the PCR product of EYFP to which the T7 promoter has been added, using the T extension vector method. The LB plate supplemented with ampicillin was cultured at 37 ° C. for 18 hours. The left arrow shows an E. coli colony having a vector into which DNA has been inserted, and the right arrow shows an E. coli colony having a vector into which no DNA has been inserted.
FIG. 6 shows the result of confirming the insert by colony PCR of fluorescent colonies.
FIG. 7 shows that GFP-expressing E. coli was selected by the cell sorter. Arrows indicate GFP-expressing colonies selected with a cell sorter (FACS) in a 96-well plate with LB agar medium added. All of the selected colonies express GFP (insert DNA is inserted).
FIG. 8 shows the structure of plasmid pGFPEX.
FIG. 9 shows the structure of the insert sequence containing the EYFP gene.
FIG. 10 shows the fluorescence spectrum at 488 nm excitation of E. coli DH5α (DE3) pLysS strain having the pGFPEx vector into which the EYFP gene has been inserted. The IPTG induction shows a GFP peak, and the arabinose induction shows an EYFP peak.

Claims

A DNA fragment having a promoter sequence at the end at the cloning site of a cloning vector having a cloning site having one or more restriction enzyme sites, a ribosome binding sequence, and a gene for host selection in order from 5 ′ to 3 ′ Discriminating the presence or absence of insertion of the insert into the cloning site of the vector, including discriminating the indicator based on the expression of the gene for selection of the host for the host transformed with the recombinant vector obtained by inserting a method for the gene for the host of choice may Ri Oh with the gene for a fluorescent protein or a variant thereof, the promoter sequence is a T7 promoter sequence, the host is E. coli expressing T7 RNA polymerase, the method described above.

The method according to claim 1, wherein the gene for host selection is a gene encoding a green fluorescent protein or a variant thereof.

The method according to claim 1 or 2, wherein the ribosome binding sequence is an SD sequence or a Kozak sequence.

The method according to any one of claims 1 to 3, wherein a gene for a fluorescent protein that emits fluorescence under visible light is used as a gene for selecting a host.

As a host selection gene, the 64th amino acid is Leu, the 65th amino acid is Thr, the 99th amino acid is Ser, and the 153rd amino acid is the amino acid sequence of the wild-type green fluorescent protein. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein a gene encoding an amino acid sequence that is Thr, the 163rd amino acid is Ala, and the 208th amino acid is Leu is used.

The method according to any one of claims 1 to 5, further comprising an origin of replication.

Furthermore, the method in any one of Claim 1 to 6 which has an antibiotic resistance gene.

The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the cloning vector is a cloning vector having the base sequence described in SEQ ID NO: 5.

(A) A cloning site having one or more restriction enzyme sites in the 5 ′ to 3 ′ direction, a ribosome binding sequence, and a cloning site of a cloning vector having a fluorescent protein or a mutant gene in turn, and a T7 promoter at the end Inserting a DNA fragment having a sequence to produce a recombinant vector;
(B) a step of transforming the obtained recombinant vector into E. coli expressing T7 RNA polymerase to produce a transformant; and (C) a fluorescent protein introduced into the obtained transformant or its Selecting a transformant having a recombinant vector by discriminating an indicator based on the expression of a mutant gene;
A method for cloning a gene comprising

The gene cloning method according to claim 9 , wherein the step (C) is performed by a fluorescent cell sorter or a microchip cell sorter.