JP4696382B2 - 三本鎖ｄｎａの形成方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖DNAと一本鎖DNAとを含む複合体の形成方法、二本鎖DNAと一本鎖DNAとを含む複合体、及びサザンハイブリダイゼーションに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、二本鎖DNAと一本鎖DNAとを含む複合体の形成方法が知られている。即ち、図１９に示すように、ターゲットDNA（二本鎖DNA）を用意すると共に、このターゲットDNAのいずれか一方のDNA鎖の一部の塩基配列と、相補的な塩基配列を有するプローブDNA（一本鎖DNA）を用意する。次に、緩衝剤等を含む反応液に、これらのDNAと大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を混ぜて、十分な時間保温する。
【０００３】
そうすると、ターゲットDNAとプローブDNAとRecAタンパク質とからなるDNA−タンパク質複合体が形成される。具体的には、まず、プローブDNAにRecAタンパク質が結合してプローブDNA−RecAタンパク質複合体が形成される。続いて、このプローブDNA−RecAタンパク質複合体が、ターゲットDNAに結合し、三本鎖形成領域を有するDNA-タンパク質複合体が形成される。その際、プローブDNAは、RecAタンパク質が関与した状態で、ターゲットDNAのうち、プローブDNAと相補的な塩基配列からなる領域に結合すると考えられている。この状態のDNA−タンパク質複合体は、三本鎖形成領域を有するにも拘わらず、比較的安定なものである。詳しくは、B. Jagadeeshwar Rao et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88，2984-2988（1991）、Gurucharan Reddy et al.，Biochemistry，33，11486-11492（1994）、Efim I. Golub et al.，Mutation Research，351，117-124（1996）等を参照されたい。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、図１９に示すように、このDNA−タンパク質複合体に、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）やタンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼK）などを加えて十分な時間保温し、RecAタンパク質を失活させると、DNA−タンパク質複合体からRecAタンパク質が除去されるだけでなく、ターゲットDNAとプローブDNAとの結合も解消される。つまり、DNA−タンパク質複合体は、RecAタンパク質の存在下においてのみ、その構造が安定に維持され、RecAタンパク質がない状態では、安定な三本鎖DNAを形成することができなかった。遺伝子工学等の分野において、三本鎖DNAを利用しようとした場合、RecAタンパク質が結合した状態の複合体では、RecAタンパク質の存在により多くの制限を受け、その利用範囲が狭くなる。そこで、このようなタンパク質が存在しなくても安定な構造を維持することができる三本鎖DNAの形成方法の開発が待たれていた。
【０００５】
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、複合体中にタンパク質を含有しないにもかかわらず、安定な状態を維持することができる三本鎖DNAの形成方法、三本鎖DNA、及び、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段、作用及び効果】
その解決手段は、直鎖状の二本鎖DNA、この二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNA、RecAタンパク質、並びに、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ、を反応させて、上記二本鎖DNAのうち、上記一方のDNA鎖の5'末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖DNAのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が、少なくとも上記RecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成するDNA−タンパク質複合体形成工程と、上記RecAタンパク質及び上記エキソヌクレアーゼＩを失活させて、上記二本鎖DNAの末端近傍包含領域に上記一本鎖DNAの相補的領域が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAを形成するタンパク質失活工程と、を備える三本鎖DNAの形成方法である。
【０００７】
本発明によれば、DNA−タンパク質複合体形成工程において、二本鎖DNAと一本鎖DNAとRecAタンパク質と大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩから、DNA−タンパク質複合体を形成する。そしてその後、タンパク質失活工程において、RecAタンパク質及びエキソヌクレアーゼＩを失活させると、二本鎖DNAの末端近傍包含領域に一本鎖DNAの相補的領域が結合した三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAを形成することができる。このような三本鎖DNAは、その構造を安定化させるための特別なタンパク質等（例えば、前述したRecAタンパク質）が存在しなくても、多少の熱を加えるなどしても解離することなく、安定な状態を維持することができる。なお、本発明では、三本鎖形成領域は、二本鎖DNAの一方の末端近傍包含領域に形成するだけでなく、二本鎖DNAの両方の末端近傍包含領域に形成することも可能である。
【０００８】
このような三本鎖DNAの形成方法は、例えば、サザンハイブリダイゼーションにおいて利用可能である。従来のサザンハイブリダイゼーションは、例えば、次のように行う。即ち、ターゲットDNAとして、適当な制限酵素で切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意すると共に、プローブDNAとして、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPを用いて、5'末端を32Pで標識した一本鎖DNAを用意する。そして、ターゲットDNA（二本鎖DNA）について、アガロースゲル電気泳動を行う。その後、アガロースゲルをメンブレン上に載せて吸引等を行い、アガロースゲル中のターゲットDNA（二本鎖DNA）をメンブレン上に移す。その後、熱処理等を行って、ターゲットDNA（二本鎖DNA）をメンブレンに固定すると共に、ターゲットDNA（二本鎖DNA）を解離させて一本鎖の状態にする。次に、このメンブレンをプローブDNA溶液（標識した一本鎖DNAの溶液）に浸して、ハイブリダイゼーションを行う。その後、メンブレンを洗浄する。その後は、このメンブレンのオートラジオグラムをとり、標識プローブDNA（標識した一本鎖DNA）からのシグナルをＸ線フィルム上に記録する。
【０００９】
これに対し、本発明を利用したサザンハイブリダイゼーションは、例えば、次のように行うことができる。即ち、従来と同様に、ターゲットDNA（二本鎖DNA）と標識プローブDNA（標識した一本鎖DNA）を用意する。ここで、本発明を利用した場合、これらのDNAとRecAタンパク質と大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩにより、DNA−タンパク質複合体を形成する（DNA−タンパク質複合体形成工程）。そしてその後、RecAタンパク質及びエキソヌクレアーゼＩを失活させ、三本鎖形成領域を有する安定な三本鎖DNAを形成する（タンパク質失活工程）。次に、この三本鎖DNAについて、アガロースゲル電気泳動を行う。電気泳動後は、アガロースゲルを濾紙等の上に載せてゲル乾燥機で乾燥させた後、アガロースゲルのオートラジオグラムをとり、標識プローブDNA（標識した一本鎖DNA）からのシグナルをＸ線フィルム上に記録する。
【００１０】
このように、サザンハイブリダイゼーションに本発明を適用した場合、従来と比較すれば、容易かつ短時間でサザンハイブリダイゼーションを行うことができる。アガロースゲル中のDNAをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブDNA溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業がなくなるからである。なお、プローブDNAとして、蛍光物質等で化学的に標識した一本鎖DNAを利用する場合においても、同様なことが言える。
【００１１】
ここで、三本鎖DNAは、二本鎖DNAの少なくとも一方の末端近傍包含領域に、一本鎖DNAの相補的領域が結合して三本鎖形成領域を形成したものであれば、その結合形態は問われない。つまり、二本鎖DNAと一本鎖DNAとの間で、必ずしも、ワトソン・クリック型塩基対やフーグスティーン型塩基対のような特定の構造をとっている必要はなく、二本鎖DNAの末端近傍包含領域と一本鎖DNAの相補的領域との間で、何らかの特異的な相互作用によって三本鎖形成領域が形成されていればよい。
【００１２】
二本鎖DNAは、直鎖状であれば、いかなるものを用いてもよい。即ち、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、3000Mbpといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なDNAであっても構わない。勿論、二本鎖DNAの由来は問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来のDNAやそれらを改変したDNAであっても、微生物等のもつプラスミドDNA等やプラスミドDNA等に異種のDNA断片を挿入したキメラDNA等であっても、あるいは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。
【００１３】
一本鎖DNAは、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状のものであれば、いかなるもの用いてもよい。即ち、この条件を満たす限り、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。また、その由来も問われない。これらの点は、二本鎖DNAと同様である。
【００１４】
実質的に相補的な程度は、一般的には、およそ70〜80％以上の相補性を有することが必要とされ、より好ましくは、ほぼ100％の相補性を有することである。相補性が高いほど、より安定な三本鎖形成領域（三本鎖DNA）を形成することができるからである。但し、必要とされる相補性の程度は、相補的領域の長さによって若干変動する。また、相補的領域全体の相補性は同じ（例えば70％）であっても、相補的領域内全体でほぼ等しい相補性（70％）を有する場合と、相補的領域内に相補性が高い領域（例えば90％）と低い領域（例えば50％）が偏在する場合とによっても、若干変動する。
【００１５】
また、一本鎖DNAは、相補的領域を含むものであればよいから、一本鎖DNA全体が相補的領域からなるものであっても、あるいは、相補的領域にさらに他の塩基配列が付加されたものであっても構わない。但し、一本鎖DNA全体が相補的領域からなるものの方が、より安定な三本鎖DNAを形成しやすいので好ましい。なお、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「末端近傍の塩基から始まる塩基配列」と、実質的に相補的な塩基配列を含む必要があるのは、次のような理由による。即ち、一本鎖DNAが、二本鎖DNAの一方のDNA鎖の末端近傍以外の塩基配列（例えば、中央付近の塩基配列）にだけ相補的である場合には、DNA−タンパク質複合体形成工程において安定なDNA−タンパク質複合体を形成することができるが、タンパク質失活工程でタンパク質を失活させると、二本鎖DNAと一本鎖DNAが解離してしまい、安定な三本鎖DNAが得られないからである。
【００１６】
また、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「5'末端近傍」の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む必要があるのも、同様な理由による。即ち、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「3'末端近傍」の塩基配列にだけ相補的である場合には、DNA−タンパク質複合体形成工程において安定なDNA−タンパク質複合体を形成することはできるが、タンパク質を失活させると、二本鎖DNAと一本鎖DNAが解離してしまい、安定な三本鎖DNAが得られないからである。
【００１７】
RecAタンパク質として、具体的には、大腸菌（Escherichia coli）に由来するRecAタンパク質の他、耐熱性細菌（Thermus thermophilus）やその他の腸内細菌においてRecA遺伝子によりコードされている多機能タンパク質、あるいは、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、メチロフィルス メチロトローファス（Methylophilus methylotrophus）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ウスティラゴ メイディス（Ustilago maydis）等に由来するRecA類似タンパク質などが挙げられる。また、酵母（Saccharomyces cerevisiae）やヒトなど真核生物に由来するRecA類似タンパク質もこれに含まれる。
【００１８】
【００１９】
【００２０】
DNA−タンパク質複合体形成工程は、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体の存在下において、緩衝液中で行うのが好ましい。効率よく、安定なDNA−タンパク質複合体を形成することができるからである。緩衝液は、反応の最適条件を得るため適宜変更することできる。例えば、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）と酢酸や塩酸等の適当な酸とにより、ｐＨを約4.0〜9.0、より好ましくは、約7.0〜8.0に調節したトリス系の緩衝液を使用すればよい。緩衝剤は、一般に約10〜100mM、好ましくは、約30mMで使用する。
【００２１】
ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としては、例えば、アデノシン5'−三リン酸（ATP）、グアノシン5'−三リン酸（GTP）、UTP、CTPや、アデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ATP-γS）、グアノシン（γ−チオ）−三リン酸（GTP-γS）、dATP、dUTP、dCTPなどを挙げることができる。これらは、さらにヌクレオシド二リン酸（例えば、ADP）と組み合わせて使用することもできる。なお、特に、DNA−タンパク質複合体を形成する系において、ATP等ヌクレオシド三リン酸が生化学的な分解を伴う場合には、ヌクレオシド三リン酸の類似体（例えば、ATP-γS）を使用するのが好ましい。これらヌクレオシド三リン酸等は、0.1〜10mM、好ましくは、約5mMで使用する。
【００２２】
反応液中の核酸（二本鎖DNA及び一本鎖DNA）の濃度は、核酸が十分に溶解することができる濃度であればよく、適宜変更することができる。二本鎖DNAに対する一本鎖DNAの割合は、モル比で約1〜100倍とするのが好ましい。また、RecAタンパク質は、一本鎖DNAの3塩基当たり1分子に相当するように加えるのが好ましい。また、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩは、二本鎖DNAの1μg当たり約1unit加えるのが好ましい。このように調製した反応液は、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、5分間以上、一般には約60分間保温することにより、DNA−タンパク質複合体を形成することができる。
【００２３】
なお、この工程では、上記のように反応液中にすべてのもの加えて一定時間保温する方法の他、次のような方法を採ることもできる。即ち、まず、ヌクレオシド三リン酸等を含む緩衝液に、二本鎖DNAと一本鎖DNAとRecAタンパク質とを加えて、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、数分間以上、好ましくは約10分間保温する。そしてその後、この反応液に大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩを加えて、さらに、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、5分以上、一般には約30分間保温する。
【００２４】
このような方法で反応させると、特に安定なDNA−タンパク質複合体を形成することができる。その理由としては、エキソヌクレアーゼＩは、本来、一本鎖DNAを末端から切断していく酵素であるから、最初から反応液に加えると、一本鎖DNAが削られてしまうことがある。しかし、このようにエキソヌクレアーゼＩを後から加えると、一本鎖DNAには先にRecAタンパク質が結合して、エキソヌクレアーゼＩから保護されるため、一本鎖DNAが切断されにくくなり、安定なDNA−タンパク質複合体を形成することができると考えられるからである。
【００２５】
タンパク質失活工程で、タンパク質を失活させるには、反応液にキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）を加えるか、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を加えるか、または、タンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼK）を加え、あるいは、これらの処理を組み合わせて行った後、例えば、約37℃で10分間以上保温すればよい。こうして得られる反応液から三本鎖DNAだけを回収するには、フェノール、クロロホルム等の溶媒抽出により除タンパク質処理を行った後、適当なカラムクロマトグラフィーで回収する方法を利用したり、あるいは、エタノール沈殿で一旦DNAを析出させる方法を利用すればよい。
【００２６】
さらに、上記の三本鎖DNAの形成方法であって、前記一本鎖DNAは、前記実質的に相補的な塩基配列が20mer以上からなる三本鎖DNAの形成方法とすると良い。
【００２７】
一本鎖DNAの相補的領域は、理論上短くても、二本鎖DNAのそれに対応する末端近傍包含領域に結合して三本鎖形成領域を形成することができる。しかし、一本鎖DNAの相補的領域が短いと、具体的には、20merよりも短いと、三本鎖形成領域が不安定になりやすい。つまり、三本鎖DNAが不安定になりやすい。これに対し、本発明では、実質的に相補的な塩基配列が20mer以上からなる一本鎖DNAを使用する。従って、この相補的領域と二本鎖DNAのそれに対応する末端近傍包含領域とはより強く結合して安定な三本鎖形成領域を形成することができる。つまり、より安定な三本鎖DNAを形成することができる。なお、一本鎖DNAの実質的に相補的な塩基配列が約30mer以上からなるものであると、さらに、安定な三本鎖DNAを形成することができるので好適である。
【００２８】
さらに、上記のいずれかに記載の三本鎖DNAの形成方法であって、前記一本鎖DNAは、前記二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端から約20mer以内の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む三本鎖DNAの形成方法とするのが好ましい。
【００２９】
前述したように、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含むものであれば、二本鎖DNAの末端近傍包含領域と一本鎖DNAの相補的領域が結合して三本鎖形成領域を形成することができる。しかし、一本鎖DNAの相補的領域が、二本鎖DNAの末端から離れて結合するほど、三本鎖形成領域が不安定で解離しやすくなる。即ち、三本鎖DNAを形成したときに、一本鎖DNAの3'末端の延長上に二本鎖形成領域が長くできるほど、この二本鎖形成領域の存在による構造ストレスにより、三本鎖形成領域が不安定になり、三本鎖形成領域が解消されやすくなる。
【００３０】
これに対し、本発明では、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端から20mer以内の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む一本鎖DNAを使用する。つまり、この一本鎖DNAの相補的領域は、二本鎖DNAの末端のごく近傍から始まる領域に対して相補的である。従って、この方法により形成される三本鎖DNAは、一本鎖DNAの3'末端の延長上にできる二本鎖形成領域が短くなる、あるいは、このような二本鎖形成領域ができなくなる。このため、二本鎖形成領域の存在による構造ストレスが生じにくく、三本鎖形成領域が安定化される。つまり、本発明によれば、より安定な三本鎖DNAを形成することができる。
【００３１】
特に、一本鎖DNAは、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含むのが好ましい。三本鎖DNAを形成したときに、一本鎖DNAの3'末端の延長上に二本鎖形成領域ができなくなるので、三本鎖形成領域を最も安定化することができる。従って、最も安定な三本鎖DNAを形成することができる。なお、一本鎖DNAの相補的領域は、約60mer以下の塩基配列からなるのが好ましい。このように一本鎖DNAの相補的領域が比較的短いと、三本鎖形成領域（三本鎖DNA）が不安定になりやすく、この場合に特に、一本鎖DNAの相補的領域を二本鎖DNAの末端のごく近傍から始まる領域に対して相補的であるようにして、三本鎖形成領域（三本鎖DNA）の安定化を図るべきだからである。
【００３２】
さらに、上記のいずれかに記載の三本鎖DNAの形成方法であって、前記RecAタンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質である三本鎖DNAの形成方法とすると良い。
【００３３】
前述したように、RecAタンパク質には、様々なものを適宜選択することができる。これらのうち、入手容易性、安全性、機能性を考えると、大腸菌に由来するRecAタンパク質を用いるのが好ましい。
【００３４】
【００３５】
【００３６】
また、他の解決手段は、直鎖状の二本鎖DNAと、この二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNAと、からなり、上記二本鎖DNAのうち、上記一方のDNA鎖の5'末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖DNAのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAである。
【００３７】
本発明の三本鎖DNAは、従来のようにタンパク質を含まず、二本鎖DNAと一本鎖DNAのみが結合してなるものである。そして、一本鎖DNAの相補的領域が、二本鎖DNAの少なくとも一方の末端近傍包含領域に結合した三本鎖形成領域を有する。このような三本鎖DNAは、その構造を安定化させるための特別なタンパク質等（例えば、前述したRecAタンパク質）が存在しなくても、多少の熱を加えるなどしても解離することなく、安定な状態を維持することができる。なお、本発明の三本鎖DNAには、二本鎖DNAの一方の末端近傍包含領域が三本鎖形成領域となったものの他、二本鎖DNAの両方の末端近傍包含領域がそれぞれ三本鎖形成領域となったものも含まれる。
【００３８】
このような三本鎖DNAは、例えば、サザンハイブリダイゼーションにおいて利用可能である。即ち、ターゲットDNAとして、適当な制限酵素で切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意すると共に、プローブDNAとして、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPを用いて、5'末端を32Pで標識した一本鎖DNAを用意する。そして、これらのDNAから、一本鎖DNAの相補的領域が二本鎖DNAの少なくとも一方の末端近傍包含領域に結合した三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAを形成する。次に、この三本鎖DNAについて、アガロースゲル電気泳動を行う。電気泳動後は、アガロースゲルを濾紙等の上に載せてゲル乾燥機で乾燥させた後、アガロースゲルのオートラジオグラムをとり、プローブDNA（標識した一本鎖DNA）からのシグナルをＸ線フィルム上に記録する。
【００３９】
このように、サザンハイブリダイゼーションに本発明の三本鎖DNAを利用した場合、従来と比較すれば、容易かつ短時間でサザンハイブリダイゼーションを行うことができる。アガロースゲル中のDNAをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブDNA溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業がなくなるからである。なお、プローブDNAとして、蛍光物質等で化学的に標識した一本鎖DNAを利用する場合においても、同様なことが言える。
【００４０】
さらに、上記の三本鎖DNAであって、前記三本鎖形成領域は、DNA1本鎖当たり約20mer以上の塩基配列からなる三本鎖DNAとすると良い。
【００４１】
三本鎖形成領域は理論上短くてもできるが、極端に短いと、具体的には、DNA1本鎖当たり20merよりも短いと、三本鎖形成領域が不安定になりやすい。つまり、三本鎖DNAが不安定になりやすい。これに対し、本発明では、三本鎖形成領域が、DNA1本鎖当たり約20mer以上の塩基配列からなるので、三本鎖形成領域が安定であり、三本鎖DNAも安定である。なお、三本鎖形成領域が、DNA1本鎖当たり約30mer以上の塩基配列からなるものであると、さらに、三本鎖形成領域（三本鎖DNA）が安定であるので、好適である。
【００４２】
さらに、上記のいずれかに記載の三本鎖DNAであって、前記三本鎖形成領域を構成する前記一本鎖DNAの3'末端の延長上には、二本鎖形成領域が存在しない、または、約20bp以下の二本鎖形成領域が存在する三本鎖DNAとするのが好ましい。
【００４３】
三本鎖形成領域は、二本鎖DNAの末端近傍包含領域に形成することができる。しかし、三本鎖形成領域が二本鎖DNAの末端から離れれば離れるほど、三本鎖形成領域は不安定で解離しやすくなる。さらに具体的に説明すると、三本鎖形成領域を構成する一本鎖DNAの3'末端の延長上に二本鎖形成領域が長くできるほど、この二本鎖形成領域の存在による構造ストレスにより、三本鎖形成領域が不安定になり、三本鎖形成領域が解消されやすくなる。これに対し、本発明では、三本鎖形成領域を構成する一本鎖DNAの3'末端の延長上に、二本鎖形成領域が存在しないか、あるいは、二本鎖形成領域が存在しても約20bp以下の短いものでしかない。従って、この三本鎖DNAは、二本鎖形成領域の存在による構造ストレスが生じない、あるいは生じにくく、三本鎖形成領域が安定化される。つまり、本発明の三本鎖DNAは安定な構造を維持することができる。なお、三本鎖形成領域がDNA1本鎖当たり約60mer以下の塩基配列からなるのが好ましい。このように三本鎖形成領域が比較的短いと、三本鎖形成領域（三本鎖DNA）が不安定になりやすく、この場合に特に、三本鎖形成領域を構成する一本鎖DNAの3'末端の延長上に、二本鎖形成領域が存在しないか、約20bp以下の短い二本鎖形成領域が存在するようにして、三本鎖形成領域（三本鎖DNA）の安定化を図るべきだからである。
【００４４】
また、他の解決手段は、直鎖状の二本鎖DNAと、標識した一本鎖DNAであって、上記二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNAと、からなり、上記二本鎖DNAのうち、上記一方のDNA鎖の5'末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖DNAのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAについて、アガロースゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、上記三本鎖DNAを含むアガロースゲルを乾燥させる乾燥工程と、乾燥した上記アガロースゲルから上記標識した一本鎖DNA由来のシグナルを検出する検出工程と、を備えるサザンハイブリダイゼーションである。
【００４５】
本発明によれば、ターゲットDNA（二本鎖DNA）と標識プローブDNA（標識した一本鎖DNA）とからなる三本鎖DNAを用いて、これについてアガロースゲル電気泳動を行う（電気泳動工程）。電気泳動後は、アガロースゲルを濾紙等の上に載せてゲル乾燥機等で乾燥させた後（乾燥工程）、アガロースゲルから標識プローブDNA（標識した一本鎖DNA）由来のシグナルを検出する（検出工程）。このようなサザンハイブリダイゼーションは、前述した従来の方法と比較すれば、アガロースゲル中のDNAをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブDNA溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業がなくなる。従って、サザンハイブリダイゼーションを容易かつ短時間で行うことができる。
【００４６】
なお、標識プローブDNAである標識した一本鎖DNAは、放射性元素を用いて標識したものであっても、蛍光物質等の化学物質を用いて標識したものであってもよい。放射性元素を用いて標識すれば、サザンハイブリダイゼーションの検出能力を向上させることができる。一方、化学物質を用いて標識すれば、サザンハイブリダイゼーションの各工程をより安全に行うことができる。また、ロボット等により各工程を自動化することも可能である。
【００４７】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
以下、本発明の実施例を、図を参照しつつ説明する。まず、三本鎖DNAの形成方法及びこの方法により形成される三本鎖DNAについて説明する。図１に示すように、ターゲットDNAとして、環状プラスミドDNAの１つであるpBR322 DNA（4.4kbp）を制限酵素ScaＩ及びNruＩで切断した２種類の直鎖状の二本鎖DNA（DNA断片１及びDNA断片２）を用意した。DNA断片１は約2.9kbp、DNA断片２は約1.5kbpである。
【００４８】
また、図１に示すように、プローブDNAとして、上記DNA断片１のScaＩ切断部位の近傍に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１（配列番号：１））を用意した。具体的には、DNA断片１のうち、ScaＩ切断部位側に5'末端が位置するDNA鎖の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１を用意した。また、別のプローブDNAとして、上記DNA断片２のScaＩ切断部位の近傍に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド２（配列番号：２））も用意した。具体的には、DNA断片２のうち、ScaＩ切断部位側に5'末端が位置するDNA鎖の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド２を用意した。
【００４９】
これらのオリゴヌクレオチド１及び２は、DNA断片１及びDNA断片２の塩基配列に基づいて公知の手法により合成すればよい。その後、これらのオリゴヌクレオチド１及び２について、T4 Polynucleotidekinaseと［γ-32P］ATPを用いて、32Pで5'末端をそれぞれ標識した。
オリゴヌクレオチド１：5'-cact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagt-3'
オリゴヌクレオチド２：5'-acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt-3'
【００５０】
また、組換えタンパク質として大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を、また、ヌクレアーゼとして大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）を用意した。さらに、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSを、また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。
【００５１】
次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、図２に示すように、200ngのターゲットDNA（DNA断片１及びDNA断片２）と、標識プローブDNA（1pmolの標識オリゴヌクレオチド１及び1pmolの標識オリゴヌクレオチド２）と、3.0μgのRecAタンパク質と、4unitのエキソヌクレアーゼＩとを、4.8mMのATP-γS、20mMの酢酸マグネシウム及び30mMの酢酸トリス（pH7.2）中で、37℃において30分間保温した。この反応液の全量は、約20μlである。なお、図２は、簡略化して、ターゲットDNA（DNA断片）とプローブDNA（オリゴヌクレオチド）の２つの組み合わせのうち、一方のみを図示した説明図である。
【００５２】
これにより、２種類のDNA−タンパク質複合体が形成される。即ち、DNA断片１のScaＩ切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド１全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体が形成される。また、DNA断片２のScaＩ切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド２全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体が形成される。
【００５３】
具体的には、まず、オリゴヌクレオチド１（プローブDNA）にRecAタンパク質が結合してプローブDNA−RecAタンパク質複合体が形成される。続いて、このプローブDNA−RecAタンパク質複合体が、DNA断片１（ターゲットDNA）に結合し、DNA-タンパク質複合体を形成する。その際、このDNA−タンパク質複合体は、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で、オリゴヌクレオチド１が、DNA断片１のうち、オリゴヌクレオチド１と相補的な塩基配列からなる領域（ScaＩ切断部位側の末端近傍領域）に結合すると考えられる。なお、エキソヌクレアーゼＩは、このDNA−タンパク質複合体の安定化に作用するものと考えられる。同様に、オリゴヌクレオチド２（プローブDNA）にRecAタンパク質が結合してプローブDNA−RecAタンパク質複合体が形成され、続いて、これが、DNA断片２（ターゲットDNA）に結合し、DNA-タンパク質複合体を形成する。その際、このDNA−タンパク質複合体は、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で、オリゴヌクレオチド２が、DNA断片２のうち、オリゴヌクレオチド２と相補的な塩基配列からなる領域（ScaＩ切断部位側の末端近傍領域）に結合すると考えられる。なお、エキソヌクレアーゼＩは、このDNA−タンパク質複合体の安定化に作用するものと考えられる。これらのDNA−タンパク質複合体は、三本鎖形成領域を有するにも拘わらず、比較的安定なものである。
【００５４】
次に、タンパク質失活工程において、図２に示すように、この反応液に、0.5％（W/Vol）SDSと0.7mg/mlプロティナーゼKを加え、37℃において30分間保温し、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させた。これにより、二種類の三本鎖DNAが形成される。即ち、DNA断片１のScaＩ切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド１全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAが形成される。また、DNA断片２のScaＩ切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド２全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAが形成される。
【００５５】
従来の方法では、前述したように、三本鎖形成領域を有する安定なDNA−タンパク質複合体ができても、タンパク質を失活させると、三本鎖形成領域が解消され、ターゲットDNA（二本鎖DNA）とプローブDNA（一本鎖DNA）に解離していた。しかし、本実施例１では、タンパク質（RecAタンパク質及びエキソヌクレアーゼＩ）を失活させても、安定な三本鎖DNAを得ることができる。このような三本鎖DNAは、その構造を維持するために特別なタンパク質等を必要とせず、多少の熱を加えても、安定な状態を維持することができる。
【００５６】
なお、RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質等と、エキソヌクレアーゼＩ等と、ATP-γS等のヌクレオシド三リン酸等と、酢酸トリス等を含む緩衝剤とは、キットとして用意しておくと便利である。このようなキットを利用すれば、ターゲットDNAやプローブDNAの種類が変わっても、容易に三本鎖DNAを形成することができるからである。
【００５７】
次いで、上記の三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションについて説明する。まず、上述したようにして三本鎖DNAを形成した。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、DNA断片１及び２と、標識オリゴヌクレオチド１及び２と、RecAタンパク質と、エキソヌクレアーゼＩとを反応させて、２種類のDNA−タンパク質複合体を形成した。その後、タンパク質失活工程において、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させて、DNA断片１のScaＩ切断部位側の末端近傍領域にオリゴヌクレオチド１全体が結合して三本鎖形成領域を形成してなる三本鎖DNAと、DNA断片２のScaＩ切断部位側の末端近傍領域にオリゴヌクレオチド２全体が結合して三本鎖形成領域を形成してなる三本鎖DNAとを形成した。
【００５８】
次に、電気泳動工程において、反応液の半分量（約10μl）について、1％のアガロースゲルで電気泳動を行った。そして、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してアガロースゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAの写真を記録した。その結果を図３（Ｂ）のレーン２に示す。次に、乾燥工程において、このアガロースゲルを濾紙の上に載せてゲル乾燥機で乾燥させた。その後、検出工程において、乾燥させたアガロースゲルのオートラジオグラムをとり、標識オリゴヌクレオチド１及び２由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録した。その結果を図３（Ａ）のレーン２に示す。図３（Ａ）及び（Ｂ）において、上方の約2.9kbp付近に検出されたシグナルは、DNA断片１にオリゴヌクレオチド１が結合した三本鎖DNAによるものであり、下方の約1.5kbp付近に検出されたシグナルは、DNA断片２にオリゴヌクレオチド２が結合した三本鎖DNAによるものである。
【００５９】
このようなサザンハイブリダイゼーションは、従来の方法と比較すれば、アガロースゲル中のDNAをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブDNA溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業がなくなる。従って、サザンハイブリダイゼーションを容易かつ短時間で行うことができる。
【００６０】
次いで、図３に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、DNAサイズマーカーである。図中の左端には、その大きさが示してある。このDNAサイズマーカーは、λDNAを制限酵素HindIIIで切断し、その後、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPをを用いて、各DNA断片の5'末端を32Pでそれぞれ標識したものである。レーン１は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、その代わりに4unitのMug Bean nucleaseを加えて、レーン２と同じ反応を行った結果を示す。それ以外の各工程は、上述したレーン２と同じである。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、その代わりに4unitのエキソヌクレアーゼIII（ExonucleaseIII）を加えて、レーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、その代わりに4unitのT4 PNKを加えて、レーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、その代わりに4unitのT4 DNA Ligaseを加えて、レーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。
【００６１】
図３（Ａ）の結果から明らかなように、レーン２のみにシグナルが検出され、それ以外のレーン１，３〜６にはシグナルが検出されなかった。レーン２及び６の結果より、安定な三本鎖DNAを形成するためには、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩが必要となることが判る。また、レーン１，３，４，５の結果より、エキソヌクレアーゼＩの代わりに、Mug Bean nucleaseやエキソヌクレアーゼIII、T4 PNK、T4 DNA Ligaseを用いても、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。このことから、安定な三本鎖DNAを形成するためには、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩまたはエキソヌクレアーゼＩと類似する機能を有するタンパク質が必要であると考えられる。
【００６２】
（実施例２）
次いで、第２の実施例について説明する。なお、上記実施例１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図４に示すように、ターゲットDNAとして、環状プラスミドDNAの１つであるpUC118 DNA（約3.2kbp）を制限酵素HincIIで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。なお、pUC118 DNAの塩基配列については、GeneBank登録番号U07650を参照されたい。
【００６３】
また、図４に示すように、プローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド３（配列番号：３））を用意した。具体的には、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド３を用意した。そして、このオリゴヌクレオチド３について、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPを用いて、32Pで5'末端を標識した。
オリゴヌクレオチド３：5'-cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc gagctcggta cccggggatc ctctagagtc-3'
【００６４】
次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、200ngのターゲットDNA（直鎖状のpUC118 DNA）と、1pmolの標識プローブDNA（標識オリゴヌクレオチド３）と、3.0μgのRecAタンパク質と、4unitのエキソヌクレアーゼＩとを、4.8mMのATP-γS、20mMの酢酸マグネシウム、30mMの酢酸トリス（pH7.2）中で、37℃において30分間保温した。これにより、上記実施例１と同様に、DNA−タンパク質複合体が形成される。即ち、ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図４中右方）に、オリゴヌクレオチド３全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなる安定なDNA−タンパク質複合体が形成される（図２参照）。
【００６５】
次に、タンパク質失活工程において、この反応液に、0.5％（W/Vol）のSDSと0.7mg/mlのプロティナーゼKを加え、37℃において30分間保温し、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させた。これにより、上記実施例１と同様に、安定な三本鎖DNAが形成される。即ち、ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図４中右方）に、オリゴヌクレオチド３全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAが形成される（図２参照）。この三本鎖DNAも、その構造を維持するために特別なタンパク質等を必要とせず、多少の熱を加えても、安定な状態を維持することができる。
【００６６】
次に、上記実施例１と同様に、電気泳動工程において、反応液の半分量について1％のアガロースゲルで電気泳動を行った。そして、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してアガロースゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAの写真を記録した。その結果を図５（Ｂ）のレーン１に示す。その後も、上記実施例１と同様に、乾燥工程を行った後、検出工程において、アガロースゲルのオートラジオグラムをとり、標識オリゴヌクレオチド３由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録した。その結果を図５（Ａ）のレーン１に示す。 図５（Ａ）及び（Ｂ）において、約3.2kbp付近に検出されたシグナルは、ターゲットDNAにオリゴヌクレオチド３が結合した三本鎖DNAによるものである。なお、このサザンハイブリダイゼーションも、上記実施例１と同様な工程によるものであるから、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業が少なく、容易かつ短時間で行うことができる。
【００６７】
一方、図４に示すように、上記のプローブDNA（オリゴヌクレオチド３）とは別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAのうち、上述した末端近傍領域とは異なる側の末端近傍領域（図中左方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド４（配列番号：４））を用意した。具体的には、ターゲットDNAのうち、他方のDNA鎖（図中上方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド４を用意した。そして、このオリゴヌクレオチド４について、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPを用いて、32Pで5'末端を標識した。
オリゴヌクレオチド４：5'-caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg cctgcaggtc-3'
【００６８】
そして、DNA−タンパク質複合体形成工程を、上述の標識オリゴヌクレオチド３の代わりに標識オリゴヌクレオチド４を用いて行い、ターゲットDNAの他方の末端近傍領域（図４中左方）に、オリゴヌクレオチド４全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなる安定なDNA−タンパク質複合体が形成した（図２参照）。その後、上述のタンパク質失活工程を行い、ターゲットDNAの他方の末端近傍領域に（図４中左方）、オリゴヌクレオチド４全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAを形成した（図２参照）。勿論、この三本鎖DNAも安定なものである。次に、上述の通り、電気泳動工程を行い、染色されたDNAの写真を記録した。その結果を図５（Ｂ）のレーン３に示す。その後も、上述の通り、乾燥工程及び検出工程を行った。その結果を図５（Ａ）のレーン３に示す。
【００６９】
次いで、図５に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記実施例１と同様なDNAサイズマーカーである。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド５（配列番号：５）を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。このオリゴヌクレオチド５は、図４に示すように、ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図中右方）に相補的な一本鎖DNAである。但し、このオリゴヌクレオチド５は、オリゴヌクレオチド３とは異なり、ターゲットDNAのうち、図中上方のDNA鎖の3'末端近傍の60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなる。なお、このオリゴヌクレオチド５も、オリゴヌクレオチド３，４等と同様な方法で標識した。
オリゴヌクレオチド５：5'-gactctagag gatccccggg taccgagctc gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg-3'
【００７０】
レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド６（配列番号：６）を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。このオリゴヌクレオチド６は、図４に示すように、ターゲットDNAの他方の末端近傍領域（図中左方）に相補的な一本鎖DNAである。しかし、このオリゴヌクレオチド６は、オリゴヌクレオチド４とは異なり、ターゲットDNAのうち、図中下方のDNA鎖の3'末端近傍の60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなる。なお、このオリゴヌクレオチド６も、オリゴヌクレオチド３，４等と同様な方法で標識した。
オリゴヌクレオチド６：5'-gacctgcagg catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg-3'
【００７１】
図５（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１とレーン３にシグナルが検出されたが、レーン２とレーン４にはシグナルが検出されなかった。レーン１，３の結果より、三本鎖形成領域は、ターゲットDNAのいずれの末端近傍領域にも形成できることが判る。しかし、レーン２，４の結果より、プローブDNAが、ターゲットDNAのうち、いずれか一方のDNA鎖の「3'末端近傍」の塩基配列と相補的である場合には、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。このことから、安定な三本鎖DNAを形成するためには、プローブDNA（一本鎖DNA）が、ターゲットDNA（二本鎖DNA）のうち、いずれか一方のDNA鎖の「5'末端近傍」の塩基配列と相補的でなければらないと考えられる。
【００７２】
なお、レーン２，４のように、プローブDNAが、ターゲットDNAのうち、いずれか一方のDNA鎖の「3'末端近傍」の塩基配列と相補的である場合でも、DNA−タンパク質複合体形成工程においては、安定なDNA−タンパク質複合体を形成することが判っている。しかし、タンパク質失活工程で、RecAタンパク質及びエキソヌクレアーゼＩを失活させると、三本鎖形成領域が解消してしまうので、安定な三本鎖DNAを得ることはできない。
【００７３】
（実施例３）
次いで、第３の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図６に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン１は、上記実施例２のレーン２と同じ反応等を行ったものである（図５参照）。即ち、ターゲットDNAとしてpUC118 DNAを制限酵素HincIIで切断した直鎖状の二本鎖DNAを、プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド５（ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の3'末端近傍の塩基配列と相補的な塩基配列からなるもの）を用いた（図４参照）。そして、DNA−タンパク質複合体形成工程において、反応液を30分間保温した。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を60分間保温し、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を120分間保温し、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を180分間保温し、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。
【００７４】
レーン５は、上記実施例２のレーン１と同じ反応等を行ったものである（図５参照）。即ち、ターゲットDNAとしてpUC118 DNAを制限酵素HincIIで切断した直鎖状の二本鎖DNAを、プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド３（ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基配列と相補的な塩基配列からなるもの）を用いた（図４参照）。そして、DNA−タンパク質複合体形成工程において、反応液を30分間保温した。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を60分間保温し、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を120分間保温し、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。レーン８は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を180分間保温し、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。
【００７５】
図６（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１〜４にはシグナルが検出されなかったが、レーン５〜８にはシグナルが検出された。また、レーン５〜８のシグナルは、レーン５が最も弱く、レーン６、レーン７といくにつれて強く、レーン８で最も強く検出された。レーン１〜４の結果より、プローブDNAが、ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の「3'末端近傍」の塩基配列と相補的である場合には、たとえDNA−タンパク質複合体形成工程において反応時間を長くとっても、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。
【００７６】
一方、レーン５〜８の結果より、プローブDNAが、ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の「5'末端近傍」の塩基配列と相補的である場合には、比較的短い時間（30分間）でも、安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。さらに、実験データは省略するが、反応時間を５分程度としても、安定な三本鎖DNAを形成できることが判っている。また、上記の結果より、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応時間を長くとるほど、安定な三本鎖DNAがより多く形成されることが判る。なお、反応時間が30分間と60分間との間では、シグナルの強さの違いが大きいのに対し、60分間と120分間、120分間と180分間との間では、シグナルの強さにそれほど大きな違いがないことから、60分間程度の反応時間でターゲットDNA（二本鎖DNA）の多くが、三本鎖DNAになるものと考えられる。このことから、DNA−タンパク質複合体形成工程における反応時間は、5分間以上で、できるだけ長くとるのが好ましいが、一般には、60分間程度とするのが適当であると考えられる。
【００７７】
（実施例４）
次いで、第４の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図７に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン１は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン１（図６参照）と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、ターゲットDNAとしてpUC118 DNAを制限酵素HincIIで切断した直鎖状の二本鎖DNAを、プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド５（ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の3'末端近傍の塩基配列と相補的な塩基配列からなるもの）を用いた（図４参照）。そして、DNA−タンパク質複合体形成工程において、反応液を30分間保温した。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン２（図６参照）と同じ反応等を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は60分間である。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン３（図６参照）と同じ反応等を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は120分間である。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン３（図６参照）と同じ反応等を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は180分間である。
【００７８】
レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン５（図６参照）と同じ反応を行った結果を示す。プローブDNAはオリゴヌクレオチド３（ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基配列と相補的な塩基配列からなるもの）であり、DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は30分間である。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン６（図６参照）と同じ反応を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は60分間である。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン７（図６参照）と同じ反応を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は120分間である。レーン８は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン８（図６参照）と同じ反応を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は180分間である。
【００７９】
図７（Ａ）の結果から明らかなように、いずれのレーン１〜８にもシグナルが検出されなかった。レーン１〜４の結果は、ATP-γSを加えてDNA−タンパク質複合体形成工程を行った上記実施例３のレーン１〜４においても、シグナルが検出されなかった（三本鎖DNAが形成されなかった）のであるから、ATP-γSを加えずに反応を行ってもシグナルが検出されない（三本鎖DNAが形成されない）のは、容易に予想され得る結果である。一方、レーン５〜８の結果より、ATP-γSを加えてDNA−タンパク質複合体形成工程を行った上記実施例３のレーン５〜８においてはシグナルが検出されたが、本実施例４では反応時間を長くとった場合でもシグナルが検出されなかったから、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSが必要とされることが判る。
【００８０】
このことから、少なくとも、組換えタンパク質としてRecAを利用し、ヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼＩを利用する場合には、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSまたはこれと類似する機能を有するものが必要であると考えられる。しかし、別の実験結果（後述する実施例６を参照）によれば、ATP-γSを加えなくても、ごく少量、具体的には、ATP-γSを加えた場合に比して、1/50〜1/100程度の三本鎖DNAが形成されることが判っている。従って、三本鎖DNAを形成するためには、必ずしもATP-γSまたはこれと類似する機能を有するものが必要であるとは言えないが、効率よく安定な三本鎖DNAを形成するためには、ATP-γS等を加えてDNA−タンパク質複合体形成工程を行うのが好ましいと考えられる。
【００８１】
（実施例５）
次いで、第５の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図８に結果を示した比較実験について説明する。レーン１〜４は、上記実施例２のレーン１〜４（図５参照）とそれぞれ同じ反応等を行った結果を示す。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNA（直鎖状にしたpUC118 DNA）と、標識オリゴヌクレオチド３，４，５または６と、RecAタンパク質と、エキソヌクレアーゼＩとを、ATP-γS、酢酸マグネシウム及び酢酸トリス中で反応させたものである。レーン１は標識オリゴヌクレオチド３を、レーン２は標識オリゴヌクレオチド５を、レーン３は標識オリゴヌクレオチド４を、レーン４は標識オリゴヌクレオチド６を使用している（図４参照）。
【００８２】
レーン５〜８は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSの代わりに4.8mMのATPを加え、それ以外はレーン１〜４とそれぞれ同じ反応等を行った結果を示す。レーン９〜１２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSの代わりに4.8mMのGTP-γSを加え、それ以外はレーン１〜４とそれぞれ同じ反応等を行った結果を示す。レーン１３〜１６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSの代わりに4.8mMのGTPを加え、それ以外はレーン１〜４とそれぞれ同じ反応等を行った結果を示す。
【００８３】
この図８（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１，３，５，７，９，１１にシグナルが検出されたが、それ以外のレーン２，４，６，８，１０，１２，１３〜１６にはシグナルが検出されなかった。レーン１〜４は、上記実施例２のレーン１〜４と同じ反応等を行ったものであるから、同様な結果となっている（図５参照）。レーン５〜８は、シグナルの強さは弱いものの、レーン１〜４の場合と同様にシグナルが検出されている。従って、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としてATPを用いても、安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。レーン９〜１２は、レーン１〜４の場合と同様に、同程度の強さのシグナルが検出されている。従って、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としてGTP-γSを用いても、安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。レーン１３〜１６には、シグナルが検出されていない。従って、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としてGTPを用いても、検出レベル以上の量の三本鎖DNAを形成できないことが判る。
【００８４】
これらのことから、安定な三本鎖DNAを形成するために、適切なヌクレオチド三リン酸またはそれらの類似体を選択することが好ましいと考えられる。即ち、少なくとも、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを使用する場合には、ATP-γS、ATPまたはGTP-γSを、さらには、ATP-γSまたはGTP-γSを用いるのが好ましいと考えられる。但し、ATPを用いたときに、三本鎖DNAの形成量が少なくなるのは、ATPが反応液中で生化学的に分解されるためであると考えられる。従って、このような分解が起こりにくい反応液を選択すれば、ATPを用いても三本鎖DNAの形成量を増加させることができるものと考えられる。また、データは省略するが、ヌクレオシド三リン酸として、UTPやCTPについても同様な実験を行ったが、少なくともRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを使用する場合には、GTPと同様、検出レベル以上の量の三本鎖DNAは形成されなかった。
【００８５】
なお、前述したように、別の実験結果（後述する実施例６を参照）によれば、ATP-γSを加えなくても、ごく少量だが、三本鎖DNAが形成されることが判っている。従って、三本鎖DNAを形成するためには、ヌクレオチド三リン酸またはそれらの類似体が必ずしも必要であるとは言えないが、効率よく安定な三本鎖DNAを形成するためには、DNA−タンパク質複合体形成工程において、上述のようにヌクレオチド三リン酸等を適宜選択するのが好ましい。
【００８６】
（実施例６）
次いで、第６の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図９に結果を示した比較実験について説明する。レーン２は、上記実施例２のレーン１と同じ反応を行った結果を示す（図５参照）。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNA（直鎖状のpUC118 DNA）と、標識プローブDNA（標識オリゴヌクレオチド３）と、RecAタンパク質と、エキソヌクレアーゼＩとを、ATP-γS、酢酸マグネシウム及び酢酸トリス中で反応させたものである。つまり、タンパク質（酵素）としては、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを加えている。
【００８７】
レーン１は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてRecAタンパク質のみを加え（エキソヌクレアーゼＩは加えない）、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩとエキソヌクレアーゼVII（ExonucleaseVII）とを加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてエキソヌクレアーゼＩのみを加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてエキソヌクレアーゼＩとエキソヌクレアーゼVIIとを加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてエキソヌクレアーゼVIIのみを加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼVIIとを加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン８〜レーン１４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外はレーン１〜７とそれぞれ同じ反応を行った結果を示す。
【００８８】
図９（Ａ）の結果から明らかなように、レーン２，３，９にシグナルが検出されたが、それ以外のレーン１，４〜８，１０〜１４にはシグナルが検出されなかった。レーン１〜７の結果より、DNA−タンパク質複合体形成工程において、タンパク質（酵素）として、少なくともRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩが必要であることが判る。なお、レーン２（RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを加えた場合）に比べ、レーン３（RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩとエキソヌクレアーゼVIIを加えた場合）のシグナルが弱くなっているのは、次のような理由によるものと考えられる。即ち、エキソヌクレアーゼVIIにより、ターゲットDNAまたはプローブDNAの末端の一部が削られて、三本鎖形成領域が形成されにくくなったと思われる。つまり、DNAを末端から切断するというエキソヌクレアーゼＩ本来の活性は、RecAタンパク質が存在することによりブロックされる。しかし、同じくDNAを末端から切断するエキソヌクレアーゼVII本来の活性は、RecAタンパク質が存在してもブロックされにくく、このため、ターゲットDNAまたはプローブDNAが削られて、三本鎖形成領域が形成されにくくなったと考えられる。
【００８９】
レーン８〜１４の結果より、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSが存在しなくても、タンパク質（酵素）として、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩがあれば、安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。但し、レーン２と比較してレーン９のシグナルの強さがかなり弱い（1/50〜1/100）ことから、安定な三本鎖DNAは、ATP-γSの存在下で効率よく形成されると考えられる。なお、レーン１０にはシグナルが検出されていないが、レーン３でシグナルが検出されたことから考えると、レーン１０においても、恐らく検出レベル以下のごく少ない量ではあるが、三本鎖DNAが形成されているものと推測される。以上のことから、安定な三本鎖DNAを形成するためには、DNA−タンパク質複合体形成工程において、タンパク質（酵素）として、RecAタンパク質またはこれと類似する機能を有するものと、エキソヌクレアーゼＩまたはこれと類似する機能を有するものが必要であることを考えられる。また、安定な三本鎖DNAを効率よく形成するためには、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSなど、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体を加えるのが好ましいと考えられる。
【００９０】
（実施例７）
次いで、第７の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１０に結果を示した比較実験について説明する。レーン１は、ATP-γSを加えず、それ以外は上記実施例２のレーン１と同じ反応等を行った結果を示す（図５参照）。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNA（直鎖状のpUC118 DNA）と、標識プローブDNA（標識オリゴヌクレオチド３）（図４参照）と、RecAタンパク質と、エキソヌクレアーゼＩとを、酢酸マグネシウム及び酢酸トリス中で反応させたものである。レーン２は、ATP-γSを加えず、それ以外は上記実施例２のレーン３と同じ反応等を行った結果を示す（図５参照）。即ち、標識プローブDNAは、標識オリゴヌクレオチド４である（図４参照）。
【００９１】
レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識オリゴヌクレオチドを加えず、それ以外は上記実施例２と同様な反応を行い、さらに、タンパク質失活工程を行った。その後、エタノール沈殿の行い、DNAを１倍濃度のＳＳＣ溶液に溶かし、これに1pmolの標識オリゴヌクレオチド３を加えて、60℃で30分間保温した。そして、その半分量についてアガロースゲル電気泳動等を上記各実施例と同様に行った。レーン４は、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド３の代わりに標識オリゴヌクレオチド５を用いて、それ以外はレーン３と同じ反応等を行った結果を示す。レーン５は、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド３の代わりに標識オリゴヌクレオチド４を用いて、それ以外はレーン３と同じ反応等を行った結果を示す。レーン６は、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド３の代わりに標識オリゴヌクレオチド６を用いて、それ以外はレーン３と同じ反応等を行った結果を示す。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、それ以外はレーン３と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、標識プローブは、オリゴヌクレオチド３である。レーン８は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、標識プローブは、オリゴヌクレオチド４である。
【００９２】
図１０（Ａ）の結果から明らかなように、いずれのレーン１〜８にもシグナルが検出されなかった。レーン１，２の結果より、DNA-タンパク質複合体形成工程においてATP-γSの存在しない場合には、三本鎖DNAがほとんど形成されないことが判る。レーン３〜６の結果より、DNA−タンパク質複合体形成工程においてプローブDNA（オリゴヌクレオチド）を加えなければ、タンパク質失活工程後にこれを加えても、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。また、これまでに述べてきた三本鎖DNAは、エキソヌクレアーゼＩによりターゲットDNAの末端が一本鎖となり、これにプローブDNAが結合しているわけでないことが判る。
【００９３】
レーン７，８の結果から、DNA−タンパク質複合体形成工程においてエキソヌクレアーゼＩとプローブDNA（オリゴヌクレオチド）を加えず反応させて、タンパク質失活工程後にプローブDNA（オリゴヌクレオチド）を加えても、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。これらのことから、安定な三本鎖DNAを形成するためには、プローブDNAをDNA−タンパク質複合体形成工程で加え、ターゲットDNAとプローブDNAとタンパク質とからなるDNA−タンパク質複合体を一旦形成する必要があると考えられる。
【００９４】
（実施例８）
次いで、第８の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１２に結果を示した比較実験について説明する。まず、図１１に示すように、ターゲットDNAとして、M13mp18 RF DNA（約7.2kbp）を制限酵素SnaBＩで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。なお、M13mp18 RF DNAの塩基配列については、GeneBank登録番号X02513を参照されたい。
【００９５】
また、プローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド７（配列番号：７））を用意した。このオリゴヌクレオチド７は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる80merの塩基配列と、100％相補的な80merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド８（配列番号：８））を用意した。このオリゴヌクレオチド８は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド９（配列番号：９））を用意した。このオリゴヌクレオチド９は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる50merの塩基配列と、100％相補的な50merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１０（配列番号：１０））を用意した。このオリゴヌクレオチド１０は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる40merの塩基配列と、100％相補的な40merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１１（配列番号：１１））を用意した。このオリゴヌクレオチド１１は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる30merの塩基配列と、100％相補的な30merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１２（配列番号：１２））を用意した。このオリゴヌクレオチド１２は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる20merの塩基配列と、100％相補的な20merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１３（配列番号：１３））を用意した。このオリゴヌクレオチド１３は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる10merの塩基配列と、100％相補的な10merの塩基配列からなる。そして、これらのオリゴヌクレオチド７〜１３について、T4 Polynucleotidekinaseと［γ-32P］ATPをを用いて、32Pで5'末端をそれぞれ標識した。
【００９６】
オリゴヌクレオチド７：5'-acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド８：5'-agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド９：5'-aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド１０：5'-actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド１１：5'-gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド１２：5'-ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド１３：5'-ggtaaaatac-3'
【００９７】
次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、200ngのターゲットDNA（直鎖状にしたM13mp18 RF DNA）と、1pmolの標識オリゴヌクレオチド７と、3.0μgのRecAタンパク質と、4unitのエキソヌクレアーゼＩとを、4.8mMのATP-γS、20mMの酢酸マグネシウム、30mMの酢酸トリス（pH7.2）中で、37℃において30分間保温した。これにより、上記実施例１等と同様に、DNA−タンパク質複合体が形成される。即ち、ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図１１中右方）に、オリゴヌクレオチド７全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなる安定なDNA−タンパク質複合体が形成される（図２参照）。
【００９８】
次に、タンパク質失活工程において、この反応液に、0.5％（W/Vol）のSDSと0.7mg/mlのプロティナーゼKを加え、37℃において30分間保温し、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させた。これにより、上記実施例１等と同様に、安定な三本鎖DNAが形成される。即ち、ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図１１中右方）に、オリゴヌクレオチド７全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAが形成される（図２参照）。この三本鎖DNAも、その構造を維持するために特別なタンパク質等を必要とせず、多少の熱を加えても、安定な状態を維持することができる。
【００９９】
次に、上記実施例１等と同様に、電気泳動工程において、反応液の半分量について1％のアガロースゲルで電気泳動を行った。そして、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してアガロースゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAの写真を記録した。その結果を図１２（Ｂ）のレーン１に示す。その後も、上記実施例１等と同様に、乾燥工程を行った後、検出工程において、アガロースゲルのオートラジオグラムをとり、標識オリゴヌクレオチド７由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録した。その結果を図１２（Ａ）のレーン１に示す。図１２（Ａ）及び（Ｂ）において、約7.2kbp付近に検出されたシグナルは、ターゲットDNAにオリゴヌクレオチド７が結合した三本鎖DNAによるものである。なお、このサザンハイブリダイゼーションも、上記実施例１等と同様な工程によるものであるから、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業が少なく、容易かつ短時間で行うことができる。
【０１００】
レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド８を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド９を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド１０を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド１１を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド１２を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド１３を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１０１】
図１２（Ａ）の結果から明らかなように、いずれのレーン１〜７にもシグナルが検出された。レーン１〜４では強いシグナルが検出され、レーン５ではそれらよりも若干弱いシグナルが検出され、レーン６ではさらに弱いシグナルが検出され、レーン７ではそれよりもさらに弱いシグナルが検出されている。これらの結果から、プローブDNA（オリゴヌクレオチド）の長さが長いほど、安定な三本鎖DNAが形成されやすいことが判る。十分な量の安定な三本鎖DNAを形成するには、DNA-タンパク質複合体形成工程の反応時間にもよるが、プローブDNA（オリゴヌクレオチド）の長さが20mer以上であり、さらには、30mer以上であるのが好ましいと考えられる。
【０１０２】
（実施例９）
次いで、第９の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１４に結果を示した比較実験について説明する。まず、図１３に示すように、ターゲットDNAとして、上記実施例８と同様に、M13mp18 RF DNA（約7.2kbp）を制限酵素SnaBＩで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。
【０１０３】
また、図１３に示すように、プローブDNAとして、上記実施例８で用いたオリゴヌクレオチド８を用意した。また、別のプローブDNAとして、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方）の5'末端から数えて11番目の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１４（配列番号：１４）を用意した。また、別のプローブDNAとして、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端から数えて21番目の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１５（配列番号：１５）を用意した。また、別のプローブDNAとして、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端から数えて31番目の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１６（配列番号：１６）を用意した。そして、これらのオリゴヌクレオチド８，１４〜１６について、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPをを用いて、32Pで5'末端をそれぞれ標識した。
【０１０４】
オリゴヌクレオチド１４：5'-caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg-3'
オリゴヌクレオチド１５：5'-acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt-3'
オリゴヌクレオチド１６：5'-cagcatcgga acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat-3'
【０１０５】
図１４において、レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン１は、上記実施例８のレーン２と同様な反応等を行った結果を示す（図１２参照）。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNAとして直鎖状にしたM13mp18 RF DNAを、プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド８を使用した。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド１４を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド１５を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド１６を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１０６】
図１４（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１〜３にはシグナルが検出されたが、レーン４にはシグナルが検出されなかった。また、レーン１〜３のうち、レーン１のシグナルが最も強く、レーン３のシグナルが最も弱かった。このことから、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するプローブDNAの3'末端の延長上に、二本鎖形成領域が存在しないと（レーン１の場合）、最も安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。また、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するプローブDNAの3'末端の延長上に、二本鎖形成領域が存在しても、二本鎖形成領域が存在しても約20bp以下の短いものであれば（レーン２または３の場合）、安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。一方、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するプローブDNAの3'末端の延長上に、長い二本鎖形成領域が存在する場合（レーン４）、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。
【０１０７】
このような結果となる理由は、三本鎖形成領域を構成するプローブDNAの3'末端の延長上に存在する二本鎖形成領域により、構造ストレスが生じ、三本鎖形成領域が解消されやすくなるためであると考えられる。従って、安定な三本鎖DNAを形成するためには、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するプローブDNAの3'末端の延長上にできる二本鎖形成領域が20bp以下の短いものであり、さらには、このような二本鎖形成領域が存在しないのが好ましいと考えられる。
【０１０８】
（実施例１０）
次いで、第１０の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１５に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン１は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウムを加えず、それ以外は上記実施例２のレーン１（図５参照）と同じ反応等を行った結果を示す。レーン２は、上記実施例２のレーン１と同じ反応等を行った結果を示す（図５参照）。酢酸マグネシウムの量は20mMである。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウムの量を40mMとし、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウムの量を60mMとし、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１０９】
図１５（Ａ）の結果から明らかなように、レーン２〜４にシグナルが検出されたが、レーン１にはシグナルが検出されなかった。また、レーン２〜４のシグナルの強さはほぼ同程度であった。このことから、安定な三本鎖DNAを形成するためには、少なくとも、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを用いる場合、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウム、具体的にはMgイオンまたはそれに類似する機能を有するものが必要であると考えられる。また、その量は、20mM程度あれば十分であると考えられる。
【０１１０】
（実施例１１）
次いで、第１１の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１６に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン１は、上記実施例２のレーン１と同じ反応等を行った結果を示す（図５参照）。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、反応液に20mMの酢酸マグネシウムを加えている。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウムを加えず、その代わりに10mMの塩化コバルトを加えて、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、さらに10mMの塩化コバルトを加えて、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウムを加えず、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１１１】
レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、4.8mMのATP-γS、10mMの酢酸マグネシウム、66mMの酢酸カルシウム、33mMの酢酸トリス（pH7.8）、及び、0.5mMのDTT中で、ターゲットDNA（pUC118 DNA）と標識オリゴヌクレオチド３とRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩとを反応させた結果を示す。それ以外はレーン１と同様である。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、さらに10mMの塩化コバルトを加えて、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えず、その代わりに4.8mMのGTPを加えて、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。レーン８は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えず、その代わりに4.8mMのATPを加えて、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１１２】
図１６（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１にのみシグナルが検出され、それ以外のレーンにはシグナルが検出されなかった。レーン１，４の結果から、少なくともRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを用いる場合には、効率的に安定な三本鎖DNAを形成するために、DNA−タンパク質複合体形成工程において、Mgイオンが必要であることが判る。また、レーン２の結果から、Coイオンでは、Mgイオンに代用できないことが判る。一方、レーン３，５，６の結果から、Mgイオンがあっても、CaイオンやCoイオンが存在する場合には、安定な三本鎖DNAを形成することが困難であることが判る。また、レーン７，８の結果から、レーン５の反応液においてATP-γSの代わりにATPやGTPを用いても、効率的に安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。これらのことから、効率的に安定な三本鎖DNAを形成するためには、少なくともRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを用いる場合、DNA−タンパク質複合体形成工程において、Mgイオンが必要であると考えられる。
【０１１３】
（実施例１２）
次いで、第１２の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１７に示すように、ターゲットDNAとして、ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとPvuIIで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。この中には、p53遺伝子がコードされた約2.2kbpのDNA断片１が含まれる。また、別のターゲットDNAとして、ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとEcoRＩで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。この中には、p53遺伝子がコードされた約7.5kbpのDNA断片２が含まれる。また、別のターゲットDNAとして、ヒトのゲノムDNAを制限酵素PvuIIとEcoRＩで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。この中には、p53遺伝子がコードされた約5.4kbpのDNA断片３が含まれる。なお、これらのDNA断片１〜３を含むヒトp53遺伝子の塩基配列については、GeneBank登録番号U94788を参照されたい。
【０１１４】
一方、図１７に示すように、プローブDNAとして、上記DNA断片１及び２のHindIII切断部位側の末端近傍領域に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１７（配列番号：１７））を用意した。具体的には、上記DNA断片１，２のうち、一方のDNA鎖のHindIII切断部位側の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１７を用意した。また、別のプローブDNAとして、上記DNA断片２及び３のEcoRＩ切断部位側の末端近傍領域に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１８（配列番号：１８））を用意した。具体的には、上記DNA断片２，３のうち、一方のDNA鎖のEcoRＩ切断部位側の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１８を用意した。そして、これらのオリゴヌクレオチド１７，１８について、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPを用いて、32Pで5'末端をそれぞれ標識した。
オリゴヌクレオチド１７：5'-ctttg cagtgaaagg aatcaaagaa atggagccgt gtatcaggtg gggaagggtg ggggc-3'
オリゴヌクレオチド１８：5'-ctgtgggtt gattccacac ccccgcccgg cacccgcgtc cgcgccatgg ccatctacaa g-3'
【０１１５】
次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、上記DNA断片１を含む5μgのターゲットDNA（ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとPvuIIで切断したもの）と、5pmolの標識オリゴヌクレオチド１７と、10.0μgのRecAタンパク質と、4unitのエキソヌクレアーゼＩとを、4.8mMのATP-γS、20mMの酢酸マグネシウム、30mMの酢酸トリス（pH7.2）中で、37℃において30分間保温した。これにより、上記実施例１等と同様に、DNA−タンパク質複合体が形成される。即ち、ターゲットDNAに含まれる上記DNA断片１のHindIII切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド１７全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなる安定なDNA−タンパク質複合体が形成される（図２参照）。
【０１１６】
次に、タンパク質失活工程において、反応液に、0.5％（W/Vol）SDSと0.7mg/mlプロティナーゼKを加え、37℃において30分間保温し、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させた。これにより、上記実施例１等と同様に、安定な三本鎖DNAが形成される。即ち、ターゲットDNAに含まれる上記DNA断片１のHindIII切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド１７全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAが形成される（図２参照）。この三本鎖DNAも、その構造を維持するために特別なタンパク質等を必要とせず、多少の熱を加えても、安定な状態を維持することができる。
【０１１７】
その後、この反応液について、フェノール・クロロホルム抽出を１回行った後、S-400スピンカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）の操作を２回行い、未反応の標識オリゴヌクレオチド１７を除去した。次に、その全量（約20μl）について、1％のアガロースゲルで電気泳動を行った。そして、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してアガロースゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAの写真を記録した。その結果を図１８（Ｂ）のレーン１に示す。
【０１１８】
次に、このアガロースゲルを濾紙の上に載せてゲル乾燥機で乾燥させた。その後、アガロースゲルのオートラジオグラムをとり、標識オリゴヌクレオチド１７からのシグナルをＸ線フィルム上に記録した。その結果を図１８（Ａ）のレーン１に示す。図１８（Ａ）において、約2.2kbp付近に検出されたシグナルは、DNA断片１にオリゴヌクレオチド１７が結合した三本鎖DNAによるものである。なお、このようなジェノミックサザンハイブリダイゼーションも、上記実施例１等と同様な工程によるものであるから、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業が少なく、容易かつ短時間で行うことができる。
【０１１９】
次いで、図１８に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNAとして、上記DNA断片２を含む5μgのターゲットDNA（ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとEcoRＩで切断したもの）を使用した。それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNAとして、上記DNA断片３を含む5μgのターゲットDNA（ヒトのゲノムDNAを制限酵素PvuIIとEcoRＩで切断したもの）を使用した。それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１２０】
レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド１８を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、ターゲットDNAは、ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとPvuIIで切断したものを用いている。レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド１８を加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、ターゲットDNAは、ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとEcoRＩで切断したものを用いている。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド１８を加え、それ以外はレーン３と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、ターゲットDNAは、ヒトのゲノムDNAを制限酵素PvuIIとEcoRＩで切断したものを用いている。
【０１２１】
図１８（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１，２，５，６にはシグナルが検出されたが、レーン３，４にはシグナルが検出されなかった。レーン１，２，５，６の結果より、これらのレーンでは、レーン１について上述したように、安定な三本鎖DNAが形成されていることが判る。レーン２の約7.5kbp付近のシグナルは、DNA断片２とオリゴヌクレオチド１７とが結合した三本鎖DNAによるものである。レーン５の約7.5kbp付近のシグナルは、DNA断片２とオリゴヌクレオチド１８とが結合した三本鎖DNAによるものである。レーン６の約5.4kbp付近のシグナルは、DNA断片３とオリゴヌクレオチド１８とが結合した三本鎖DNAによるものである。
【０１２２】
一方、レーン３，４の結果より、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するオリゴヌクレオチドの3'末端の延長上に長い二本鎖形成領域が形成されると、三本鎖形成領域が解消し、安定な三本鎖DNAを形成することができないことが判る。これは、長い二本鎖形成領域による構造ストレスにより、三本鎖形成領域が解消されるためであると考えられる。これらのことから、ジェノミックサザンハイブリダイゼーションにおいても、三本鎖DNAを利用することが有効であると考えられる。また、安定な三本鎖DNAを形成するためには、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するオリゴヌクレオチドの3'末端の延長上に長い二本鎖形成領域ができないようにする必要があると考えられる。
【０１２３】
以上において、本発明の実施の形態を実施例に即して説明したが、本発明は上記各実施例１〜１２に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることは言うまでもない。例えば、上記各実施例では、プローブDNA（一本鎖DNA）として、ターゲットDNA（二本鎖DNA）の一部と100%相補的なオリゴヌクレオチドを使用したが、プローブDNAは、実質的に相補的、具体的には70〜80％以上の相補性があれば、一般に三本鎖DNAを形成することができる。また、プローブDNA（一本鎖DNA）は、二本鎖DNAと相補的な領域の他に、二本鎖DNAと相補的でない他の塩基配列が付加されたものでもよい。このようなプローブDNAでも、ターゲットDNAに結合して三本鎖DNAを形成できるからである。但し、より安定な三本鎖DNAを形成するためには、上記各実施例のように、プローブDNA（一本鎖DNA）は、その全体がターゲットDNA（二本鎖DNA）の一部と100%相補的であるのが好ましい。また、プローブDNAは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドである必要ななく、その由来は問われない。プローブDNAにオリゴヌクレオチド以外のものを用いても、安定な三本鎖DNAを形成することができるからである。
【０１２４】
また、上記各実施例では、組換えタンパク質としてRecAタンパク質を使用したが、前述したように、それ以外のものを使用することも可能である。但し、入手容易性、安全性、機能性を考慮すると、RecAタンパク質が最も適していると思われる。また、上記各実施例では、三本鎖DNAを形成するためのヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼＩを使用したが、前述したように、これと類似する機能を有するタンパク質を利用することも可能である。但し、これも入手容易性、安全性、機能性を考慮すると、エキソヌクレアーゼＩが最も適していると思われる。また、上記各実施例では、タンパク質失活工程において、タンパク質を失活させるために、SDSとプロティナーゼKを加えているが、前述したように、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤を利用してもよい。このようなものでも、タンパク質を失活させることができるからである。
【０１２５】
また、上記各実施例では、ターゲットDNA（二本鎖DNA）のどちらか一方の末端近傍領域に、プローブDNA（一本鎖DNA）結合させて三本鎖形成領域を形成したが、ターゲットDNA（二本鎖DNA）の両方の末端近傍領域に、プローブDNA（一本鎖DNA）を結合させて、両方の末端近傍領域に三本鎖形成領域を形成することもできる。このような三本鎖DNAも、上記各実施例で述べた三本鎖DNAと同様に、特別なタンパク質等がなくても安定な構造を維持することができる。
【０１２６】
【配列表】
＜110＞ アイシン精機株式会社 AISIN SEIKI CO.,LTD
＜120＞ 三本鎖DNAの形成方法、三本鎖DNA、及びサザンハイブリダイゼーション
＜130＞ ＡＫ０００５３７
＜160＞ 18
＜210＞ 1
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pBR322のScaＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 1
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 60
＜210＞ 2
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pBR322のScaＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 2
オリゴヌクレオチド２：
acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 60
＜210＞ 3
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pUC118のHincII認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 3
cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc gagctcggta cccggggatc ctctagagtc 60
＜210＞ 4
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pUC118のHincII認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 4
caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg cctgcaggtc 60
＜210＞ 5
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pUC118のHincII認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 5
gactctagag gatccccggg taccgagctc gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 60
＜210＞ 6
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pUC118のHincII認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 6
gacctgcagg catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 60
＜210＞ 7
＜211＞ 80
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 7
acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt 60
ccattaaacg ggtaaaatac 20
＜210＞ 8
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 8
agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 60
＜210＞ 9
＜211＞ 50
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 9
aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 50
＜210＞ 10
＜211＞ 40
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 10
actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 40
＜210＞ 11
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 11
gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 30
＜210＞ 12
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 12
ccattaaacg ggtaaaatac 20
＜210＞ 13
＜211＞ 10
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 13
ggtaaaatac 10
＜210＞ 14
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 14
caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg 60
＜210＞ 15
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 15
acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt 60
＜210＞ 16
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 16
cagcatcgga acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat 60
＜210＞ 17
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ ヒトp53遺伝子のHindIII認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 17
ctttgcagtg aaaggaatca aagaaatgga gccgtgtatc aggtggggaa gggtgggggc 60
＜210＞ 18
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ ヒトp53遺伝子のEcoRＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 18
ctgtgggttg attccacacc cccgcccggc acccgcgtcc gcgccatggc catctacaag 60
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に関し、ターゲットDNAとプローブDNAについて示す説明図である。
【図２】実施例１に関し、DNA−タンパク質複合体の形成及び三本鎖DNAの形成について示す説明図である。
【図３】実施例１に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図４】実施例２に関し、ターゲットDNAとプローブDNAについて示す説明図である。
【図５】実施例２に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図６】実施例３に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図７】実施例４に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図８】実施例５に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図９】実施例６に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１０】実施例７に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１１】実施例８に関し、ターゲットDNAとプローブDNAについて示す説明図である。
【図１２】実施例８に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１３】実施例９に関し、ターゲットDNAとプローブDNAについて示す説明図である。
【図１４】実施例９に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１５】実施例１０に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１６】実施例１１に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１７】実施例１２に関し、ターゲットDNAとプローブDNAについて示す説明図である。
【図１８】実施例１２に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１９】従来技術に関し、三本鎖DNA（DNA−タンパク質複合体）の形成及び三本鎖DNAの解離について示す説明図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖DNAと一本鎖DNAとを含む複合体の形成方法、二本鎖DNAと一本鎖DNAとを含む複合体、及びサザンハイブリダイゼーションに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、二本鎖DNAと一本鎖DNAとを含む複合体の形成方法が知られている。即ち、図１９に示すように、ターゲットDNA（二本鎖DNA）を用意すると共に、このターゲットDNAのいずれか一方のDNA鎖の一部の塩基配列と、相補的な塩基配列を有するプローブDNA（一本鎖DNA）を用意する。次に、緩衝剤等を含む反応液に、これらのDNAと大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を混ぜて、十分な時間保温する。
【０００３】
そうすると、ターゲットDNAとプローブDNAとRecAタンパク質とからなるDNA−タンパク質複合体が形成される。具体的には、まず、プローブDNAにRecAタンパク質が結合してプローブDNA−RecAタンパク質複合体が形成される。続いて、このプローブDNA−RecAタンパク質複合体が、ターゲットDNAに結合し、三本鎖形成領域を有するDNA-タンパク質複合体が形成される。その際、プローブDNAは、RecAタンパク質が関与した状態で、ターゲットDNAのうち、プローブDNAと相補的な塩基配列からなる領域に結合すると考えられている。この状態のDNA−タンパク質複合体は、三本鎖形成領域を有するにも拘わらず、比較的安定なものである。詳しくは、B. Jagadeeshwar Rao et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88，2984-2988（1991）、Gurucharan Reddy et al.，Biochemistry，33，11486-11492（1994）、Efim I. Golub et al.，Mutation Research，351，117-124（1996）等を参照されたい。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、図１９に示すように、このDNA−タンパク質複合体に、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）やタンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼK）などを加えて十分な時間保温し、RecAタンパク質を失活させると、DNA−タンパク質複合体からRecAタンパク質が除去されるだけでなく、ターゲットDNAとプローブDNAとの結合も解消される。つまり、DNA−タンパク質複合体は、RecAタンパク質の存在下においてのみ、その構造が安定に維持され、RecAタンパク質がない状態では、安定な三本鎖DNAを形成することができなかった。遺伝子工学等の分野において、三本鎖DNAを利用しようとした場合、RecAタンパク質が結合した状態の複合体では、RecAタンパク質の存在により多くの制限を受け、その利用範囲が狭くなる。そこで、このようなタンパク質が存在しなくても安定な構造を維持することができる三本鎖DNAの形成方法の開発が待たれていた。
【０００５】
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、複合体中にタンパク質を含有しないにもかかわらず、安定な状態を維持することができる三本鎖DNAの形成方法、三本鎖DNA、及び、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段、作用及び効果】
その解決手段は、直鎖状の二本鎖DNA、この二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNA、RecAタンパク質、並びに、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ、を反応させて、上記二本鎖DNAのうち、上記一方のDNA鎖の5'末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖DNAのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が、少なくとも上記RecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成するDNA−タンパク質複合体形成工程と、上記RecAタンパク質及び上記エキソヌクレアーゼＩを失活させて、上記二本鎖DNAの末端近傍包含領域に上記一本鎖DNAの相補的領域が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAを形成するタンパク質失活工程と、を備える三本鎖DNAの形成方法である。
【０００７】
本発明によれば、DNA−タンパク質複合体形成工程において、二本鎖DNAと一本鎖DNAとRecAタンパク質と大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩから、DNA−タンパク質複合体を形成する。そしてその後、タンパク質失活工程において、RecAタンパク質及びエキソヌクレアーゼＩを失活させると、二本鎖DNAの末端近傍包含領域に一本鎖DNAの相補的領域が結合した三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAを形成することができる。このような三本鎖DNAは、その構造を安定化させるための特別なタンパク質等（例えば、前述したRecAタンパク質）が存在しなくても、多少の熱を加えるなどしても解離することなく、安定な状態を維持することができる。なお、本発明では、三本鎖形成領域は、二本鎖DNAの一方の末端近傍包含領域に形成するだけでなく、二本鎖DNAの両方の末端近傍包含領域に形成することも可能である。
【０００８】
このような三本鎖DNAの形成方法は、例えば、サザンハイブリダイゼーションにおいて利用可能である。従来のサザンハイブリダイゼーションは、例えば、次のように行う。即ち、ターゲットDNAとして、適当な制限酵素で切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意すると共に、プローブDNAとして、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPを用いて、5'末端を32Pで標識した一本鎖DNAを用意する。そして、ターゲットDNA（二本鎖DNA）について、アガロースゲル電気泳動を行う。その後、アガロースゲルをメンブレン上に載せて吸引等を行い、アガロースゲル中のターゲットDNA（二本鎖DNA）をメンブレン上に移す。その後、熱処理等を行って、ターゲットDNA（二本鎖DNA）をメンブレンに固定すると共に、ターゲットDNA（二本鎖DNA）を解離させて一本鎖の状態にする。次に、このメンブレンをプローブDNA溶液（標識した一本鎖DNAの溶液）に浸して、ハイブリダイゼーションを行う。その後、メンブレンを洗浄する。その後は、このメンブレンのオートラジオグラムをとり、標識プローブDNA（標識した一本鎖DNA）からのシグナルをＸ線フィルム上に記録する。
【０００９】
これに対し、本発明を利用したサザンハイブリダイゼーションは、例えば、次のように行うことができる。即ち、従来と同様に、ターゲットDNA（二本鎖DNA）と標識プローブDNA（標識した一本鎖DNA）を用意する。ここで、本発明を利用した場合、これらのDNAとRecAタンパク質と大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩにより、DNA−タンパク質複合体を形成する（DNA−タンパク質複合体形成工程）。そしてその後、RecAタンパク質及びエキソヌクレアーゼＩを失活させ、三本鎖形成領域を有する安定な三本鎖DNAを形成する（タンパク質失活工程）。次に、この三本鎖DNAについて、アガロースゲル電気泳動を行う。電気泳動後は、アガロースゲルを濾紙等の上に載せてゲル乾燥機で乾燥させた後、アガロースゲルのオートラジオグラムをとり、標識プローブDNA（標識した一本鎖DNA）からのシグナルをＸ線フィルム上に記録する。
【００１０】
このように、サザンハイブリダイゼーションに本発明を適用した場合、従来と比較すれば、容易かつ短時間でサザンハイブリダイゼーションを行うことができる。アガロースゲル中のDNAをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブDNA溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業がなくなるからである。なお、プローブDNAとして、蛍光物質等で化学的に標識した一本鎖DNAを利用する場合においても、同様なことが言える。
【００１１】
ここで、三本鎖DNAは、二本鎖DNAの少なくとも一方の末端近傍包含領域に、一本鎖DNAの相補的領域が結合して三本鎖形成領域を形成したものであれば、その結合形態は問われない。つまり、二本鎖DNAと一本鎖DNAとの間で、必ずしも、ワトソン・クリック型塩基対やフーグスティーン型塩基対のような特定の構造をとっている必要はなく、二本鎖DNAの末端近傍包含領域と一本鎖DNAの相補的領域との間で、何らかの特異的な相互作用によって三本鎖形成領域が形成されていればよい。
【００１２】
二本鎖DNAは、直鎖状であれば、いかなるものを用いてもよい。即ち、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、3000Mbpといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なDNAであっても構わない。勿論、二本鎖DNAの由来は問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来のDNAやそれらを改変したDNAであっても、微生物等のもつプラスミドDNA等やプラスミドDNA等に異種のDNA断片を挿入したキメラDNA等であっても、あるいは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。
【００１３】
一本鎖DNAは、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状のものであれば、いかなるもの用いてもよい。即ち、この条件を満たす限り、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。また、その由来も問われない。これらの点は、二本鎖DNAと同様である。
【００１４】
実質的に相補的な程度は、一般的には、およそ70〜80％以上の相補性を有することが必要とされ、より好ましくは、ほぼ100％の相補性を有することである。相補性が高いほど、より安定な三本鎖形成領域（三本鎖DNA）を形成することができるからである。但し、必要とされる相補性の程度は、相補的領域の長さによって若干変動する。また、相補的領域全体の相補性は同じ（例えば70％）であっても、相補的領域内全体でほぼ等しい相補性（70％）を有する場合と、相補的領域内に相補性が高い領域（例えば90％）と低い領域（例えば50％）が偏在する場合とによっても、若干変動する。
【００１５】
また、一本鎖DNAは、相補的領域を含むものであればよいから、一本鎖DNA全体が相補的領域からなるものであっても、あるいは、相補的領域にさらに他の塩基配列が付加されたものであっても構わない。但し、一本鎖DNA全体が相補的領域からなるものの方が、より安定な三本鎖DNAを形成しやすいので好ましい。なお、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「末端近傍の塩基から始まる塩基配列」と、実質的に相補的な塩基配列を含む必要があるのは、次のような理由による。即ち、一本鎖DNAが、二本鎖DNAの一方のDNA鎖の末端近傍以外の塩基配列（例えば、中央付近の塩基配列）にだけ相補的である場合には、DNA−タンパク質複合体形成工程において安定なDNA−タンパク質複合体を形成することができるが、タンパク質失活工程でタンパク質を失活させると、二本鎖DNAと一本鎖DNAが解離してしまい、安定な三本鎖DNAが得られないからである。
【００１６】
また、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「5'末端近傍」の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む必要があるのも、同様な理由による。即ち、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の「3'末端近傍」の塩基配列にだけ相補的である場合には、DNA−タンパク質複合体形成工程において安定なDNA−タンパク質複合体を形成することはできるが、タンパク質を失活させると、二本鎖DNAと一本鎖DNAが解離してしまい、安定な三本鎖DNAが得られないからである。
【００１７】
RecAタンパク質として、具体的には、大腸菌（Escherichia coli）に由来するRecAタンパク質の他、耐熱性細菌（Thermus thermophilus）やその他の腸内細菌においてRecA遺伝子によりコードされている多機能タンパク質、あるいは、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、メチロフィルス メチロトローファス（Methylophilus methylotrophus）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ウスティラゴ メイディス（Ustilago maydis）等に由来するRecA類似タンパク質などが挙げられる。また、酵母（Saccharomyces cerevisiae）やヒトなど真核生物に由来するRecA類似タンパク質もこれに含まれる。
【００１８】
【００１９】
【００２０】
DNA−タンパク質複合体形成工程は、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体の存在下において、緩衝液中で行うのが好ましい。効率よく、安定なDNA−タンパク質複合体を形成することができるからである。緩衝液は、反応の最適条件を得るため適宜変更することできる。例えば、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）と酢酸や塩酸等の適当な酸とにより、ｐＨを約4.0〜9.0、より好ましくは、約7.0〜8.0に調節したトリス系の緩衝液を使用すればよい。緩衝剤は、一般に約10〜100mM、好ましくは、約30mMで使用する。
【００２１】
ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としては、例えば、アデノシン5'−三リン酸（ATP）、グアノシン5'−三リン酸（GTP）、UTP、CTPや、アデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ATP-γS）、グアノシン（γ−チオ）−三リン酸（GTP-γS）、dATP、dUTP、dCTPなどを挙げることができる。これらは、さらにヌクレオシド二リン酸（例えば、ADP）と組み合わせて使用することもできる。なお、特に、DNA−タンパク質複合体を形成する系において、ATP等ヌクレオシド三リン酸が生化学的な分解を伴う場合には、ヌクレオシド三リン酸の類似体（例えば、ATP-γS）を使用するのが好ましい。これらヌクレオシド三リン酸等は、0.1〜10mM、好ましくは、約5mMで使用する。
【００２２】
反応液中の核酸（二本鎖DNA及び一本鎖DNA）の濃度は、核酸が十分に溶解することができる濃度であればよく、適宜変更することができる。二本鎖DNAに対する一本鎖DNAの割合は、モル比で約1〜100倍とするのが好ましい。また、RecAタンパク質は、一本鎖DNAの3塩基当たり1分子に相当するように加えるのが好ましい。また、大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩは、二本鎖DNAの1μg当たり約1unit加えるのが好ましい。このように調製した反応液は、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、5分間以上、一般には約60分間保温することにより、DNA−タンパク質複合体を形成することができる。
【００２３】
なお、この工程では、上記のように反応液中にすべてのもの加えて一定時間保温する方法の他、次のような方法を採ることもできる。即ち、まず、ヌクレオシド三リン酸等を含む緩衝液に、二本鎖DNAと一本鎖DNAとRecAタンパク質とを加えて、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、数分間以上、好ましくは約10分間保温する。そしてその後、この反応液に大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩを加えて、さらに、4〜60℃、好ましくは約37℃のおいて、5分以上、一般には約30分間保温する。
【００２４】
このような方法で反応させると、特に安定なDNA−タンパク質複合体を形成することができる。その理由としては、エキソヌクレアーゼＩは、本来、一本鎖DNAを末端から切断していく酵素であるから、最初から反応液に加えると、一本鎖DNAが削られてしまうことがある。しかし、このようにエキソヌクレアーゼＩを後から加えると、一本鎖DNAには先にRecAタンパク質が結合して、エキソヌクレアーゼＩから保護されるため、一本鎖DNAが切断されにくくなり、安定なDNA−タンパク質複合体を形成することができると考えられるからである。
【００２５】
タンパク質失活工程で、タンパク質を失活させるには、反応液にキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）を加えるか、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を加えるか、または、タンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼK）を加え、あるいは、これらの処理を組み合わせて行った後、例えば、約37℃で10分間以上保温すればよい。こうして得られる反応液から三本鎖DNAだけを回収するには、フェノール、クロロホルム等の溶媒抽出により除タンパク質処理を行った後、適当なカラムクロマトグラフィーで回収する方法を利用したり、あるいは、エタノール沈殿で一旦DNAを析出させる方法を利用すればよい。
【００２６】
さらに、上記の三本鎖DNAの形成方法であって、前記一本鎖DNAは、前記実質的に相補的な塩基配列が20mer以上からなる三本鎖DNAの形成方法とすると良い。
【００２７】
一本鎖DNAの相補的領域は、理論上短くても、二本鎖DNAのそれに対応する末端近傍包含領域に結合して三本鎖形成領域を形成することができる。しかし、一本鎖DNAの相補的領域が短いと、具体的には、20merよりも短いと、三本鎖形成領域が不安定になりやすい。つまり、三本鎖DNAが不安定になりやすい。これに対し、本発明では、実質的に相補的な塩基配列が20mer以上からなる一本鎖DNAを使用する。従って、この相補的領域と二本鎖DNAのそれに対応する末端近傍包含領域とはより強く結合して安定な三本鎖形成領域を形成することができる。つまり、より安定な三本鎖DNAを形成することができる。なお、一本鎖DNAの実質的に相補的な塩基配列が約30mer以上からなるものであると、さらに、安定な三本鎖DNAを形成することができるので好適である。
【００２８】
さらに、上記のいずれかに記載の三本鎖DNAの形成方法であって、前記一本鎖DNAは、前記二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端から約20mer以内の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む三本鎖DNAの形成方法とするのが好ましい。
【００２９】
前述したように、一本鎖DNAが、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含むものであれば、二本鎖DNAの末端近傍包含領域と一本鎖DNAの相補的領域が結合して三本鎖形成領域を形成することができる。しかし、一本鎖DNAの相補的領域が、二本鎖DNAの末端から離れて結合するほど、三本鎖形成領域が不安定で解離しやすくなる。即ち、三本鎖DNAを形成したときに、一本鎖DNAの3'末端の延長上に二本鎖形成領域が長くできるほど、この二本鎖形成領域の存在による構造ストレスにより、三本鎖形成領域が不安定になり、三本鎖形成領域が解消されやすくなる。
【００３０】
これに対し、本発明では、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端から20mer以内の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む一本鎖DNAを使用する。つまり、この一本鎖DNAの相補的領域は、二本鎖DNAの末端のごく近傍から始まる領域に対して相補的である。従って、この方法により形成される三本鎖DNAは、一本鎖DNAの3'末端の延長上にできる二本鎖形成領域が短くなる、あるいは、このような二本鎖形成領域ができなくなる。このため、二本鎖形成領域の存在による構造ストレスが生じにくく、三本鎖形成領域が安定化される。つまり、本発明によれば、より安定な三本鎖DNAを形成することができる。
【００３１】
特に、一本鎖DNAは、二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含むのが好ましい。三本鎖DNAを形成したときに、一本鎖DNAの3'末端の延長上に二本鎖形成領域ができなくなるので、三本鎖形成領域を最も安定化することができる。従って、最も安定な三本鎖DNAを形成することができる。なお、一本鎖DNAの相補的領域は、約60mer以下の塩基配列からなるのが好ましい。このように一本鎖DNAの相補的領域が比較的短いと、三本鎖形成領域（三本鎖DNA）が不安定になりやすく、この場合に特に、一本鎖DNAの相補的領域を二本鎖DNAの末端のごく近傍から始まる領域に対して相補的であるようにして、三本鎖形成領域（三本鎖DNA）の安定化を図るべきだからである。
【００３２】
さらに、上記のいずれかに記載の三本鎖DNAの形成方法であって、前記RecAタンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質である三本鎖DNAの形成方法とすると良い。
【００３３】
前述したように、RecAタンパク質には、様々なものを適宜選択することができる。これらのうち、入手容易性、安全性、機能性を考えると、大腸菌に由来するRecAタンパク質を用いるのが好ましい。
【００３４】
【００３５】
【００３６】
また、他の解決手段は、直鎖状の二本鎖DNAと、この二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNAと、からなり、上記二本鎖DNAのうち、上記一方のDNA鎖の5'末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖DNAのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAである。
【００３７】
本発明の三本鎖DNAは、従来のようにタンパク質を含まず、二本鎖DNAと一本鎖DNAのみが結合してなるものである。そして、一本鎖DNAの相補的領域が、二本鎖DNAの少なくとも一方の末端近傍包含領域に結合した三本鎖形成領域を有する。このような三本鎖DNAは、その構造を安定化させるための特別なタンパク質等（例えば、前述したRecAタンパク質）が存在しなくても、多少の熱を加えるなどしても解離することなく、安定な状態を維持することができる。なお、本発明の三本鎖DNAには、二本鎖DNAの一方の末端近傍包含領域が三本鎖形成領域となったものの他、二本鎖DNAの両方の末端近傍包含領域がそれぞれ三本鎖形成領域となったものも含まれる。
【００３８】
このような三本鎖DNAは、例えば、サザンハイブリダイゼーションにおいて利用可能である。即ち、ターゲットDNAとして、適当な制限酵素で切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意すると共に、プローブDNAとして、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPを用いて、5'末端を32Pで標識した一本鎖DNAを用意する。そして、これらのDNAから、一本鎖DNAの相補的領域が二本鎖DNAの少なくとも一方の末端近傍包含領域に結合した三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAを形成する。次に、この三本鎖DNAについて、アガロースゲル電気泳動を行う。電気泳動後は、アガロースゲルを濾紙等の上に載せてゲル乾燥機で乾燥させた後、アガロースゲルのオートラジオグラムをとり、プローブDNA（標識した一本鎖DNA）からのシグナルをＸ線フィルム上に記録する。
【００３９】
このように、サザンハイブリダイゼーションに本発明の三本鎖DNAを利用した場合、従来と比較すれば、容易かつ短時間でサザンハイブリダイゼーションを行うことができる。アガロースゲル中のDNAをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブDNA溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業がなくなるからである。なお、プローブDNAとして、蛍光物質等で化学的に標識した一本鎖DNAを利用する場合においても、同様なことが言える。
【００４０】
さらに、上記の三本鎖DNAであって、前記三本鎖形成領域は、DNA1本鎖当たり約20mer以上の塩基配列からなる三本鎖DNAとすると良い。
【００４１】
三本鎖形成領域は理論上短くてもできるが、極端に短いと、具体的には、DNA1本鎖当たり20merよりも短いと、三本鎖形成領域が不安定になりやすい。つまり、三本鎖DNAが不安定になりやすい。これに対し、本発明では、三本鎖形成領域が、DNA1本鎖当たり約20mer以上の塩基配列からなるので、三本鎖形成領域が安定であり、三本鎖DNAも安定である。なお、三本鎖形成領域が、DNA1本鎖当たり約30mer以上の塩基配列からなるものであると、さらに、三本鎖形成領域（三本鎖DNA）が安定であるので、好適である。
【００４２】
さらに、上記のいずれかに記載の三本鎖DNAであって、前記三本鎖形成領域を構成する前記一本鎖DNAの3'末端の延長上には、二本鎖形成領域が存在しない、または、約20bp以下の二本鎖形成領域が存在する三本鎖DNAとするのが好ましい。
【００４３】
三本鎖形成領域は、二本鎖DNAの末端近傍包含領域に形成することができる。しかし、三本鎖形成領域が二本鎖DNAの末端から離れれば離れるほど、三本鎖形成領域は不安定で解離しやすくなる。さらに具体的に説明すると、三本鎖形成領域を構成する一本鎖DNAの3'末端の延長上に二本鎖形成領域が長くできるほど、この二本鎖形成領域の存在による構造ストレスにより、三本鎖形成領域が不安定になり、三本鎖形成領域が解消されやすくなる。これに対し、本発明では、三本鎖形成領域を構成する一本鎖DNAの3'末端の延長上に、二本鎖形成領域が存在しないか、あるいは、二本鎖形成領域が存在しても約20bp以下の短いものでしかない。従って、この三本鎖DNAは、二本鎖形成領域の存在による構造ストレスが生じない、あるいは生じにくく、三本鎖形成領域が安定化される。つまり、本発明の三本鎖DNAは安定な構造を維持することができる。なお、三本鎖形成領域がDNA1本鎖当たり約60mer以下の塩基配列からなるのが好ましい。このように三本鎖形成領域が比較的短いと、三本鎖形成領域（三本鎖DNA）が不安定になりやすく、この場合に特に、三本鎖形成領域を構成する一本鎖DNAの3'末端の延長上に、二本鎖形成領域が存在しないか、約20bp以下の短い二本鎖形成領域が存在するようにして、三本鎖形成領域（三本鎖DNA）の安定化を図るべきだからである。
【００４４】
また、他の解決手段は、直鎖状の二本鎖DNAと、標識した一本鎖DNAであって、上記二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNAと、からなり、上記二本鎖DNAのうち、上記一方のDNA鎖の5'末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖DNAのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAについて、アガロースゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、上記三本鎖DNAを含むアガロースゲルを乾燥させる乾燥工程と、乾燥した上記アガロースゲルから上記標識した一本鎖DNA由来のシグナルを検出する検出工程と、を備えるサザンハイブリダイゼーションである。
【００４５】
本発明によれば、ターゲットDNA（二本鎖DNA）と標識プローブDNA（標識した一本鎖DNA）とからなる三本鎖DNAを用いて、これについてアガロースゲル電気泳動を行う（電気泳動工程）。電気泳動後は、アガロースゲルを濾紙等の上に載せてゲル乾燥機等で乾燥させた後（乾燥工程）、アガロースゲルから標識プローブDNA（標識した一本鎖DNA）由来のシグナルを検出する（検出工程）。このようなサザンハイブリダイゼーションは、前述した従来の方法と比較すれば、アガロースゲル中のDNAをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブDNA溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業がなくなる。従って、サザンハイブリダイゼーションを容易かつ短時間で行うことができる。
【００４６】
なお、標識プローブDNAである標識した一本鎖DNAは、放射性元素を用いて標識したものであっても、蛍光物質等の化学物質を用いて標識したものであってもよい。放射性元素を用いて標識すれば、サザンハイブリダイゼーションの検出能力を向上させることができる。一方、化学物質を用いて標識すれば、サザンハイブリダイゼーションの各工程をより安全に行うことができる。また、ロボット等により各工程を自動化することも可能である。
【００４７】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
以下、本発明の実施例を、図を参照しつつ説明する。まず、三本鎖DNAの形成方法及びこの方法により形成される三本鎖DNAについて説明する。図１に示すように、ターゲットDNAとして、環状プラスミドDNAの１つであるpBR322 DNA（4.4kbp）を制限酵素ScaＩ及びNruＩで切断した２種類の直鎖状の二本鎖DNA（DNA断片１及びDNA断片２）を用意した。DNA断片１は約2.9kbp、DNA断片２は約1.5kbpである。
【００４８】
また、図１に示すように、プローブDNAとして、上記DNA断片１のScaＩ切断部位の近傍に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１（配列番号：１））を用意した。具体的には、DNA断片１のうち、ScaＩ切断部位側に5'末端が位置するDNA鎖の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１を用意した。また、別のプローブDNAとして、上記DNA断片２のScaＩ切断部位の近傍に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド２（配列番号：２））も用意した。具体的には、DNA断片２のうち、ScaＩ切断部位側に5'末端が位置するDNA鎖の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド２を用意した。
【００４９】
これらのオリゴヌクレオチド１及び２は、DNA断片１及びDNA断片２の塩基配列に基づいて公知の手法により合成すればよい。その後、これらのオリゴヌクレオチド１及び２について、T4 Polynucleotidekinaseと［γ-32P］ATPを用いて、32Pで5'末端をそれぞれ標識した。
オリゴヌクレオチド１：5'-cact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagt-3'
オリゴヌクレオチド２：5'-acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt-3'
【００５０】
また、組換えタンパク質として大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質を、また、ヌクレアーゼとして大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ（ExonucleaseＩ）を用意した。さらに、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSを、また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。
【００５１】
次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、図２に示すように、200ngのターゲットDNA（DNA断片１及びDNA断片２）と、標識プローブDNA（1pmolの標識オリゴヌクレオチド１及び1pmolの標識オリゴヌクレオチド２）と、3.0μgのRecAタンパク質と、4unitのエキソヌクレアーゼＩとを、4.8mMのATP-γS、20mMの酢酸マグネシウム及び30mMの酢酸トリス（pH7.2）中で、37℃において30分間保温した。この反応液の全量は、約20μlである。なお、図２は、簡略化して、ターゲットDNA（DNA断片）とプローブDNA（オリゴヌクレオチド）の２つの組み合わせのうち、一方のみを図示した説明図である。
【００５２】
これにより、２種類のDNA−タンパク質複合体が形成される。即ち、DNA断片１のScaＩ切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド１全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体が形成される。また、DNA断片２のScaＩ切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド２全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体が形成される。
【００５３】
具体的には、まず、オリゴヌクレオチド１（プローブDNA）にRecAタンパク質が結合してプローブDNA−RecAタンパク質複合体が形成される。続いて、このプローブDNA−RecAタンパク質複合体が、DNA断片１（ターゲットDNA）に結合し、DNA-タンパク質複合体を形成する。その際、このDNA−タンパク質複合体は、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で、オリゴヌクレオチド１が、DNA断片１のうち、オリゴヌクレオチド１と相補的な塩基配列からなる領域（ScaＩ切断部位側の末端近傍領域）に結合すると考えられる。なお、エキソヌクレアーゼＩは、このDNA−タンパク質複合体の安定化に作用するものと考えられる。同様に、オリゴヌクレオチド２（プローブDNA）にRecAタンパク質が結合してプローブDNA−RecAタンパク質複合体が形成され、続いて、これが、DNA断片２（ターゲットDNA）に結合し、DNA-タンパク質複合体を形成する。その際、このDNA−タンパク質複合体は、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で、オリゴヌクレオチド２が、DNA断片２のうち、オリゴヌクレオチド２と相補的な塩基配列からなる領域（ScaＩ切断部位側の末端近傍領域）に結合すると考えられる。なお、エキソヌクレアーゼＩは、このDNA−タンパク質複合体の安定化に作用するものと考えられる。これらのDNA−タンパク質複合体は、三本鎖形成領域を有するにも拘わらず、比較的安定なものである。
【００５４】
次に、タンパク質失活工程において、図２に示すように、この反応液に、0.5％（W/Vol）SDSと0.7mg/mlプロティナーゼKを加え、37℃において30分間保温し、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させた。これにより、二種類の三本鎖DNAが形成される。即ち、DNA断片１のScaＩ切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド１全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAが形成される。また、DNA断片２のScaＩ切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド２全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAが形成される。
【００５５】
従来の方法では、前述したように、三本鎖形成領域を有する安定なDNA−タンパク質複合体ができても、タンパク質を失活させると、三本鎖形成領域が解消され、ターゲットDNA（二本鎖DNA）とプローブDNA（一本鎖DNA）に解離していた。しかし、本実施例１では、タンパク質（RecAタンパク質及びエキソヌクレアーゼＩ）を失活させても、安定な三本鎖DNAを得ることができる。このような三本鎖DNAは、その構造を維持するために特別なタンパク質等を必要とせず、多少の熱を加えても、安定な状態を維持することができる。
【００５６】
なお、RecAタンパク質等の相同的組換えタンパク質等と、エキソヌクレアーゼＩ等と、ATP-γS等のヌクレオシド三リン酸等と、酢酸トリス等を含む緩衝剤とは、キットとして用意しておくと便利である。このようなキットを利用すれば、ターゲットDNAやプローブDNAの種類が変わっても、容易に三本鎖DNAを形成することができるからである。
【００５７】
次いで、上記の三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションについて説明する。まず、上述したようにして三本鎖DNAを形成した。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、DNA断片１及び２と、標識オリゴヌクレオチド１及び２と、RecAタンパク質と、エキソヌクレアーゼＩとを反応させて、２種類のDNA−タンパク質複合体を形成した。その後、タンパク質失活工程において、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させて、DNA断片１のScaＩ切断部位側の末端近傍領域にオリゴヌクレオチド１全体が結合して三本鎖形成領域を形成してなる三本鎖DNAと、DNA断片２のScaＩ切断部位側の末端近傍領域にオリゴヌクレオチド２全体が結合して三本鎖形成領域を形成してなる三本鎖DNAとを形成した。
【００５８】
次に、電気泳動工程において、反応液の半分量（約10μl）について、1％のアガロースゲルで電気泳動を行った。そして、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してアガロースゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAの写真を記録した。その結果を図３（Ｂ）のレーン２に示す。次に、乾燥工程において、このアガロースゲルを濾紙の上に載せてゲル乾燥機で乾燥させた。その後、検出工程において、乾燥させたアガロースゲルのオートラジオグラムをとり、標識オリゴヌクレオチド１及び２由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録した。その結果を図３（Ａ）のレーン２に示す。図３（Ａ）及び（Ｂ）において、上方の約2.9kbp付近に検出されたシグナルは、DNA断片１にオリゴヌクレオチド１が結合した三本鎖DNAによるものであり、下方の約1.5kbp付近に検出されたシグナルは、DNA断片２にオリゴヌクレオチド２が結合した三本鎖DNAによるものである。
【００５９】
このようなサザンハイブリダイゼーションは、従来の方法と比較すれば、アガロースゲル中のDNAをメンブレンに移す作業や、このメンブレンをプローブDNA溶液に浸す作業、また、メンブレンを洗浄する作業など、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業がなくなる。従って、サザンハイブリダイゼーションを容易かつ短時間で行うことができる。
【００６０】
次いで、図３に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、DNAサイズマーカーである。図中の左端には、その大きさが示してある。このDNAサイズマーカーは、λDNAを制限酵素HindIIIで切断し、その後、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPをを用いて、各DNA断片の5'末端を32Pでそれぞれ標識したものである。レーン１は、上述のDNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、その代わりに4unitのMug Bean nucleaseを加えて、レーン２と同じ反応を行った結果を示す。それ以外の各工程は、上述したレーン２と同じである。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、その代わりに4unitのエキソヌクレアーゼIII（ExonucleaseIII）を加えて、レーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、その代わりに4unitのT4 PNKを加えて、レーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、その代わりに4unitのT4 DNA Ligaseを加えて、レーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。
【００６１】
図３（Ａ）の結果から明らかなように、レーン２のみにシグナルが検出され、それ以外のレーン１，３〜６にはシグナルが検出されなかった。レーン２及び６の結果より、安定な三本鎖DNAを形成するためには、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩが必要となることが判る。また、レーン１，３，４，５の結果より、エキソヌクレアーゼＩの代わりに、Mug Bean nucleaseやエキソヌクレアーゼIII、T4 PNK、T4 DNA Ligaseを用いても、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。このことから、安定な三本鎖DNAを形成するためには、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩまたはエキソヌクレアーゼＩと類似する機能を有するタンパク質が必要であると考えられる。
【００６２】
（実施例２）
次いで、第２の実施例について説明する。なお、上記実施例１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図４に示すように、ターゲットDNAとして、環状プラスミドDNAの１つであるpUC118 DNA（約3.2kbp）を制限酵素HincIIで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。なお、pUC118 DNAの塩基配列については、GeneBank登録番号U07650を参照されたい。
【００６３】
また、図４に示すように、プローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド３（配列番号：３））を用意した。具体的には、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド３を用意した。そして、このオリゴヌクレオチド３について、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPを用いて、32Pで5'末端を標識した。
オリゴヌクレオチド３：5'-cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc gagctcggta cccggggatc ctctagagtc-3'
【００６４】
次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、200ngのターゲットDNA（直鎖状のpUC118 DNA）と、1pmolの標識プローブDNA（標識オリゴヌクレオチド３）と、3.0μgのRecAタンパク質と、4unitのエキソヌクレアーゼＩとを、4.8mMのATP-γS、20mMの酢酸マグネシウム、30mMの酢酸トリス（pH7.2）中で、37℃において30分間保温した。これにより、上記実施例１と同様に、DNA−タンパク質複合体が形成される。即ち、ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図４中右方）に、オリゴヌクレオチド３全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなる安定なDNA−タンパク質複合体が形成される（図２参照）。
【００６５】
次に、タンパク質失活工程において、この反応液に、0.5％（W/Vol）のSDSと0.7mg/mlのプロティナーゼKを加え、37℃において30分間保温し、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させた。これにより、上記実施例１と同様に、安定な三本鎖DNAが形成される。即ち、ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図４中右方）に、オリゴヌクレオチド３全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAが形成される（図２参照）。この三本鎖DNAも、その構造を維持するために特別なタンパク質等を必要とせず、多少の熱を加えても、安定な状態を維持することができる。
【００６６】
次に、上記実施例１と同様に、電気泳動工程において、反応液の半分量について1％のアガロースゲルで電気泳動を行った。そして、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してアガロースゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAの写真を記録した。その結果を図５（Ｂ）のレーン１に示す。その後も、上記実施例１と同様に、乾燥工程を行った後、検出工程において、アガロースゲルのオートラジオグラムをとり、標識オリゴヌクレオチド３由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録した。その結果を図５（Ａ）のレーン１に示す。 図５（Ａ）及び（Ｂ）において、約3.2kbp付近に検出されたシグナルは、ターゲットDNAにオリゴヌクレオチド３が結合した三本鎖DNAによるものである。なお、このサザンハイブリダイゼーションも、上記実施例１と同様な工程によるものであるから、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業が少なく、容易かつ短時間で行うことができる。
【００６７】
一方、図４に示すように、上記のプローブDNA（オリゴヌクレオチド３）とは別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAのうち、上述した末端近傍領域とは異なる側の末端近傍領域（図中左方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド４（配列番号：４））を用意した。具体的には、ターゲットDNAのうち、他方のDNA鎖（図中上方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド４を用意した。そして、このオリゴヌクレオチド４について、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPを用いて、32Pで5'末端を標識した。
オリゴヌクレオチド４：5'-caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg cctgcaggtc-3'
【００６８】
そして、DNA−タンパク質複合体形成工程を、上述の標識オリゴヌクレオチド３の代わりに標識オリゴヌクレオチド４を用いて行い、ターゲットDNAの他方の末端近傍領域（図４中左方）に、オリゴヌクレオチド４全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなる安定なDNA−タンパク質複合体が形成した（図２参照）。その後、上述のタンパク質失活工程を行い、ターゲットDNAの他方の末端近傍領域に（図４中左方）、オリゴヌクレオチド４全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAを形成した（図２参照）。勿論、この三本鎖DNAも安定なものである。次に、上述の通り、電気泳動工程を行い、染色されたDNAの写真を記録した。その結果を図５（Ｂ）のレーン３に示す。その後も、上述の通り、乾燥工程及び検出工程を行った。その結果を図５（Ａ）のレーン３に示す。
【００６９】
次いで、図５に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記実施例１と同様なDNAサイズマーカーである。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド５（配列番号：５）を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。このオリゴヌクレオチド５は、図４に示すように、ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図中右方）に相補的な一本鎖DNAである。但し、このオリゴヌクレオチド５は、オリゴヌクレオチド３とは異なり、ターゲットDNAのうち、図中上方のDNA鎖の3'末端近傍の60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなる。なお、このオリゴヌクレオチド５も、オリゴヌクレオチド３，４等と同様な方法で標識した。
オリゴヌクレオチド５：5'-gactctagag gatccccggg taccgagctc gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg-3'
【００７０】
レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド６（配列番号：６）を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。このオリゴヌクレオチド６は、図４に示すように、ターゲットDNAの他方の末端近傍領域（図中左方）に相補的な一本鎖DNAである。しかし、このオリゴヌクレオチド６は、オリゴヌクレオチド４とは異なり、ターゲットDNAのうち、図中下方のDNA鎖の3'末端近傍の60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなる。なお、このオリゴヌクレオチド６も、オリゴヌクレオチド３，４等と同様な方法で標識した。
オリゴヌクレオチド６：5'-gacctgcagg catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg-3'
【００７１】
図５（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１とレーン３にシグナルが検出されたが、レーン２とレーン４にはシグナルが検出されなかった。レーン１，３の結果より、三本鎖形成領域は、ターゲットDNAのいずれの末端近傍領域にも形成できることが判る。しかし、レーン２，４の結果より、プローブDNAが、ターゲットDNAのうち、いずれか一方のDNA鎖の「3'末端近傍」の塩基配列と相補的である場合には、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。このことから、安定な三本鎖DNAを形成するためには、プローブDNA（一本鎖DNA）が、ターゲットDNA（二本鎖DNA）のうち、いずれか一方のDNA鎖の「5'末端近傍」の塩基配列と相補的でなければらないと考えられる。
【００７２】
なお、レーン２，４のように、プローブDNAが、ターゲットDNAのうち、いずれか一方のDNA鎖の「3'末端近傍」の塩基配列と相補的である場合でも、DNA−タンパク質複合体形成工程においては、安定なDNA−タンパク質複合体を形成することが判っている。しかし、タンパク質失活工程で、RecAタンパク質及びエキソヌクレアーゼＩを失活させると、三本鎖形成領域が解消してしまうので、安定な三本鎖DNAを得ることはできない。
【００７３】
（実施例３）
次いで、第３の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図６に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン１は、上記実施例２のレーン２と同じ反応等を行ったものである（図５参照）。即ち、ターゲットDNAとしてpUC118 DNAを制限酵素HincIIで切断した直鎖状の二本鎖DNAを、プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド５（ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の3'末端近傍の塩基配列と相補的な塩基配列からなるもの）を用いた（図４参照）。そして、DNA−タンパク質複合体形成工程において、反応液を30分間保温した。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を60分間保温し、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を120分間保温し、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を180分間保温し、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。
【００７４】
レーン５は、上記実施例２のレーン１と同じ反応等を行ったものである（図５参照）。即ち、ターゲットDNAとしてpUC118 DNAを制限酵素HincIIで切断した直鎖状の二本鎖DNAを、プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド３（ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基配列と相補的な塩基配列からなるもの）を用いた（図４参照）。そして、DNA−タンパク質複合体形成工程において、反応液を30分間保温した。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を60分間保温し、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を120分間保温し、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。レーン８は、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応液を180分間保温し、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。
【００７５】
図６（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１〜４にはシグナルが検出されなかったが、レーン５〜８にはシグナルが検出された。また、レーン５〜８のシグナルは、レーン５が最も弱く、レーン６、レーン７といくにつれて強く、レーン８で最も強く検出された。レーン１〜４の結果より、プローブDNAが、ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の「3'末端近傍」の塩基配列と相補的である場合には、たとえDNA−タンパク質複合体形成工程において反応時間を長くとっても、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。
【００７６】
一方、レーン５〜８の結果より、プローブDNAが、ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の「5'末端近傍」の塩基配列と相補的である場合には、比較的短い時間（30分間）でも、安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。さらに、実験データは省略するが、反応時間を５分程度としても、安定な三本鎖DNAを形成できることが判っている。また、上記の結果より、DNA−タンパク質複合体形成工程において反応時間を長くとるほど、安定な三本鎖DNAがより多く形成されることが判る。なお、反応時間が30分間と60分間との間では、シグナルの強さの違いが大きいのに対し、60分間と120分間、120分間と180分間との間では、シグナルの強さにそれほど大きな違いがないことから、60分間程度の反応時間でターゲットDNA（二本鎖DNA）の多くが、三本鎖DNAになるものと考えられる。このことから、DNA−タンパク質複合体形成工程における反応時間は、5分間以上で、できるだけ長くとるのが好ましいが、一般には、60分間程度とするのが適当であると考えられる。
【００７７】
（実施例４）
次いで、第４の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図７に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン１は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン１（図６参照）と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、ターゲットDNAとしてpUC118 DNAを制限酵素HincIIで切断した直鎖状の二本鎖DNAを、プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド５（ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の3'末端近傍の塩基配列と相補的な塩基配列からなるもの）を用いた（図４参照）。そして、DNA−タンパク質複合体形成工程において、反応液を30分間保温した。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン２（図６参照）と同じ反応等を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は60分間である。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン３（図６参照）と同じ反応等を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は120分間である。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン３（図６参照）と同じ反応等を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は180分間である。
【００７８】
レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン５（図６参照）と同じ反応を行った結果を示す。プローブDNAはオリゴヌクレオチド３（ターゲットDNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基配列と相補的な塩基配列からなるもの）であり、DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は30分間である。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン６（図６参照）と同じ反応を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は60分間である。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン７（図６参照）と同じ反応を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は120分間である。レーン８は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外は上記実施例３のレーン８（図６参照）と同じ反応を行った結果を示す。DNA−タンパク質複合体形成工程の反応時間は180分間である。
【００７９】
図７（Ａ）の結果から明らかなように、いずれのレーン１〜８にもシグナルが検出されなかった。レーン１〜４の結果は、ATP-γSを加えてDNA−タンパク質複合体形成工程を行った上記実施例３のレーン１〜４においても、シグナルが検出されなかった（三本鎖DNAが形成されなかった）のであるから、ATP-γSを加えずに反応を行ってもシグナルが検出されない（三本鎖DNAが形成されない）のは、容易に予想され得る結果である。一方、レーン５〜８の結果より、ATP-γSを加えてDNA−タンパク質複合体形成工程を行った上記実施例３のレーン５〜８においてはシグナルが検出されたが、本実施例４では反応時間を長くとった場合でもシグナルが検出されなかったから、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSが必要とされることが判る。
【００８０】
このことから、少なくとも、組換えタンパク質としてRecAを利用し、ヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼＩを利用する場合には、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSまたはこれと類似する機能を有するものが必要であると考えられる。しかし、別の実験結果（後述する実施例６を参照）によれば、ATP-γSを加えなくても、ごく少量、具体的には、ATP-γSを加えた場合に比して、1/50〜1/100程度の三本鎖DNAが形成されることが判っている。従って、三本鎖DNAを形成するためには、必ずしもATP-γSまたはこれと類似する機能を有するものが必要であるとは言えないが、効率よく安定な三本鎖DNAを形成するためには、ATP-γS等を加えてDNA−タンパク質複合体形成工程を行うのが好ましいと考えられる。
【００８１】
（実施例５）
次いで、第５の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図８に結果を示した比較実験について説明する。レーン１〜４は、上記実施例２のレーン１〜４（図５参照）とそれぞれ同じ反応等を行った結果を示す。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNA（直鎖状にしたpUC118 DNA）と、標識オリゴヌクレオチド３，４，５または６と、RecAタンパク質と、エキソヌクレアーゼＩとを、ATP-γS、酢酸マグネシウム及び酢酸トリス中で反応させたものである。レーン１は標識オリゴヌクレオチド３を、レーン２は標識オリゴヌクレオチド５を、レーン３は標識オリゴヌクレオチド４を、レーン４は標識オリゴヌクレオチド６を使用している（図４参照）。
【００８２】
レーン５〜８は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSの代わりに4.8mMのATPを加え、それ以外はレーン１〜４とそれぞれ同じ反応等を行った結果を示す。レーン９〜１２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSの代わりに4.8mMのGTP-γSを加え、それ以外はレーン１〜４とそれぞれ同じ反応等を行った結果を示す。レーン１３〜１６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ATP-γSの代わりに4.8mMのGTPを加え、それ以外はレーン１〜４とそれぞれ同じ反応等を行った結果を示す。
【００８３】
この図８（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１，３，５，７，９，１１にシグナルが検出されたが、それ以外のレーン２，４，６，８，１０，１２，１３〜１６にはシグナルが検出されなかった。レーン１〜４は、上記実施例２のレーン１〜４と同じ反応等を行ったものであるから、同様な結果となっている（図５参照）。レーン５〜８は、シグナルの強さは弱いものの、レーン１〜４の場合と同様にシグナルが検出されている。従って、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としてATPを用いても、安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。レーン９〜１２は、レーン１〜４の場合と同様に、同程度の強さのシグナルが検出されている。従って、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としてGTP-γSを用いても、安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。レーン１３〜１６には、シグナルが検出されていない。従って、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としてGTPを用いても、検出レベル以上の量の三本鎖DNAを形成できないことが判る。
【００８４】
これらのことから、安定な三本鎖DNAを形成するために、適切なヌクレオチド三リン酸またはそれらの類似体を選択することが好ましいと考えられる。即ち、少なくとも、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを使用する場合には、ATP-γS、ATPまたはGTP-γSを、さらには、ATP-γSまたはGTP-γSを用いるのが好ましいと考えられる。但し、ATPを用いたときに、三本鎖DNAの形成量が少なくなるのは、ATPが反応液中で生化学的に分解されるためであると考えられる。従って、このような分解が起こりにくい反応液を選択すれば、ATPを用いても三本鎖DNAの形成量を増加させることができるものと考えられる。また、データは省略するが、ヌクレオシド三リン酸として、UTPやCTPについても同様な実験を行ったが、少なくともRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを使用する場合には、GTPと同様、検出レベル以上の量の三本鎖DNAは形成されなかった。
【００８５】
なお、前述したように、別の実験結果（後述する実施例６を参照）によれば、ATP-γSを加えなくても、ごく少量だが、三本鎖DNAが形成されることが判っている。従って、三本鎖DNAを形成するためには、ヌクレオチド三リン酸またはそれらの類似体が必ずしも必要であるとは言えないが、効率よく安定な三本鎖DNAを形成するためには、DNA−タンパク質複合体形成工程において、上述のようにヌクレオチド三リン酸等を適宜選択するのが好ましい。
【００８６】
（実施例６）
次いで、第６の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図９に結果を示した比較実験について説明する。レーン２は、上記実施例２のレーン１と同じ反応を行った結果を示す（図５参照）。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNA（直鎖状のpUC118 DNA）と、標識プローブDNA（標識オリゴヌクレオチド３）と、RecAタンパク質と、エキソヌクレアーゼＩとを、ATP-γS、酢酸マグネシウム及び酢酸トリス中で反応させたものである。つまり、タンパク質（酵素）としては、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを加えている。
【００８７】
レーン１は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてRecAタンパク質のみを加え（エキソヌクレアーゼＩは加えない）、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩとエキソヌクレアーゼVII（ExonucleaseVII）とを加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてエキソヌクレアーゼＩのみを加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてエキソヌクレアーゼＩとエキソヌクレアーゼVIIとを加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてエキソヌクレアーゼVIIのみを加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酵素としてRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼVIIとを加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン８〜レーン１４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えずに、それ以外はレーン１〜７とそれぞれ同じ反応を行った結果を示す。
【００８８】
図９（Ａ）の結果から明らかなように、レーン２，３，９にシグナルが検出されたが、それ以外のレーン１，４〜８，１０〜１４にはシグナルが検出されなかった。レーン１〜７の結果より、DNA−タンパク質複合体形成工程において、タンパク質（酵素）として、少なくともRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩが必要であることが判る。なお、レーン２（RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを加えた場合）に比べ、レーン３（RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩとエキソヌクレアーゼVIIを加えた場合）のシグナルが弱くなっているのは、次のような理由によるものと考えられる。即ち、エキソヌクレアーゼVIIにより、ターゲットDNAまたはプローブDNAの末端の一部が削られて、三本鎖形成領域が形成されにくくなったと思われる。つまり、DNAを末端から切断するというエキソヌクレアーゼＩ本来の活性は、RecAタンパク質が存在することによりブロックされる。しかし、同じくDNAを末端から切断するエキソヌクレアーゼVII本来の活性は、RecAタンパク質が存在してもブロックされにくく、このため、ターゲットDNAまたはプローブDNAが削られて、三本鎖形成領域が形成されにくくなったと考えられる。
【００８９】
レーン８〜１４の結果より、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSが存在しなくても、タンパク質（酵素）として、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩがあれば、安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。但し、レーン２と比較してレーン９のシグナルの強さがかなり弱い（1/50〜1/100）ことから、安定な三本鎖DNAは、ATP-γSの存在下で効率よく形成されると考えられる。なお、レーン１０にはシグナルが検出されていないが、レーン３でシグナルが検出されたことから考えると、レーン１０においても、恐らく検出レベル以下のごく少ない量ではあるが、三本鎖DNAが形成されているものと推測される。以上のことから、安定な三本鎖DNAを形成するためには、DNA−タンパク質複合体形成工程において、タンパク質（酵素）として、RecAタンパク質またはこれと類似する機能を有するものと、エキソヌクレアーゼＩまたはこれと類似する機能を有するものが必要であることを考えられる。また、安定な三本鎖DNAを効率よく形成するためには、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSなど、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体を加えるのが好ましいと考えられる。
【００９０】
（実施例７）
次いで、第７の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１０に結果を示した比較実験について説明する。レーン１は、ATP-γSを加えず、それ以外は上記実施例２のレーン１と同じ反応等を行った結果を示す（図５参照）。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNA（直鎖状のpUC118 DNA）と、標識プローブDNA（標識オリゴヌクレオチド３）（図４参照）と、RecAタンパク質と、エキソヌクレアーゼＩとを、酢酸マグネシウム及び酢酸トリス中で反応させたものである。レーン２は、ATP-γSを加えず、それ以外は上記実施例２のレーン３と同じ反応等を行った結果を示す（図５参照）。即ち、標識プローブDNAは、標識オリゴヌクレオチド４である（図４参照）。
【００９１】
レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識オリゴヌクレオチドを加えず、それ以外は上記実施例２と同様な反応を行い、さらに、タンパク質失活工程を行った。その後、エタノール沈殿の行い、DNAを１倍濃度のＳＳＣ溶液に溶かし、これに1pmolの標識オリゴヌクレオチド３を加えて、60℃で30分間保温した。そして、その半分量についてアガロースゲル電気泳動等を上記各実施例と同様に行った。レーン４は、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド３の代わりに標識オリゴヌクレオチド５を用いて、それ以外はレーン３と同じ反応等を行った結果を示す。レーン５は、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド３の代わりに標識オリゴヌクレオチド４を用いて、それ以外はレーン３と同じ反応等を行った結果を示す。レーン６は、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド３の代わりに標識オリゴヌクレオチド６を用いて、それ以外はレーン３と同じ反応等を行った結果を示す。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、それ以外はレーン３と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、標識プローブは、オリゴヌクレオチド３である。レーン８は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、エキソヌクレアーゼＩを加えず、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、標識プローブは、オリゴヌクレオチド４である。
【００９２】
図１０（Ａ）の結果から明らかなように、いずれのレーン１〜８にもシグナルが検出されなかった。レーン１，２の結果より、DNA-タンパク質複合体形成工程においてATP-γSの存在しない場合には、三本鎖DNAがほとんど形成されないことが判る。レーン３〜６の結果より、DNA−タンパク質複合体形成工程においてプローブDNA（オリゴヌクレオチド）を加えなければ、タンパク質失活工程後にこれを加えても、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。また、これまでに述べてきた三本鎖DNAは、エキソヌクレアーゼＩによりターゲットDNAの末端が一本鎖となり、これにプローブDNAが結合しているわけでないことが判る。
【００９３】
レーン７，８の結果から、DNA−タンパク質複合体形成工程においてエキソヌクレアーゼＩとプローブDNA（オリゴヌクレオチド）を加えず反応させて、タンパク質失活工程後にプローブDNA（オリゴヌクレオチド）を加えても、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。これらのことから、安定な三本鎖DNAを形成するためには、プローブDNAをDNA−タンパク質複合体形成工程で加え、ターゲットDNAとプローブDNAとタンパク質とからなるDNA−タンパク質複合体を一旦形成する必要があると考えられる。
【００９４】
（実施例８）
次いで、第８の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１２に結果を示した比較実験について説明する。まず、図１１に示すように、ターゲットDNAとして、M13mp18 RF DNA（約7.2kbp）を制限酵素SnaBＩで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。なお、M13mp18 RF DNAの塩基配列については、GeneBank登録番号X02513を参照されたい。
【００９５】
また、プローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド７（配列番号：７））を用意した。このオリゴヌクレオチド７は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる80merの塩基配列と、100％相補的な80merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド８（配列番号：８））を用意した。このオリゴヌクレオチド８は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド９（配列番号：９））を用意した。このオリゴヌクレオチド９は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる50merの塩基配列と、100％相補的な50merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１０（配列番号：１０））を用意した。このオリゴヌクレオチド１０は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる40merの塩基配列と、100％相補的な40merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１１（配列番号：１１））を用意した。このオリゴヌクレオチド１１は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる30merの塩基配列と、100％相補的な30merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１２（配列番号：１２））を用意した。このオリゴヌクレオチド１２は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる20merの塩基配列と、100％相補的な20merの塩基配列からなる。また、別のプローブDNAとして、上記ターゲットDNAの一方の末端近傍（図中右方）に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１３（配列番号：１３））を用意した。このオリゴヌクレオチド１３は、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端の塩基から始まる10merの塩基配列と、100％相補的な10merの塩基配列からなる。そして、これらのオリゴヌクレオチド７〜１３について、T4 Polynucleotidekinaseと［γ-32P］ATPをを用いて、32Pで5'末端をそれぞれ標識した。
【００９６】
オリゴヌクレオチド７：5'-acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド８：5'-agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド９：5'-aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド１０：5'-actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド１１：5'-gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド１２：5'-ccattaaacg ggtaaaatac-3'
オリゴヌクレオチド１３：5'-ggtaaaatac-3'
【００９７】
次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、200ngのターゲットDNA（直鎖状にしたM13mp18 RF DNA）と、1pmolの標識オリゴヌクレオチド７と、3.0μgのRecAタンパク質と、4unitのエキソヌクレアーゼＩとを、4.8mMのATP-γS、20mMの酢酸マグネシウム、30mMの酢酸トリス（pH7.2）中で、37℃において30分間保温した。これにより、上記実施例１等と同様に、DNA−タンパク質複合体が形成される。即ち、ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図１１中右方）に、オリゴヌクレオチド７全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなる安定なDNA−タンパク質複合体が形成される（図２参照）。
【００９８】
次に、タンパク質失活工程において、この反応液に、0.5％（W/Vol）のSDSと0.7mg/mlのプロティナーゼKを加え、37℃において30分間保温し、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させた。これにより、上記実施例１等と同様に、安定な三本鎖DNAが形成される。即ち、ターゲットDNAの一方の末端近傍領域（図１１中右方）に、オリゴヌクレオチド７全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAが形成される（図２参照）。この三本鎖DNAも、その構造を維持するために特別なタンパク質等を必要とせず、多少の熱を加えても、安定な状態を維持することができる。
【００９９】
次に、上記実施例１等と同様に、電気泳動工程において、反応液の半分量について1％のアガロースゲルで電気泳動を行った。そして、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してアガロースゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAの写真を記録した。その結果を図１２（Ｂ）のレーン１に示す。その後も、上記実施例１等と同様に、乾燥工程を行った後、検出工程において、アガロースゲルのオートラジオグラムをとり、標識オリゴヌクレオチド７由来のシグナルをＸ線フィルム上に記録した。その結果を図１２（Ａ）のレーン１に示す。図１２（Ａ）及び（Ｂ）において、約7.2kbp付近に検出されたシグナルは、ターゲットDNAにオリゴヌクレオチド７が結合した三本鎖DNAによるものである。なお、このサザンハイブリダイゼーションも、上記実施例１等と同様な工程によるものであるから、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業が少なく、容易かつ短時間で行うことができる。
【０１００】
レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド８を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド９を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド１０を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド１１を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド１２を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド１３を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１０１】
図１２（Ａ）の結果から明らかなように、いずれのレーン１〜７にもシグナルが検出された。レーン１〜４では強いシグナルが検出され、レーン５ではそれらよりも若干弱いシグナルが検出され、レーン６ではさらに弱いシグナルが検出され、レーン７ではそれよりもさらに弱いシグナルが検出されている。これらの結果から、プローブDNA（オリゴヌクレオチド）の長さが長いほど、安定な三本鎖DNAが形成されやすいことが判る。十分な量の安定な三本鎖DNAを形成するには、DNA-タンパク質複合体形成工程の反応時間にもよるが、プローブDNA（オリゴヌクレオチド）の長さが20mer以上であり、さらには、30mer以上であるのが好ましいと考えられる。
【０１０２】
（実施例９）
次いで、第９の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１４に結果を示した比較実験について説明する。まず、図１３に示すように、ターゲットDNAとして、上記実施例８と同様に、M13mp18 RF DNA（約7.2kbp）を制限酵素SnaBＩで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。
【０１０３】
また、図１３に示すように、プローブDNAとして、上記実施例８で用いたオリゴヌクレオチド８を用意した。また、別のプローブDNAとして、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方）の5'末端から数えて11番目の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１４（配列番号：１４）を用意した。また、別のプローブDNAとして、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端から数えて21番目の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１５（配列番号：１５）を用意した。また、別のプローブDNAとして、ターゲットDNAのうち、一方のDNA鎖（図中下方のDNA鎖）の5'末端から数えて31番目の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１６（配列番号：１６）を用意した。そして、これらのオリゴヌクレオチド８，１４〜１６について、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPをを用いて、32Pで5'末端をそれぞれ標識した。
【０１０４】
オリゴヌクレオチド１４：5'-caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg-3'
オリゴヌクレオチド１５：5'-acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt-3'
オリゴヌクレオチド１６：5'-cagcatcgga acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat-3'
【０１０５】
図１４において、レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン１は、上記実施例８のレーン２と同様な反応等を行った結果を示す（図１２参照）。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNAとして直鎖状にしたM13mp18 RF DNAを、プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド８を使用した。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド１４を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド１５を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド１６を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１０６】
図１４（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１〜３にはシグナルが検出されたが、レーン４にはシグナルが検出されなかった。また、レーン１〜３のうち、レーン１のシグナルが最も強く、レーン３のシグナルが最も弱かった。このことから、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するプローブDNAの3'末端の延長上に、二本鎖形成領域が存在しないと（レーン１の場合）、最も安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。また、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するプローブDNAの3'末端の延長上に、二本鎖形成領域が存在しても、二本鎖形成領域が存在しても約20bp以下の短いものであれば（レーン２または３の場合）、安定な三本鎖DNAを形成できることが判る。一方、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するプローブDNAの3'末端の延長上に、長い二本鎖形成領域が存在する場合（レーン４）、安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。
【０１０７】
このような結果となる理由は、三本鎖形成領域を構成するプローブDNAの3'末端の延長上に存在する二本鎖形成領域により、構造ストレスが生じ、三本鎖形成領域が解消されやすくなるためであると考えられる。従って、安定な三本鎖DNAを形成するためには、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するプローブDNAの3'末端の延長上にできる二本鎖形成領域が20bp以下の短いものであり、さらには、このような二本鎖形成領域が存在しないのが好ましいと考えられる。
【０１０８】
（実施例１０）
次いで、第１０の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１５に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン１は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウムを加えず、それ以外は上記実施例２のレーン１（図５参照）と同じ反応等を行った結果を示す。レーン２は、上記実施例２のレーン１と同じ反応等を行った結果を示す（図５参照）。酢酸マグネシウムの量は20mMである。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウムの量を40mMとし、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウムの量を60mMとし、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１０９】
図１５（Ａ）の結果から明らかなように、レーン２〜４にシグナルが検出されたが、レーン１にはシグナルが検出されなかった。また、レーン２〜４のシグナルの強さはほぼ同程度であった。このことから、安定な三本鎖DNAを形成するためには、少なくとも、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを用いる場合、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウム、具体的にはMgイオンまたはそれに類似する機能を有するものが必要であると考えられる。また、その量は、20mM程度あれば十分であると考えられる。
【０１１０】
（実施例１１）
次いで、第１１の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１６に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン１は、上記実施例２のレーン１と同じ反応等を行った結果を示す（図５参照）。即ち、DNA−タンパク質複合体形成工程において、反応液に20mMの酢酸マグネシウムを加えている。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウムを加えず、その代わりに10mMの塩化コバルトを加えて、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、さらに10mMの塩化コバルトを加えて、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、酢酸マグネシウムを加えず、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１１１】
レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、4.8mMのATP-γS、10mMの酢酸マグネシウム、66mMの酢酸カルシウム、33mMの酢酸トリス（pH7.8）、及び、0.5mMのDTT中で、ターゲットDNA（pUC118 DNA）と標識オリゴヌクレオチド３とRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩとを反応させた結果を示す。それ以外はレーン１と同様である。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、さらに10mMの塩化コバルトを加えて、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。レーン７は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えず、その代わりに4.8mMのGTPを加えて、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。レーン８は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ATP-γSを加えず、その代わりに4.8mMのATPを加えて、それ以外はレーン５と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１１２】
図１６（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１にのみシグナルが検出され、それ以外のレーンにはシグナルが検出されなかった。レーン１，４の結果から、少なくともRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを用いる場合には、効率的に安定な三本鎖DNAを形成するために、DNA−タンパク質複合体形成工程において、Mgイオンが必要であることが判る。また、レーン２の結果から、Coイオンでは、Mgイオンに代用できないことが判る。一方、レーン３，５，６の結果から、Mgイオンがあっても、CaイオンやCoイオンが存在する場合には、安定な三本鎖DNAを形成することが困難であることが判る。また、レーン７，８の結果から、レーン５の反応液においてATP-γSの代わりにATPやGTPを用いても、効率的に安定な三本鎖DNAを形成できないことが判る。これらのことから、効率的に安定な三本鎖DNAを形成するためには、少なくともRecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを用いる場合、DNA−タンパク質複合体形成工程において、Mgイオンが必要であると考えられる。
【０１１３】
（実施例１２）
次いで、第１２の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。図１７に示すように、ターゲットDNAとして、ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとPvuIIで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。この中には、p53遺伝子がコードされた約2.2kbpのDNA断片１が含まれる。また、別のターゲットDNAとして、ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとEcoRＩで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。この中には、p53遺伝子がコードされた約7.5kbpのDNA断片２が含まれる。また、別のターゲットDNAとして、ヒトのゲノムDNAを制限酵素PvuIIとEcoRＩで切断した直鎖状の二本鎖DNAを用意した。この中には、p53遺伝子がコードされた約5.4kbpのDNA断片３が含まれる。なお、これらのDNA断片１〜３を含むヒトp53遺伝子の塩基配列については、GeneBank登録番号U94788を参照されたい。
【０１１４】
一方、図１７に示すように、プローブDNAとして、上記DNA断片１及び２のHindIII切断部位側の末端近傍領域に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１７（配列番号：１７））を用意した。具体的には、上記DNA断片１，２のうち、一方のDNA鎖のHindIII切断部位側の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１７を用意した。また、別のプローブDNAとして、上記DNA断片２及び３のEcoRＩ切断部位側の末端近傍領域に相補的な一本鎖DNA（オリゴヌクレオチド１８（配列番号：１８））を用意した。具体的には、上記DNA断片２，３のうち、一方のDNA鎖のEcoRＩ切断部位側の5'末端の塩基から始まる60merの塩基配列と、100％相補的な60merの塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１８を用意した。そして、これらのオリゴヌクレオチド１７，１８について、T4 Polynucleotide kinaseと［γ-32P］ATPを用いて、32Pで5'末端をそれぞれ標識した。
オリゴヌクレオチド１７：5'-ctttg cagtgaaagg aatcaaagaa atggagccgt gtatcaggtg gggaagggtg ggggc-3'
オリゴヌクレオチド１８：5'-ctgtgggtt gattccacac ccccgcccgg cacccgcgtc cgcgccatgg ccatctacaa g-3'
【０１１５】
次に、DNA−タンパク質複合体形成工程において、上記DNA断片１を含む5μgのターゲットDNA（ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとPvuIIで切断したもの）と、5pmolの標識オリゴヌクレオチド１７と、10.0μgのRecAタンパク質と、4unitのエキソヌクレアーゼＩとを、4.8mMのATP-γS、20mMの酢酸マグネシウム、30mMの酢酸トリス（pH7.2）中で、37℃において30分間保温した。これにより、上記実施例１等と同様に、DNA−タンパク質複合体が形成される。即ち、ターゲットDNAに含まれる上記DNA断片１のHindIII切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド１７全体が、少なくともRecAタンパク質が関与した状態で結合してなる安定なDNA−タンパク質複合体が形成される（図２参照）。
【０１１６】
次に、タンパク質失活工程において、反応液に、0.5％（W/Vol）SDSと0.7mg/mlプロティナーゼKを加え、37℃において30分間保温し、RecAタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させた。これにより、上記実施例１等と同様に、安定な三本鎖DNAが形成される。即ち、ターゲットDNAに含まれる上記DNA断片１のHindIII切断部位側の末端近傍領域に、オリゴヌクレオチド１７全体が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAが形成される（図２参照）。この三本鎖DNAも、その構造を維持するために特別なタンパク質等を必要とせず、多少の熱を加えても、安定な状態を維持することができる。
【０１１７】
その後、この反応液について、フェノール・クロロホルム抽出を１回行った後、S-400スピンカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）の操作を２回行い、未反応の標識オリゴヌクレオチド１７を除去した。次に、その全量（約20μl）について、1％のアガロースゲルで電気泳動を行った。そして、電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してアガロースゲル中のDNAを染色し、その後、染色されたDNAの写真を記録した。その結果を図１８（Ｂ）のレーン１に示す。
【０１１８】
次に、このアガロースゲルを濾紙の上に載せてゲル乾燥機で乾燥させた。その後、アガロースゲルのオートラジオグラムをとり、標識オリゴヌクレオチド１７からのシグナルをＸ線フィルム上に記録した。その結果を図１８（Ａ）のレーン１に示す。図１８（Ａ）において、約2.2kbp付近に検出されたシグナルは、DNA断片１にオリゴヌクレオチド１７が結合した三本鎖DNAによるものである。なお、このようなジェノミックサザンハイブリダイゼーションも、上記実施例１等と同様な工程によるものであるから、熟練を要する作業かつ比較的長い時間を要する作業が少なく、容易かつ短時間で行うことができる。
【０１１９】
次いで、図１８に結果を示した比較実験について説明する。レーンＭは、上記各実施例と同様なDNAサイズマーカーである。レーン２は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNAとして、上記DNA断片２を含む5μgのターゲットDNA（ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとEcoRＩで切断したもの）を使用した。それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。レーン３は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットDNAとして、上記DNA断片３を含む5μgのターゲットDNA（ヒトのゲノムDNAを制限酵素PvuIIとEcoRＩで切断したもの）を使用した。それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。
【０１２０】
レーン４は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとして標識オリゴヌクレオチド１８を加え、それ以外はレーン１と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、ターゲットDNAは、ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとPvuIIで切断したものを用いている。レーン５は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド１８を加え、それ以外はレーン２と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、ターゲットDNAは、ヒトのゲノムDNAを制限酵素HindIIIとEcoRＩで切断したものを用いている。レーン６は、DNA−タンパク質複合体形成工程において、標識プローブDNAとしてオリゴヌクレオチド１８を加え、それ以外はレーン３と同じ反応等を行った結果を示す。即ち、ターゲットDNAは、ヒトのゲノムDNAを制限酵素PvuIIとEcoRＩで切断したものを用いている。
【０１２１】
図１８（Ａ）の結果から明らかなように、レーン１，２，５，６にはシグナルが検出されたが、レーン３，４にはシグナルが検出されなかった。レーン１，２，５，６の結果より、これらのレーンでは、レーン１について上述したように、安定な三本鎖DNAが形成されていることが判る。レーン２の約7.5kbp付近のシグナルは、DNA断片２とオリゴヌクレオチド１７とが結合した三本鎖DNAによるものである。レーン５の約7.5kbp付近のシグナルは、DNA断片２とオリゴヌクレオチド１８とが結合した三本鎖DNAによるものである。レーン６の約5.4kbp付近のシグナルは、DNA断片３とオリゴヌクレオチド１８とが結合した三本鎖DNAによるものである。
【０１２２】
一方、レーン３，４の結果より、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するオリゴヌクレオチドの3'末端の延長上に長い二本鎖形成領域が形成されると、三本鎖形成領域が解消し、安定な三本鎖DNAを形成することができないことが判る。これは、長い二本鎖形成領域による構造ストレスにより、三本鎖形成領域が解消されるためであると考えられる。これらのことから、ジェノミックサザンハイブリダイゼーションにおいても、三本鎖DNAを利用することが有効であると考えられる。また、安定な三本鎖DNAを形成するためには、三本鎖DNAを形成したときに、三本鎖形成領域を構成するオリゴヌクレオチドの3'末端の延長上に長い二本鎖形成領域ができないようにする必要があると考えられる。
【０１２３】
以上において、本発明の実施の形態を実施例に即して説明したが、本発明は上記各実施例１〜１２に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることは言うまでもない。例えば、上記各実施例では、プローブDNA（一本鎖DNA）として、ターゲットDNA（二本鎖DNA）の一部と100%相補的なオリゴヌクレオチドを使用したが、プローブDNAは、実質的に相補的、具体的には70〜80％以上の相補性があれば、一般に三本鎖DNAを形成することができる。また、プローブDNA（一本鎖DNA）は、二本鎖DNAと相補的な領域の他に、二本鎖DNAと相補的でない他の塩基配列が付加されたものでもよい。このようなプローブDNAでも、ターゲットDNAに結合して三本鎖DNAを形成できるからである。但し、より安定な三本鎖DNAを形成するためには、上記各実施例のように、プローブDNA（一本鎖DNA）は、その全体がターゲットDNA（二本鎖DNA）の一部と100%相補的であるのが好ましい。また、プローブDNAは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドである必要ななく、その由来は問われない。プローブDNAにオリゴヌクレオチド以外のものを用いても、安定な三本鎖DNAを形成することができるからである。
【０１２４】
また、上記各実施例では、組換えタンパク質としてRecAタンパク質を使用したが、前述したように、それ以外のものを使用することも可能である。但し、入手容易性、安全性、機能性を考慮すると、RecAタンパク質が最も適していると思われる。また、上記各実施例では、三本鎖DNAを形成するためのヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼＩを使用したが、前述したように、これと類似する機能を有するタンパク質を利用することも可能である。但し、これも入手容易性、安全性、機能性を考慮すると、エキソヌクレアーゼＩが最も適していると思われる。また、上記各実施例では、タンパク質失活工程において、タンパク質を失活させるために、SDSとプロティナーゼKを加えているが、前述したように、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤を利用してもよい。このようなものでも、タンパク質を失活させることができるからである。
【０１２５】
また、上記各実施例では、ターゲットDNA（二本鎖DNA）のどちらか一方の末端近傍領域に、プローブDNA（一本鎖DNA）結合させて三本鎖形成領域を形成したが、ターゲットDNA（二本鎖DNA）の両方の末端近傍領域に、プローブDNA（一本鎖DNA）を結合させて、両方の末端近傍領域に三本鎖形成領域を形成することもできる。このような三本鎖DNAも、上記各実施例で述べた三本鎖DNAと同様に、特別なタンパク質等がなくても安定な構造を維持することができる。
【０１２６】
【配列表】
＜110＞ アイシン精機株式会社 AISIN SEIKI CO.,LTD
＜120＞ 三本鎖DNAの形成方法、三本鎖DNA、及びサザンハイブリダイゼーション
＜130＞ ＡＫ０００５３７
＜160＞ 18
＜210＞ 1
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pBR322のScaＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 1
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 60
＜210＞ 2
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pBR322のScaＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 2
オリゴヌクレオチド２：
acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 60
＜210＞ 3
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pUC118のHincII認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 3
cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc gagctcggta cccggggatc ctctagagtc 60
＜210＞ 4
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pUC118のHincII認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 4
caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg cctgcaggtc 60
＜210＞ 5
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pUC118のHincII認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 5
gactctagag gatccccggg taccgagctc gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 60
＜210＞ 6
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ pUC118のHincII認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 6
gacctgcagg catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 60
＜210＞ 7
＜211＞ 80
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 7
acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt 60
ccattaaacg ggtaaaatac 20
＜210＞ 8
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 8
agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 60
＜210＞ 9
＜211＞ 50
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 9
aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 50
＜210＞ 10
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＜212＞ DNA
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＜220＞
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＜400＞ 10
actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 40
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＜212＞ DNA
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＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 11
gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac 30
＜210＞ 12
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＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 12
ccattaaacg ggtaaaatac 20
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＜211＞ 10
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 13
ggtaaaatac 10
＜210＞ 14
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 14
caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg 60
＜210＞ 15
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 15
acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt 60
＜210＞ 16
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ M13mp18 RFのSnaBＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 16
cagcatcgga acgagggtag caacggctac agaggctttg aggactaaag actttttcat 60
＜210＞ 17
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ ヒトp53遺伝子のHindIII認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 17
ctttgcagtg aaaggaatca aagaaatgga gccgtgtatc aggtggggaa gggtgggggc 60
＜210＞ 18
＜211＞ 60
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ ヒトp53遺伝子のEcoRＩ認識部位近傍の塩基配列を参考にして合成
＜400＞ 18
ctgtgggttg attccacacc cccgcccggc acccgcgtcc gcgccatggc catctacaag 60
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に関し、ターゲットDNAとプローブDNAについて示す説明図である。
【図２】実施例１に関し、DNA−タンパク質複合体の形成及び三本鎖DNAの形成について示す説明図である。
【図３】実施例１に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図４】実施例２に関し、ターゲットDNAとプローブDNAについて示す説明図である。
【図５】実施例２に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図６】実施例３に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図７】実施例４に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図８】実施例５に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図９】実施例６に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１０】実施例７に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１１】実施例８に関し、ターゲットDNAとプローブDNAについて示す説明図である。
【図１２】実施例８に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１３】実施例９に関し、ターゲットDNAとプローブDNAについて示す説明図である。
【図１４】実施例９に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１５】実施例１０に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１６】実施例１１に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１７】実施例１２に関し、ターゲットDNAとプローブDNAについて示す説明図である。
【図１８】実施例１２に関し、三本鎖DNAを利用したサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は標識オリゴヌクレオチド由来のシグナルを記録したＸ線フィルムの写真であり、（Ｂ）はアガロースゲル電気泳動を行い、DNAを染色した後のアガロースゲルの写真である。
【図１９】従来技術に関し、三本鎖DNA（DNA−タンパク質複合体）の形成及び三本鎖DNAの解離について示す説明図である。
Claims (3)
- 直鎖状の二本鎖DNA、
この二本鎖DNAのうち一方のDNA鎖の5'末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖DNA、
RecAタンパク質、並びに、
大腸菌（Escherichia coli）のエキソヌクレアーゼＩ、
を反応させて、上記二本鎖DNAのうち、上記一方のDNA鎖の5'末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖DNAのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が、少なくとも上記RecAタンパク質が関与した状態で結合してなるDNA−タンパク質複合体を形成するDNA−タンパク質複合体形成工程と、
上記RecAタンパク質及び上記エキソヌクレアーゼＩを失活させて、上記二本鎖DNAの末端近傍包含領域に上記一本鎖DNAの相補的領域が結合してなる三本鎖形成領域を有する三本鎖DNAを形成するタンパク質失活工程と、を備える
三本鎖DNAの形成方法。 - 請求項１に記載の三本鎖DNAの形成方法であって、
前記一本鎖DNAは、前記実質的に相補的な塩基配列が20mer以上からなる
三本鎖DNAの形成方法。 - 請求項１または請求項２に記載の三本鎖DNAの形成方法であって、
前記RecAタンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のRecAタンパク質である
三本鎖DNAの形成方法。
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