JP4845279B2

JP4845279B2 - 生体機能測定方法

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Publication number: JP4845279B2
Application number: JP2001077257A
Authority: JP
Inventors: レモン・タダシ・カド; 佑一田中; 陽介岸
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2021-02-09
Also published as: JP2002243641A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、通常の顕微鏡による観察方法を適用できない条件下、例えば観察対象が大きな動物の場合や動物が活動しているときの脳内情報を得ようとした場合において、極微小領域からの蛍光信号を得ることができ、極短パルスレーザ光による多光子励起を応用した生体機能測定装置並びにファイバープローブ光検出装置を開発したものであり、例えば近赤外極短パルスレーザ光源とファイバープローブとを用いたファイバープローブ光検出装置と、それを用いた生体機能測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
走査機能を有する顕微鏡ないしプローブにレーザ光をファイバーに通して導入して、画像を取得するスキャニング共焦点顕微鏡については特開平３−８７８０４号公報に開示されている。
【０００３】
また、極短パルスレーザと顕微鏡を組み合わせた多光子励起レーザ顕微鏡装置については特許２８４８９５２号公報に公開され、さらに極短パルスレーザとファイバーを用い、光学デバイスにレーザ光を導光して標本に照射する超短光パルスの伝達装置、発生装置および伝達方法に関しては特開平１０−１８６４２４号公報に公開されている。
【０００４】
図５は、特開平３−８７８０４号公報（第１の先行例）に開示されているスキャニング共焦点顕微鏡装置を示す図である。
【０００５】
レーザ光源５１からのレーザ光は、レンズ５２を介してファイバー５３に導入される。
【０００６】
レーザ光は、カプラ５４、ファイバー５５を介して、ハウジング５６の内部に設置された圧電素子５９上の保持具５７で保持される。
【０００７】
ファイバー５５から出射されたレーザ光は、レンズ６０ａ，６０ｂによって標本５８の焦点位置５８ａに集光する。
【０００８】
焦点位置５８ａからの反射光ないし蛍光は再びレンズ６０ａ，６０ｂ、ファイバー５５を通り、カプラ５４によってファイバー６１に入射する。
【０００９】
さらに、フィルター６２で波長を選択し、光電変換素子６３によって電気量に変換され、コンピュータ６４に入力される。
【００１０】
なお、コンピュータ６４はドライバ６５およびケーブル６７を介して圧電素子５９を制御する。
【００１１】
この圧電素子５９によってファイバー５５の先端が傾き、レーザのレンズ６０ａに対する入射角度を変え、標本５８内の焦点位置５８ａを光軸垂直方向に変えることができる。
【００１２】
このようにファイバー５５先端を走査して得られた蛍光量をコンピュータ６４によって画像構築し、モニター６６で表示することができることが記載されている。
【００１３】
図６は、特開平１０−１８６４２４号公報（第２の先行例）に開示されている超短光パルスの伝送装置を示す図である。
【００１４】
レーザ光源１は極短パルスレーザである。
【００１５】
レーザ光源１とファイバー３との間にはパルスストレッチャー光学系２が設置されている。
【００１６】
ファイバー３を通過したレーザ光はパルスコンプレッサー光学系４を通り、光学デバイス５に入射される。
【００１７】
この先行例の作用について説明する。
【００１８】
レーザ光源１から発せられた極短パルスレーザ光はパルスストレッチャー光学系２に入射される。
【００１９】
パルスストレッチャー光学系２では光源から発せられたレーザ光のパルス幅を伸ばし、１パルスあたりのピークパワーを減少させる。
【００２０】
パルスレーザ光は、数ナノメートル程度の波長幅を有している。
【００２１】
ファイバーなどの媒質を透過する際に長波長側の波長成分の光が先に進むため、入射されるレーザ光の波長に対してその波長の短い方を早く出力し、長い方を遅く出力するように入射するレーザ光を分光し波長に対応して光路長を調整できるよう、たとえばプリズムやグレーティングなどの分光光学素子を使用している。
【００２２】
パルスストレッチャー光学系２を通ったレーザ光は、短波長側を早く、長波長側を遅くファイバー３に入射する。
【００２３】
ファイバー３を透過中に長波長側が早く進むのでパルス幅は入射時よりも短くなり、ファイバー３から出射される。
【００２４】
パルス長が短くなったレーザ光は、さらにパルスコンプレッサー光学系４に導入され、パルス幅が圧縮される。
【００２５】
ただし、パルスコンプレッサー光学系４からは短波長側が若干早い極短パルスのレーザ光が出射される。
【００２６】
そして、さらに光学デバイス５に入射されて、標本までの間にリレー光学系、対物レンズ（図示せず）などの光学系を透過する間にさらに短波長側の光が遅れるため結果的に標本面において元々のレーザ光のもつパルス幅に近いパルス幅でレーザ光を標本に照射することができる。
【００２７】
ここで、光学デバイス５は走査型顕微鏡を想定しており、通常の顕微鏡にレーザ光を走査する偏向光学系が配備され、標本上にレーザ光を走査させて画像を取得するものである。
【００２８】
元々のレーザ光の持つパルス幅に近いパルス幅で標本を照射すれば、標本面での多光子励起現象を効率よく起こすことができ、標本画像を効率よく取得することができる。
【００２９】
【発明が解決しようとする課題】
第１の先行例においては、レーザ光源に可視波長域の連続レーザ光を用いているため、ＩＲ極短パルスレーザに比べて標本表面より深度の深い位置の励起ができず、その位置の蛍光を検出することができない。
【００３０】
また、第１の先行例の場合、標本が歯であり、上下の歯で挟み込んでプローブを固定するというもので、固定方法としては非常に不安定なものであり、信号や画像を取得するには実用的ではないという問題点があった。
【００３１】
また、第２の先行例では、極短パルスレーザ光をファイバーで顕微鏡に導入し、標本面で多光子励起現象の発生確率を上昇させればＳ／Ｎのよい標本画像を取得することは可能である。
【００３２】
ただし、この第２の先行例においては、光学デバイスとして顕微鏡を例に挙げており、顕微鏡における標本としては通常微小な標本、例えば切片標本や培養標本或いは顕微鏡下に設置できる小動物、例えばマウスなどを観察するものである。
【００３３】
しかしながら、比較的大きな動物の観察を考えたとき、通常の市販されている顕微鏡下で観察することは困難である。
【００３４】
また、小動物を観察する場合でも顕微鏡下に設置できるよう麻酔等をかけて特別に誂えたステージに固定していた。
【００３５】
麻酔をかけた状態での計測では、動物が本来活動しているときの、例えば脳内の情報を得ることと異なる可能性があるという問題点があった。
【００３６】
さらに、レーザ光源と標本の設置場所の制限や該標本の大きさによりファイバーの長さを種々変えることもあるが、この第２の先行例ではこれらについて考慮されてなく実用上の制約があるという問題があった。
【００３７】
さらに、脳の内部や種々の被検物からの蛍光等を効果的に検出することができるような光検出器と、それを用いた生体機能測定装置の出現が強く望まれていた。
【００３８】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、通常の顕微鏡による観察方法を適用できない条件下、例えば動物が活動している状態で安定した観察が可能な生体機能測定装置を提供することを目的とする。
【００３９】
したがって、上記目的を達成するために、第１の観点によれば、多光子励起を起こさせる極短パルスレーザ光を出射し、シングルモード光ファイバを用いて前記極短パルスレーザー光を標本に接触するように固定されたプローブアセンブリに伝送し、前記プローブアセンブリの光学系により、前記伝送された極短パルスレーザ光を前記標本に対して集光し、前記極短パルスレーザー光の照射に基づく多光子励起により生じた標本からの前記蛍光を前記プローブアセンブリと前記シングルモード光ファイバを介して光検出器に伝送し、前記光検出器により前記蛍光を測定することにより前記標本の脳内情報を取得し、前記プローブアセンブリの光学系は、前記標本の表面から１０００μmまでの距離から発せられる蛍光を測定可能な焦点距離を有することを特徴とする動き回る動物（人を除く）の観察に用いる生体機能測定装置における生体機能測定方法、である。
【００４０】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器を示す図である。
【００４１】
本発明は、通常の顕微鏡による観察方法を適用できない条件下、例えば観察対象が大きな動物であるために通常の顕微鏡下では観察できない場合や、動物が活動しているときの脳内情報を麻酔を使用せずに通常の顕微鏡で得ようとした場合等においても、極微小領域からの蛍光信号を得ることができる、極短パルスレーザ光による多光子励起を応用して開発した生体機能測定装置である。
【００４２】
以下に、図面を用いて本発明の実施の形態を説明する。
【００４３】
同図において、レーザ光源１１は近赤外極短パルスで発振するレーザ光源である。
【００４４】
レーザ光源１１から出射したレーザ光の光路上には、ミラー１０ａが配置されており、また、ミラー１０ａにて反射したレーザ光の光路上にはミラー１０ｂが配置されている。
【００４５】
ミラー１０ｂにて反射したレーザ光の光路上にはパルスストレッチャー１２が設けられている。
【００４６】
パルスストレッチャー１２は、レーザ光源１１から発せられたレーザ光のパルス幅を伸ばし、１パルスあたりのピークパワーを減少させる。
【００４７】
また、パルスストレッチャー１２においては、入射されるレーザ光の波長に対してその波長の短い方を早く出力し、長い方を遅く出力するように、入射するレーザ光を分光し波長に対応して光路を調整できるようプリズムやグレーティングなどの分光光学素子を使用している。
【００４８】
パルスストレッチャー１２から出射したパルス幅が伸ばされたレーザ光の光路上には、ミラー１０ｃの反射光路上には、光分岐部が配置されている。
【００４９】
この光分岐部は、ダイクロイックフィルターを用いた光学システムやダイクロイックミラー等からなり、本実施の形態で使用しているダイクロイックミラー１３は、ロングパスの特性を有し、パルスストレッチャー１２からのレーザ光（励起光）を透過させるとともに、標本からの反射光・蛍光を反射するものである。
【００５０】
ダイクロイックミラー１３を透過したパルスストレッチャー１２によってパルス幅が伸ばされたレーザ光の光路上には、当該レーザ光を光ファイバー（以下、ファイバーと称する。）１５の一端面に集光するための集光レンズ１４が設けられている。
【００５１】
また、ファイバー１５の他端は、後述するプローブアセンブリ１７ａのファイバー接合部に接続されており、ファイバー１５の他端には、標本１８内の集光位置１８ａにファイバー１５を通過してきたレーザ光を集光すると共に、焦点位置１８ａから発せられた検出光である蛍光をファイバー１５の他端面に集光する集光光学系１６が設けられている。
【００５２】
この集光光学系１６は、金属製保護ハウジングとファイバー接合部とを有したプローブアセンブリ１７ａ内において摺動可能に設けられている。
【００５３】
プローブアセンブリ１７ａには、アタッチメントとして極小の保持部、例えば、標本である小動物の頭などに直接接触するようなネジ穴を有するフランジ部分１７ｂが設けられており、該フランジ部分１７ｂを標本に接触させてネジなどによって機械的に固定される。
【００５４】
一方、ファイバー１５から出射し、ダイクロイックミラー１３によって反射される標本１８からの検出光（反射光・蛍光）の光路上には、励起光をカットするためのフィルター１９、及びこのフィルター１９を通過した検出光を光ファイバー（以下、ファイバーと称する。）２１の一端面に集光するための集光レンズ２０が設けられている。
【００５５】
ファイバー２１の他端面には、ファイバー２１を通過した検出光を平行光にするためのレンズ２２が設けられており、このレンズ２２によって平行光にされた検出光は、検出・測定系２６に導かれる。
【００５６】
検出・測定系２６に導かれた検出光の光路系には、反射光等をカットして測光波長のみを選択するための測光フィルター２４ａが設けられている。
【００５７】
測光フィルター２４ａを通過した検出光の光路上には検出光を測光するための光電変換素子２５ａが設けられている。
【００５８】
なお、標本１８から発せられる蛍光が、２波長同時測光でレシオを計算するものであるときには、ダイクロイックミラー２３を光路中に設けて波長を分離する。
【００５９】
ダイクロイックミラー２３で反射された検出光は、該検出光の光路上に設けた測光フィルター２４ｂによって波長を選択し、光電変換素子２５ｂによって検出光を測光する。
【００６０】
これらの光電変換素子２５ａ，２５ｂには、当該光電変換素子２５ａ，２５ｂからのデータを蓄積し処理するための不図示のコンピュータが接続されている。
【００６１】
次に、本実施の形態に係る生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器の動作を説明する。
【００６２】
レーザ光源１１から発せられたレーザ光はミラー１０ａ，１０ｂを介して、パルスストレッチャー１２に入射される。
【００６３】
パルスストレッチャー１２はレーザ光源１１から発せられたレーザ光のパルス幅を伸ばし、１パルスあたりのピークパワーを減少させる。
【００６４】
また、パルスストレッチャー１２においては、入射されるレーザ光の波長に対してその波長の短い方を早く出力し、長い方を遅く出力するように、入射するレーザ光を分光し波長に対応して光路長が調整される。
【００６５】
パルスストレッチャー１２を出力したレーザ光はダイクロイックミラー１３を透過し、集光レンズ１４によってファイバー１５の端面に集光され、入射される。
【００６６】
ファイバー１５を通過し、集光光学系１６を備えたプローブアセンブリ１７ａから出射したレーザ光はファイバー１５を通過中に長波長側が早く進むのでパルス幅は入射時よりも短くなって出射される。
【００６７】
ファイバー１５から出射したレーザ光は集光光学系１６を備えたプローブアセンブリ１７ａにより標本１８内の焦点位置１８ａで集光し、２光子吸収現象により焦点位置１８ａを励起する。
【００６８】
集光光学系１６を備えたプローブアセンブリ１７ａは例えば小動物の頭部等に固定できるフランジ部分１７ｂに対して摺動可能なように固定されている。
【００６９】
本実施の形態の生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器においては、フランジ部分１７ｂ内に集光光学系１６を備えたプローブアセンブリ１７ａを摺動可能に設けていることから、標本１８の深さ方向に焦点を変えることができるので、深度の情報を得ることができる。
【００７０】
焦点位置１８ａから発せられた蛍光は再び集光光学系１６によりファイバー１５端面に集光され、ファイバー１５を通過してダイクロイックミラー１３まで戻り、ダイクロイックミラー１３により反射され、フィルター１９によってレーザ光（励起光）がカットされ、集光レンズ２０によってファイバー２１の端面に集光される。
【００７１】
ファイバー２１を通過した検出光はその端面より出射し、レンズ２２によって平行光にされ、検出・測定系２６に導かれる。
【００７２】
検出・測定系２６に導かれた平行光は、測光フィルター２４ａによって測光波長が選択され、光電変換素子２５ａによって検出光が測光される。
【００７３】
なお、２波長同時測光する場合であって、ダイクロイックミラー２３、測光フィルター２４ｂ及び光電変換素子２５ｂを配置した場合には、レンズ２２によって平行光とされた検出光のうち、特定の波長の検出光はダイクロイックミラー２３によって反射されると共に、他の特定の波長の検出光はダイクロイックミラー２３を透過する。
【００７４】
そして、ダイクロイックミラー２３を透過した検出光は、上述のように、測光フィルター２４ａによって測光波長が選択され、光電変換素子２５ａによって検出光が測光される。
【００７５】
一方、ダイクロイックミラー２３によって反射された検出光は、測光フィルター２４ｂによって測光波長が選択され、光電変換素子２５ｂによって検出光が測光される。
【００７６】
なお、本実施の形態においては、フランジ部分１７ｂ内において集光光学系１６を備えたプローブアセンブリ１７ａを光軸と直角方向に走査する走査装置もしくは集光光学系１６から出射する光を光軸と直角方向に偏向する光学系（図示せず）を用いることによって標本の２次元画像を得るようにすることも可能である。
【００７７】
したがって、本実施の形態の生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器によれば、近赤外極短パルスを使用する生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器において、光学系を標本に固定することができる保持部とファイバー５とを有しているので、比較的大きな動物の観察を容易にすることができる。
【００７８】
また、上述した保持部にＸＹ調整用のマイクロメーターとＺ調整用のマイクロメーターを設けることにより、３次元画像を取得できる３次元方向に調整可能なシステムを構成することもできる。
【００７９】
なお、３次元方向に調整可能なシステムは、ＸＹ調整用のマイクロメーターがＸＹ平面で±１００μｍを調整可能であり、Ｚ調整用のマイクロメーターがＺ軸方向で２μｍの分解能をもつことが好ましい。
【００８０】
また、上述した保持部に設けられる調整手段は、プローブアセンブリの小さな振動やファイバーの伸展に対しても安定であることが望まれる。
【００８１】
なお、調整手段自体の寸法としては、底面部で７×７ｍｍ、高さ１５ｍｍ以下であることが好ましく、該底面部は標本（接触対象物）に対してネジ穴のついたフランジ部分で固定される。
【００８２】
図２は、上述したファイバープローブ光検出器の集光光学系７００の一例を示す図である。
【００８３】
図２（ａ）は、上記集光光学系を通ったレーザ光の光路と集光位置について示した図であり、図２（ｂ）は、上記集光光学系内のプリズム８１について説明する図である。
【００８４】
図２に示す集光光学系７００は、ファイバー１５の先端部１５ａより出射されるレーザ光を略平行光にするレンズ８０と、該レンズ８０からのレーザ光の光路を光軸と直交する方向（図２（ａ）中のＸＹ方向）に任意に変更（偏向）することができる光路変更手段、ここではプリズム８１と、該プリズム８１を通過したレーザ光を標本１８に集光するためのレンズ８２とから構成される。
【００８５】
さらに、レンズ８０は、標本１８に対してレンズ８２の集光位置が光軸方向に任意に変更するように、ファイバー１５からプリズム８１の間で光軸方向（図２（ａ）中のＺ方向）に移動、例えば第１のレンズ位置８０ａと第２のレンズ位置８０ｂとに移動できる構成となっているものとする。
【００８６】
なお、レンズ８０を光軸方向に移動させるレンズ移動機構としては、例えば手動による機械的制御手段や、ステッピングモータ、圧電素子等を用いた電気的制御手段によって実現することができる。
【００８７】
また、光軸方向での焦点位置の制御であれば、レンズ８０の移動に限られるものではなく、例えばレンズ８２を光軸方向に移動させるようにしてもよい。
【００８８】
次いで、図２（ａ）に示すプリズム８１の構成の一例について図２（ｂ）を参照して以下に説明する。
【００８９】
プリズム８１は、ガラス部材のような透過性を有する二枚の平行平面板、ここでは入射面８１ｄを有する平行平面板７３と、出射面８１ｂ（８１ａ，８１ｃ）を有する平行平面板７４と、該平行平面板７３，７４間にそれぞれの平行平面板７３，７４が、例えば共に平行となるように設けられ、内部にシリコンオイルのような液体７６を封入した状態で弾性変形可能なシリコンゴム７５と、平行平面板７３，７４間に少なくとも三個所設けられ、平行平面板７４を揺動させるように構成された少なくとも三つの圧電素子７７とから構成される。
【００９０】
なお、上記圧電素子７７には、不図示の制御部が設けられており、該制御部の制御によってプリズム８１を通過するレーザ光の光路を光軸方向に対して直交する方向に任意に変更（偏向）させることができるものとする。
【００９１】
以下に、上述した集光光学系７００のレンズ８０とプリズム８１の動作について説明する。
【００９２】
ここでは、図２（ａ）に示すレンズ８０のレンズ移動機構を例えばステッピングモータや圧電素子等の電気的制御手段で制御する例で説明する。
【００９３】
先ず、レンズ移動機構は、レンズ８０をレーザ光の光軸方向において前後に位置を移動させ、図２（ａ）に示す第１のレンズ位置８０ａにレンズ８０を位置決めする。
【００９４】
なお、図２（ａ）では、レンズ８０が第１のレンズ位置８０ａと第２のレンズ位置８０ｂをが重ねて図示されているものとする。
【００９５】
次いで、プリズム８１は、封入されたシリコンオイル７６を介在した平行平面板７３、７４で構成されており、圧電素子７７を制御することによって平行平面板７３の入射面８１ｄに対して平行平面板７４の出射面を、平行平面板７３に対して平行平面板７４が平行となっている場合の出射面８１ｂや、平行平面板７３に対して平行平面板７４が傾斜している場合の出射面８１ａ（又は８１ｃ）とすることができ、入射面８１ｄより入射したレーザ光の傾きを変えることができるようになっている。
【００９６】
図２（ｂ）は、上述した状態の一例を示しており、プリズム８１の圧電素子７７を矢印８１ｅで示す方向へ制御し、出射面８１ｂを出射面８１ｃのように制御することで、入射面８１ｄに垂直に入射したレーザ光の光軸９０を出射面８１ｃで曲げて光軸９１のようなレーザ光を出射させる。
【００９７】
次に、上述した構成からなる集光光学系７００の具体的な動作について説明する。
【００９８】
レンズ８０が第１のレンズ位置８０ａにあるとき、レーザ光の光路７０ａ，７０ｂはレンズ８０を通り、光路７１ａ，７１ｂのように進行し、出射面が符号８１ｂで示したようになっているプリズム８１を通り、点線で示す光路７１ｃ，７１ｄのように進行し、レンズ８２で集光されて点線で示す光路７１ｅ，７１ｆから光路７１ｇ，７１ｈのように進行して、標本１８の焦点位置８５に集光される。
【００９９】
また、レンズ８０が第２のレンズ位置８０ｂにあるとき、レーザ光の光路７０ａ，７０ｂはレンズ８０を通り、光路７２ａ，７２ｂのように進行し、出射面が符号８１ｂで示したようになっているプリズム８１を通り、光路７２ｃ，７２ｄのように進行し、レンズ８２で集光されて光路７２ｅ，７２ｆから光路７２ｇ，７２ｈのように進行して、標本１８の焦点位置８６に集光される。
【０１００】
このように、図２（ａ）に示す集光光学系７００においては、レンズ８０の位置をレーザ光の進行方向（光軸方向）に移動制御することにより、標本１８内における焦点位置をレーザ光の進行方向（光軸方向）に移動させることができる。
【０１０１】
次に、標本１８内における焦点位置をレーザ光の進行方向（光軸方向）に直交する方向に移動させることについて説明する。
【０１０２】
図２（ａ）において、レンズ８０が第２のレンズ位置８０ｂにあるとき、プリズム８１の出射面を符号８１ａで示したような傾きの面にすることにより、レンズ８０を通り進行してきたレーザ光の光路７２ａ，７２ｂは、プリズム８１を通り、光路７２ｃ’，７２ｄ’のように進行し、レンズ８２で集光されて光路７２ｅ’，７２ｆ’から光路７２ｇ’，７２ｈ’のように進行して、標本１８の焦点位置８７に集光される。
【０１０３】
図２（ａ）において、レンズ８０が第２のレンズ位置８０ｂにあるとき、プリズム８１の出射面が符号８１ｃで示したような傾きの面にすることにより、レンズ８０を通り進行してきたレーザ光の光路７２ａ，７２ｂは、出射面が符号８１ｃで示したようになっているプリズム８１を通り、光路７２ｃ’’，７２ｄ’’のように進行し、レンズ８２で集光されて光路７２ｅ’’，７２ｆ’’から光路７２ｇ’’，７２ｈ’’のように進行して、標本１８の焦点位置８８に集光される。
【０１０４】
即ち、プリズム８１の出射面の光路に対する傾きを符号８１ａ，８１ｂ，８１ｃで示した面のように変えることにより、標本１８における焦点位置を、それぞれ、符号８７，８６，８８で示すように、レーザ光の進行方向（光軸方向）に直交する方向に移動させることができる。
【０１０５】
このように、図２（ａ）に示す集光光学系７００においては、プリズム８１の出射面を変えてレーザ光の進行方向（光軸方向）を変えることにより、標本１８における焦点位置をレーザ光の進行方向（光軸方向）に直交する方向に移動させることができる。
【０１０６】
次に、図３を用いて第１の実施の形態に係る生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器のパルスストレッチャーについて説明する。
【０１０７】
同図において、入射光１０１はレーザ光源１１から発せられた近赤外極短パルスのレーザ光である。
【０１０８】
パルスストレッチャー１４０の内部は、４つのプリズム１４２，１４４，１４６，１４８をそれぞれ所定の位置に配置して構成され、パルスストレッチャー１２に入射した入射光１０１を、パルスストレッチャー１４０から逆分散光となった出射光１２０としてファイバー側へ入射させる。
【０１０９】
ここでは、第１と第２のプリズム１４２，１４４からなるプリズムペア１５０について説明する。
【０１１０】
該プリズムペア１５０を構成する第１と第２のプリズム１４２，１４４は、第１のプリズムの面１と第２のプリズムの面４、第１のプリズムの面２と第２のプリズムの面３が平行となるように配置しておくことで、第２のプリズムを出射するレーザ光を波長によらず入射したレーザ光と平行にすることができる。
【０１１１】
ここで、プリズムペア１５０を構成する第１のプリズム１４２に入射したレーザ光１０１は、第１と第２のプリズム１４２，１４４によって短波長成分Ｓほど大きく屈折させられるため第２のプリズム１４４中の光路長が短くなる。
【０１１２】
逆に、レーザ光１０１の長波長成分Ｌは、第２のプリズム１４４中の光路長が長くなるため、短波長成分Ｓの方が早く第２のプリズム１４４中から射出し、逆分散が与えられる。
【０１１３】
第２のプリズム１４４を出射したレーザ光は、波長によりずれている。
【０１１４】
長波長成分Ｌと短波長成分Ｓの光路が一致していないが、第１と第２のプリズム１４２，１４４から構成されるプリズムペア１５０と同様の第３と第４のプリズム１４６，１４８から構成されるプリズムペア１５２を左右対称に配置するように構成することで、レーザ光が合成された後、不図示のファイバーに入射するように構成される。
【０１１５】
ここで述べたパルスストレッチャー１４０は、第２のプリズム１４４と第３のプリズム１４６とが矢印方向に位置が移動できるように構成されている。
【０１１６】
このように第２と第３のプリズム１４４，１４６の位置を移動できるように構成することによってレーザ光の各波長成分の光路長差を変化させることができる。
【０１１７】
したがって、上述したパルスストレッチャー１４０によれば、ファイバーの長さを変えたり、レーザ光の波長を変えてもアライメント全体をやり直す必要がなく第２と第３のプリズム１４４，１４６の位置調整でそのファイバー長と波長に対応することができる。
【０１１８】
すなわち、図１に示すように近赤外極短パルスレーザ光を発振するレーザ光源１１からのレーザ光をミラー１０ａ，１０ｂにて図３に示すようなパルスストレッチャー１４０に入射光１０１として入力し、上記パルスストレッチャー１４０の４つのプリズム１４２，１４４，１４６，１４８を通る光路に対するプリズムの位置調整を、入射光１０１の条件と前記シングルモードファイバー１５の条件に対応して決めて標本１８を観察することで元々のレーザ光の持つパルス幅に近いパルス幅で標本１８を照射することができ、標本面での多光子励起現象を効率よく起こすことができ、標本画像を効率よく取得することができる。
【０１１９】
なお、パルスストレッチャー１４０の構成は、上述したようなプリズムの組み合わせに限定されるものではなく、例えば回折格子の組み合わせ、或いはプリズムと回折格子との組み合わせ、さらにはミラーとの組み合わせであってもよい。
【０１２０】
図４は、第１の実施の形態の生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器において使用される集光光学系１６を備えたプローブアセンブリ１７ａを示す図である。
【０１２１】
ファイバー１５端面から出射される光は、プローブアセンブリ１７ａ内のレンズ３１ａで平行光にされ、レンズ３１ｂで標本１８内の集光位置１８ａに集光する。
【０１２２】
集光位置１８ａからの反射光乃至蛍光は、再びレンズ３１ｂ及びレンズ３１ｂによってファイバー１５端面に入射される。
【０１２３】
フランジ部分１７ｂは、調整環１７ｃとネジ締結されており、またスプリング１７ｄによってレンズ３１ａ，３１ｂと共にプローブアセンブリ１７ａを調整環１７ａ側に常に付勢している。
【０１２４】
調整環１７ｃを回転させることによってレンズ３１ａ，３１ｂと共にプローブアセンブリ１７ｃを標本１８に対して光軸方向に移動させることができる。
【０１２５】
すなわち標本１８内の焦点位置１８ａを光軸方向に移動させることができる。
【０１２６】
また、フランジ部分１７ｂは、頭蓋骨１８ｂにネジで固定されているため、測定中に焦点位置１８ａが変わることはない。
【０１２７】
したがって、本実施の形態によれば、近赤外極短パルスで発振するレーザ光源と、該レーザ光源からの光束をファイバーに入射させる光学系と、該ファイバーの先端から出射するレーザ光を標本に集光し照射する光学系と、該光学系を該標本に固定する手段と、該標本から発する反射光乃至蛍光を該光学系で集光し、該反射光乃至は蛍光を検出する光検出器と、該レーザ光源と該ファイバーとの間に光路に対する角度と位置のいずれか一方又は双方を変えることができる機構を有するプリズム又はグレーティングを有するパルスストレッチャーと、を備えたことにより、元々のレーザ光の持つパルス幅に近いパルス幅で標本を照射することができ、標本面での多光子励起現象を効率よく起こすことができ、標本画像を効率よく取得することができる。
【０１２８】
また、動物が本来活動しているときの例えば脳内の情報を得ることができる。
【０１２９】
また、本発明は上述した動物の脳内の測定のみに限られるものではなく、例えば、均一な或いは不均一な懸濁液、プラーク、固体、生体組織の極微な測定にも適用することができる。
【０１３０】
また、上述した実施の形態で使用するシングルモードファイバーに関しては、レーザ光源側との連結端には適切な標準コネクターが設けられていると共に、使用されるファイバーは長さが５ｍ以上であり、湾曲により瞬間的なモードシフトを生じない耐性を備えていることが望ましい。
【０１３１】
また、プローブアセンブリは、直径３ｍｍ、長さ１０ｍｍを超えない保護用のステンレススチールハウジングと、レーザ光源からのレーザ光をその表面から少なくとも１ｍｍの距離に集光できるレンズと、を備えていることが望ましい。
【０１３２】
さらに、光ファイバーを４ｋｇの張力に耐え得る十分な強度で固定すると共に、水、溶剤、機械的な衝撃に対する耐性を持たせ、重量は１ｇを超えないようにすることが望ましい。
【０１３３】
なお、プローブアセンブリはターミナルアセンブリであってもよい。
【０１３４】
また、本発明の生体機能測定装置は、標本として動物の頭蓋骨の切開した部位にネジ固定されたプローブアセンブリと、大脳皮質の異なる部分に対して斜めに探査可能な調整能力をもつ調整部と、表面から１０００μｍまでの距離の脳組織から発せられる蛍光の測定が可能な焦点距離の集光レンズと、動物が前記プローブアセンブリを固定した状態で半径５ｍまで動くことを可能にする長さの前記光ファイバーと、で構成されていることが望ましく、検出された蛍光に基づいて生体機能測定装置を生体組織として自由に動き回る動物の脳の研究に適用することで、神経組織の中での存在が知られている様々な化学物質の有無及びその濃度の分析を可能にしたり、まだ定量的に明らかにされていない化学物質を特定するのにも役立たせることもできる。
【０１３５】
また、本発明の生体機能測定装置は、上述した実施の形態のような測定に限られるものではなく、得られた結果は予期された応用が実現可能なものであり、例えばレーザ光源からのレーザ光の強度を細胞でもダメージを回避できるくらい小さくすることで、バクテリアのコロニーの中で検査される細胞であっても、１μｍ程度の部位から集められる蛍光を基に分子の存在を確認したり、脳の中やセロトニンや特定の脳細胞で緑色の蛍光を発するＧＦＰのような分子を検出することにも適用できる。
【０１３６】
なお、レーザ光源からのレーザ光の強度をバクテリアのコロニーの中で検査される細胞でもダメージを回避できるくらい小さくし、１μｍ程度の部位から集められる蛍光を基に分子の存在を確認したり、脳の中やセロトニンや特定の脳細胞で緑色の蛍光を発するＧＦＰのような分子を検出することが可能である。
【０１３７】
上述した集光光学系７００は、上記例に限られるものではなく、少なくともファイバーの先端部から出射されるレーザ光の光路に集光手段と光路変更手段とが配置されており、ファイバーから出射されるレーザ光の焦点位置が調整することができるものであれば、種々変更可能である。
【０１３８】
図２に示した集光光学系７００は、あくまでも一例に過ぎないが、少なくとも二つの集光手段としての凸レンズと、該凸レンズの間に配置され、レーザ光の光軸を曲げることができる光路変更手段とを具えていることが望まれる。
【０１３９】
そして、上述した動作を実現できる手段を適宜組み合わせ、レンズの位置制御と光路変更手段によるレーザ光の光軸を曲げる制御とを行うことによって、ファイバーから出射されるレーザ光の焦点位置を三次元方向に適宜調整することができる。
【０１４０】
また、上述のプローブアセンブリ１７ａは、ステンレス、金、セラミックのような機械的保護が可能で、防錆性能があるものであれば、その素材の有無は問わない。
【０１４１】
なお、上述した集光手段と光路変更手段は、レンズやプリズムに限定されるものではなく、種々のものを使用することができ、例えば用途によっては光路変更手段として、前記プリズムに反射板のような焦点位置の調整を直接司るもの以外の光路変更手段を付加するようにしたり、透過性を有するプリズムを用いないで反射性を有する部材で光路変更を行うようにしてもよい。
【０１４２】
また、上述した集光光学系は、その構成からファイバーの先端部にチップのように組み込むことができるので、特にファイバーの外径に対して非常に大きなホルダを用意する必要がなくなる。
【０１４３】
これは、本発明の生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器を使用する場合に非常に有効であり、例えば生体内部に集光光学系部分を挿入するなどにより、所望の部分の生体内情報を得ることが望めるだけでなく、測定の信頼性が高く、その実用用途が広く、光検出装置並びにそれを用いた顕微鏡の分野の発展に寄与するところが極めて大きいものである。
【０１４４】
前記集光手段と光路変更手段の配置条件の調整は、電気的調整手段や液圧調整手段、或いは光学的調整手段等を用いることができ、前記集光手段と光路変更手段の配置条件の調整手段の少なくとも一部は、前記ファイバーの先端部、集光手段、光路変更手段の近傍に配置される。
【０１４５】
さらに、上述した調整手段は、前記ファイバーの先端部や集光手段、光路変更手段等と共に、同一のハウジング内に組み込まれて一体化していることが望ましく、このように前記ファイバーの先端部や集光手段、光路変更手段等と共に、同一のハウジング内に組み込んだ配置条件調整手段の少なくとも一部に調整情報を送信するための送信路を前記ファイバーと一体に組み込むようにすることによって、本発明の用途を大幅に拡大させることが期待できる。
【０１４６】
また、前記調整手段の調整情報には、電気的情報、液圧制御を行うための情報、光学的情報等多くの形態の情報を用いることができる。
【０１４７】
また、上述した集光光学系は、生体機能測定装置への適用のみに限定されるものではなく、本発明の光検出装置並びにそれを用いた生体機能測定装置に用いることにより得られる効果を大きく増大させ、生体機能測定装置の性能を大きく向上させることができるものである。
【０１４８】
また、上述した集光光学系を用いたファイバープローブ光検出器及びその光検出器を用いた生体機能測定装置において、レーザ光源から発振される極短パルスのレーザ光（励起光）をシングルモードファイバーを用いて標本等に導き、標本からの反射光や蛍光を励起光と同一のシングルモードファイバーを用いて光検出手段へ導く構成に、さらに、前記レーザ光源と前記シングルモードファイバーとの間で、極短パルスのレーザ光を前記シングルモードファイバーを伝送されるときに受ける群速度遅延とは逆の群速度遅延をレーザ光に生じさせるパルスストレッチャーを配置して各装置を構成することにより、二光子吸収の如き多光子吸収による蛍光の測定を効果的に行うことができる。
【０１４９】
付記
下記は、出願当初の請求項９乃至請求項１４を削除したことに伴ない、当該請求項９乃至請求項１４に対応する記載を補正により追加したものである。
本実施の形態の第１の観点では、近赤外極短パルスのレーザ光を発するレーザ光源と、保護ハウジングとファイバー結合部とからなるプローブアセンブリと、前記レーザ光源と前記プローブアセンブリのファイバー結合部とを結合する光ファイバーと、前記プローブアセンブリ内の集光レンズと、前記プローブアセンブリを標本に対して機械的に保持する保持部と、前記保持部に設けられた前記プローブアセンブリ及び焦点位置の少なくとも１つを３次元方向に調整可能な調整部と、前記レーザ光源からのレーザ光と前記標本からの光を分離する光分岐部とを備えたことを特徴とする生体機能測定装置、である。
第２の観点では、第１の観点において、前記光分岐部は、ダイクロイックフィルター又はダイクロイックミラーを用いた光学システムであり、前記生体機能測定装置は、前記標本からの光を検出する光検出装置と、前記光検出装置からのデータを蓄積・処理するコンピュータと、前記光学システムで分離された前記標本からの光を前記光検出測定装置に導く第２の光ファイバーと、をさらに備えており、前記光学システムにより前記レーザ光源からのレーザ光と前記標本からの光とを分離し、分離された前記標本からの光を前記第２の光ファイバーを通して前記光検出測定装置に導く。
第３の観点では、第１又は第２の観点において、前記保持部は、ＸＹ平面で±１００μｍ範囲内で焦点位置を調整できるＸＹ調整用マイクロメーターと、Ｚ軸方向の焦点位置を調整するＺ軸調整用マイクロメーターとからなり、前記調整部は、その底面部に形成したネジ穴を有したフランジを標本に対して接触させてネジ固定可能に構成する。
第４の観点では、第１乃至第３の観点のいずれか１つにおいて、前記光ファイバーは、湾曲により瞬間的なモードシフトを生じない長さ５ｍまで対応可能なシングルモードファイバーであり、前記レーザ光源との接続は、コネクターとなっており、前記プローブアセンブリは、ステンレススチールハウジングと、前記レーザ光源からのレーザ光をその表面から少なくとも１ｍｍの距離に集光できるレンズとを備える。
第５の観点では、第１乃至第４の観点のいずれか１つにおいて、前記プローブアセンブリは、前記標本として動物の頭蓋骨の切開した部位にネジ固定されており、前記調整部は、大脳皮質の異なる部分に対して斜めに探査可能であり、前記集光レンズは、表面から１０００μｍまでの距離の脳組織から発せられる蛍光の測定が可能な焦点距離を有し、前記光ファイバーは、前記動物が前記プローブアセンブリを固定した状態で半径５ｍまで動くことが可能である。
第６の観点では、第１乃至第５の観点のいずれか１つにおいて、前記生体機能測定装置を、懸濁液、プラーク、固体、生体組織の極微な測定に適用する。
【０１５０】
【発明の効果】
以上詳記したように、本発明によれば、通常の顕微鏡による観察方法を適用できない条件下、例えば動物が活動している状態で安定した観察が可能な生体機能測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器を示す図。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係る生体機能測定装置の集光光学系を示す図である。
【図３】本発明の第１の実施の形態のパルスストレッチャーの変形例を示す図。
【図４】第１の実施の形態の生体機能測定装置のファイバープローブ光検出器において使用される集光光学系を示す図。
【図５】第１の先行例に開示されているスキャニング共焦点顕微鏡装置を示す図。
【図６】第２の先行例に開示されている超短光パルスの伝送装置を示す図。
【符号の説明】
１…レーザ光源、
２…パルスストレッチャー、
３…ファイバー、
４…パルスコンプレッサー光学系、
５…光学デバイス、
１０ａ，１０ｂ…ミラー、
１１…レーザ光源、
１２…パルスストレッチャー、
１３…ダイクロイックミラー、
１４…集光レンズ、
１５…ファイバー、
１６…集光光学系、
１７ａ…プローブアセンブリ、
１７ｂ…フランジ部分、
１７ｃ…調整環、
１７ｄ…スプリング、
１８…標本、
１８ａ…焦点位置、
１８ｂ…頭蓋骨、
１９…フィルター、
２０…レンズ、
２１…ファイバー、
２２…レンズ、
２３…ダイクロイックミラー、
２４ａ，２４ｂ…測光フィルター、
２５ａ，２５ｂ…光電変換素子、
２６…検出系、
３１ａ，３１ｂ…レンズ、
５１…レーザ光、
５２…レンズ、
５３…ファイバー、
５４…カプラ、
５５…ファイバー、
５６…ハウジング、
５７…保持具、
５８…標本、
５８ａ…焦点位置、
５９…圧電素子、
６０ａ，６０ｂ…レンズ、
６１…ファイバー、
６２…フィルター、
６３…光電変換素子、
６４…コンピュータ、
６５…ドライバ、
６６…モニタ、
６７…ケーブル、
１０１…入射光、
１０２…直角プリズム、
１０４…回折格子、
１０６…直角プリズム、
１０８…ミラー、
１１０…凸面鏡、
１１２…凹面鏡、
１１４…ミラー、
１１６…ミラー、
１１８…ミラー、
１２０…出射光、
１３０…矢印、
１４０…パルスストレッチャー、
１４２…第１のプリズム、
１４４…第２のプリズム、
１４６…第３のプリズム、
１４８…第４のプリズム、
１５０…プリズムペア、
１５２…プリズムペア。

Claims

多光子励起を起こさせる極短パルスレーザ光を出射し、
シングルモード光ファイバを用いて前記極短パルスレーザー光を標本に接触するように固定されたプローブアセンブリに伝送し、
前記プローブアセンブリの光学系により、前記伝送された極短パルスレーザ光を前記標本に対して集光し、
前記極短パルスレーザー光の照射に基づく多光子励起により生じた標本からの前記蛍光を前記プローブアセンブリと前記シングルモード光ファイバを介して光検出器に伝送し、
前記光検出器により前記蛍光を測定することにより前記標本の脳内情報を取得し、
前記プローブアセンブリの光学系は、前記標本の表面から１０００μmまでの距離から発せられる蛍光を測定可能な焦点距離を有することを特徴とする動き回る動物（人を除く）の観察に用いる生体機能測定装置における生体機能測定方法。