JP4395331B2 - 核酸検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖DNAと一本鎖DNAが結合してなるDNA複合体を検出する核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、二本鎖DNAと一本鎖DNAとを含む複合体の形成方法が知られている。即ち、ターゲットDNA（二本鎖DNA）を用意すると共に、このターゲットDNAのいずれか一方のDNA鎖の一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブDNA（一本鎖DNA）を用意する。次に、緩衝剤等を含む反応液に、これらのDNAと大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を混ぜて、十分な時間保温する。そうすると、ターゲットDNAとプローブDNAとRecAタンパク質とからなるDNA−タンパク質複合体が形成される。具体的には、まず、プローブDNAにRecAタンパク質が結合してプローブDNA−RecAタンパク質複合体が形成される。続いて、このプローブDNA−RecAタンパク質複合体が、ターゲットDNAに結合し、三本鎖形成領域を有するDNA-タンパク質複合体が形成される。その際、プローブDNAは、RecAタンパク質が関与した状態で、ターゲットDNAのうち、プローブDNAと相補的な塩基配列からなる領域に結合すると考えられている。この状態のDNA−タンパク質複合体は、比較的安定なものである。
【０００３】
ところが、このDNA−タンパク質複合体に、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）やタンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼK）などを加えて十分な時間保温し、RecAタンパク質を失活させると、DNA−タンパク質複合体からRecAタンパク質が除去されるだけでなく、ターゲットDNAとプローブDNAとの結合も解消される。つまり、DNA−タンパク質複合体は、RecAタンパク質の存在下においてのみ、その構造が安定に維持され、RecAタンパク質がない状態では、安定なDNA複合体を形成することができなかった。遺伝子工学等の分野において、DNA複合体を利用しようとした場合、RecAタンパク質が結合した状態の複合体では、RecAタンパク質の存在により多くの制限を受け、その利用範囲が狭くなる。そこで、このようなタンパク質が存在しなくても安定な構造を維持できるDNA複合体の形成方法の開発が待たれていた。
【０００４】
このような問題に対し、本出願人は、複合体中にタンパク質を含有しないにも拘わらず、安定な状態を維持できるDNA複合体の形成方法を見出した（特許文献１参照。）。即ち、直鎖状の二本鎖DNAと、この二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNAを用意する。次に、緩衝剤等を含む反応液に、これらのDNAと大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を混ぜ、さらに、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩを混ぜて、十分な時間保温する。そうすると、少なくとも二本鎖DNAと一本鎖DNAとRecAタンパク質を含む比較的安定なDNA−タンパク質複合体が形成される。このようにして形成したDNA−タンパク質複合体は、その後、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させても、安定なDNA複合体を形成できる。つまり、複合体中にタンパク質を含有しないにも拘わらず、安定な状態を維持できるDNA複合体を形成できる。
【発明が解決しようとする課題】
このようなDNA複合体は、例えば、予め一本鎖DNAを標識しておけば、DNA複合体が標識されるため、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法により、その存在を確認できる。
しかしながら、従来は、DNA複合体を可視化して確認することはできなかったため、DNA複合体の構造や形態などを調べることができなかった。また、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法では、DNA複合体の集団（バルク）を検出するため、試料が微量の場合には、DNA複合体を確実に検出することができない。また、検出に時間を要するなどの問題点があった。
【０００５】
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、二本鎖DNAと一本鎖DNAが結合したDNA複合体を可視化して検出できる核酸検出方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
その解決手段は、直鎖状の二本鎖DNA、この二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列に、相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNA、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質である組換えタンパク質、並びに、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩであるヌクレアーゼ、を反応させて、上記二本鎖DNAのうち、上記一方のDNA鎖の5'末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖DNAのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が、少なくとも上記組換えタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成するDNA−タンパク質複合体形成工程と、上記組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させて、上記二本鎖DNAの末端近傍包含領域に上記一本鎖DNAの相補的領域が結合してなるDNA複合体を形成するタンパク質失活工程と、原子間力顕微鏡により、上記DNA複合体を検出するＡＦＭ検出工程と、を備え、上記DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加え、上記タンパク質失活工程後、上記ＡＦＭ検出工程前に、上記DNA複合体と上記ヌクレアーゼとを反応させるヌクレアーゼ処理工程を備えることを特徴とする核酸検出方法である。
【０００７】
本発明によれば、DNA−タンパク質複合体形成工程において、二本鎖DNAと一本鎖DNAと組換えタンパク質とヌクレアーゼから、DNA−タンパク質複合体を形成する。そしてその後、タンパク質失活工程において、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させると、二本鎖DNAの末端近傍包含領域に一本鎖DNAの相補的領域が結合したDNA複合体を形成できる。このようなDNA複合体は、その構造を安定化させるための特別なタンパク質等（例えば、前述したRecAタンパク質）が存在しなくても、多少の熱を加えるなどしても解離することなく、安定な状態を維持できる。その後は、ＡＦＭ検出工程において、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により、このDNA複合体を検出する。
【０００８】
このような方法によりDNA複合体を検出すれば、DNA複合体を可視化して確認できるので、DNA複合体の構造や形態なども調べることができる。また、DNA複合体の一つ一つを可視化するので、試料が微量であっても、DNA複合体を確実に検出できる。さらに、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法に比して、DNAの一部を標識するなどの手間もなく、また、DNA複合体を電気泳動したり、そのゲルを乾燥させる必要もないため、検出に要する時間も短くて済む。
なお、二本鎖DNAと一本鎖DNAの結合領域は、二本鎖DNAの一方の末端近傍包含領域に形成するだけでなく、二本鎖DNAの両方の末端近傍包含領域に形成することも可能である。
また、組換えタンパク質は、入手容易性、安全性、機能性を考えると、大腸菌に由来するRecAタンパク質を用いるのが好ましい。
また、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えて反応させれば、より効率よく、DNAタンパク質複合体を形成できる。その結果、より効率よくDNA複合体を形成できる。
また、DNA−タンパク質複合体形成工程でATP-γSを加えてDNAタンパク質複合体を形成する場合、二本鎖DNAの一方のDNA鎖の一部がひげ状に遊離したDNA複合体が形成されることがある。これに対し、本発明では、タンパク質失活工程後、ＡＦＭ検出工程前に、DNA複合体とヌクレアーゼとを反応させるので、ひげ状に遊離したDNAはヌクレアーゼにより分解される。従って、ひげ状に遊離した部分のないDNA複合体をＡＦＭにより観察できる。
【０００９】
ここで、DNA結合体は、二本鎖DNAの少なくとも一方の末端近傍包含領域に、一本鎖DNAの相補的領域が結合したものであれば、その結合形態は問われない。つまり、二本鎖DNAと一本鎖DNAとの間で、必ずしも、ワトソン・クリック型塩基対やフーグスティーン型塩基対のような特定の構造をとっている必要はなく、二本鎖DNAの末端近傍包含領域と一本鎖DNAの相補的領域との間で、何らかの特異的な相互作用によって結合されていればよい。
【００１０】
二本鎖DNAは、直鎖状であれば、いかなるものを用いてもよい。即ち、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、3000Mbpといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なDNAであっても構わない。勿論、二本鎖DNAの由来は問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来のDNAやそれらを改変したDNAであっても、微生物等のもつプラスミドDNA等やプラスミドDNA等に異種のDNA断片を挿入したキメラDNA等であっても、あるいは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。
【００１１】
一本鎖DNAは、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状のものであれば、いかなるもの用いてもよい。即ち、この条件を満たす限り、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。また、その由来も問われない。これらの点は、二本鎖DNAと同様である。
【００１２】
相補的な程度は、一般的には、およそ70〜80％以上の相補性を有することが必要とされ、より好ましくは、ほぼ100％の相補性を有することである。相補性が高いほど、より安定なDNA複合体を形成できるからである。但し、必要とされる相補性の程度は、相補的領域の長さによって若干変動する。また、相補的領域全体の相補性は同じ（例えば70％）であっても、相補的領域内全体でほぼ等しい相補性（70％）を有する場合と、相補的領域内に相補性が高い領域（例えば90％）と低い領域（例えば50％）が偏在する場合とによっても、若干変動する。
【００１３】
また、一本鎖DNAは、相補的領域を含むものであればよいから、一本鎖DNA全体が相補的領域からなるものであっても、あるいは、相補的領域にさらに他の塩基配列が付加されたものであっても構わない。但し、一本鎖DNA全体が相補的領域からなるものの方が、より安定なDNA複合体を形成しやすいので好ましい。
なお、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「末端近傍の塩基から始まる塩基配列」と、実質的に相補的な塩基配列を含む必要があるのは、次のような理由による。即ち、一本鎖DNAが、二本鎖DNAの一方のDNA鎖の末端近傍以外の塩基配列（例えば、中央付近の塩基配列）にだけ相補的である場合には、DNA−タンパク質複合体形成工程において安定なDNA−タンパク質複合体を形成できるが、タンパク質失活工程でタンパク質を失活させると、二本鎖DNAと一本鎖DNAが解離してしまい、安定なDNA複合体が得られないからである。
【００１４】
また、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「5'末端近傍」の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む必要があるのも、同様な理由による。即ち、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「3'末端近傍」の塩基配列にだけ相補的である場合には、DNA−タンパク質複合体形成工程において安定なDNA−タンパク質複合体を形成することはできるが、タンパク質を失活させると、二本鎖DNAと一本鎖DNAが解離してしまい、安定なDNA複合体が得られないからである。
【００１５】
【００１６】
【００１７】
【００１８】
DNA−タンパク質複合体形成工程は、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体の存在下において、緩衝液中で行うのが好ましい。効率よく、安定なDNA−タンパク質複合体を形成できるからである。
緩衝液は、使用する組換えタンパク質及びヌクレアーゼにより、反応の最適条件を得るため適宜変更することできる。例えば、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）と酢酸や塩酸等の適当な酸とにより、ｐＨを約4.0〜9.0、より好ましくは、約7.0〜8.0に調節したトリス系の緩衝液を使用すればよい。緩衝剤は、一般に約10〜100mM、好ましくは、約30mMで使用する。
【００１９】
ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としては、例えば、アデノシン5'−三リン酸（ATP）、グアノシン5'−三リン酸（GTP）、UTP、CTPや、アデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ATP-γS）、グアノシン（γ−チオ）−三リン酸（GTP-γS）、dATP、dUTP、dCTPなどを挙げることができる。これらは、さらにヌクレオシド二リン酸（例えば、ADP）と組み合わせて使用することもできる。なお、これらヌクレオシド三リン酸等は、0.1〜10mM、好ましくは、約5mMで使用する。
【００２０】
反応液中の核酸（二本鎖DNA及び一本鎖DNA）の濃度は、核酸が十分に溶解できる濃度であればよく、適宜変更できる。二本鎖DNAに対する一本鎖DNAの割合は、モル比で約1〜100倍とするのが好ましい。また、組換えタンパク質は、一本鎖DNAの3塩基当たり1分子に相当するように加えるのが好ましい。但し、使用する組換えタンパク質によってその最適量は若干変動する。また、ヌクレアーゼは、二本鎖DNAの1μg当たり約1unit加えるのが好ましい。但し、これも使用するヌクレアーゼによってその最適量は若干変動する。
このように調製した反応液は、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、5分間以上、一般には約30〜60分間保温することにより、DNA−タンパク質複合体を形成できる。
【００２１】
なお、この工程では、上記のように反応液中にすべてのもの加えて一定時間保温する方法の他、次のような方法を採ることもできる。即ち、まず、ヌクレオシド三リン酸等を含む緩衝液に、二本鎖DNAと一本鎖DNAと組換えタンパク質とを加えて、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、数分間以上、好ましくは約10分間保温する。そしてその後、この反応液にヌクレアーゼを加えて、さらに、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、5分間以上、一般には約30分間保温する。
【００２２】
このような方法で反応させると、特に安定なDNA−タンパク質複合体を形成できる。その理由としては、エキソヌクレアーゼＩ等は、本来、一本鎖DNAを末端から切断していく酵素であるから、最初から反応液に加えると、一本鎖DNAが削られてしまうことがある。しかし、このようにエキソヌクレアーゼＩ等を後から加えると、一本鎖DNAには先に組換えタンパク質が結合して、エキソヌクレアーゼＩから保護されるため、一本鎖DNAが切断されにくくなり、安定なDNA−タンパク質複合体を形成できると考えられるからである。
【００２３】
タンパク質失活工程で、タンパク質を失活させるには、反応液にキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）を加えるか、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を加えるか、または、タンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼK）を加え、あるいは、これらの処理を組み合わせて行った後、例えば、約37℃で10分間以上保温すればよい。こうして得られる反応液からDNA複合体だけを回収するには、フェノール、クロロホルム等の溶媒抽出により除タンパク質処理を行った後、適当なカラムクロマトグラフィーで回収する方法を利用したり、あるいは、エタノール沈殿で一旦DNAを析出させる方法を利用すればよい。
【００２４】
【００２５】
【００２６】
【００２７】
【００２８】
さらに、上記のいずれかに記載の酸検出方法であって、上記DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸を加えることを特徴とする核酸検出方法とすると良い。
【００２９】
このように、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP等のヌクレオシド三リン酸を加えて反応させれば、より効率よく、DNAタンパク質複合体を形成できる。その結果、より効率よくDNA複合体を形成できる。
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【００３３】
【００３４】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸検出方法であって、上記一本鎖DNAは、60mer以上の塩基配列からなることを特徴とする核酸検出方法とすると良い。
【００３５】
一本鎖DNAは、その鎖長が短くても、二本鎖DNAに結合してDNA複合体を形成できる。しかし、一本鎖DNAが短いと、具体的には、60merよりも短いと、原子間力顕微鏡で観察を行ったときに、二本鎖DNAとDNA複合体との区別がつきにくい。即ち、DNA複合体の検出がより難しくなる。
これに対し、本発明では、60mer以上の塩基配列からなる一本鎖DNAを使用する。従って、原子力顕微鏡で観察した場合に、DNA複合体をより確実に検出できる。
【００３６】
【発明の実施の形態】
（実施形態１）
以下、本発明の実施形態について図面を参照しつつ説明する。
まず、ターゲットDNA（二本鎖DNA）を用意する（図１参照）。図１はDNA複合体の形成について模式的に示したものである。本実施形態では、pSP64poly(A)DNA（Promega）（3030bp）を制限酵素RsaＩで３つのDNA断片（1892bpと676bpと462bpのDNA断片）に切断し、このうちの最も大きいDNA断片（約1.9kbp）をターゲットDNAとした。具体的には、pSP64poly(A)DNAを制限酵素RsaＩで切断した後、ゲル濾過を用いて目的のDNA断片を分離精製した。ゲル濾過は、S-1000セファクリル（アマシャム・マルマシア株式会社）を用い、溶出緩衝液にTE Buffer（10mM Tris-HCl，pH7.0，1mM EDTA，1.5M NaCl）を用いて、100cmのオープンカラムで行った。溶出されてきたDNAサンプル液を1mL/minの速度で2mlずつ回収した。そして、回収したそれぞれのサンプルの一部を電気泳動して確認した。その結果を図２に示す。
【００３７】
図２から明らかなように、レーン１〜レーン２あたりでは、シグナルがほとんど検出されなかった。また、レーン３〜レーン２０あたりでは、最も大きい約1.9kbpのDNA断片に由来するシグナルが主として確認された。また、レーン２１〜レーン２７あたりでは、最も大きい約1.9kbpの断片に由来するシグナルと共に、２番目に大きい約0.7kbpのDNA断片に由来するシグナルが主として確認された。また、レーン２８〜レーン２９あたりでは、２番目に大きい約0.7kbpのDNA断片に由来するシグナルが主として確認された。また、レーン３０〜レーン３７では、２番目に大きい約0.7kbpのDNA断片に由来するシグナルと、最も小さい約0.5kbpのDNA断片に由来するシグナルが主として確認された。このような結果に基づいて、ターゲットDNAには、レーン３〜レーン２０に使用したサンプルを利用した。
【００３８】
次に、プローブDNA（一本鎖DNA）を用意する（図１参照）。本実施形態では、長さの異なる５種類のプローブDNA、即ち、150merの第１プローブDNA、300merの第２プローブDNA、600merの第３プローブDNA、900merの第４プローブDNA、及び、1200merの第５プローブDNAを用意した。具体的には、最も短い第１プローブDNAは、DNA合成によりオリゴヌクレオチド１として調製した。一方、第２プローブDNA〜第５プローブDNAは、ＰＣＲ反応を利用して調製した。ＰＣＲ反応は、600ngのpSP64poly(A)DNA（Promega）を鋳型として、50μlのＰＣＲ反応液に、0.5mM（最終濃度）のフォワード側のプライマーDNAと0.5mM（最終濃度）のリバース側のプライマーDNA、0.25unitのTaKaRa Taq（タカラバイオ株式会社）、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTPを、10mM Tris-HCl buffer（pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2 に混合した。ＰＣＲ反応は、１サイクル（94℃，2min）、３０サイクル（94℃，30sec−60℃，30sec−74℃，60sec）、１サイクル（74℃，7min−4℃，1min）の条件で行った。その後、ＰＣＲ反応液に色素液を加え、1％アガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動後にアガロースゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。その結果を図３のレーン１〜レーン４に示す。
【００３９】
なお、第２プローブDNAは、フォワード側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド２を、リバース側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド３を使用した。また、第３プローブDNAは、フォワード側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド４を、リバース側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド３を使用した。また、第４プローブDNAは、フォワード側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド５を、リバース側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド３を使用した。また、第５プローブDNAは、フォワード側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド６を、リバース側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド３を使用した。オリゴヌクレオチド１〜オリゴヌクレオチド６は、いずれもpSP64poly(A)DNAに100％相補的な配列からなるものである。なお、オリゴヌクレオチド３の5'末端には、後に一本鎖のプローブDNAを調製するために、ビオチンを付加させておいた。
【００４０】
オリゴヌクレオチド１：
5'-tgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagt-3’
オリゴヌクレオチド２：
5'-gccgggaagctagagtaagtagtt-3’
オリゴヌクレオチド３：
5'-actcaccagtcacagaaaagcatc-3’
オリゴヌクレオチド４：
5'-gttttaaatcaatctaaagtatat-3’
オリゴヌクレオチド５：
5'-ggtggcctaactacggctacacta-3’
オリゴヌクレオチド６：
5'-tcgtgcgctctcctgttccgaccc-3’
【００４１】
図３から明らかなように、レーン１には、300bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出された。また、レーン２には、600bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出された。レーン３には、900bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出された。レーン４には、1200bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出された。
【００４２】
次に、レーン１に用いたＰＣＲ反応液から、ゲル濾過を用いて目的のＰＣＲ産物を分離精製した。ゲル濾過は、S-400セファクリル（アマシャム・マルマシア株式会社）を用い、溶出液にTE Buffer (10mM Tris-HCl, pH7.0, 1mM EDTA, 1.5M NaCl)を用いて、20cmのオープンカラムで行った。その後、精製したDNA液に色素液を加え、1％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後にアガロースゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。同様に、レーン２〜レーン４に用いたＰＣＲ反応液からも、ゲル濾過を用いてそれぞれ目的のＰＣＲ産物を分離精製し、電気泳動を行った。その結果を図３のレーン５〜レーン８に示す。
【００４３】
図３から明らかなように、レーン５には、300bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン１よりも減少した。また、レーン６には、600bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン２よりも減少した。また、レーン７には、900bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン３よりも減少した。また、レーン８には、1200bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン４よりも減少した。従って、ＰＣＲ反応液をゲル濾過したことにより、目的のＰＣＲ産物をより高純度で分離精製することができた。
【００４４】
次に、二本鎖である各ＰＣＲ産物から一本鎖のプローブDNA（第２プローブDNA〜第５プローブDNA）をそれぞれ調製した。具体的には、125ul(10ug/ul)のDynabeads Streptavidin（DYNAL社）をMagnet standを用いて、500ulの6XSSC bufferで１回洗浄し、125ulの6XSSC bufferに懸濁した。上澄液を除き、そこに125ulの6XSSC bufferに希釈したゲルろ過精製を行った50ulのPCR増幅産物を混ぜ合わせた。PCR産物とDynabeads Streptavidinとの結合反応は、室温で60分間行った。Magnet standを用いて上澄を除いた後、500ulの6XSSC bufferで3回洗浄、250ulの1XSSC bufferで1回洗浄して、未反応のPCR productを除いた。一本鎖DNAの変性は、100ulのNaOH(0.15M)を加え室温で１０分間反応を行い、Magnet standを用いて上澄を新しいチューブに移した。そこに11ulの10XTE buffer(pH7.5), 6.5ul Acetic scid (1.25M)を加え、エタノール沈殿を行い一本鎖DNAを濃縮回収した。
【００４５】
なお、第１プローブDNAは、ターゲットDNAの一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる150merの塩基配列と100％相補的な150merの塩基配列からなる。また、第２プローブDNAは、ターゲットDNAの一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる300merの塩基配列と100％相補的な300merの塩基配列からなる。また、第３プローブDNAは、ターゲットDNAの一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる600merの塩基配列と100％相補的な600merの塩基配列からなる。また、第４プローブDNAは、ターゲットDNAの一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる900merの塩基配列と100％相補的な900merの塩基配列からなる。また、第５プローブDNAは、ターゲットDNAの一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる1200merの塩基配列と、100％相補的な1200merの塩基配列からなる。
【００４６】
ここで、準備した二本鎖ターゲットDNAと一本鎖プローブDNAを原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により観察した。ＡＦＭ標本作製の手順は次の通り行った。まず、二本鎖ターゲットDNAと一本鎖の第３プローブDNAを含むDNA液に最終濃度10mMとなるように塩化マグネシウムを加え、10ミリ角の雲母基板のへき開直後の新鮮な表面に50μl滴下し、室温で5分間静置した。次に、これを滅菌水5mlで洗浄し、窒素ガスで水分を吹き飛ばし、さらに真空下で40℃、15分乾燥して作製した。そして、この標本について、原子間力顕微鏡で観察した。DNAの可視化条件は、上記で作製した標本を走査型プローブ顕微鏡（ナノスコープIIIa）（Degital Instruments 社）にセットし、シリコン単結晶カンチレバー（D-NCH-10V)を用いて、タッピングモードにて測定した。スキャン範囲はＸ−Ｙ方向に0.5-2μｍ、高さ（Ｚ軸）方向に2nmで行った。DNAの長さはフリーウエアであるNIHimageを使用して計測した。その結果を図４に示す。また、図４の写真を模式的に示したものを図５に示す。
【００４７】
図４から明らかなように、原子間力顕微鏡によれば、約1.9kbpの二本鎖DNAが線状に存在する様子を各々の分子について確実に観察できた（図中左側）。また、600merの一本鎖の第３プローブDNAについてもその存在を各々の分子について確実に観察できた（図中右上）。一本鎖DNAでは、太くなっている部分や粒状になっている部分が所々見られるが、これは、一本鎖DNAは、同一分子内で相補的な配列が結合して高次構造をとるためであると考えられる。なお、この原子間力顕微鏡による観察では、少なくとも100mer程度の長さを有するものであれば、十分にその存在を確認できることが判った。
【００４８】
次に、組換えタンパク質として大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を、また、ヌクレアーゼとして大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）を用意した。さらに、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSを、また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。
【００４９】
次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNAと、プローブDNAと、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質と、大腸菌（Escherichia
coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）とを反応させて、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖の5'末端を含む末端包含領域に、プローブDNA、少なくとも大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成する（図１参照）。具体的には、1pmolのプローブDNA、3.0 μgのRecAタンパク、4 unitのExonucleaseＩ、4.8mM ATP-γS、600 ngのターゲットDNAを、20 mM 酢酸マグネシウム、30 mM 酢酸トリス（pH7.2）中で、37℃で30分間保温した。この反応では、まず、プローブDNAにRecAタンパク質が結合してプローブDNA−RecAタンパク質複合体が形成される。続いて、このプローブDNA−RecAタンパク質複合体が、ターゲットDNAに結合し、DNA-タンパク質複合体が形成される。その際、このDNA−タンパク質複合体は、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で、プローブDNAが、ターゲットDNAのうち、プローブDNAと相補的な塩基配列からなる領域（末端領域）に結合すると考えられる。なお、エキソヌクレアーゼＩは、このDNA−タンパク質複合体の安定化に作用するものと考えられる。このようなDNA−タンパク質複合体は、比較的安定なものである。
【００５０】
次に、タンパク質失活工程において、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させて、ターゲットDNAの末端近傍包含領域にプローブDNAが結合してなるDNA複合体を形成する（図１参照）。具体的には、上記の反応液に、0.5％（W/Vol）SDSと0.7mg/mlプロティナーゼKを加え、37℃において60分間保温し、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させた（除タンパクを行った）。これにより、ターゲットDNAの末端近傍包含領域にプローブDNAが結合してなるDNA複合体が形成される。このようなDNA複合体は、その構造を維持するために特別なタンパク質等を必要とせず、多少の熱を加えても、安定な状態を維持できる。
【００５１】
ここで、DNA複合体の形成を確認するための実験を行った。即ち、タンパク質失活工程を行った後の反応液に色素液を加え、1％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後にゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。その結果を図６のレーン５に示す。なお、このレーン５は、プローブDNAとして600merの第３プローブDNAを使用して上述の各反応を行ったものである。
【００５２】
図６のレーン５を見ると、図中に矢印Ａ、矢印Ｂ、矢印Ｃで示したように、３本のシグナルが検出された。このうち矢印Ａで示す位置のシグナルが、その大きさからしてDNA複合体に由来するものと考えられる。一方、矢印Ｂで示す位置のシグナルは、その大きさからしてDNA複合体を形成していないターゲットDNAに由来するものと考えられる。また、矢印Ｃで示す位置のシグナルは、その大きさからしてDNA複合体を形成していないプローブDNAに由来するものと考えられる。
【００５３】
次に、図６に結果を示した比較実験について説明する。
レーン１は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程において、RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン２は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン３は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程において、RecAタンパク質とATP-γSを加えずに、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン４は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間（レーン５では30分間）を0分間とし、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン６は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間（レーン５では30分間）を60分間とし、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
【００５４】
これから明らかなように、レーン１及びレーン３では、矢印Ａで示す位置にシグナルが検出されなかった。つまり、レーン１及びレーン３では、DNA複合体が形成されていない。この結果から、安定なDNA複合体の形成には、DNA−タンパク質複合体形成工程において、RecAタンパク質が必要であることが判る。また、レーン２では矢印Ａで示す位置にごく弱いシグナルしか検出されなかった。この結果から、安定なDNA複合体の形成には、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えるのが好適であることが判る。また、レーン４でも矢印Ａで示す位置にはごく弱いシグナルしか検出されなかった。この結果から、安定なDNA複合体の形成には、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ある程度の反応時間を要することが判る。一方、レーン６では、DNA−タンパク質複合体形成工程を十分に長い反応時間で行っているため、レーン５と同様に、矢印Ａで示す位置に強いシグナルが検出されている。即ち、安定なDNA複合体が形成されている。
【００５５】
また、その他のプローブDNAについても、上述した各反応を行い、図６のレーン５と同様に、DNA複合体の形成を確認するための電気泳動を行った。その結果を図７に示す。
レーン１は、第１プローブDNA（150mer）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が30分間）を行った結果を示す。
レーン２は、第２プローブDNA（300mer）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が30分間）を行った結果を示す。
レーン３は、第４プローブDNA（900mer）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が30分間）を行った結果を示す。
レーン４は、第５プローブDNA（1200mer）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が30分間）を行った結果を示す。
レーン５は、第１プローブDNA（150mer）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が60分間）を行った結果を示す。
レーン６は、第２プローブDNA（300mer）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が60分間）を行った結果を示す。
レーン７は、第４プローブDNA（900mer）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が60分間）を行った結果を示す。
レーン８は、第５プローブDNA（1200mer）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が60分間）を行った結果を示す。
【００５６】
図７のいずれもレーンにおいても、図中に矢印で示したシグナルと共に、それよりも大きい位置（図中上方）と小さい位置（図中下方）にそれぞれシグナルが観察された。大きい位置のシグナルは、その大きさからしてそれぞれのDNA複合体に由来するものと考えられる。一方、矢印で示す位置のシグナルは、その大きさからしてDNA複合体を形成していないターゲットDNAに由来するものと考えられる。また、小さい位置のシグナルは、その大きさからしてDNA複合体を形成していないそれぞれのプローブDNAに由来するものと考えられる。このように、いずれのプローブDNAを用いても、DNA複合体が形成されているのが判る。
【００５７】
次に、図６及び図７のゲル写真で観察されているDNA複合体を、ゲルから切り出し精製した。精製は、Gel extraction kit（アマシャム・ファルマシア）を用いて、そのプロトコルに従って行った。その後、精製した各DNA液に色素液を加え、1％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後にアガロースゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。その結果を図８に示す。
レーン１は、図７のレーン１のDNA複合体を切り出し精製した結果、即ち、第１プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン２は、図７のレーン２のDNA複合体を切り出し精製した結果、即ち、第２プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン３は、図６のレーン５のDNA複合体を切り出し精製した結果、即ち、第３プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン４は、図７のレーン３のDNA複合体を切り出し精製した結果、即ち、第４プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン５は、図７のレーン４のDNA複合体を切り出し精製した結果、即ち、第５プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を電気泳動した結果を示す。
【００５８】
図８のいずれのレーンにおいても、各々のDNA複合体に由来するシグナルが観察され、それ以外のジグナルは僅かしか観察されなかった。この結果より、いずれのサンプルも、高純度にDNA複合体が分離精製されていることが判る。
【００５９】
次に、ＡＦＭ検出工程において、原子間力顕微鏡により、精製したDNA複合体を観察した。AFM標本作製の手順は次の通りに行った。DNA液に最終濃度10mMとなるように塩化マグネシウムを加え、10ミリ角の雲母基板のへき開直後の新鮮な表面に50μl滴下し、室温にて5分間静置した。次に、これを滅菌水5mlで洗浄し、窒素ガスで水分を吹き飛ばし、さらに真空下で40℃15分乾燥して作製した。遺伝子の可視化条件は、上記で作製した標本を走査型プローブ顕微鏡（ナノスコープIIIa）（Degital Instruments 社）にセットし、シリコン単結晶カンチレバー（D-NCH-10V)を用いて、タッピングモードにて測定した。スキャン範囲はＸ−Ｙ方向に0.5-2μｍ、高さ（Ｚ軸）方向に2nmで行った。DNAの長さはフリーウエアであるNIHimageを使用して計測した。
【００６０】
なお、プローブDNAとして第１プローブDNA（150mer）を使用した結果を図９に示し、図９の写真を模式的に示したものを図１０に示す。また、プローブDNAとして第２プローブDNA（300mer）を使用した結果を図１１に示し、図１１の写真を模式的に示したものを図１２に示す。また、プローブDNAとして第３プローブDNA（600mer）を使用した結果を図１３に示し、図１３の写真を模式的に示したものを図１４に示す。また、プローブDNAとして第４プローブDNA（900mer）を使用した結果を図１５に示し、図１５の写真を模式的に示したものを図１６に示す。また、プローブDNAとして第５プローブDNA（1200mer）を使用した結果を図１７に示し、図１７の写真を模式的に示したものを図１８に示す。
【００６１】
図９及び図１０に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第１プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。このDNA複合体は、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。そして、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１１及び図１２に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第２プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。このDNA複合体も、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。そして、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１３及び図１４に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第３プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。このDNA複合体も、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。そして、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１５及び図１６に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第４プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。このDNA複合体も、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。そして、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１７及び図１８に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第５プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。このDNA複合体も、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。そして、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている。
【００６２】
以上で説明したようにしてDNA複合体を検出すれば、DNA複合体を可視化して確認できるので、DNA複合体の構造や形態なども調べることができる。また、DNA複合体の一つ一つを可視化するので、試料が微量であっても、DNA複合体を確実に検出できる。さらに、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法に比して、DNAの一部を標識するなどの手間もなく、また、DNA複合体を電気泳動したり、ゲルを乾燥させる必要もないため、検出に要する時間も短くて済む。
【００６３】
また、DNA−タンパク質複合体形成工程で用いる組換えタンパク質には、様々なものを適宜選択できるが、入手容易性、安全性、機能性を考えると、本実施形態のように、大腸菌に由来するRecAタンパク質を用いるのが好ましい。
また、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えて反応させることにより、より効率よく、DNAタンパク質複合体を形成でき、その結果、より効率よく、DNA複合体を形成できる。
また、一本鎖DNAは、その鎖長が短くても、二本鎖DNAに結合してDNA複合体を形成できる。しかし、一本鎖DNAが短いと、具体的には、60merよりも短いと、原子間力顕微鏡で観察を行ったときに、二本鎖DNAとDNA複合体との区別がつきにくい。即ち、DNA複合体の検出がより難しくなる。そこで、本実施形態のように、60mer以上の塩基配列からなる一本鎖DNAを使用すると、原子力顕微鏡で観察した場合に、DNA複合体をより確実に検出できる。
【００６４】
（実施形態２）
次いで、第２の実施の形態について説明する。なお、上記実施形態１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施形態では、タンパク質失活工程後、ＡＦＭ検出工程前に、DNA複合体とヌクレアーゼとを反応させるヌクレアーゼ処理工程を行う。それ以外は、基本的に上記実施形態１と同じである。
【００６５】
具体的に説明すると、ターゲットDNA（二本鎖DNA）として、上記実施形態１と同様に、pSP64poly(A)DNAを制限酵素RsaＩで３つのDNA断片に切断し、このうちの最も大きいDNA断片（約1.9kbp）を精製した。また、プローブDNA（一本鎖DNA）として、上記実施形態１でも利用した150merの第１プローブDNAを用意した。また、上記実施形態１と同様に、組換えタンパク質として、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を、ヌクレアーゼとして、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）を用意した。さらに、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSを、また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。
【００６６】
そして次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、上記実施形態１と同様にして、ターゲットDNAと、プローブDNAと、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質と、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）とを反応させて、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖の5'末端を含む末端包含領域に、プローブDNA、少なくとも大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成した。
次に、タンパク質失活工程において、上記実施形態１と同様にして、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させて、ターゲットDNAの末端近傍包含領域にプローブDNAが結合してなるDNA複合体を形成した。
その後、上記実施形態１と同様に、反応液を電気泳動した後、DNA結合体をゲルから切り出して精製した。
【００６７】
次に、本実施形態では、DNA複合体とヌクレアーゼとを反応させるヌクレアーゼ処理工程を行った。詳細には、精製した上記のDNA溶液について、10 unitsの大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）（Epicentre社製）、33mM Tris-Acetate（pH7.8）、66mM potassium acetate、10mM magnesium acetate、0.5mM DTT中で、37℃において20分間反応させた。
【００６８】
次に、ＡＦＭ検出工程において、上記実施形態１と同様にして、原子間力顕微鏡により、DNA複合体を観察した。その結果を図１９に示す。また、図１９の写真を模式的に示したものを図２０に示す。
図１９及び図２０に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第１プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。なお、図中では、２つのDNA複合体が観察されている。このDNA複合体は、上記実施形態１と同様に、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。上記実施形態１では、図９及び図１０に示したように、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている（ひげ状に遊離している）。これに対し、本実施形態では、およそ１００個のDNA複合体を観察したが、図１９及び図２０に示すように、ひげ状の部分を持つDNA複合体は観察されなかった。なお、観察されたDNA複合体の長さは、ターゲットDNAの長さと同じであった。このことから、ひげ状に遊離したターゲットDNAの一部は、ヌクレアーゼ処理工程において、一本鎖DNAに特異的なヌクレアーゼにより分解されてなくなったものと考えられる。
【００６９】
以上で説明したように、本実施形態においても、DNA複合体を可視化して確認できるので、DNA複合体の構造や形態なども調べることができるなど、上記実施形態１と同様な効果を得ることができる。また、本実施形態では、タンパク質失活工程後、ＡＦＭ検出工程前に、ヌクレアーゼ処理工程を行っているので、ひげ状に遊離したDNA鎖のないDNA複合体をＡＦＭにより観察できる。
【００７０】
（実施形態３）
次いで、第３の実施の形態について説明する。なお、上記実施形態１または実施形態２と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施形態では、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSの代わりにATPを用いて反応させる点が、上記実施形態１と異なる。それ以外は、基本的に上記実施形態１と同様である。
【００７１】
具体的に説明すると、ターゲットDNA（二本鎖DNA）として、上記実施形態１と同様に、pSP64poly(A)DNAを制限酵素RsaＩで３つのDNA断片に切断し、このうちの最も大きいDNA断片（約1.9kbp）を精製した。また、プローブDNA（一本鎖DNA）として、上記実施形態１でも利用した900merの第４プローブDNAを用意した。また、上記実施形態１と同様に、組換えタンパク質として、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を、ヌクレアーゼとして、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）を用意した。また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。なお、上記のように、本実施形態では、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATPを用意した。
【００７２】
そして次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、上記実施形態１と同様にして、ターゲットDNAと、プローブDNAと、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質と、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）とを反応させて、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖の5'末端を含む末端包含領域に、プローブDNA、少なくとも大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成した。即ち、ATP-γSの代わりにATPを用いた以外は、上記実施形態１と同様な反応を行って、DNA−タンパク質複合体を形成した。
【００７３】
次に、ＡＦＭ検出工程において、上記実施形態１と同様にして、原子間力顕微鏡により、DNA複合体を観察した。その結果を図２１に示す。また、図２１の写真を模式的に示したものを図２２に示す。
図２１及び図２２に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第４プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。なお、図中では、２つのDNA複合体が観察されている。このDNA複合体は、上記実施形態１と同様に、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。上記実施形態１では、図１５及び図１６に示したように、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている（ひげ状に遊離している）。これに対し、本実施形態では、およそ１００個のDNA複合体を観察したが、図２１及び図２２に示すように、ひげ状の部分を持つDNA複合体は観察されなかった。なお、観察されたDNA複合体の長さは、ターゲットDNAの長さと同じであった。即ち、上記実施形態２と同様な結果が得られた。この理由としては、DNA−タンパク質複合体形成工程中に、ATPが生化学的に分解され、RecAタンパク質がひげ状に遊離した一本鎖DNAから外れて、一本鎖DNAがヌクレアーゼにより分解されてなくなったものと考えられる。
【００７４】
以上で説明したように、本実施形態においても、DNA複合体を可視化して確認できるので、DNA複合体の構造や形態なども調べることができるなど、上記実施形態１または２と同様な効果を得ることができる。また、本実施形態では、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSの代わりにATPを用いているため、ひげ状に遊離したDNA鎖のないDNA複合体をＡＦＭにより観察できる。
【００７５】
（実施形態４）
次いで、第４の実施の形態について説明する。なお、上記実施形態１〜実施形態３のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施形態では、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSの代わりにGTPを用いて反応させる点が、上記実施形態１と異なる。それ以外は、基本的に上記実施形態１と同様である。
【００７６】
具体的に説明すると、ターゲットDNA（二本鎖DNA）として、上記実施形態１と同様に、pSP64poly(A)DNAを制限酵素RsaＩで３つのDNA断片に切断し、このうちの最も大きいDNA断片（約1.9kbp）を精製した。また、プローブDNA（一本鎖DNA）として、上記実施形態１でも利用した900merの第４プローブDNAを用意した。また、上記実施形態１と同様に、組換えタンパク質として、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を、ヌクレアーゼとして、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）を用意した。また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。なお、上記のように、本実施形態では、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、GTPを用意した。
【００７７】
そして次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、上記実施形態１と同様にして、ターゲットDNAと、プローブDNAと、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質と、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）とを反応させて、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖の5'末端を含む末端包含領域に、プローブDNA、少なくとも大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成した。即ち、ATP-γSの代わりにGTPを用いた以外は、上記実施形態１と同様な反応を行って、DNA−タンパク質複合体を形成した。
【００７８】
次に、ＡＦＭ検出工程において、上記実施形態１と同様にして、原子間力顕微鏡により、DNA複合体を観察した。その結果を図２３に示す。また、図２３の写真を模式的に示したものを図２４に示す。
図２３及び図２４に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第４プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。なお、図中では、２つのDNA複合体が観察されている。このDNA複合体は、上記実施形態１と同様に、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。上記実施形態１では、図１５及び図１６に示したように、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている（ひげ状に遊離している）。これに対し、本実施形態では、およそ１００個のDNA複合体を観察したが、図２３及び図２４に示すように、ひげ状の部分を持つDNA複合体は観察されなかった。なお、観察されたDNA複合体の長さは、ターゲットDNAの長さと同じであった。即ち、上記実施形態２及び実施形態３と同様な結果が得られた。この理由としては、上記実施形態３の場合と同様に、DNA−タンパク質複合体形成工程中に、GTPが生化学的に分解され、RecAタンパク質がひげ状に遊離した一本鎖DNAから外れて、一本鎖DNAがヌクレアーゼにより分解されてなくなったものと考えられる。
【００７９】
以上で説明したように、本実施形態においても、DNA複合体を可視化して確認できるので、DNA複合体の構造や形態なども調べることができるなど、上記実施形態１〜３と同様な効果を得ることができる。また、本実施形態では、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSの代わりにGTPを用いているため、ひげ状に遊離したDNA鎖のないDNA複合体をＡＦＭにより観察できる。
【００８０】
以上において、本発明を実施形態に即して説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることはいうまでもない。
【００８１】
【発明の効果】
本発明によれば、二本鎖DNAと一本鎖DNAが結合したDNA複合体を可視化して検出できる。
【００８２】
【配列表】
＜110＞ 株式会社アイシン・コスモス研究所
AISIN COSMOS R&D CO.,LTD
財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所
Kazusa DNA Research Institute
＜120＞ 核酸検出方法
＜130＞ ２００２ＡＩＣＯ０１
＜160＞ 6
＜210＞ 1
＜211＞ 150
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 1
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 150
＜210＞ 2
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 2
gccgggaagc tagagtaagt agtt 24
＜210＞ 3
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 3
actcaccagt cacagaaaag catc 24
＜210＞ 4
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 4
gttttaaatc aatctaaagt atat 24
＜210＞ 5
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 5
ggtggcctaa ctacggctac acta
＜210＞ 6
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 6
tcgtgcgctc tcctgttccg accc 24
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施形態１に関し、DNA複合体の形成について示す説明図である。
【図２】 実施形態１に関し、ゲル濾過したターゲットDNAを電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】 実施形態１に関し、第２〜第５プローブDNAを調製するためのＰＣＲ産物をそれぞれ電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】 実施形態１に関し、ターゲットDNAと第３プローブDNAを原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図５】 実施形態１に関し、図４の写真を模式的に示した説明図である。
【図６】 実施形態１に関し、様々な反応条件でDNA複合体を形成したものについて電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図７】 実施形態１に関し、様々なプローブDNAでDNA複合体を形成したものについて電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図８】 実施形態１に関し、精製した様々なDNA複合体を電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図９】 実施形態１に関し、第１プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１０】 実施形態１に関し、図９の写真を模式的に示した説明図である。
【図１１】 実施形態１に関し、第２プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１２】 実施形態１に関し、図１１の写真を模式的に示した説明図である。
【図１３】 実施形態１に関し、第３プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１４】 実施形態１に関し、図１３の写真を模式的に示した説明図である。
【図１５】 実施形態１に関し、第４プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１６】 実施形態１に関し、図１５の写真を模式的に示した説明図である。
【図１７】 実施形態１に関し、第５プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１８】 実施形態１に関し、図１７の写真を模式的に示した説明図である。
【図１９】 実施形態２に関し、DNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図２０】 実施形態２に関し、図１９の写真を模式的に示した説明図である。
【図２１】 実施形態３に関し、DNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図２２】 実施形態３に関し、図２１の写真を模式的に示した説明図である。
【図２３】 実施形態４に関し、DNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図２４】 実施形態３に関し、図２３の写真を模式的に示した説明図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖DNAと一本鎖DNAが結合してなるDNA複合体を検出する核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、二本鎖DNAと一本鎖DNAとを含む複合体の形成方法が知られている。即ち、ターゲットDNA（二本鎖DNA）を用意すると共に、このターゲットDNAのいずれか一方のDNA鎖の一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブDNA（一本鎖DNA）を用意する。次に、緩衝剤等を含む反応液に、これらのDNAと大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を混ぜて、十分な時間保温する。そうすると、ターゲットDNAとプローブDNAとRecAタンパク質とからなるDNA−タンパク質複合体が形成される。具体的には、まず、プローブDNAにRecAタンパク質が結合してプローブDNA−RecAタンパク質複合体が形成される。続いて、このプローブDNA−RecAタンパク質複合体が、ターゲットDNAに結合し、三本鎖形成領域を有するDNA-タンパク質複合体が形成される。その際、プローブDNAは、RecAタンパク質が関与した状態で、ターゲットDNAのうち、プローブDNAと相補的な塩基配列からなる領域に結合すると考えられている。この状態のDNA−タンパク質複合体は、比較的安定なものである。
【０００３】
ところが、このDNA−タンパク質複合体に、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）やタンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼK）などを加えて十分な時間保温し、RecAタンパク質を失活させると、DNA−タンパク質複合体からRecAタンパク質が除去されるだけでなく、ターゲットDNAとプローブDNAとの結合も解消される。つまり、DNA−タンパク質複合体は、RecAタンパク質の存在下においてのみ、その構造が安定に維持され、RecAタンパク質がない状態では、安定なDNA複合体を形成することができなかった。遺伝子工学等の分野において、DNA複合体を利用しようとした場合、RecAタンパク質が結合した状態の複合体では、RecAタンパク質の存在により多くの制限を受け、その利用範囲が狭くなる。そこで、このようなタンパク質が存在しなくても安定な構造を維持できるDNA複合体の形成方法の開発が待たれていた。
【０００４】
このような問題に対し、本出願人は、複合体中にタンパク質を含有しないにも拘わらず、安定な状態を維持できるDNA複合体の形成方法を見出した（特許文献１参照。）。即ち、直鎖状の二本鎖DNAと、この二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNAを用意する。次に、緩衝剤等を含む反応液に、これらのDNAと大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を混ぜ、さらに、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩを混ぜて、十分な時間保温する。そうすると、少なくとも二本鎖DNAと一本鎖DNAとRecAタンパク質を含む比較的安定なDNA−タンパク質複合体が形成される。このようにして形成したDNA−タンパク質複合体は、その後、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させても、安定なDNA複合体を形成できる。つまり、複合体中にタンパク質を含有しないにも拘わらず、安定な状態を維持できるDNA複合体を形成できる。
【発明が解決しようとする課題】
このようなDNA複合体は、例えば、予め一本鎖DNAを標識しておけば、DNA複合体が標識されるため、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法により、その存在を確認できる。
しかしながら、従来は、DNA複合体を可視化して確認することはできなかったため、DNA複合体の構造や形態などを調べることができなかった。また、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法では、DNA複合体の集団（バルク）を検出するため、試料が微量の場合には、DNA複合体を確実に検出することができない。また、検出に時間を要するなどの問題点があった。
【０００５】
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、二本鎖DNAと一本鎖DNAが結合したDNA複合体を可視化して検出できる核酸検出方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
その解決手段は、直鎖状の二本鎖DNA、この二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列に、相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNA、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質である組換えタンパク質、並びに、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩであるヌクレアーゼ、を反応させて、上記二本鎖DNAのうち、上記一方のDNA鎖の5'末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖DNAのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が、少なくとも上記組換えタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成するDNA−タンパク質複合体形成工程と、上記組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させて、上記二本鎖DNAの末端近傍包含領域に上記一本鎖DNAの相補的領域が結合してなるDNA複合体を形成するタンパク質失活工程と、原子間力顕微鏡により、上記DNA複合体を検出するＡＦＭ検出工程と、を備え、上記DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加え、上記タンパク質失活工程後、上記ＡＦＭ検出工程前に、上記DNA複合体と上記ヌクレアーゼとを反応させるヌクレアーゼ処理工程を備えることを特徴とする核酸検出方法である。
【０００７】
本発明によれば、DNA−タンパク質複合体形成工程において、二本鎖DNAと一本鎖DNAと組換えタンパク質とヌクレアーゼから、DNA−タンパク質複合体を形成する。そしてその後、タンパク質失活工程において、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させると、二本鎖DNAの末端近傍包含領域に一本鎖DNAの相補的領域が結合したDNA複合体を形成できる。このようなDNA複合体は、その構造を安定化させるための特別なタンパク質等（例えば、前述したRecAタンパク質）が存在しなくても、多少の熱を加えるなどしても解離することなく、安定な状態を維持できる。その後は、ＡＦＭ検出工程において、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により、このDNA複合体を検出する。
【０００８】
このような方法によりDNA複合体を検出すれば、DNA複合体を可視化して確認できるので、DNA複合体の構造や形態なども調べることができる。また、DNA複合体の一つ一つを可視化するので、試料が微量であっても、DNA複合体を確実に検出できる。さらに、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法に比して、DNAの一部を標識するなどの手間もなく、また、DNA複合体を電気泳動したり、そのゲルを乾燥させる必要もないため、検出に要する時間も短くて済む。
なお、二本鎖DNAと一本鎖DNAの結合領域は、二本鎖DNAの一方の末端近傍包含領域に形成するだけでなく、二本鎖DNAの両方の末端近傍包含領域に形成することも可能である。
また、組換えタンパク質は、入手容易性、安全性、機能性を考えると、大腸菌に由来するRecAタンパク質を用いるのが好ましい。
また、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えて反応させれば、より効率よく、DNAタンパク質複合体を形成できる。その結果、より効率よくDNA複合体を形成できる。
また、DNA−タンパク質複合体形成工程でATP-γSを加えてDNAタンパク質複合体を形成する場合、二本鎖DNAの一方のDNA鎖の一部がひげ状に遊離したDNA複合体が形成されることがある。これに対し、本発明では、タンパク質失活工程後、ＡＦＭ検出工程前に、DNA複合体とヌクレアーゼとを反応させるので、ひげ状に遊離したDNAはヌクレアーゼにより分解される。従って、ひげ状に遊離した部分のないDNA複合体をＡＦＭにより観察できる。
【０００９】
ここで、DNA結合体は、二本鎖DNAの少なくとも一方の末端近傍包含領域に、一本鎖DNAの相補的領域が結合したものであれば、その結合形態は問われない。つまり、二本鎖DNAと一本鎖DNAとの間で、必ずしも、ワトソン・クリック型塩基対やフーグスティーン型塩基対のような特定の構造をとっている必要はなく、二本鎖DNAの末端近傍包含領域と一本鎖DNAの相補的領域との間で、何らかの特異的な相互作用によって結合されていればよい。
【００１０】
二本鎖DNAは、直鎖状であれば、いかなるものを用いてもよい。即ち、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、3000Mbpといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なDNAであっても構わない。勿論、二本鎖DNAの由来は問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来のDNAやそれらを改変したDNAであっても、微生物等のもつプラスミドDNA等やプラスミドDNA等に異種のDNA断片を挿入したキメラDNA等であっても、あるいは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。
【００１１】
一本鎖DNAは、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状のものであれば、いかなるもの用いてもよい。即ち、この条件を満たす限り、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。また、その由来も問われない。これらの点は、二本鎖DNAと同様である。
【００１２】
相補的な程度は、一般的には、およそ70〜80％以上の相補性を有することが必要とされ、より好ましくは、ほぼ100％の相補性を有することである。相補性が高いほど、より安定なDNA複合体を形成できるからである。但し、必要とされる相補性の程度は、相補的領域の長さによって若干変動する。また、相補的領域全体の相補性は同じ（例えば70％）であっても、相補的領域内全体でほぼ等しい相補性（70％）を有する場合と、相補的領域内に相補性が高い領域（例えば90％）と低い領域（例えば50％）が偏在する場合とによっても、若干変動する。
【００１３】
また、一本鎖DNAは、相補的領域を含むものであればよいから、一本鎖DNA全体が相補的領域からなるものであっても、あるいは、相補的領域にさらに他の塩基配列が付加されたものであっても構わない。但し、一本鎖DNA全体が相補的領域からなるものの方が、より安定なDNA複合体を形成しやすいので好ましい。
なお、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「末端近傍の塩基から始まる塩基配列」と、実質的に相補的な塩基配列を含む必要があるのは、次のような理由による。即ち、一本鎖DNAが、二本鎖DNAの一方のDNA鎖の末端近傍以外の塩基配列（例えば、中央付近の塩基配列）にだけ相補的である場合には、DNA−タンパク質複合体形成工程において安定なDNA−タンパク質複合体を形成できるが、タンパク質失活工程でタンパク質を失活させると、二本鎖DNAと一本鎖DNAが解離してしまい、安定なDNA複合体が得られないからである。
【００１４】
また、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「5'末端近傍」の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む必要があるのも、同様な理由による。即ち、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「3'末端近傍」の塩基配列にだけ相補的である場合には、DNA−タンパク質複合体形成工程において安定なDNA−タンパク質複合体を形成することはできるが、タンパク質を失活させると、二本鎖DNAと一本鎖DNAが解離してしまい、安定なDNA複合体が得られないからである。
【００１５】
【００１６】
【００１７】
【００１８】
DNA−タンパク質複合体形成工程は、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体の存在下において、緩衝液中で行うのが好ましい。効率よく、安定なDNA−タンパク質複合体を形成できるからである。
緩衝液は、使用する組換えタンパク質及びヌクレアーゼにより、反応の最適条件を得るため適宜変更することできる。例えば、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）と酢酸や塩酸等の適当な酸とにより、ｐＨを約4.0〜9.0、より好ましくは、約7.0〜8.0に調節したトリス系の緩衝液を使用すればよい。緩衝剤は、一般に約10〜100mM、好ましくは、約30mMで使用する。
【００１９】
ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としては、例えば、アデノシン5'−三リン酸（ATP）、グアノシン5'−三リン酸（GTP）、UTP、CTPや、アデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ATP-γS）、グアノシン（γ−チオ）−三リン酸（GTP-γS）、dATP、dUTP、dCTPなどを挙げることができる。これらは、さらにヌクレオシド二リン酸（例えば、ADP）と組み合わせて使用することもできる。なお、これらヌクレオシド三リン酸等は、0.1〜10mM、好ましくは、約5mMで使用する。
【００２０】
反応液中の核酸（二本鎖DNA及び一本鎖DNA）の濃度は、核酸が十分に溶解できる濃度であればよく、適宜変更できる。二本鎖DNAに対する一本鎖DNAの割合は、モル比で約1〜100倍とするのが好ましい。また、組換えタンパク質は、一本鎖DNAの3塩基当たり1分子に相当するように加えるのが好ましい。但し、使用する組換えタンパク質によってその最適量は若干変動する。また、ヌクレアーゼは、二本鎖DNAの1μg当たり約1unit加えるのが好ましい。但し、これも使用するヌクレアーゼによってその最適量は若干変動する。
このように調製した反応液は、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、5分間以上、一般には約30〜60分間保温することにより、DNA−タンパク質複合体を形成できる。
【００２１】
なお、この工程では、上記のように反応液中にすべてのもの加えて一定時間保温する方法の他、次のような方法を採ることもできる。即ち、まず、ヌクレオシド三リン酸等を含む緩衝液に、二本鎖DNAと一本鎖DNAと組換えタンパク質とを加えて、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、数分間以上、好ましくは約10分間保温する。そしてその後、この反応液にヌクレアーゼを加えて、さらに、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、5分間以上、一般には約30分間保温する。
【００２２】
このような方法で反応させると、特に安定なDNA−タンパク質複合体を形成できる。その理由としては、エキソヌクレアーゼＩ等は、本来、一本鎖DNAを末端から切断していく酵素であるから、最初から反応液に加えると、一本鎖DNAが削られてしまうことがある。しかし、このようにエキソヌクレアーゼＩ等を後から加えると、一本鎖DNAには先に組換えタンパク質が結合して、エキソヌクレアーゼＩから保護されるため、一本鎖DNAが切断されにくくなり、安定なDNA−タンパク質複合体を形成できると考えられるからである。
【００２３】
タンパク質失活工程で、タンパク質を失活させるには、反応液にキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）を加えるか、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を加えるか、または、タンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼK）を加え、あるいは、これらの処理を組み合わせて行った後、例えば、約37℃で10分間以上保温すればよい。こうして得られる反応液からDNA複合体だけを回収するには、フェノール、クロロホルム等の溶媒抽出により除タンパク質処理を行った後、適当なカラムクロマトグラフィーで回収する方法を利用したり、あるいは、エタノール沈殿で一旦DNAを析出させる方法を利用すればよい。
【００２４】
【００２５】
【００２６】
【００２７】
【００２８】
さらに、上記のいずれかに記載の酸検出方法であって、上記DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸を加えることを特徴とする核酸検出方法とすると良い。
【００２９】
このように、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP等のヌクレオシド三リン酸を加えて反応させれば、より効率よく、DNAタンパク質複合体を形成できる。その結果、より効率よくDNA複合体を形成できる。
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【００３３】
【００３４】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸検出方法であって、上記一本鎖DNAは、60mer以上の塩基配列からなることを特徴とする核酸検出方法とすると良い。
【００３５】
一本鎖DNAは、その鎖長が短くても、二本鎖DNAに結合してDNA複合体を形成できる。しかし、一本鎖DNAが短いと、具体的には、60merよりも短いと、原子間力顕微鏡で観察を行ったときに、二本鎖DNAとDNA複合体との区別がつきにくい。即ち、DNA複合体の検出がより難しくなる。
これに対し、本発明では、60mer以上の塩基配列からなる一本鎖DNAを使用する。従って、原子力顕微鏡で観察した場合に、DNA複合体をより確実に検出できる。
【００３６】
【発明の実施の形態】
（実施形態１）
以下、本発明の実施形態について図面を参照しつつ説明する。
まず、ターゲットDNA（二本鎖DNA）を用意する（図１参照）。図１はDNA複合体の形成について模式的に示したものである。本実施形態では、pSP64poly(A)DNA（Promega）（3030bp）を制限酵素RsaＩで３つのDNA断片（1892bpと676bpと462bpのDNA断片）に切断し、このうちの最も大きいDNA断片（約1.9kbp）をターゲットDNAとした。具体的には、pSP64poly(A)DNAを制限酵素RsaＩで切断した後、ゲル濾過を用いて目的のDNA断片を分離精製した。ゲル濾過は、S-1000セファクリル（アマシャム・マルマシア株式会社）を用い、溶出緩衝液にTE Buffer（10mM Tris-HCl，pH7.0，1mM EDTA，1.5M NaCl）を用いて、100cmのオープンカラムで行った。溶出されてきたDNAサンプル液を1mL/minの速度で2mlずつ回収した。そして、回収したそれぞれのサンプルの一部を電気泳動して確認した。その結果を図２に示す。
【００３７】
図２から明らかなように、レーン１〜レーン２あたりでは、シグナルがほとんど検出されなかった。また、レーン３〜レーン２０あたりでは、最も大きい約1.9kbpのDNA断片に由来するシグナルが主として確認された。また、レーン２１〜レーン２７あたりでは、最も大きい約1.9kbpの断片に由来するシグナルと共に、２番目に大きい約0.7kbpのDNA断片に由来するシグナルが主として確認された。また、レーン２８〜レーン２９あたりでは、２番目に大きい約0.7kbpのDNA断片に由来するシグナルが主として確認された。また、レーン３０〜レーン３７では、２番目に大きい約0.7kbpのDNA断片に由来するシグナルと、最も小さい約0.5kbpのDNA断片に由来するシグナルが主として確認された。このような結果に基づいて、ターゲットDNAには、レーン３〜レーン２０に使用したサンプルを利用した。
【００３８】
次に、プローブDNA（一本鎖DNA）を用意する（図１参照）。本実施形態では、長さの異なる５種類のプローブDNA、即ち、150merの第１プローブDNA、300merの第２プローブDNA、600merの第３プローブDNA、900merの第４プローブDNA、及び、1200merの第５プローブDNAを用意した。具体的には、最も短い第１プローブDNAは、DNA合成によりオリゴヌクレオチド１として調製した。一方、第２プローブDNA〜第５プローブDNAは、ＰＣＲ反応を利用して調製した。ＰＣＲ反応は、600ngのpSP64poly(A)DNA（Promega）を鋳型として、50μlのＰＣＲ反応液に、0.5mM（最終濃度）のフォワード側のプライマーDNAと0.5mM（最終濃度）のリバース側のプライマーDNA、0.25unitのTaKaRa Taq（タカラバイオ株式会社）、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTPを、10mM Tris-HCl buffer（pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2 に混合した。ＰＣＲ反応は、１サイクル（94℃，2min）、３０サイクル（94℃，30sec−60℃，30sec−74℃，60sec）、１サイクル（74℃，7min−4℃，1min）の条件で行った。その後、ＰＣＲ反応液に色素液を加え、1％アガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動後にアガロースゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。その結果を図３のレーン１〜レーン４に示す。
【００３９】
なお、第２プローブDNAは、フォワード側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド２を、リバース側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド３を使用した。また、第３プローブDNAは、フォワード側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド４を、リバース側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド３を使用した。また、第４プローブDNAは、フォワード側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド５を、リバース側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド３を使用した。また、第５プローブDNAは、フォワード側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド６を、リバース側のプライマーDNAにオリゴヌクレオチド３を使用した。オリゴヌクレオチド１〜オリゴヌクレオチド６は、いずれもpSP64poly(A)DNAに100％相補的な配列からなるものである。なお、オリゴヌクレオチド３の5'末端には、後に一本鎖のプローブDNAを調製するために、ビオチンを付加させておいた。
【００４０】
オリゴヌクレオチド１：
5'-tgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagt-3’
オリゴヌクレオチド２：
5'-gccgggaagctagagtaagtagtt-3’
オリゴヌクレオチド３：
5'-actcaccagtcacagaaaagcatc-3’
オリゴヌクレオチド４：
5'-gttttaaatcaatctaaagtatat-3’
オリゴヌクレオチド５：
5'-ggtggcctaactacggctacacta-3’
オリゴヌクレオチド６：
5'-tcgtgcgctctcctgttccgaccc-3’
【００４１】
図３から明らかなように、レーン１には、300bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出された。また、レーン２には、600bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出された。レーン３には、900bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出された。レーン４には、1200bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出された。
【００４２】
次に、レーン１に用いたＰＣＲ反応液から、ゲル濾過を用いて目的のＰＣＲ産物を分離精製した。ゲル濾過は、S-400セファクリル（アマシャム・マルマシア株式会社）を用い、溶出液にTE Buffer (10mM Tris-HCl, pH7.0, 1mM EDTA, 1.5M NaCl)を用いて、20cmのオープンカラムで行った。その後、精製したDNA液に色素液を加え、1％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後にアガロースゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。同様に、レーン２〜レーン４に用いたＰＣＲ反応液からも、ゲル濾過を用いてそれぞれ目的のＰＣＲ産物を分離精製し、電気泳動を行った。その結果を図３のレーン５〜レーン８に示す。
【００４３】
図３から明らかなように、レーン５には、300bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン１よりも減少した。また、レーン６には、600bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン２よりも減少した。また、レーン７には、900bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン３よりも減少した。また、レーン８には、1200bpの目的のDNA断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン４よりも減少した。従って、ＰＣＲ反応液をゲル濾過したことにより、目的のＰＣＲ産物をより高純度で分離精製することができた。
【００４４】
次に、二本鎖である各ＰＣＲ産物から一本鎖のプローブDNA（第２プローブDNA〜第５プローブDNA）をそれぞれ調製した。具体的には、125ul(10ug/ul)のDynabeads Streptavidin（DYNAL社）をMagnet standを用いて、500ulの6XSSC bufferで１回洗浄し、125ulの6XSSC bufferに懸濁した。上澄液を除き、そこに125ulの6XSSC bufferに希釈したゲルろ過精製を行った50ulのPCR増幅産物を混ぜ合わせた。PCR産物とDynabeads Streptavidinとの結合反応は、室温で60分間行った。Magnet standを用いて上澄を除いた後、500ulの6XSSC bufferで3回洗浄、250ulの1XSSC bufferで1回洗浄して、未反応のPCR productを除いた。一本鎖DNAの変性は、100ulのNaOH(0.15M)を加え室温で１０分間反応を行い、Magnet standを用いて上澄を新しいチューブに移した。そこに11ulの10XTE buffer(pH7.5), 6.5ul Acetic scid (1.25M)を加え、エタノール沈殿を行い一本鎖DNAを濃縮回収した。
【００４５】
なお、第１プローブDNAは、ターゲットDNAの一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる150merの塩基配列と100％相補的な150merの塩基配列からなる。また、第２プローブDNAは、ターゲットDNAの一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる300merの塩基配列と100％相補的な300merの塩基配列からなる。また、第３プローブDNAは、ターゲットDNAの一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる600merの塩基配列と100％相補的な600merの塩基配列からなる。また、第４プローブDNAは、ターゲットDNAの一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる900merの塩基配列と100％相補的な900merの塩基配列からなる。また、第５プローブDNAは、ターゲットDNAの一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる1200merの塩基配列と、100％相補的な1200merの塩基配列からなる。
【００４６】
ここで、準備した二本鎖ターゲットDNAと一本鎖プローブDNAを原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により観察した。ＡＦＭ標本作製の手順は次の通り行った。まず、二本鎖ターゲットDNAと一本鎖の第３プローブDNAを含むDNA液に最終濃度10mMとなるように塩化マグネシウムを加え、10ミリ角の雲母基板のへき開直後の新鮮な表面に50μl滴下し、室温で5分間静置した。次に、これを滅菌水5mlで洗浄し、窒素ガスで水分を吹き飛ばし、さらに真空下で40℃、15分乾燥して作製した。そして、この標本について、原子間力顕微鏡で観察した。DNAの可視化条件は、上記で作製した標本を走査型プローブ顕微鏡（ナノスコープIIIa）（Degital Instruments 社）にセットし、シリコン単結晶カンチレバー（D-NCH-10V)を用いて、タッピングモードにて測定した。スキャン範囲はＸ−Ｙ方向に0.5-2μｍ、高さ（Ｚ軸）方向に2nmで行った。DNAの長さはフリーウエアであるNIHimageを使用して計測した。その結果を図４に示す。また、図４の写真を模式的に示したものを図５に示す。
【００４７】
図４から明らかなように、原子間力顕微鏡によれば、約1.9kbpの二本鎖DNAが線状に存在する様子を各々の分子について確実に観察できた（図中左側）。また、600merの一本鎖の第３プローブDNAについてもその存在を各々の分子について確実に観察できた（図中右上）。一本鎖DNAでは、太くなっている部分や粒状になっている部分が所々見られるが、これは、一本鎖DNAは、同一分子内で相補的な配列が結合して高次構造をとるためであると考えられる。なお、この原子間力顕微鏡による観察では、少なくとも100mer程度の長さを有するものであれば、十分にその存在を確認できることが判った。
【００４８】
次に、組換えタンパク質として大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を、また、ヌクレアーゼとして大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）を用意した。さらに、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSを、また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。
【００４９】
次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNAと、プローブDNAと、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質と、大腸菌（Escherichia
coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）とを反応させて、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖の5'末端を含む末端包含領域に、プローブDNA、少なくとも大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成する（図１参照）。具体的には、1pmolのプローブDNA、3.0 μgのRecAタンパク、4 unitのExonucleaseＩ、4.8mM ATP-γS、600 ngのターゲットDNAを、20 mM 酢酸マグネシウム、30 mM 酢酸トリス（pH7.2）中で、37℃で30分間保温した。この反応では、まず、プローブDNAにRecAタンパク質が結合してプローブDNA−RecAタンパク質複合体が形成される。続いて、このプローブDNA−RecAタンパク質複合体が、ターゲットDNAに結合し、DNA-タンパク質複合体が形成される。その際、このDNA−タンパク質複合体は、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で、プローブDNAが、ターゲットDNAのうち、プローブDNAと相補的な塩基配列からなる領域（末端領域）に結合すると考えられる。なお、エキソヌクレアーゼＩは、このDNA−タンパク質複合体の安定化に作用するものと考えられる。このようなDNA−タンパク質複合体は、比較的安定なものである。
【００５０】
次に、タンパク質失活工程において、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させて、ターゲットDNAの末端近傍包含領域にプローブDNAが結合してなるDNA複合体を形成する（図１参照）。具体的には、上記の反応液に、0.5％（W/Vol）SDSと0.7mg/mlプロティナーゼKを加え、37℃において60分間保温し、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させた（除タンパクを行った）。これにより、ターゲットDNAの末端近傍包含領域にプローブDNAが結合してなるDNA複合体が形成される。このようなDNA複合体は、その構造を維持するために特別なタンパク質等を必要とせず、多少の熱を加えても、安定な状態を維持できる。
【００５１】
ここで、DNA複合体の形成を確認するための実験を行った。即ち、タンパク質失活工程を行った後の反応液に色素液を加え、1％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後にゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。その結果を図６のレーン５に示す。なお、このレーン５は、プローブDNAとして600merの第３プローブDNAを使用して上述の各反応を行ったものである。
【００５２】
図６のレーン５を見ると、図中に矢印Ａ、矢印Ｂ、矢印Ｃで示したように、３本のシグナルが検出された。このうち矢印Ａで示す位置のシグナルが、その大きさからしてDNA複合体に由来するものと考えられる。一方、矢印Ｂで示す位置のシグナルは、その大きさからしてDNA複合体を形成していないターゲットDNAに由来するものと考えられる。また、矢印Ｃで示す位置のシグナルは、その大きさからしてDNA複合体を形成していないプローブDNAに由来するものと考えられる。
【００５３】
次に、図６に結果を示した比較実験について説明する。
レーン１は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程において、RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン２は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン３は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程において、RecAタンパク質とATP-γSを加えずに、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン４は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間（レーン５では30分間）を0分間とし、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン６は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間（レーン５では30分間）を60分間とし、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
【００５４】
これから明らかなように、レーン１及びレーン３では、矢印Ａで示す位置にシグナルが検出されなかった。つまり、レーン１及びレーン３では、DNA複合体が形成されていない。この結果から、安定なDNA複合体の形成には、DNA−タンパク質複合体形成工程において、RecAタンパク質が必要であることが判る。また、レーン２では矢印Ａで示す位置にごく弱いシグナルしか検出されなかった。この結果から、安定なDNA複合体の形成には、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えるのが好適であることが判る。また、レーン４でも矢印Ａで示す位置にはごく弱いシグナルしか検出されなかった。この結果から、安定なDNA複合体の形成には、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ある程度の反応時間を要することが判る。一方、レーン６では、DNA−タンパク質複合体形成工程を十分に長い反応時間で行っているため、レーン５と同様に、矢印Ａで示す位置に強いシグナルが検出されている。即ち、安定なDNA複合体が形成されている。
【００５５】
また、その他のプローブDNAについても、上述した各反応を行い、図６のレーン５と同様に、DNA複合体の形成を確認するための電気泳動を行った。その結果を図７に示す。
レーン１は、第１プローブDNA（150mer）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が30分間）を行った結果を示す。
レーン２は、第２プローブDNA（300mer）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が30分間）を行った結果を示す。
レーン３は、第４プローブDNA（900mer）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が30分間）を行った結果を示す。
レーン４は、第５プローブDNA（1200mer）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が30分間）を行った結果を示す。
レーン５は、第１プローブDNA（150mer）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が60分間）を行った結果を示す。
レーン６は、第２プローブDNA（300mer）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が60分間）を行った結果を示す。
レーン７は、第４プローブDNA（900mer）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が60分間）を行った結果を示す。
レーン８は、第５プローブDNA（1200mer）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間が60分間）を行った結果を示す。
【００５６】
図７のいずれもレーンにおいても、図中に矢印で示したシグナルと共に、それよりも大きい位置（図中上方）と小さい位置（図中下方）にそれぞれシグナルが観察された。大きい位置のシグナルは、その大きさからしてそれぞれのDNA複合体に由来するものと考えられる。一方、矢印で示す位置のシグナルは、その大きさからしてDNA複合体を形成していないターゲットDNAに由来するものと考えられる。また、小さい位置のシグナルは、その大きさからしてDNA複合体を形成していないそれぞれのプローブDNAに由来するものと考えられる。このように、いずれのプローブDNAを用いても、DNA複合体が形成されているのが判る。
【００５７】
次に、図６及び図７のゲル写真で観察されているDNA複合体を、ゲルから切り出し精製した。精製は、Gel extraction kit（アマシャム・ファルマシア）を用いて、そのプロトコルに従って行った。その後、精製した各DNA液に色素液を加え、1％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後にアガロースゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。その結果を図８に示す。
レーン１は、図７のレーン１のDNA複合体を切り出し精製した結果、即ち、第１プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン２は、図７のレーン２のDNA複合体を切り出し精製した結果、即ち、第２プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン３は、図６のレーン５のDNA複合体を切り出し精製した結果、即ち、第３プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン４は、図７のレーン３のDNA複合体を切り出し精製した結果、即ち、第４プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン５は、図７のレーン４のDNA複合体を切り出し精製した結果、即ち、第５プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を電気泳動した結果を示す。
【００５８】
図８のいずれのレーンにおいても、各々のDNA複合体に由来するシグナルが観察され、それ以外のジグナルは僅かしか観察されなかった。この結果より、いずれのサンプルも、高純度にDNA複合体が分離精製されていることが判る。
【００５９】
次に、ＡＦＭ検出工程において、原子間力顕微鏡により、精製したDNA複合体を観察した。AFM標本作製の手順は次の通りに行った。DNA液に最終濃度10mMとなるように塩化マグネシウムを加え、10ミリ角の雲母基板のへき開直後の新鮮な表面に50μl滴下し、室温にて5分間静置した。次に、これを滅菌水5mlで洗浄し、窒素ガスで水分を吹き飛ばし、さらに真空下で40℃15分乾燥して作製した。遺伝子の可視化条件は、上記で作製した標本を走査型プローブ顕微鏡（ナノスコープIIIa）（Degital Instruments 社）にセットし、シリコン単結晶カンチレバー（D-NCH-10V)を用いて、タッピングモードにて測定した。スキャン範囲はＸ−Ｙ方向に0.5-2μｍ、高さ（Ｚ軸）方向に2nmで行った。DNAの長さはフリーウエアであるNIHimageを使用して計測した。
【００６０】
なお、プローブDNAとして第１プローブDNA（150mer）を使用した結果を図９に示し、図９の写真を模式的に示したものを図１０に示す。また、プローブDNAとして第２プローブDNA（300mer）を使用した結果を図１１に示し、図１１の写真を模式的に示したものを図１２に示す。また、プローブDNAとして第３プローブDNA（600mer）を使用した結果を図１３に示し、図１３の写真を模式的に示したものを図１４に示す。また、プローブDNAとして第４プローブDNA（900mer）を使用した結果を図１５に示し、図１５の写真を模式的に示したものを図１６に示す。また、プローブDNAとして第５プローブDNA（1200mer）を使用した結果を図１７に示し、図１７の写真を模式的に示したものを図１８に示す。
【００６１】
図９及び図１０に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第１プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。このDNA複合体は、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。そして、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１１及び図１２に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第２プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。このDNA複合体も、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。そして、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１３及び図１４に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第３プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。このDNA複合体も、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。そして、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１５及び図１６に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第４プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。このDNA複合体も、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。そして、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１７及び図１８に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第５プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。このDNA複合体も、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。そして、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている。
【００６２】
以上で説明したようにしてDNA複合体を検出すれば、DNA複合体を可視化して確認できるので、DNA複合体の構造や形態なども調べることができる。また、DNA複合体の一つ一つを可視化するので、試料が微量であっても、DNA複合体を確実に検出できる。さらに、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法に比して、DNAの一部を標識するなどの手間もなく、また、DNA複合体を電気泳動したり、ゲルを乾燥させる必要もないため、検出に要する時間も短くて済む。
【００６３】
また、DNA−タンパク質複合体形成工程で用いる組換えタンパク質には、様々なものを適宜選択できるが、入手容易性、安全性、機能性を考えると、本実施形態のように、大腸菌に由来するRecAタンパク質を用いるのが好ましい。
また、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えて反応させることにより、より効率よく、DNAタンパク質複合体を形成でき、その結果、より効率よく、DNA複合体を形成できる。
また、一本鎖DNAは、その鎖長が短くても、二本鎖DNAに結合してDNA複合体を形成できる。しかし、一本鎖DNAが短いと、具体的には、60merよりも短いと、原子間力顕微鏡で観察を行ったときに、二本鎖DNAとDNA複合体との区別がつきにくい。即ち、DNA複合体の検出がより難しくなる。そこで、本実施形態のように、60mer以上の塩基配列からなる一本鎖DNAを使用すると、原子力顕微鏡で観察した場合に、DNA複合体をより確実に検出できる。
【００６４】
（実施形態２）
次いで、第２の実施の形態について説明する。なお、上記実施形態１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施形態では、タンパク質失活工程後、ＡＦＭ検出工程前に、DNA複合体とヌクレアーゼとを反応させるヌクレアーゼ処理工程を行う。それ以外は、基本的に上記実施形態１と同じである。
【００６５】
具体的に説明すると、ターゲットDNA（二本鎖DNA）として、上記実施形態１と同様に、pSP64poly(A)DNAを制限酵素RsaＩで３つのDNA断片に切断し、このうちの最も大きいDNA断片（約1.9kbp）を精製した。また、プローブDNA（一本鎖DNA）として、上記実施形態１でも利用した150merの第１プローブDNAを用意した。また、上記実施形態１と同様に、組換えタンパク質として、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を、ヌクレアーゼとして、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）を用意した。さらに、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSを、また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。
【００６６】
そして次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、上記実施形態１と同様にして、ターゲットDNAと、プローブDNAと、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質と、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）とを反応させて、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖の5'末端を含む末端包含領域に、プローブDNA、少なくとも大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成した。
次に、タンパク質失活工程において、上記実施形態１と同様にして、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させて、ターゲットDNAの末端近傍包含領域にプローブDNAが結合してなるDNA複合体を形成した。
その後、上記実施形態１と同様に、反応液を電気泳動した後、DNA結合体をゲルから切り出して精製した。
【００６７】
次に、本実施形態では、DNA複合体とヌクレアーゼとを反応させるヌクレアーゼ処理工程を行った。詳細には、精製した上記のDNA溶液について、10 unitsの大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）（Epicentre社製）、33mM Tris-Acetate（pH7.8）、66mM potassium acetate、10mM magnesium acetate、0.5mM DTT中で、37℃において20分間反応させた。
【００６８】
次に、ＡＦＭ検出工程において、上記実施形態１と同様にして、原子間力顕微鏡により、DNA複合体を観察した。その結果を図１９に示す。また、図１９の写真を模式的に示したものを図２０に示す。
図１９及び図２０に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第１プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。なお、図中では、２つのDNA複合体が観察されている。このDNA複合体は、上記実施形態１と同様に、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。上記実施形態１では、図９及び図１０に示したように、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている（ひげ状に遊離している）。これに対し、本実施形態では、およそ１００個のDNA複合体を観察したが、図１９及び図２０に示すように、ひげ状の部分を持つDNA複合体は観察されなかった。なお、観察されたDNA複合体の長さは、ターゲットDNAの長さと同じであった。このことから、ひげ状に遊離したターゲットDNAの一部は、ヌクレアーゼ処理工程において、一本鎖DNAに特異的なヌクレアーゼにより分解されてなくなったものと考えられる。
【００６９】
以上で説明したように、本実施形態においても、DNA複合体を可視化して確認できるので、DNA複合体の構造や形態なども調べることができるなど、上記実施形態１と同様な効果を得ることができる。また、本実施形態では、タンパク質失活工程後、ＡＦＭ検出工程前に、ヌクレアーゼ処理工程を行っているので、ひげ状に遊離したDNA鎖のないDNA複合体をＡＦＭにより観察できる。
【００７０】
（実施形態３）
次いで、第３の実施の形態について説明する。なお、上記実施形態１または実施形態２と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施形態では、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSの代わりにATPを用いて反応させる点が、上記実施形態１と異なる。それ以外は、基本的に上記実施形態１と同様である。
【００７１】
具体的に説明すると、ターゲットDNA（二本鎖DNA）として、上記実施形態１と同様に、pSP64poly(A)DNAを制限酵素RsaＩで３つのDNA断片に切断し、このうちの最も大きいDNA断片（約1.9kbp）を精製した。また、プローブDNA（一本鎖DNA）として、上記実施形態１でも利用した900merの第４プローブDNAを用意した。また、上記実施形態１と同様に、組換えタンパク質として、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を、ヌクレアーゼとして、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）を用意した。また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。なお、上記のように、本実施形態では、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATPを用意した。
【００７２】
そして次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、上記実施形態１と同様にして、ターゲットDNAと、プローブDNAと、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質と、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）とを反応させて、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖の5'末端を含む末端包含領域に、プローブDNA、少なくとも大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成した。即ち、ATP-γSの代わりにATPを用いた以外は、上記実施形態１と同様な反応を行って、DNA−タンパク質複合体を形成した。
【００７３】
次に、ＡＦＭ検出工程において、上記実施形態１と同様にして、原子間力顕微鏡により、DNA複合体を観察した。その結果を図２１に示す。また、図２１の写真を模式的に示したものを図２２に示す。
図２１及び図２２に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第４プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。なお、図中では、２つのDNA複合体が観察されている。このDNA複合体は、上記実施形態１と同様に、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。上記実施形態１では、図１５及び図１６に示したように、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている（ひげ状に遊離している）。これに対し、本実施形態では、およそ１００個のDNA複合体を観察したが、図２１及び図２２に示すように、ひげ状の部分を持つDNA複合体は観察されなかった。なお、観察されたDNA複合体の長さは、ターゲットDNAの長さと同じであった。即ち、上記実施形態２と同様な結果が得られた。この理由としては、DNA−タンパク質複合体形成工程中に、ATPが生化学的に分解され、RecAタンパク質がひげ状に遊離した一本鎖DNAから外れて、一本鎖DNAがヌクレアーゼにより分解されてなくなったものと考えられる。
【００７４】
以上で説明したように、本実施形態においても、DNA複合体を可視化して確認できるので、DNA複合体の構造や形態なども調べることができるなど、上記実施形態１または２と同様な効果を得ることができる。また、本実施形態では、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSの代わりにATPを用いているため、ひげ状に遊離したDNA鎖のないDNA複合体をＡＦＭにより観察できる。
【００７５】
（実施形態４）
次いで、第４の実施の形態について説明する。なお、上記実施形態１〜実施形態３のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施形態では、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSの代わりにGTPを用いて反応させる点が、上記実施形態１と異なる。それ以外は、基本的に上記実施形態１と同様である。
【００７６】
具体的に説明すると、ターゲットDNA（二本鎖DNA）として、上記実施形態１と同様に、pSP64poly(A)DNAを制限酵素RsaＩで３つのDNA断片に切断し、このうちの最も大きいDNA断片（約1.9kbp）を精製した。また、プローブDNA（一本鎖DNA）として、上記実施形態１でも利用した900merの第４プローブDNAを用意した。また、上記実施形態１と同様に、組換えタンパク質として、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を、ヌクレアーゼとして、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）を用意した。また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。なお、上記のように、本実施形態では、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、GTPを用意した。
【００７７】
そして次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、上記実施形態１と同様にして、ターゲットDNAと、プローブDNAと、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質と、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）とを反応させて、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖の5'末端を含む末端包含領域に、プローブDNA、少なくとも大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成した。即ち、ATP-γSの代わりにGTPを用いた以外は、上記実施形態１と同様な反応を行って、DNA−タンパク質複合体を形成した。
【００７８】
次に、ＡＦＭ検出工程において、上記実施形態１と同様にして、原子間力顕微鏡により、DNA複合体を観察した。その結果を図２３に示す。また、図２３の写真を模式的に示したものを図２４に示す。
図２３及び図２４に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットDNAと第４プローブDNAのDNA複合体を観察することができた。なお、図中では、２つのDNA複合体が観察されている。このDNA複合体は、上記実施形態１と同様に、ターゲットDNAのうちプローブDNAと相補的な領域に、プローブDNAが結合している。上記実施形態１では、図１５及び図１６に示したように、ターゲットDNAの一部（プローブDNAが結合した部分）は、二本鎖DNAがほどけて一本鎖の状態となっている（ひげ状に遊離している）。これに対し、本実施形態では、およそ１００個のDNA複合体を観察したが、図２３及び図２４に示すように、ひげ状の部分を持つDNA複合体は観察されなかった。なお、観察されたDNA複合体の長さは、ターゲットDNAの長さと同じであった。即ち、上記実施形態２及び実施形態３と同様な結果が得られた。この理由としては、上記実施形態３の場合と同様に、DNA−タンパク質複合体形成工程中に、GTPが生化学的に分解され、RecAタンパク質がひげ状に遊離した一本鎖DNAから外れて、一本鎖DNAがヌクレアーゼにより分解されてなくなったものと考えられる。
【００７９】
以上で説明したように、本実施形態においても、DNA複合体を可視化して確認できるので、DNA複合体の構造や形態なども調べることができるなど、上記実施形態１〜３と同様な効果を得ることができる。また、本実施形態では、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSの代わりにGTPを用いているため、ひげ状に遊離したDNA鎖のないDNA複合体をＡＦＭにより観察できる。
【００８０】
以上において、本発明を実施形態に即して説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることはいうまでもない。
【００８１】
【発明の効果】
本発明によれば、二本鎖DNAと一本鎖DNAが結合したDNA複合体を可視化して検出できる。
【００８２】
【配列表】
＜110＞ 株式会社アイシン・コスモス研究所
AISIN COSMOS R&D CO.,LTD
財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所
Kazusa DNA Research Institute
＜120＞ 核酸検出方法
＜130＞ ２００２ＡＩＣＯ０１
＜160＞ 6
＜210＞ 1
＜211＞ 150
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 1
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 150
＜210＞ 2
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 2
gccgggaagc tagagtaagt agtt 24
＜210＞ 3
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 3
actcaccagt cacagaaaag catc 24
＜210＞ 4
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 4
gttttaaatc aatctaaagt atat 24
＜210＞ 5
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 5
ggtggcctaa ctacggctac acta
＜210＞ 6
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pSP64poly(A)+ DNAの塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 6
tcgtgcgctc tcctgttccg accc 24
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施形態１に関し、DNA複合体の形成について示す説明図である。
【図２】 実施形態１に関し、ゲル濾過したターゲットDNAを電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】 実施形態１に関し、第２〜第５プローブDNAを調製するためのＰＣＲ産物をそれぞれ電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】 実施形態１に関し、ターゲットDNAと第３プローブDNAを原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図５】 実施形態１に関し、図４の写真を模式的に示した説明図である。
【図６】 実施形態１に関し、様々な反応条件でDNA複合体を形成したものについて電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図７】 実施形態１に関し、様々なプローブDNAでDNA複合体を形成したものについて電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図８】 実施形態１に関し、精製した様々なDNA複合体を電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図９】 実施形態１に関し、第１プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１０】 実施形態１に関し、図９の写真を模式的に示した説明図である。
【図１１】 実施形態１に関し、第２プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１２】 実施形態１に関し、図１１の写真を模式的に示した説明図である。
【図１３】 実施形態１に関し、第３プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１４】 実施形態１に関し、図１３の写真を模式的に示した説明図である。
【図１５】 実施形態１に関し、第４プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１６】 実施形態１に関し、図１５の写真を模式的に示した説明図である。
【図１７】 実施形態１に関し、第５プローブDNAを用いて形成されたDNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１８】 実施形態１に関し、図１７の写真を模式的に示した説明図である。
【図１９】 実施形態２に関し、DNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図２０】 実施形態２に関し、図１９の写真を模式的に示した説明図である。
【図２１】 実施形態３に関し、DNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図２２】 実施形態３に関し、図２１の写真を模式的に示した説明図である。
【図２３】 実施形態４に関し、DNA複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図２４】 実施形態３に関し、図２３の写真を模式的に示した説明図である。
Claims (3)
- 直鎖状の二本鎖DNA、
この二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列に、相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNA、
大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質である組換えタンパク質、
並びに、
大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩであるヌクレアーゼ、
を反応させて、上記二本鎖DNAのうち、上記一方のDNA鎖の5'末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖DNAのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が、少なくとも上記組換えタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成するDNA−タンパク質複合体形成工程と、
上記組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させて、上記二本鎖DNAの末端近傍包含領域に上記一本鎖DNAの相補的領域が結合してなるDNA複合体を形成するタンパク質失活工程と、
原子間力顕微鏡により、上記DNA複合体を検出するＡＦＭ検出工程と、を備え、
上記DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加え、
上記タンパク質失活工程後、上記ＡＦＭ検出工程前に、上記DNA複合体と上記ヌクレアーゼとを反応させるヌクレアーゼ処理工程を備える
ことを特徴とする核酸検出方法。 - 請求項１に記載の核酸検出方法であって、
上記DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸を加える
ことを特徴とする核酸検出方法。 - 請求項１または請求項２に記載の核酸検出方法であって、
上記一本鎖DNAは、60mer以上の塩基配列からなる
ことを特徴とする核酸検出方法。
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