JP4382898B2 - 抗マラリア活性を有するペルオキシド誘導体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マラリア原虫類による感染症の予防及び治療に有用な新規化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マラリアは、プラスモジウム（Plasmodium）属に属する原虫の感染によって起こる伝染性疾患で、ハマダラ蚊を媒介として感染し、間欠的な熱発作、貧血、脾腫等の症状を示す。マラリアは、近年、自然や環境の変化に伴い猛威を振るい始めており、その推定感染患者数は年間３億〜５億人、年間死亡者数は、１５０〜３００万人という世界的にも重要な疾病である。ヒトに感染するマラリア原虫には、アフリカ、アジア、ラテンアメリカの熱帯地域全体に分布する熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、世界各地の熱帯と温帯の一部に分布する三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、世界各地に分布する四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）及び主として熱帯西アフリカに分布する卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）等の原虫が挙げられるが、その中でも熱帯熱マラリアがもっとも重篤な症状を示し、発症後１〜２週間で脳症、腎症、溶血性貧血、肺水腫、心臓障害、重症腸炎などを伴って容易に重症マラリアに進展し、短期間内に多臓器不全を示し宿主を死に至らしめることが多い。
現在使用されている薬剤の代表的なものにはクロロキン、プリマキン、アルテミシニン、メフロキン、ピリメサミン等が挙げられるが、これら薬剤は毒性の強いものが多いこと、更に多くの薬剤に対する耐性原虫が出現しており、この薬剤耐性マラリアの拡散が化学療法の昨今の問題点となっている。薬剤耐性マラリアに唯一有効な薬剤としてキニーネが存在するが、腎不全を引き起こす可能性が極めて高く、現在の医療水準から見てリスクの高い治療薬である。このような状況からも、抗マラリア活性が高くかつ安全性の高い新薬の開発が望まれている。
本発明に類似の化合物としては、例えば特公昭５９−４６２６６号公報、特開平８−６７７０４号公報等に記載の有機ペルオキシド化合物が公知であるが、これらはポリマー製造の際の開始剤として使用されているのみである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、毒性が低く、極めて高い抗マラリア活性を有する新規化合物を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、下記一般式（１）で表されるペルオキシド誘導体が極めて高い抗マラリア活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は一般式（１）で表されるペルオキシド誘導体に関するものである。
【化２】
［式中、Ｃは炭素数１〜６の直鎖状または分枝状の低級アルキル基を置換基として有しても良い炭素数３〜１２の単環の脂環式炭化水素環基またはアマダンチリデン基、ｎは０〜６の整数を示す。］
【０００５】
上記一般式（１）において、Ｃの置換基を有してもよい脂環式炭化水素環基としては、例えばシクロプロピリデン、シクロブチリデン、シクロペンチリデン、シクロヘキシリデン、シクロへプチリデン、シクロオクチリデン、シクロノニリデン、シクロデシリデン、シクロウンデシリデン、シクロドデシリデン基等の炭素数３〜１２の単環の脂環式炭化水素基；ビシクロブチリデン、ビシクロオクチリデン、ビシクロノニリデン、ノルボルニリデン、ノルボレニリデン、アダマンチリデン、ノルアダマンチリデン基等の架橋環又は多環の脂環式炭化水素基等が挙げられ、好ましくは炭素数６〜１２の単環の脂環式炭化水素基又はアダマンチリデン基であり、より好ましくはシクロヘキシリデン、シクロドデシリデン又はアダマンチリデン基である。
また、Ｃの脂環式炭化水素環基が有してもよい置換基としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルとして例示される直鎖又は各種分枝したペンチル基等の炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状の低級アルキル基であり、より好ましくはｔｅｒｔ−ブチル基である。
本発明化合物のうち、好ましい化合物としては一般式（１）において、Ｃが置換基として炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状の低級アルキル基を有しても良い脂環式炭化水素環基である化合物であり、より好ましくはＣが４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシリデン、シクロドデシリデン又はアダマンチリデン基であり、ｎが１〜４である化合物である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
上記一般式（１）で表される本発明化合物は下記の方法により製造できる。
【化３】
［式中、Ｃ及びｎは上記に同じ。Ｘはハロゲン原子を示す。］
上記反応工程式中、Ｘで表されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくは臭素原子、ヨウ素原子である。
【０００７】
＜反応工程（ｉ）＞
本反応工程は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６２，４９４９（１９９７）記載の方法に準じて行われる。すなわち、一般式（２）で表される公知化合物を過酸化水素存在下、適当な溶媒中でオゾンと反応させることにより一般式（３）で表されるビスヒドロペルオキシド化合物を得る。本工程で用いられる溶媒としては反応に関与しないものであれば特に制限はなく、エーテル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等を例示でき、好ましくはエーテルである。過酸化水素は３０〜１００％のものが使用できる。反応に際しては、化合物（２）に対して、過酸化水素を１〜１０倍モル量、好ましくは１〜３倍モル量使用し、オゾンを０．５〜５倍モル量、好ましくは１〜２倍モル量使用する。反応温度は−７０〜２０℃であり、反応時間は５〜３０分である。得られた化合物（３）は、通常の分離手段、例えばカラムクロマトグラフィー、再結晶等により反応混合物から容易に単離精製することが出来る。
上記反応工程（ｉ）で得られた化合物（３）は単離又は単離することなく反応工程（ｉｉ）に使用できる。
【０００８】
＜反応工程（ｉｉ）＞
上記反応工程（ｉ）で得られた化合物（３）と一般式（４）で表される化合物を、塩基存在下、適当な溶媒中で反応させることにより、一般式（１）で表される本発明化合物を得る。
本工程で使用される塩基としては、例えば水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化セシウム等のアルカリ金属の水酸化物；ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド等のアルカリ金属アルコキシド、またトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等の第三級アミンが用いられ、好ましくは水酸化セシウムである。溶媒としては、非水溶媒であれば特に制限はないが、特にジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドの様な極性の高いものが好まれる。また１８−クラウン−６の様なクラウンエーテル類を反応促進剤として添加することも可能である。反応に際しては、化合物（３）に対して化合物（４）及び塩基をそれぞれ１〜３倍モル使用する。反応促進剤を添加する場合には、化合物（３）に対して１〜１０モル量を使用する。反応温度は０〜５０℃、好ましくは１０〜３０℃であり、反応時間は１〜４８時間である。得られた化合物（１）は、通常の分離手段、例えばカラムクロマトグラフィー、再結晶等により反応混合物から容易に単離精製することが出来る。
【０００９】
本発明化合物をマラリア原虫類による感染症の予防及び治療に使用する場合、投与経路としては、経口、皮下注射、静脈注射、局所投与等のいずれでもよい。また、製剤としては、通常、製薬的に許容される担体や賦形剤、その他添加剤を用いて製造した散剤、錠剤、細粒剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の経口剤、点眼剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。製薬的に許容される担体や賦形剤、その他添加剤としては、グルコース、ラクトース、ゼラチン、マンニトール、でんぷんペースト、トリケイ酸マグネシウム、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ等があり、さらには、安定剤、増量剤、着色剤及び芳香剤の様な補助剤を含有してもよい。これらの製剤は、各々当業者に公知慣用の製造方法により製造できる。
本発明化合物の製剤中の配合量としては、０．１〜１００重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜８０重量％であり、０．１〜５０重量％が好適である。
また、１日当たりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概に決定できないが、通常成人１日当り本発明化合物を０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜６００ｍｇを１回又は２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。
【００１０】
【実施例】
次に本発明を製造例、実施例、試験例により具体的に説明する。
＜製造例１＞（シクロドデシリデン）ビスヒドロペルオキシド（化合物ａ）の合成
斉藤等の方法（Saito，I.；Nagata，R.；Yuba，K.；Matuura，T．Tetrahedron Lett．1983，24，1737）で調整した過酸化水素の２．５ｍｏｌエーテル溶液２５ｍｌに公知化合物であるメトキシメチレンシクロドデカン６３０ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）を溶かし、−７０℃でオゾン化を行った（通常のオゾン化装置（Ｎｉｐｐｏｎ Ｏｚｏｎｅ Ｍｏｄｅｌ ＯＮ−１−２（日本オゾン株式会社製））を使い、１５分間５０ｌ／ｈｒの流速で酸素を吹き込むことにより、使用したメトキシメチレンシクロドデカンと等量のオゾンを発生させた)。反応終了後、７０ｍｌのエーテルを加え、有機層を重曹水、次いで飽和食塩水で洗った後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。次いで、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、２：８)により、標記化合物ａを２３２ｍｇ（収率３３％）得た。物性値を以下に示す。
融点：１４０−１４１℃
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ： 1.2-1.8 (m, 22 H), 8.13 (br s, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ： 19.28, 21.86, 22.15, 6.02, 26.19, 26.29, 112.64.
【００１１】
＜製造例２＞（４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシリデン）ビスヒドロペルオキシド（化合物ｂ）の合成
製造例１と同様に調整した過酸化水素を含むエーテル溶液２５ｍｌに４−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メトキシメチレンシクロヘキサン５４６ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）を溶かし、−７０℃でオゾン化を行った。反応終了後、上記製造例１と同様の方法で処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、２：８）により、標記化合物ｂを２８５ｍｇ（収率４７％）得た。以下に物性値を示す。
融点：８３−８４℃(エーテル−ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ： 0.87 (s, 9 H), 1.1-1.8 (m, 9 H), 9.27 (s, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ： 23.32, 27.58, 29.70, 32.31, 47.39, 110.00.
元素分析：Anal.Calcd. for C10H20O4: C, 58.80; H, 9.87. Found: C, 58.87; H, 9.80.
【００１２】
＜製造例３＞（２−アダマンチリデン）ビスヒドロペルオキシド（化合物ｃ）の合成
製造例１と同様に調整した過酸化水素を含むエーテル溶液２５ｍｌに２−メトキシメチレンアダマンタン７１２ｍｇ（４．００ｍｍｏｌ）を溶かし、−７０℃でオゾン化を行った。反応終了後、上記製造例１と同様の方法で処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、２：８）により、標記化合物ｃを３３５ｍｇ（収率４２％）得た。以下に物性値を示す。
融点：１４４−１４５℃(エーテル−ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)δ：1.7-2.1 (m, 14 H), 8.82 (s, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)δ：26.94, 31.14, 33.68, 36.98, 112.88.
【００１３】
＜実施例１＞１，２，６，７−テトラオキサスピロ［７．１１］ノナデカン（化合物１）の合成
アルゴン雰囲気下で、水酸化セシウムの一水塩５０４ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液１０ｍｌを調整した。この溶液に、シリンジを用いて、製造例１で得られた化合物ａ３４８ｍｇ（１．５０ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液５ｍｌを、次いで１，３−ジヨードプロパン６６６ｍｇ（２．２５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液５ｍｌを、０℃で、それぞれ１０分間かけて加えた。その後、室温で１６時間撹拌した。反応終了後、７０ｍｌのエーテルを加え、有機層を重曹水、次いで飽和食塩水で洗った後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧で留去後、残渣のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物１を１６４ｍｇ（収率４０％）得た。以下に物性値を示す。
融点：８３−８４℃(ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：1.3-1.7 (m, 22 H), 2.1-2.2 (m, 2 H), 4.12 (dt, J = 12.5, 5.0 Hz, 2 H), 4.31 (dt, J = 12.5, 5.0 Hz, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ： 19.36, 21.90, 22.17, 25.91, 26.07, 26.25, 30.40, 73.94, 112.13.
元素分析：Anal. Calcd. for C15H26O4: C, 66.14; H, 10.36. Found: C, 65.91; H, 10.42.
【００１４】
＜実施例２＞１，２，６，７−テトラオキサスピロ［８．１１］イコサン（化合物２）の合成
製造例１で得られた化合物ａ３４８ｍｇ（１．５０ｍｍｏｌ）と水酸化セシウムの一水塩 ５０４ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２５ｍｌに溶かし、これに１，３−ジヨードブタン６９８ｍｇ（２．２５ｍｍｏｌ）を１０分間かけて加えた。その後、反応を室温で１６時間行った。反応終了後、上記実施例１と同様の処理法で反応混合物を処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物２を１２９ｍｇ（収率３０％）得た。以下に物性値を示す。
融点：９７−９８℃(ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：1.3-1.7 (m, 24 H), 2.2-2.3 (m, 2 H), 3.66 (t, J = 12.2 Hz, 2 H), 4.26 (dd, J = 12.2, 3.9 Hz, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：19.30, 21.89, 22.17, 25.95, 26.11, 26.43, 30.93, 32.51, 73.85, 111.82 .
元素分析： Anal. Calcd. for C16H30O4: C, 67.10; H, 10.56. Found: C, 66.66; H, 10.49 .
【００１５】
＜実施例３＞１，２，６，７−テトラオキサスピロ［９．１１］ヘニコサン（化合物３）の合成
水酸化セシウムの一水塩１００８ｍｇ（６．００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌに溶かし、これに製造例１で得られた化合物ａ６９６ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）を溶かしたジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌ及び１，３−ジヨードペンタン１４５８ｍｇ（４．５０ｍｍｏｌ）を溶かしたジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌを、別々のシリンジを用いて、０℃で１時間かけて加えた。その後、反応を室温で１６時間行った。反応終了後、上記実施例１と同様の処理法で反応混合物を処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物３を１５３ｍｇ（収率１７％）得た。以下に物性値を示す。
融点：５１−５２℃(ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：1.3-1.8 (m, 24 H), 19-2.1 (m, 4 H), 4.1-4.2 (m, 4 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：19.26, 21.92, 22.25, 24.89, 25.97, 26.06, 26.65, 28.45, 76.64, 110.89.
【００１６】
＜実施例４＞１，２，６，７−テトラオキサスピロ［８．１１］ドコサン（化合物４）の合成
水酸化セシウムの一水塩１００８ｍｇ（６．００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌに溶かし、これに製造例１で得られた化合物ａ６９６ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）を溶かしたジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌ及び１，３−ジヨードヘキサン１５２１ｍｇ（４．５０ｍｍｏｌ）を溶かしたジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌを、別々のシリンジを用いて、０℃で１時間かけて加えた。その後、反応を室温で１６時間行った。反応終了後、上記処理法で反応混合物を処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物４を１６８ｍｇ（収率１８％）得た。以下に物性値を示す。
融点：４８−４９℃（ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：1.3-1.8 (m, 30 H), 4.02 (t, J = 4.8 Hz, 4 H)１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：19.35, 21.89, 22.23, 25.00, 26.02, 26.13, 26.43, 26.99, 74.63, 112.06.
【００１７】
＜実施例５＞７，８，１２，１３−テトラオキサスピロ［６．８］トリデカン（化合物５）の合成
製造例２で得られた化合物ｂ１２５ｍｇ（０．６１ｍｍｏｌ）と水酸化セシウムの一水塩 ２０５ｍｇ（１．２２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１５ｍｌに溶かし、これに１，３−ジヨードプロパン２７２ｍｇ（０．９２ｍｍｏｌ）を１０分間かけて加えた。その後、反応を室温で１６時間続けた。反応終了後、上記実施例１と同様の処理法で反応混合物を処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物５を３８ｍｇ（収率２６％）得た。以下に物性値を示す。
融点：５８−５９℃（ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：0.86 (s, 9 H), 1.1-1.8 (m, 9 H), 2.1-2.3 (m, 2 H), 4.10-4.2 (m, 2 H), 4.3-4.5 (m, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：23.34, 23.61, 27.64, 28.59, 30.35, 31.93, 32.37, 47.44, 73.76, 74.02, 107.92.
元素分析：Anal. Calcd. for C13H24O4 : C, 63.91; H, 9.90. Found: C, 63.60; H, 9.97.
【００１８】
＜実施例６＞スピロ［トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］２，３’−［１，２，４，５］テトロキソカン（化合物６）の合成
製造例３で得られた化合物ｃ３１３ｍｇ（１．５７ｍｍｏｌ）と水酸化セシウムの一水塩５２８ｍｇ（３．１４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１５ｍｌに溶かし、これに１，３−ジヨードプロパン６９５ｍｇ（２．３５ｍｍｏｌ）を１０分間かけて加えた。その後、反応を室温で１６時間行った。反応終了後、上記処理法で反応混合物を処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物６を７３ｍｇ（収率１９％）得た。以下に物性値を示す。
融点：３４−３５℃（ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：1.6-2.3 (m, 16 H), 4.12 (dt, J = 12.9, 5.6 Hz, 2 H), 4.35 (dt, J = 12.5, 4.8 Hz, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：27.06, 30.30, 31.81, 33.67, 33.98, 37.25, 73.94, 109.95.
【００１９】
＜熱帯熱マラリア原虫の培養検定試験＞
本実験では、熱帯熱マラリア原虫としてP.falciparum FCR-3 strain（ATCC 30932)を用いた。また抗マラリア剤として市販されているクロロキンの耐性株に対する本発明化合物の効果を検証するためにP.falciparum K1 strainのクロロキン耐性マラリア原虫を用いた。実験に用いた培地は、濾過滅菌したRPMI1640培地で、ｐＨを７．４に合わせ、ヒト血清を１０％となるように添加した。マラリア原虫の培養はＯ２濃度５％、ＣＯ２濃度５％、Ｎ２濃度９０％、温度は３６．５℃で行った。ヘマトクリット値（赤血球浮遊液中に占める赤血球の体積の割合）は５％にして用いた。培養開始時の熱帯熱マラリア原虫の初期感染率は０．１％とした。２４穴培養プレートを用いて培養し、培地は毎日交換し、感染率４％で植え継ぎを行った。感染率は薄層塗沫標本を作成し、ギムザ染色あるいはDiff-Qick染色を行った後、顕微鏡（油浸、１０００×）下で計測し、マラリア原虫感染率を下記式より算出した。
マラリア原虫感染率（％）＝｛（感染赤血球数）／（総赤血球数）｝×１００
【００２０】
＜試験例１＞マラリア原虫増殖阻害スクリーニング試験
培養したマラリア原虫感染赤血球を遠心で集め、血清を含む培地で洗浄を行った後、非感染赤血球を加え、初期感染率を０．３％とした。この時のヘマトクリット値は３％である。実験に用いるサンプルは滅菌水、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）あるいはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、所定濃度のサンプルとした。
２４穴培養プレートにサンプルを５〜１０μｌずつ加えた。サンプルはduplicateあるいはtriplicateにとった。コントロールは滅菌水、ＤＭＦあるいはＤＭＳＯを１０μｌ／ウエル加えた。
次に、あらかじめ用意しておいた熱帯熱マラリア原虫培養液を９９０〜９９５μｌずつ加え、静かにピペッティングを行い培地に一様に懸濁させた。培養プレートはＣＯ２−Ｏ２−Ｎ２（５％、５％、９０％）インキュベーター中で７２時間培養した後、それぞれのウエルについて薄層塗沫標本を作成し、染色した後、顕微鏡下で観察し、試薬を加えたものの感染率およびコントロールの感染率を算出した。
上記で求めたマラリア原虫感染率から次の式によって増殖率を算出することにより、マラリア原虫に対する５０％増殖阻害濃度（ＥＣ５０）を求めた。結果を表１に示す。
増殖率（％）＝｛（［ｂ］−［ａ］）／（［ｃ］−［ａ］）｝×１００
ａ：初期感染率
ｂ：サンプル添加時の感染率
ｃ：サンプル非添加時（コントロール）の感染率
【００２１】
＜試験例２＞マウスＦＭ３Ａ細胞増殖阻害試験
マウス乳がん由来ＦＭ３Ａ細胞の野生株であるＦ２８−７株を用いた。培地はＥＳ培地に非働化した胎児牛血清を２％となるように添加し、ＣＯ２濃度５％、３７℃で培養した。この条件下でのＦＭ３Ａ細胞の倍加時間は約１２時間であった。
前培養を行い、対数増殖期に入った細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培地で希釈した。サンプルはマラリア原虫の抗マラリア活性測定時調製したものを用いた。２４穴培養プレートにサンプル溶液を５〜１０μｌずつ加えた（培地等を加えると最終濃度は１×１０−４〜１×１０−６となった）。化合物はduplicateあるいはtriplicateにとり、コントロールとして滅菌水、ＤＭＦあるいはＤＭＳＯを１０μｌ加えたウエルも同時に用意した。次に、用意しておいた培養細胞浮遊液を９９０〜９９５μｌずつ加え、静かにピペッティングを行い培地に一様に懸濁させた。４８時間培養した後、それぞれのウエルについて細胞数をセルコントローラー（ＣＣ−１０８、Ｔｏａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃｓ社製）で計数し、下記式より増殖率を算出した。
増殖率（％）＝｛（［Ｃ］−［Ａ］）／（［Ｂ］−［Ａ］）｝×１００
Ａ:初期細胞数
Ｂ:４８時間後のコントロールの細胞数
Ｃ:サンプル添加した４８時間後の細胞数
細胞増殖阻害活性は、サンプルを添加したウエルの細胞数およびコントロールの細胞数から算出した。これにより、サンプルの細胞毒性を評価し、細胞増殖阻害濃度（ＥＣ５０）で示した。ＥＣ５０値とはマラリア原虫、あるいはＦＭ３Ａ細胞の培地にサンプルを添加していないコントロールの増殖率、あるいはマラリア原虫感染率を１００％とし、サンプル添加によってコントロールの増殖率を５０％阻害するサンプルの濃度のことである（モル濃度で表示する）。結果を表１に示す。
サンプルの抗マラリア作用は、ＦＭ３Ａ細胞に対するマラリア原虫のサンプルのＥＣ５０値の比（化学療法係数、下記式参照）から評価し、薬効判定を行った。また、参考までに抗マラリア剤として利用されているクロロキンについても同様の試験を行った。結果を表１に示す。
化学療法係数＝（マウスＦＭ３Ａ細胞に対するサンプルのＥＣ５０値）
÷（熱帯熱マラリア原虫に対するサンプルのＥＣ５０値）
【００２２】
【表１】
【００２３】
以上の結果、本発明化合物は、細胞毒性が低く、マラリア原虫増殖阻害活性を有することが判明した。また、クロロキン耐性原虫に対しても効果が保持されていることが判明した。
【００２４】
＜試験例３＞ネズミマラリア原虫感染マウスを用いた原虫抑制試験
本実験はPeters，W．and Richrds，W．H．G．Antimalarial drugs Ｉ，in：W．Peters，W．H．G．Richards（Eds．），Springer-Verlag，Berlin，1984，pp．229-230に記載の4-day suppressive testに準じて行った。用いたネズミマラリア原虫（P.berghei NK65株）は強毒原虫株で、このネズミマラリア原虫を感染させるとマウスは感染してから１０日以内に全部死亡する。継代しているネズミマラリア原虫感染マウスの血中感染率が１０％となった時点で実験を開始した。エーテル麻酔を行ったマウスの心臓採血を行い、リン酸緩衝生理食塩水１ｍｌあたり５×１０６原虫/ｍｌとなるように調製した原虫浮遊液を感染していないマウスに２００μｌ腹腔内感染（i.p.）した。原虫感染２時間後、オリーブ油に懸濁した化合物を経口投与又は腹腔内投与（化合物５は腹腔内投与のみ）した。投与期間は、１日１回を連続４日間行い、実験開始４日目にマウスの尾より採血する。採血した血液で薄層塗抹標本を作製し、ギムザ染色により顕微鏡下で赤血球感染率を求めた（上記の熱帯熱マラリア原虫の培養検定試験と同様の方法で行った）。溶媒のみを投与したコントロール群に対する薬剤投与群の感染率の割合を調べることで５０％原虫抑制濃度（ＥＤ５０値）と９０％原虫抑制濃度（ＥＤ９０値）を求めた。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】
以上の結果、本発明化合物は、優れたマラリア原虫増殖抑制活性を有することが判明した。
【００２７】
【発明の効果】
本発明化合物は優れた抗マラリア作用を有し、マラリア等の原虫類による感染症の予防及び治療薬として有用である。またクロロキン耐性マラリアに対しても有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】各製造例、実施例における化合物の化学構造式の対照表を示す表図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、マラリア原虫類による感染症の予防及び治療に有用な新規化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マラリアは、プラスモジウム（Plasmodium）属に属する原虫の感染によって起こる伝染性疾患で、ハマダラ蚊を媒介として感染し、間欠的な熱発作、貧血、脾腫等の症状を示す。マラリアは、近年、自然や環境の変化に伴い猛威を振るい始めており、その推定感染患者数は年間３億〜５億人、年間死亡者数は、１５０〜３００万人という世界的にも重要な疾病である。ヒトに感染するマラリア原虫には、アフリカ、アジア、ラテンアメリカの熱帯地域全体に分布する熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、世界各地の熱帯と温帯の一部に分布する三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、世界各地に分布する四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）及び主として熱帯西アフリカに分布する卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）等の原虫が挙げられるが、その中でも熱帯熱マラリアがもっとも重篤な症状を示し、発症後１〜２週間で脳症、腎症、溶血性貧血、肺水腫、心臓障害、重症腸炎などを伴って容易に重症マラリアに進展し、短期間内に多臓器不全を示し宿主を死に至らしめることが多い。
現在使用されている薬剤の代表的なものにはクロロキン、プリマキン、アルテミシニン、メフロキン、ピリメサミン等が挙げられるが、これら薬剤は毒性の強いものが多いこと、更に多くの薬剤に対する耐性原虫が出現しており、この薬剤耐性マラリアの拡散が化学療法の昨今の問題点となっている。薬剤耐性マラリアに唯一有効な薬剤としてキニーネが存在するが、腎不全を引き起こす可能性が極めて高く、現在の医療水準から見てリスクの高い治療薬である。このような状況からも、抗マラリア活性が高くかつ安全性の高い新薬の開発が望まれている。
本発明に類似の化合物としては、例えば特公昭５９−４６２６６号公報、特開平８−６７７０４号公報等に記載の有機ペルオキシド化合物が公知であるが、これらはポリマー製造の際の開始剤として使用されているのみである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、毒性が低く、極めて高い抗マラリア活性を有する新規化合物を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、下記一般式（１）で表されるペルオキシド誘導体が極めて高い抗マラリア活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は一般式（１）で表されるペルオキシド誘導体に関するものである。
【化２】
【０００５】
上記一般式（１）において、Ｃの置換基を有してもよい脂環式炭化水素環基としては、例えばシクロプロピリデン、シクロブチリデン、シクロペンチリデン、シクロヘキシリデン、シクロへプチリデン、シクロオクチリデン、シクロノニリデン、シクロデシリデン、シクロウンデシリデン、シクロドデシリデン基等の炭素数３〜１２の単環の脂環式炭化水素基；ビシクロブチリデン、ビシクロオクチリデン、ビシクロノニリデン、ノルボルニリデン、ノルボレニリデン、アダマンチリデン、ノルアダマンチリデン基等の架橋環又は多環の脂環式炭化水素基等が挙げられ、好ましくは炭素数６〜１２の単環の脂環式炭化水素基又はアダマンチリデン基であり、より好ましくはシクロヘキシリデン、シクロドデシリデン又はアダマンチリデン基である。
また、Ｃの脂環式炭化水素環基が有してもよい置換基としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルとして例示される直鎖又は各種分枝したペンチル基等の炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状の低級アルキル基であり、より好ましくはｔｅｒｔ−ブチル基である。
本発明化合物のうち、好ましい化合物としては一般式（１）において、Ｃが置換基として炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状の低級アルキル基を有しても良い脂環式炭化水素環基である化合物であり、より好ましくはＣが４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシリデン、シクロドデシリデン又はアダマンチリデン基であり、ｎが１〜４である化合物である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
上記一般式（１）で表される本発明化合物は下記の方法により製造できる。
【化３】
上記反応工程式中、Ｘで表されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、好ましくは臭素原子、ヨウ素原子である。
【０００７】
＜反応工程（ｉ）＞
本反応工程は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６２，４９４９（１９９７）記載の方法に準じて行われる。すなわち、一般式（２）で表される公知化合物を過酸化水素存在下、適当な溶媒中でオゾンと反応させることにより一般式（３）で表されるビスヒドロペルオキシド化合物を得る。本工程で用いられる溶媒としては反応に関与しないものであれば特に制限はなく、エーテル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等を例示でき、好ましくはエーテルである。過酸化水素は３０〜１００％のものが使用できる。反応に際しては、化合物（２）に対して、過酸化水素を１〜１０倍モル量、好ましくは１〜３倍モル量使用し、オゾンを０．５〜５倍モル量、好ましくは１〜２倍モル量使用する。反応温度は−７０〜２０℃であり、反応時間は５〜３０分である。得られた化合物（３）は、通常の分離手段、例えばカラムクロマトグラフィー、再結晶等により反応混合物から容易に単離精製することが出来る。
上記反応工程（ｉ）で得られた化合物（３）は単離又は単離することなく反応工程（ｉｉ）に使用できる。
【０００８】
＜反応工程（ｉｉ）＞
上記反応工程（ｉ）で得られた化合物（３）と一般式（４）で表される化合物を、塩基存在下、適当な溶媒中で反応させることにより、一般式（１）で表される本発明化合物を得る。
本工程で使用される塩基としては、例えば水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化セシウム等のアルカリ金属の水酸化物；ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド等のアルカリ金属アルコキシド、またトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等の第三級アミンが用いられ、好ましくは水酸化セシウムである。溶媒としては、非水溶媒であれば特に制限はないが、特にジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドの様な極性の高いものが好まれる。また１８−クラウン−６の様なクラウンエーテル類を反応促進剤として添加することも可能である。反応に際しては、化合物（３）に対して化合物（４）及び塩基をそれぞれ１〜３倍モル使用する。反応促進剤を添加する場合には、化合物（３）に対して１〜１０モル量を使用する。反応温度は０〜５０℃、好ましくは１０〜３０℃であり、反応時間は１〜４８時間である。得られた化合物（１）は、通常の分離手段、例えばカラムクロマトグラフィー、再結晶等により反応混合物から容易に単離精製することが出来る。
【０００９】
本発明化合物をマラリア原虫類による感染症の予防及び治療に使用する場合、投与経路としては、経口、皮下注射、静脈注射、局所投与等のいずれでもよい。また、製剤としては、通常、製薬的に許容される担体や賦形剤、その他添加剤を用いて製造した散剤、錠剤、細粒剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の経口剤、点眼剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。製薬的に許容される担体や賦形剤、その他添加剤としては、グルコース、ラクトース、ゼラチン、マンニトール、でんぷんペースト、トリケイ酸マグネシウム、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ等があり、さらには、安定剤、増量剤、着色剤及び芳香剤の様な補助剤を含有してもよい。これらの製剤は、各々当業者に公知慣用の製造方法により製造できる。
本発明化合物の製剤中の配合量としては、０．１〜１００重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜８０重量％であり、０．１〜５０重量％が好適である。
また、１日当たりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概に決定できないが、通常成人１日当り本発明化合物を０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜６００ｍｇを１回又は２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。
【００１０】
【実施例】
次に本発明を製造例、実施例、試験例により具体的に説明する。
＜製造例１＞（シクロドデシリデン）ビスヒドロペルオキシド（化合物ａ）の合成
斉藤等の方法（Saito，I.；Nagata，R.；Yuba，K.；Matuura，T．Tetrahedron Lett．1983，24，1737）で調整した過酸化水素の２．５ｍｏｌエーテル溶液２５ｍｌに公知化合物であるメトキシメチレンシクロドデカン６３０ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）を溶かし、−７０℃でオゾン化を行った（通常のオゾン化装置（Ｎｉｐｐｏｎ Ｏｚｏｎｅ Ｍｏｄｅｌ ＯＮ−１−２（日本オゾン株式会社製））を使い、１５分間５０ｌ／ｈｒの流速で酸素を吹き込むことにより、使用したメトキシメチレンシクロドデカンと等量のオゾンを発生させた)。反応終了後、７０ｍｌのエーテルを加え、有機層を重曹水、次いで飽和食塩水で洗った後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。次いで、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、２：８)により、標記化合物ａを２３２ｍｇ（収率３３％）得た。物性値を以下に示す。
融点：１４０−１４１℃
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ： 1.2-1.8 (m, 22 H), 8.13 (br s, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ： 19.28, 21.86, 22.15, 6.02, 26.19, 26.29, 112.64.
【００１１】
＜製造例２＞（４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシリデン）ビスヒドロペルオキシド（化合物ｂ）の合成
製造例１と同様に調整した過酸化水素を含むエーテル溶液２５ｍｌに４−ｔｅｒｔ−ブチル−２−メトキシメチレンシクロヘキサン５４６ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）を溶かし、−７０℃でオゾン化を行った。反応終了後、上記製造例１と同様の方法で処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、２：８）により、標記化合物ｂを２８５ｍｇ（収率４７％）得た。以下に物性値を示す。
融点：８３−８４℃(エーテル−ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ： 0.87 (s, 9 H), 1.1-1.8 (m, 9 H), 9.27 (s, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ： 23.32, 27.58, 29.70, 32.31, 47.39, 110.00.
元素分析：Anal.Calcd. for C10H20O4: C, 58.80; H, 9.87. Found: C, 58.87; H, 9.80.
【００１２】
＜製造例３＞（２−アダマンチリデン）ビスヒドロペルオキシド（化合物ｃ）の合成
製造例１と同様に調整した過酸化水素を含むエーテル溶液２５ｍｌに２−メトキシメチレンアダマンタン７１２ｍｇ（４．００ｍｍｏｌ）を溶かし、−７０℃でオゾン化を行った。反応終了後、上記製造例１と同様の方法で処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、２：８）により、標記化合物ｃを３３５ｍｇ（収率４２％）得た。以下に物性値を示す。
融点：１４４−１４５℃(エーテル−ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)δ：1.7-2.1 (m, 14 H), 8.82 (s, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ (ＣＤＣｌ３)δ：26.94, 31.14, 33.68, 36.98, 112.88.
【００１３】
＜実施例１＞１，２，６，７−テトラオキサスピロ［７．１１］ノナデカン（化合物１）の合成
アルゴン雰囲気下で、水酸化セシウムの一水塩５０４ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液１０ｍｌを調整した。この溶液に、シリンジを用いて、製造例１で得られた化合物ａ３４８ｍｇ（１．５０ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液５ｍｌを、次いで１，３−ジヨードプロパン６６６ｍｇ（２．２５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液５ｍｌを、０℃で、それぞれ１０分間かけて加えた。その後、室温で１６時間撹拌した。反応終了後、７０ｍｌのエーテルを加え、有機層を重曹水、次いで飽和食塩水で洗った後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧で留去後、残渣のシリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物１を１６４ｍｇ（収率４０％）得た。以下に物性値を示す。
融点：８３−８４℃(ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：1.3-1.7 (m, 22 H), 2.1-2.2 (m, 2 H), 4.12 (dt, J = 12.5, 5.0 Hz, 2 H), 4.31 (dt, J = 12.5, 5.0 Hz, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ： 19.36, 21.90, 22.17, 25.91, 26.07, 26.25, 30.40, 73.94, 112.13.
元素分析：Anal. Calcd. for C15H26O4: C, 66.14; H, 10.36. Found: C, 65.91; H, 10.42.
【００１４】
＜実施例２＞１，２，６，７−テトラオキサスピロ［８．１１］イコサン（化合物２）の合成
製造例１で得られた化合物ａ３４８ｍｇ（１．５０ｍｍｏｌ）と水酸化セシウムの一水塩 ５０４ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２５ｍｌに溶かし、これに１，３−ジヨードブタン６９８ｍｇ（２．２５ｍｍｏｌ）を１０分間かけて加えた。その後、反応を室温で１６時間行った。反応終了後、上記実施例１と同様の処理法で反応混合物を処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物２を１２９ｍｇ（収率３０％）得た。以下に物性値を示す。
融点：９７−９８℃(ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：1.3-1.7 (m, 24 H), 2.2-2.3 (m, 2 H), 3.66 (t, J = 12.2 Hz, 2 H), 4.26 (dd, J = 12.2, 3.9 Hz, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：19.30, 21.89, 22.17, 25.95, 26.11, 26.43, 30.93, 32.51, 73.85, 111.82 .
元素分析： Anal. Calcd. for C16H30O4: C, 67.10; H, 10.56. Found: C, 66.66; H, 10.49 .
【００１５】
＜実施例３＞１，２，６，７−テトラオキサスピロ［９．１１］ヘニコサン（化合物３）の合成
水酸化セシウムの一水塩１００８ｍｇ（６．００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌに溶かし、これに製造例１で得られた化合物ａ６９６ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）を溶かしたジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌ及び１，３−ジヨードペンタン１４５８ｍｇ（４．５０ｍｍｏｌ）を溶かしたジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌを、別々のシリンジを用いて、０℃で１時間かけて加えた。その後、反応を室温で１６時間行った。反応終了後、上記実施例１と同様の処理法で反応混合物を処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物３を１５３ｍｇ（収率１７％）得た。以下に物性値を示す。
融点：５１−５２℃(ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：1.3-1.8 (m, 24 H), 19-2.1 (m, 4 H), 4.1-4.2 (m, 4 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：19.26, 21.92, 22.25, 24.89, 25.97, 26.06, 26.65, 28.45, 76.64, 110.89.
【００１６】
＜実施例４＞１，２，６，７−テトラオキサスピロ［８．１１］ドコサン（化合物４）の合成
水酸化セシウムの一水塩１００８ｍｇ（６．００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌに溶かし、これに製造例１で得られた化合物ａ６９６ｍｇ（３．００ｍｍｏｌ）を溶かしたジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌ及び１，３−ジヨードヘキサン１５２１ｍｇ（４．５０ｍｍｏｌ）を溶かしたジメチルホルムアミド溶液２０ｍｌを、別々のシリンジを用いて、０℃で１時間かけて加えた。その後、反応を室温で１６時間行った。反応終了後、上記処理法で反応混合物を処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物４を１６８ｍｇ（収率１８％）得た。以下に物性値を示す。
融点：４８−４９℃（ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：1.3-1.8 (m, 30 H), 4.02 (t, J = 4.8 Hz, 4 H)１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：19.35, 21.89, 22.23, 25.00, 26.02, 26.13, 26.43, 26.99, 74.63, 112.06.
【００１７】
＜実施例５＞７，８，１２，１３−テトラオキサスピロ［６．８］トリデカン（化合物５）の合成
製造例２で得られた化合物ｂ１２５ｍｇ（０．６１ｍｍｏｌ）と水酸化セシウムの一水塩 ２０５ｍｇ（１．２２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１５ｍｌに溶かし、これに１，３−ジヨードプロパン２７２ｍｇ（０．９２ｍｍｏｌ）を１０分間かけて加えた。その後、反応を室温で１６時間続けた。反応終了後、上記実施例１と同様の処理法で反応混合物を処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物５を３８ｍｇ（収率２６％）得た。以下に物性値を示す。
融点：５８−５９℃（ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：0.86 (s, 9 H), 1.1-1.8 (m, 9 H), 2.1-2.3 (m, 2 H), 4.10-4.2 (m, 2 H), 4.3-4.5 (m, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：23.34, 23.61, 27.64, 28.59, 30.35, 31.93, 32.37, 47.44, 73.76, 74.02, 107.92.
元素分析：Anal. Calcd. for C13H24O4 : C, 63.91; H, 9.90. Found: C, 63.60; H, 9.97.
【００１８】
＜実施例６＞スピロ［トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］２，３’−［１，２，４，５］テトロキソカン（化合物６）の合成
製造例３で得られた化合物ｃ３１３ｍｇ（１．５７ｍｍｏｌ）と水酸化セシウムの一水塩５２８ｍｇ（３．１４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１５ｍｌに溶かし、これに１，３−ジヨードプロパン６９５ｍｇ（２．３５ｍｍｏｌ）を１０分間かけて加えた。その後、反応を室温で１６時間行った。反応終了後、上記処理法で反応混合物を処理した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（留出液：エーテル−ヘキサン、１：２５）により、標記化合物６を７３ｍｇ（収率１９％）得た。以下に物性値を示す。
融点：３４−３５℃（ヘキサン)
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：1.6-2.3 (m, 16 H), 4.12 (dt, J = 12.9, 5.6 Hz, 2 H), 4.35 (dt, J = 12.5, 4.8 Hz, 2 H)
１３Ｃ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ：27.06, 30.30, 31.81, 33.67, 33.98, 37.25, 73.94, 109.95.
【００１９】
＜熱帯熱マラリア原虫の培養検定試験＞
本実験では、熱帯熱マラリア原虫としてP.falciparum FCR-3 strain（ATCC 30932)を用いた。また抗マラリア剤として市販されているクロロキンの耐性株に対する本発明化合物の効果を検証するためにP.falciparum K1 strainのクロロキン耐性マラリア原虫を用いた。実験に用いた培地は、濾過滅菌したRPMI1640培地で、ｐＨを７．４に合わせ、ヒト血清を１０％となるように添加した。マラリア原虫の培養はＯ２濃度５％、ＣＯ２濃度５％、Ｎ２濃度９０％、温度は３６．５℃で行った。ヘマトクリット値（赤血球浮遊液中に占める赤血球の体積の割合）は５％にして用いた。培養開始時の熱帯熱マラリア原虫の初期感染率は０．１％とした。２４穴培養プレートを用いて培養し、培地は毎日交換し、感染率４％で植え継ぎを行った。感染率は薄層塗沫標本を作成し、ギムザ染色あるいはDiff-Qick染色を行った後、顕微鏡（油浸、１０００×）下で計測し、マラリア原虫感染率を下記式より算出した。
マラリア原虫感染率（％）＝｛（感染赤血球数）／（総赤血球数）｝×１００
【００２０】
＜試験例１＞マラリア原虫増殖阻害スクリーニング試験
培養したマラリア原虫感染赤血球を遠心で集め、血清を含む培地で洗浄を行った後、非感染赤血球を加え、初期感染率を０．３％とした。この時のヘマトクリット値は３％である。実験に用いるサンプルは滅菌水、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）あるいはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、所定濃度のサンプルとした。
２４穴培養プレートにサンプルを５〜１０μｌずつ加えた。サンプルはduplicateあるいはtriplicateにとった。コントロールは滅菌水、ＤＭＦあるいはＤＭＳＯを１０μｌ／ウエル加えた。
次に、あらかじめ用意しておいた熱帯熱マラリア原虫培養液を９９０〜９９５μｌずつ加え、静かにピペッティングを行い培地に一様に懸濁させた。培養プレートはＣＯ２−Ｏ２−Ｎ２（５％、５％、９０％）インキュベーター中で７２時間培養した後、それぞれのウエルについて薄層塗沫標本を作成し、染色した後、顕微鏡下で観察し、試薬を加えたものの感染率およびコントロールの感染率を算出した。
上記で求めたマラリア原虫感染率から次の式によって増殖率を算出することにより、マラリア原虫に対する５０％増殖阻害濃度（ＥＣ５０）を求めた。結果を表１に示す。
増殖率（％）＝｛（［ｂ］−［ａ］）／（［ｃ］−［ａ］）｝×１００
ａ：初期感染率
ｂ：サンプル添加時の感染率
ｃ：サンプル非添加時（コントロール）の感染率
【００２１】
＜試験例２＞マウスＦＭ３Ａ細胞増殖阻害試験
マウス乳がん由来ＦＭ３Ａ細胞の野生株であるＦ２８−７株を用いた。培地はＥＳ培地に非働化した胎児牛血清を２％となるように添加し、ＣＯ２濃度５％、３７℃で培養した。この条件下でのＦＭ３Ａ細胞の倍加時間は約１２時間であった。
前培養を行い、対数増殖期に入った細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培地で希釈した。サンプルはマラリア原虫の抗マラリア活性測定時調製したものを用いた。２４穴培養プレートにサンプル溶液を５〜１０μｌずつ加えた（培地等を加えると最終濃度は１×１０−４〜１×１０−６となった）。化合物はduplicateあるいはtriplicateにとり、コントロールとして滅菌水、ＤＭＦあるいはＤＭＳＯを１０μｌ加えたウエルも同時に用意した。次に、用意しておいた培養細胞浮遊液を９９０〜９９５μｌずつ加え、静かにピペッティングを行い培地に一様に懸濁させた。４８時間培養した後、それぞれのウエルについて細胞数をセルコントローラー（ＣＣ−１０８、Ｔｏａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃｓ社製）で計数し、下記式より増殖率を算出した。
増殖率（％）＝｛（［Ｃ］−［Ａ］）／（［Ｂ］−［Ａ］）｝×１００
Ａ:初期細胞数
Ｂ:４８時間後のコントロールの細胞数
Ｃ:サンプル添加した４８時間後の細胞数
細胞増殖阻害活性は、サンプルを添加したウエルの細胞数およびコントロールの細胞数から算出した。これにより、サンプルの細胞毒性を評価し、細胞増殖阻害濃度（ＥＣ５０）で示した。ＥＣ５０値とはマラリア原虫、あるいはＦＭ３Ａ細胞の培地にサンプルを添加していないコントロールの増殖率、あるいはマラリア原虫感染率を１００％とし、サンプル添加によってコントロールの増殖率を５０％阻害するサンプルの濃度のことである（モル濃度で表示する）。結果を表１に示す。
サンプルの抗マラリア作用は、ＦＭ３Ａ細胞に対するマラリア原虫のサンプルのＥＣ５０値の比（化学療法係数、下記式参照）から評価し、薬効判定を行った。また、参考までに抗マラリア剤として利用されているクロロキンについても同様の試験を行った。結果を表１に示す。
化学療法係数＝（マウスＦＭ３Ａ細胞に対するサンプルのＥＣ５０値）
÷（熱帯熱マラリア原虫に対するサンプルのＥＣ５０値）
【００２２】
【表１】
以上の結果、本発明化合物は、細胞毒性が低く、マラリア原虫増殖阻害活性を有することが判明した。また、クロロキン耐性原虫に対しても効果が保持されていることが判明した。
【００２４】
＜試験例３＞ネズミマラリア原虫感染マウスを用いた原虫抑制試験
本実験はPeters，W．and Richrds，W．H．G．Antimalarial drugs Ｉ，in：W．Peters，W．H．G．Richards（Eds．），Springer-Verlag，Berlin，1984，pp．229-230に記載の4-day suppressive testに準じて行った。用いたネズミマラリア原虫（P.berghei NK65株）は強毒原虫株で、このネズミマラリア原虫を感染させるとマウスは感染してから１０日以内に全部死亡する。継代しているネズミマラリア原虫感染マウスの血中感染率が１０％となった時点で実験を開始した。エーテル麻酔を行ったマウスの心臓採血を行い、リン酸緩衝生理食塩水１ｍｌあたり５×１０６原虫/ｍｌとなるように調製した原虫浮遊液を感染していないマウスに２００μｌ腹腔内感染（i.p.）した。原虫感染２時間後、オリーブ油に懸濁した化合物を経口投与又は腹腔内投与（化合物５は腹腔内投与のみ）した。投与期間は、１日１回を連続４日間行い、実験開始４日目にマウスの尾より採血する。採血した血液で薄層塗抹標本を作製し、ギムザ染色により顕微鏡下で赤血球感染率を求めた（上記の熱帯熱マラリア原虫の培養検定試験と同様の方法で行った）。溶媒のみを投与したコントロール群に対する薬剤投与群の感染率の割合を調べることで５０％原虫抑制濃度（ＥＤ５０値）と９０％原虫抑制濃度（ＥＤ９０値）を求めた。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
以上の結果、本発明化合物は、優れたマラリア原虫増殖抑制活性を有することが判明した。
【００２７】
【発明の効果】
本発明化合物は優れた抗マラリア作用を有し、マラリア等の原虫類による感染症の予防及び治療薬として有用である。またクロロキン耐性マラリアに対しても有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】各製造例、実施例における化合物の化学構造式の対照表を示す表図である。
Claims (3)
- 一般式（１）で表されるペルオキシド誘導体。
- 一般式（１）中、Ｃが４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシリデン、シクロドデシリデン又はアダマンチリデン基であり、ｎが１〜４である請求項１記載のペルオキシド誘導体。
- 一般式（１）で表される化合物を含有する抗マラリア剤。
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