JP4309787B2

JP4309787B2 - 多光子励起型測定装置

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Publication number: JP4309787B2
Application number: JP2004070268A
Authority: JP
Inventors: 芳弘河野; 唯史平田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-03-12
Filing date: 2004-03-12
Publication date: 2009-08-05
Anticipated expiration: 2024-03-12
Also published as: JP2005257509A

Description

この発明は、多光子励起型測定装置に関するものである。

従来、生体等の試料にその表面から励起光を照射して、試料の表面下の比較的深い位置から発せられる蛍光を検出することにより、細胞等の機能を観察する装置として、多光子励起型の顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この多光子励起型の顕微鏡は、レーザ光源として極短パルスを発生する極短パルスレーザを使用する。極短パルスレーザは、光ファイバや光学デバイスのレンズ等の光学系の媒質を透過する際に、群速度分散によってパルス幅が長くなることが知られている。

このため、光ファイバの入口にプリズムを組み合わせたパルスストレッチャを配置してパルス幅を伸ばし、１パルスあたりのピークパワーを減少させた状態で光ファイバに入射させる一方、光ファイバの出口にパルスコンプレッサを配置してパルス長をレーザ光源出射時以上に圧縮した後に光学デバイスに入射させることにより、対物レンズから試料に照射させる時点では元々のレーザ光のパルス幅に近いパルス幅とする技術が開示されている。
特開２００２−２４３６４１号公報（第３頁等）

しかしながら、試料に対向させてレーザ光を照射し、得られた蛍光や反射光を検出する測定ヘッドは、実験小動物等の観察対象部位に対してあらゆる角度や位置から測定を行う必要性から、小型化の要請がある。これに対して、特許文献１の構造では、測定ヘッドを小型化することができないという問題がある。また、従来のように、パルスストレッチャやパルスコンプレッサを、レーザ光源、光ファイバおよび測定ヘッドの外部に配置したのでは、装置全体が大型化してしまう不都合がある。

この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、多光子励起現象を効率的に発生させるとともに、必要最小限の構成によって測定ヘッドおよび装置全体を小型化し得る多光子励起型測定装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、極短パルスレーザ光を発振するレーザ光源と、該レーザ光源からの極短パルスレーザ光を伝達する光ファイバ手段と、該光ファイバ手段により伝達された極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料から発せられた蛍光または反射光を測定する光学系を有する測定ヘッドとを備え、前記光ファイバ手段が、負の群速度分散を付与する第１の光ファイバと、異なる正の群速度分散を付与する複数の第２の光ファイバと、前記第１の光ファイバにより伝播されてきた極短パルスレーザ光を伝播させる第２の光ファイバを、前記レーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長に基づいて切り替えるファイバ切替手段とを備える多光子励起型測定装置を提供する。

この発明によれば、測定ヘッドがレーザ光源から分離され、光ファイバ手段によって接続されているので、測定ヘッドを小型化し、光ファイバ手段を構成する光ファイバを湾曲させて試料に対し任意の角度および位置に設定することが可能となる。これにより、試料の形態や観察対象部位に合わせて測定ヘッドを配置して測定を行うことができる。

レーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光は、レーザ光源内部に設けられたコリメータレンズや、測定ヘッド内の光学系を通過させられる間に正の群速度分散を付与されてパルス幅が伸びる。一方、光ファイバを通過させられることにより、負の群速度分散が付与されるので、他の光学系による群速度分散が補償されて、元々のレーザ光源から発せられたのと同等のパルス幅を有する極短パルスレーザ光として試料に照射される。これにより、十分なパワーを試料深部の所定位置に付与して、多光子励起現象を効率よく発生させ、試料の深部の鮮明な蛍光画像を取得することが可能となる。

この場合において、本発明によれば、光ファイバにより分散補償を行うので、特別に分散補償装置を設ける必要がないという利点がある。すなわち、分散補償を行うには、間隔をあけて配置される２つのプリズムを用いたプリチャーパのような大がかりな装置が必要となるが、本発明によれば、光源から測定ヘッドに極短パルスレーザ光を導く光ファイバ手段自体によって分散補償が行われるので、構成部品を増やすことなく、コンパクトに構成することができる。
また、この発明によれば、ファイバ切替手段の作動により、レーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長に基づいて第２の光ファイバが切り替えられる。すなわち、極短パルスレーザの波長に依存して、第１の光ファイバにおける負の群速度分散量が変化するので、第２の光ファイバを切り替えることで、その変化分を補って、装置全体として群速度分散をなくすことができる。

上記発明の参考例として、前記光ファイバが、フォトニッククリスタルファイバからなることが好ましい。フォトニッククリスタルファイバによれば、伝播する極短パルスレーザ光の波長に応じて、群速度分散量の異なる複数種類のものが用意されているので、使用する極短パルスレーザ光の波長に応じて、負の群速度分散を生ずるものを選択することができ、上記目的を簡易に達成できる。

また、上記発明の参考例として、前記レーザ光源が、出射する極短パルスレーザ光の波長を切り替え可能であり、前記光ファイバ手段が、群速度分散量の異なる複数の光ファイバと、前記レーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長に基づいて、該極短パルスレーザ光を伝播させる光ファイバを切り替えるファイバ切替手段とを備えることとしてもよい。

レーザ光源が出射する極短パルスレーザ光の波長を切り替えると、これに応じてファイバ切替手段を作動させ、当該波長の極短パルスレーザ光を伝播させる際に、光ファイバ以外の光学系により発生する正の群速度分散を補償し得る負の群速度分散を発生可能な光ファイバを選択することにより、パルス幅の圧縮された極短パルスレーザ光を試料に照射して、多光子励起現象を効率的に発生させることが可能となる。

また、この場合に、第２の光ファイバとして、長さの異なる同一種類の複数の光ファイバを用いることとしてもよい。光ファイバは、長さを異ならせることで群速度分散の量を異ならせることができるので、このようにすることで、簡易に上記目的を達成することができる。

本発明によれば、光ファイバによって群速度分散の補償を行うことで、装置を簡易かつコンパクトに構成することができ、効率的に多光子励起現象を発生させて鮮明な蛍光画像を得ることができるという効果を奏する。

以下、本発明の一実施形態に係る多光子励起型測定装置について、図１を参照して説明する。
本実施形態に係る多光子励起型測定装置１は、図１に示されるように、レーザ光源２と、測定ヘッド３と、これらレーザ光源２と測定ヘッド３とを接続する光ファイバ４とから構成されている。レーザ光源２は、例えば、パルス幅が約１００ｆｓｅｃ（フェムト秒）の近赤外極短パルスレーザ光を発振する光源、例えば、チタンサファイアレーザ光源である。

前記測定ヘッド３は、光ファイバ４によって伝達されてきた極短パルスレーザ光を平行光にするコリメータレンズ５と、該コリメータレンズ５からの平行光を反射するダイクロイックミラー６と、該ダイクロイックミラー６によって反射された光を２次元方向に走査させる光走査部７と、該光走査部７によって走査される光を中間像位置に結像させる瞳投影光学系８と、該瞳投影光学系８によって結像された中間像を試料Ａにおいて再結像させる結像光学系９および対物光学系１０と、試料Ａから発せられて、対物光学系１０、結像光学系９、瞳投影光学系８、光走査部７およびダイクロイックミラー６を介して戻る蛍光を検出する光電子増倍管（PMT:Photomultiplier
Tube）１１とを測定ヘッド本体１２内に収容している。図中、符号１４は、資料Ａを載置するベース、符号１５はベース１４から鉛直方向に延びる支柱、符号１６は支柱１５に沿って測定ヘッド３を上下動あるいは傾斜可能に支持するアームである。

前記測定ヘッド本体１２は、コネクタ１３によって、光ファイバ４の一端に着脱可能に接続されている。
前記光ファイバ４としては、例えば、フォトニッククリスタルファイバのように、内部を伝播させる極短パルスレーザ光が所定の波長のときに、群速度分散量がゼロとなり、それより大きい波長かそれより小さい波長かに依存して、符号が異なる群速度分散を発生するものが採用されている。

また、ここで用いられる光ファイバ４は、伝播する極短パルスレーザ光の波長とは異なる波長において群速度分散量がゼロとなるフォトニッククリスタルファイバが選択され、光ファイバ４自体では負の群速度分散を生じるようになっている。光ファイバ４により発生する負の群速度分散量は、他の光学系、例えば、レーザ光源２の出口に配置されているコリメータレンズ２ａや、前記測定ヘッド３における種々の光学系５，８，９，１０による正の群速度分散の総量と同等に設定されている。

このように構成された本実施形態に係る多光子励起型測定装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る多光子励起型測定装置１により、試料Ａ、例えば、実験小動物の皮下組織、あるいは、臓器表面下の組織等の観察対象部位の観察を行うには、レーザ光源２を作動させて極短パルスレーザ光を光ファイバ４によって測定ヘッド３に伝達させる。

光ファイバ４の端面から測定ヘッド３内に出射された極短パルスレーザ光は、コリメータレンズ５によって平行光とされた後にダイクロイックミラー６において反射され、光走査部７に入射される。そして、光走査部７において反射された極短パルスレーザ光は、瞳投影光学系８、結像光学系９および対物光学系１０によって、試料Ａに再結像され、試料Ａ内において多光子励起現象を発生させる。その結果、発生した蛍光が、対物光学系１０、結像光学系９、瞳投影光学系８、光走査部７を介して同一光路を戻り、ダイクロイックミラー６において反射されることなく透過して、光電子増倍管１１によって検出される。光走査部７を作動させることにより、試料Ａ内における再結像位置が２次元方向に走査され、光電子増倍管１１には２次元的な画像として検出されることになる。

この場合において、レーザ光源２内に含まれているコリメータレンズ２ａ等の光学系、測定ヘッド３内に収容されているコリメータレンズ５、瞳投影光学系８、結像光学系９および対物光学系１０においては各レンズを通過させられることにより、その媒質の波長に対する屈折率変化の非線形性によって正の群速度分散を生じさせられ、それによって、パルス幅が伸びることになる。これに対して、本実施形態に係る多光子励起型測定装置１においては、光ファイバ４が負の群速度分散を生じさせるように構成されているので、装置全体の正の群速度分散は光ファイバ４の負の群速度分散によって補償される。

その結果、対物光学系１０から試料Ａ内の観察対象部位に照射される時点で、極短パルスレーザ光は、レーザ光源２から発せられたのと同等の約１００ｆｓｅｃのパルス幅を有するレーザ光となっており、観察対象部位において、多光子励起現象を効率よく生じさせることができることになる。
この場合において、本実施形態に係る多光子励起型測定装置１によれば、レーザ光源２と測定ヘッド３とを接続する光ファイバ４によって装置全体の群速度分散を補償することができるので、特別な装置が不要である。また、大がかりなプリチャーパ等を採用する必要がないので、装置を簡易かつコンパクトに構成することができるという利点がある。

次に、本発明の第２の実施形態に係る多光子励起型測定装置２０について、図２を参照して説明する。
本実施形態の説明においては、上述した第１の実施形態に係る多光子励起型測定装置１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を簡略化する。

本実施形態に係る多光子励起型測定装置２０は、レーザ光源２１および光ファイバ手段２２において、第１の実施形態に係る多光子励起型測定装置１と相違している。
レーザ光源２１は、例えば、８００〜８８０ｎｍの波長帯域において出射する極短パルスレーザ光の波長を段階的に、例えば、ｎ段階に切替可能なレーザ光源である。
また、光ファイバ手段２２は、図２に示されるように、複数の、例えば、ｎ本の光ファイバ２２−１〜２２−ｎと、これらの光ファイバ２２−１〜２２−ｎの両端に配置された光スイッチ２３，２４とを備えている。

光ファイバ２２−１〜２２−ｎは、レーザ光源２１から段階的に発せられる極短パルスレーザ光の各波長に対応して設けられており、それぞれの波長の極短パルスレーザ光を伝播させたときに、該極短パルスレーザ光に付与する負の群速度分散量が同等となるように設定されている。すなわち、例えば、波長８００ｎｍの極短パルスレーザ光がレーザ光源２１から発せられる場合には、光ファイバ２２−１が、波長８８０ｎｍの極短パルスレーザ光がレーザ光源２１から発せられる場合には、光ファイバ２２−ｎが選択され、それぞれの光ファイバ２２−１〜２２−ｎ内を８００ｎｍ〜８８０ｎｍの極短パルスレーザ光が伝播させられたときに、同等の負の群速度分散を生ずるようになっている。また、この負の群速度分散量は、光ファイバ２２−１〜２２−ｎ以外の光学系により付与される正の群速度分散量と釣り合って、その総量が略ゼロとなるように設定されている。

前記光スイッチ２３，２４は、例えば、ガルバノミラー２３ａ，２４ａとこれを制御する制御装置２３ｂ，２４ｂのように制御装置２３ｂ，２４ｂからの指令信号に応じて、波長の異なる極短パルスレーザ光を異なる光ファイバ２２−１〜２２−ｎに入射させるようにガルバノミラー２３ａ，２４ａの角度を調節する構造のものでよい。また、これに代えて、音響光学偏向器（ＡＯＤ：Acoust-Optic
Deflector）とこれを制御する制御装置のように、レーザ光源２１から発せられる極短パルスレーザ光を波長に応じて異なる方向に出射する構造のものでもよい

このように構成された本実施形態に係る多光子励起型測定装置２０によれば、レーザ光源２１から異なる波長の極短パルスレーザ光を発すると、その波長情報が制御装置２３ｂ，２４ｂに送られ、制御装置２３ｂ，２４ｂが、光スイッチ２３，２４に、選択すべき光ファイバ２２−１〜２２−ｎを指示する。これにより、レーザ光源２１から出射された極短パルスレーザ光は、その波長に応じて選択された光ファイバ２２−１〜２２−ｎ内を伝播して測定ヘッド３に入射される。

各光ファイバ２２−１〜２２−ｎには異なる波長の極短パルスレーザ光が入射されるが、全ての光ファイバ２２−１〜２２−ｎにおいて付与される負の群速度分散量が同等となるように設定されているので、異なる波長の極短パルスレーザ光を試料Ａの観察対象部位に照射する場合においても、常に、群速度分散を補償して、効率的に多光子励起現象を発生させることができる。

なお、上記実施形態においては、光ファイバ２２−１〜２２−ｎによって常に負の群速度分散を生ずるように設定した例について説明したが、これに代えて、例えば、光ファイバ２２−１〜２２−ｎ以外の他の光学系６〜１０等における群速度分散を補償する補償部材が備えられている場合には、レーザ光源２１から発せられる極短パルスレーザ光の各波長に対して、光ファイバ２２−１〜２２−ｎ自体の群速度分散をゼロにするような光ファイバを選択することにしてもよい。

次に、本発明の第３の実施形態に係る多光子励起型測定装置３０について、図３を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明においては、上述した第２の実施形態に係る多光子励起型測定装置２０と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を簡略化する。

本実施形態に係る多光子励起型測定装置３０は、光ファイバ手段３１において、第２の実施形態に係る多光子励起型測定装置２０と相違している。
本実施形態における光ファイバ手段３１は、負の群速度分散を生ずる第１の光ファイバ３２と、正の群速度分散を生ずる第２の光ファイバ３３とを備えている。

第２の光ファイバ３３は、長さの異なる複数の光ファイバ３３−１〜３３−ｎにより構成されている。これらの光ファイバ３３−１〜３３−ｎは、いずれも長さのみ異なる同一の種類の光ファイバにより構成され、いずれも正の群速度分散を生ずるようになっている。
これらの第２の光ファイバ３３の両端には、光スイッチ３４，３５が配置されており、レーザ光源２１から発せられる極短パルスレーザ光の波長に応じて異なる光ファイバ３３−１〜３３−ｎが選択されるようになっている。図中、符号３６は、レーザ光源２１から波長情報を受けとって、光スイッチ３４，３５に切換信号を出力する制御装置である。

このように構成された本実施形態に係る多光子励起型測定装置３０によれば、第１の光ファイバ３２は負の群速度分散を生ずるが、レーザ光源２１から発せられる極短パルスレーザ光の波長に応じてその群速度分散量が変化するため、第２の光ファイバ３３を切り替えることで、その変化分を補償することができる。
具体的には、第１の光ファイバ３２が、該第１の光ファイバ３２を除く全ての光学系の正の群速度分散を補償する。したがって、第１の光ファイバ３２の負の群速度分散が小さくなった場合には、第２の光ファイバ３３を構成する光ファイバ３３−１〜３３−ｎを切り替えて、正の群速度分散を小さくし、負の群速度分散が大きくなった場合には、正の群速度分散を大きくするように第２の光ファイバ３３を構成する光ファイバ３３−１〜３３−ｎを切り替えて、全体として群速度分散を略ゼロにすることができる。

その結果、第２の実施形態に係る多光子励起型測定装置２０と同様に、ＧＦＰやＲＦＰなどの様々な蛍光タンパクの観察や、種々の蛍光色素の観察を簡単な波長の切替えで行うことができ、しかも、全ての波長による観察において、鮮明な蛍光画像を得ることができるという効果がある。

本発明の第１の実施形態に係る多光子励起型測定装置を模式的に示す全体構成図である。本発明の第２の実施形態に係る多光子励起型測定装置を模式的に示す全体構成図である。本発明の第３の実施形態に係る多光子励起型測定装置を模式的に示す全体構成図である。

符号の説明

Ａ試料
１，２０，３０多光子励起型測定装置
２，２１レーザ光源
３測定ヘッド
４，２２，３１光ファイバ手段
８瞳投影光学系（光学系）
９結像光学系（光学系）
１０対物光学系（光学系）
２２−１〜２２−ｎ，３３−１〜３３−ｎ光ファイバ
２３，２４，３４，３５スイッチ（ファイバ切替手段）
３２第１の光ファイバ
３３第２の光ファイバ

Claims

極短パルスレーザ光を発振するレーザ光源と、
該レーザ光源からの極短パルスレーザ光を伝達する光ファイバ手段と、
該光ファイバ手段により伝達された極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料から発せられた蛍光または反射光を測定する光学系を有する測定ヘッドとを備え、
前記光ファイバ手段が、負の群速度分散を付与する第１の光ファイバと、異なる正の群速度分散を付与する複数の第２の光ファイバと、前記第１の光ファイバにより伝播されてきた極短パルスレーザ光を伝播させる第２の光ファイバを、前記レーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長に基づいて切り替えるファイバ切替手段とを備える多光子励起型測定装置。
前記第２の光ファイバが、長さの異なる同一種類の複数の光ファイバからなる請求項１に記載の多光子励起型測定装置。