JP4412658B2 - チオレドキシン高含有酵母およびその製造法 - Google Patents

Description

本発明は、新規な培養条件において酵母を培養することより、酵母細胞中のチオレドキシン含量を増加させることを特徴とする、チオレドキシン高含有酵母およびその製造法に関する。

チオレドキシン（以下、「ＴＲＸ」という）とは、高度に保存されたＣ−Ｘ−Ｙ−Ｃの活性中心（特に、Ｘ：Ｇｌｙ、Ｙ：Ｐｒｏ）を持つ、約１２ｋＤａの電子伝達タンパク質であり、ほとんどの生物の細胞内に存在することが知られている（非特許文献１から４）。ＴＲＸは、他のタンパク質に存在するジスルフィド結合の酸化還元活性を有し、その酸化還元活性によりタンパク質の活性や機能、性質を調節する機能を有する。

様々なストレス、特に酸化ストレスは、脂質、遺伝子、タンパク質などの生体高分子に傷害を与え、細胞・組織に害を及ぼすが、それに伴いＴＲＸの体内での濃度が変化することが知られている。すなわち体内でのＴＲＸ濃度の上昇により、各種ストレスにより生じたアレルギーの改善もしくは予防、粘膜の保護もしくは修復、皮膚の保護等がなされると考えられている。

ＴＲＸが有する酸化還元活性を応用した様々な技術がこれまでに開示されている。例えばＴＲＸによる各種アレルゲンの中和（特許文献１）、ＴＲＸによる転写因子ＡＰ−１の活性化（特許文献２）、ＴＲＸによるアレルギー予防、皮質改善、粘膜障害保護（特許文献３）、炎症疾患の予防ないし治療（特許文献４）等が開示されている。
特表平１０−５１０２４４号公報 特開平１０−１９１９７７号公報 特開２０００−１０３７４３号公報 特開２００２−１７９５８８号公報 Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｔ．Ｃ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｅ．Ｃ．＆ Ｒｅｉｃｈａｒｄ，Ｐ．（１９６４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３９，３４３６−３４４４ Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４，２３７−２７１ Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１３９６３−１３９６６ Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｂ．Ｂ．，Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ，Ｐ．，Ｄｅｃｏｔｔｉｇｎｉｅｓ，Ｐ．＆ Ｌｏｚａｎｏ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３１４，２５７−２６０ Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．，Ｔｒｅｖａｎｉｃｈ，Ｓ．，Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｍｉｋｉ，Ｔ．，Ｍｉｙａｂｅ，Ｓ．，Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｓ．，Ｉｚａｗａ，Ｓ．＆ Ｋｉｍｕｒａ，Ａ．（１９９６）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．，７１（３），２９７−３００ Ｔｒａｎ，Ｌ．Ｔ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．＆ Ｋｉｍｕｒａ，Ａ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１６４（２），１６６−１７２ Ｉｚａｗａ，Ｓ．，Ｍａｅｄａ，Ｋ．，Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｋ．，Ｍａｎｏ，Ｊ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．＆ Ｋｉｍｕｒａ，Ａ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２８４５９−２８４６５ Ｋｕｇｅ，Ｓ．＆Ｊｏｎｅｓ，Ｎ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．，１３（３），６５５−６６４ Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．＆Ｋｉｍｕｒａ，Ａ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（４２），２５９５８−２５９６５ Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．，Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．＆Ｋｉｍｕｒａ，Ａ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（５），２９７７−２９８３ Ｋｕｇｅ，Ｓ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｎ．＆Ｎｏｍｏｔｏ，Ａ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．，１６（７），１７１０−１７２０

上述のようなＴＲＸの性質を利用し、機能性食品素材としてＴＲＸを利用することが可能であると考えられる。ところが、ＴＲＸを産業的なスケールで大量に製造する場合には、克服しなければならない課題が存在する。すなわち、遺伝子組換え体を用いたＴＲＸは食品には使用することはできないため、遺伝子非組換え体からのＴＲＸ抽出を行わなければならない。しかしながら食品に酵母細胞中にＴＲＸは通常酵母菌体ｇ当たり１０〜１００μｇ程度しか含有されておらず、例えば１ｍｇのＴＲＸを精製するためには、精製効率を１００％と仮定しても少なくとも１〜１０ｋｇの酵母菌体を必要とする。酵母抽出物からのＴＲＸを容易かつ効率的に回収・精製するためには酵母細胞中のＴＲＸ含有量を高める必要がある。また、酵母自体を摂取する場合もＴＲＸを高濃度で含有するものを利用するのが好ましい。したがって、本発明の目的の１つは、酵母細胞中のＴＲＸ含有量を高めることを可能にするような、酵母の新規培養方法を確立し、該方法によって製造されるチオレドキシン高含有酵母を提供することである。

本発明者らは、鋭意研究の結果、酵母を培養する際、培地中に茶成分を添加して負荷培養を行うことにより、酵母細胞中のチオレドキシン（ＴＲＸ）の含有量を増加させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。以下、本発明を詳細に説明する。

（１）ＴＲＸ高含有酵母の製造方法
本発明によれば、酵母の培養においてストレス負荷を行うことを含む、ＴＲＸ高含有酵母の製造方法が提供される。本明細書において「ストレス負荷」とは、酵母に対して生理学的条件とは異なる生物学的刺激、生化学的刺激、化学的刺激、物理的刺激等を与えることをいう。本発明のＴＲＸ高含有酵母の製造方法は、ストレス負荷によってＴＲＸ遺伝子発現に関与する転写因子を活性化することによって、ＴＲＸの発見を促進されるという発見に基づく。ここで、ＴＲＸ遺伝子発現に関与する転写因子は、限定されないが、好ましくはＹａｐ１、Ｓｋｎ７を含む。後述の実施例７に記載するように、Ｙａｐ１は、通常、細胞質と核との間をシャトルしているが、ストレス負荷によって核に局在し、ＴＲＸ遺伝子発現の活性を促進しているものと考えられる。Ｓｋｎ７は、通常、核内に局在している。

本発明の一態様として、本発明のＴＲＸ高含有酵母の製造方法では、ストレス負荷を与える時期は、酵母の培養開始と同時、対数増殖期、定常期のいずれであってもよい。後述する実施例６に記載するように、前記のいずれの時期においてもストレス負荷を与えてもＴＲＸの高発現が観察されるが、定常期においてストレス負荷を与えた場合において、より高い発現が得られた。本明細書において、対数期とは、好ましくは、ＯＤ６１０＝０．１ないし４．０、より好ましくは、ＯＤ６１０＝０．５ないし２．０の範囲を意味する。定常期とは、ＯＤ６１０が、１５ないし４０の範囲で実質的に変化しなくなった状態を意味し、例えば、２０ないし４０時間培養、より好ましくは２４ないし３６時間培養を行った時の状態のことを指す。

本発明の一態様としては、ストレス負荷は、培地中に茶成分を添加することであってよい。本発明の製造方法に使用する茶成分は、限定されないが、茶抽出物、カテキン類、これらの混合物が例示される。茶抽出物としては、その原料として、緑茶、ウーロン茶、番茶、玄米茶などの使用が例示されるが、菌体内ＴＲＸ含量を増加させる効果とこのような菌体を工業的に製造するコストとを考慮すると、茶抽出物としては緑茶抽出物を用いることが好ましい。「緑茶抽出物」には、カテキン類（例えば、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピカテキン、没食子酸エピガロカテキン）などの成分が含まれる。本発明の製造方法においては、後述する実施例に記載するように、緑茶ポリフェノール（カテキン類）を緑茶から抽出・精製した市販のサンフェノンＢＧ（太陽化学株式会社製）を使用することもできる。

本発明においては、前記茶成分を培地に添加してＴＲＸ高含有酵母を製造することができる。茶成分を培地に添加する場合、茶成分の最終濃度は、好ましくは０．０１−５．０％、より好ましくは０．０３−４．０％、さらにより好ましくは０．１−３．０％、最も好ましくは１．０−２．０％である。また、茶成分の添加後、酵母を培養する時間は、好ましくは０．５−２．０時間、より好ましくは１．０−１．５時間である。

本発明においては、酵母の培養に用いる培地、及び流加培養に用いる流加液は、限定されないが、当業者であれば目的に応じて公知のものの中から適宜選択して使用ことができる。好ましくはＨ培地、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地、廃糖蜜、より好ましくはＨ培地、ＳＤ培地、最も好ましくはＨ培地である。なお、これらの培地には炭素源、窒素源等を適宜含んでいてもよい。ここで、本明細書において使用する「Ｈ培地」とは、１％ グルコース、０．２％ 酵母エキス、０．５％ ペプトン、０．０３％ Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．０３％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０１％ ＭｇＣｌ₂を含む酵母用培地をいう。「ＳＤ培地」とは、２％ グルコース、１％ ペプトンを含む酵母用培地をいう。「ＹＰＤ培地」とは、２％ グルコース、１％ 酵母エキス、２％ ペプトンを含む酵母用培地をいう。また、前記培地を寒天培地として使用する場合には、さらに２％の寒天を添加することによって調製することができる。さらに、本発明のＴＲＸ高含有酵母の培養では、培地のｐＨは重要である。ｐＨは、好ましくは７．０〜９．０、より好ましくは７．０〜８．０、さらに好ましくは７．４〜７．８、最も好ましくは７．６に調製される。また、市販のサンフェノンＢＧを培地に添加する場合、培地のｐＨが若干低下するため、例えば、１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを調整することができる。

本発明の一態様において、ＴＲＸ高含有酵母は、酵母の培養において緑茶抽出物によるストレス負荷を行った後、ストレス負荷を除去した培養条件下で所定時間さらに培養することによって製造することができる。

酵母の培養方法は、限定されないが、バッチ培養、流加連続培養、流加バッチ培養などが例示され、当業者であれば適宜選択することができる。また、培養は、ジャーファーメンター（小松川化工機（株）等）を用いて好適に行うことができる。ジャーファーメンターを使用する場合の培養条件は、特に制限はなく、当業者であれば適宜決定することができ、例えば、培養温度としては２８〜３３℃程度、培養時間としては１〜１２０時間程度、ｐＨとしては６〜９程度、通気量としては０〜５ｖｖｍ程度、攪拌速度としては１００〜７００ｒｐｍ程度の範囲内で調整することができる。

本発明の製造方法は、ストレス負荷によって転写因子を活性化させ、ＴＲＸ遺伝子発現を促進させることに基づくが、このような転写因子の利用は外因性ＴＲＸ遺伝子、内因性ＴＲＸ遺伝子のいずれであってもよい。ただし、外来性ＴＲＸ遺伝子を導入した組換え体を食品に用いることはできないため、内因性ＴＲＸ遺伝子が好ましい。ここで、「内因性ＴＲＸ遺伝子」とは、酵母が本来、染色体中に遺伝子として有しているＴＲＸの遺伝子であって、遺伝子工学的手法によって酵母に外来遺伝子として導入する外因性ＴＲＸ遺伝子は含まない。ＴＲＸ遺伝子には、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＡＡ８５５８４として開示される１０４個のアミノ酸残基からなるＴＲＸ２をコードする遺伝子が例示される。こうした天然のＴＲＸの中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。また、ＴＲＸ遺伝子のアリルを含んでもよい。

本発明の一態様として、ストレス負荷によってＴＲＸ含有量は、ストレス負荷がない場合と比較して、有意に増加する。より具体的には、後述の実施例３では、遺伝子組換え体を用いた場合に、ＴＲＸプロモーターの活性が少なくとも約６．５倍増加した。また、実施例８では、実用菌体を用いた場合に、湿菌体１ｇ当たりのＴＲＸ含有量が少なくとも約１．２倍、最大約１．６倍増加した。よって、本発明のチオレドキシン高含有酵母の製造方法により、ストレス負荷によってＴＲＸ含有量は、ストレス負荷がない場合と比較して好ましくは６．５倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは２倍以上、さらにより好ましくは１．６倍以上、最も好ましくは１．２倍以上増加する。

（２）ＴＲＸ高含有酵母
本発明によれば、上述した製造方法によって製造されるＴＲＸ高含有酵母が提供される。本発明の製造方法に使用される酵母は、限定されないが、機能性食品素材として利用することを考慮して、安全性確認が容易な天然供給源から得られる食用酵母が好ましい。食用酵母には、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、ミコトルラ（Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の菌体が例示される。本発明のＴＲＸ高含有酵母の製造に使用される酵母は、サッカロミセス属由来の酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。サッカロミセス属由来の酵母としては、好ましくはパン酵母、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母、味噌醤油酵母、より好ましくはパン酵母である。

本発明のＴＲＸ高含有酵母のＴＲＸ含有量は、好ましくは１２０μｇ以上、より好ましくは１３０μｇ以上、さらにより好ましくは１４０μｇ以上、最も好ましくは１８０μｇ／ｇ湿菌体以上、２００μｇ／ｇ湿菌体以下である。

本発明のＴＲＸ高含有酵母は、食品用途に使用する場合、生菌のままの形態でも良いが、菌体の破砕物を調製して使用することができる。菌体の破砕の方法は、顕微鏡観察下で未破砕菌体がなくなる程度の破砕度合いであれば特に制限はなく、当業者であれば、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ダイノミル等の物理的破砕処理であってもよく、または化学的破砕処理であってもよい。なお、ＴＲＸ高含有酵母を破砕物の形態で用いる場合、その破砕物は、破砕したままで乾燥させない液状物であってもよく、または破砕後に乾燥させた乾燥物であってもよい。

本発明のＴＲＸ高含有酵母またはその破砕物は、食品または飲料に含有させ、使用することができる。その使用の態様は、限定されないが、当業者であれば目的に応じて適宜選択することができる。例えば、パン、ビスケットやクラッカー等の製菓、流動食、水産・食肉加工品、麺類、調味料、ジュース等の飲料、または各種健康食品・飲料等に所定量の前記酵母または破砕物を添加することができる。

（３）スケールアップにおけるＴＲＸ高含有酵母の製造
本発明によれば、酵母によるＴＲＸを産業的スケールにおいて容易にかつ大量に製造することができる。実験室レベルでの小スケールから工業的に製造可能な大スケールへのスケールアップについては、限定されないが、当業者であれば公知の方法により行うことができる。より具体的には、後述する実施例８に記載したように、ストレス負荷としてサンフェノンを２．０％添加した場合には、実用菌体のＴＲＸ含有量は１９７μｇ／ｇ湿菌体であり、サンフェノン無添加の場合（１２６μｇ／ｇ湿菌体）と比べて約１．６倍増加させることができる。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１ 酵母の培養とＴＲＸの発現
実施例においては、実験室レベルにおいて、ＴＲＸ２の発現条件を検討する目的で、ＴＲＸ２−ｌａｃＺレポーター遺伝子を導入したＹＰＨ２５０株（以下、「組換えＹＰＨ２５０株」という）を調製した。

具体的には、先ず、ＴＲＸ２−ｌａｃＺレポーター遺伝子を含むプラスミドは、Ｋｕｇｅ，Ｓ．＆Ｊｏｎｅｓ，Ｎ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．，１３（３），６５５−６６４（非特許文献８）に記載の方法を用いて作成された。当該プラスミドは、ＴＲＸ遺伝子の上流に存在するＴＲＸプロモーターと、ｌａｃＺのＯＲＦを組み合わせた構成となっている。当該構成により、カテキンの添加によるＴＲＸプロモーターの活性化をその下流のｌａｃＺ遺伝子の発現に置き換えてレポーターアッセイすることができる。

次いで、ＴＲＸ２−ｌａｃＺレポーター遺伝子を含むプラスミドのＹＰＨ２５０株への導入を公知のエレクトロポレーション法を用いて行った。エレクトロポレーションは、例えば、Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．＆Ｋｉｍｕｒａ，Ａ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（４２），２５９５８−２５９６５（非特許文献９）、又はＩｎｏｕｅ，Ｙ．，Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．＆Ｋｉｍｕｒａ，Ａ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（５），２９７７−２９８３（非特許文献１０）に記載の方法を用いて行うことができる。具体的には、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒを使用し、酵母への遺伝子導入として一般的な条件（１．５ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）を採用した。

組換えＹＰＨ２５０株の培養には、プラスミドの脱落を防ぐためウラシルを含まないＳＤ最少培地（２％ グルコース、０．６７％ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、ｐＨ５．５）に２０μｇ／ｍｌとなるようにＬ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｌｙｓ、およびアデニンを加えたもの、また必要に応じてＹＰＤ培地（２％ グルコース、１％ 酵母エキス、２％ ペプトン）、およびＨ培地（１％ グルコース、０．２％ 酵母エキス、０．５％ ペプトン、０．０３％ Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．０３％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０１％ ＭｇＣｌ₂）（非特許文献６）を用いた。なお、ｐＨの調整にはＮａＯＨを用いた。

ストレス負荷となる物質として、食品添加物として使用が認可されている物質である転写因子Ｙａｐ１の活性化を促すような物質の探索を行い、その結果、緑茶抽出物に着目した。その根拠は、発明者らは以前、大腸菌を使った実験で、カテキンやエピガロカテキンガレートなどの緑茶成分中のポリフェノール類が、一般に知られているように活性酸素を消去するのではなく、銅イオンの存在下ではむしろ逆効果を示すことを見出したことに基づいている（非特許文献５）。使用した緑茶抽出物は、市販のサンフェノンＢＧ（太陽化学株式会社製）である。また、カテキン、エピガロカテキンガレート、および没食子酸は和研薬株式会社から購入した。

本試験例においては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ２５０株（ＭＡＴａ ｔｒｐ１−Δ１ ｈｉｓ３−Δ２００ ｌｅｕ２−Δ１ ｌｙｓ２−８０１ ａｄｅ２−１０１ ｕｒａ３−５２）（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０４６７６）をＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒより取り寄せ、植え継いだものを使用した。

２８℃において、プラスミドの脱落を防ぐ目的でＳＤ培地においてＯＤ６１０＝１になるまで振とう培養した後、培養液５０ｍｌを遠心チューブに移して集菌し、上清を取り除き、予めｐＨ調整をした各種培地（５０ｍｌ）に上記菌体を懸濁した。その後、サンフェノン粉末、あるいは予め水で溶解しておいたサンフェノンを最終濃度で０．１％になるように添加した後、２００ｍｌ容三角フラスコに移して更に２８℃で９０分間振とう培養を行った。なお、サンフェノンを水に溶解させるとｐＨが若干低下することから、培地のｐＨを調整することにした。

培養後、５０ｍｌの培養液を遠心して集菌し、０．８５％ ＮａＣｌ溶液で菌体を２〜３回洗浄した。その後、１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに菌体を移し、菌体とほぼ等量のガラスビーズを加え、さらに２５０〜３００μｌの１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加えた。これをＦａｓｔ Ｐｒｅｐ（Ｑｂｉｏｇｅｎ社）で３０秒激しく振とうして菌体を破砕した。遠心（１４０００ｒｐｍ、４℃、１０分）し、その上清（無細胞抽出液）を酵素として用いた。β−ガラクトシダーゼ活性の測定は常法に従い行った。比活性は１０００×Ａ４２０／時間（ｈ）／ｍｇタンパク質で標記した。

上記の無細胞抽出液の調製法のうち、菌体を破砕する緩衝液として１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて無細胞抽出液を得た。タンパク質濃度を定量した後、常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度１５％）を行った。各レーンには５０μｇ程度のタンパク質がロードされるようにアプライ量を調整した。常法に従ってＰＶＤＦ膜にブロットし、１次抗体として大腸菌で発現、精製したＴＲＸ２を用いて免疫したウサギの抗血清（非特許文献７）を用いた。２次抗体はＨＲＰをコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、４−クロロ−１−ナフトールとＨ₂Ｏ₂で発色させてＴＲＸのバンドを確認した。用いた抗体はＴＲＸ１とＴＲＸ２を区別することはできないことを確認している。

実施例２ 培地のｐＨ変化によるＴＲＸの発現への影響
酵母を培養する際の培地のｐＨ変化によるＴＲＸの発現への影響を検討した。実施例１と同様に、ＴＲＸ２−ｌａｃＺを持つ株をＳＤ培地でＯＤ６１０＝１まで培養した後、ｐＨを６．５から８．０まで変化させたＨ培地に菌体を懸濁した。そこへ０．１％となるようサンフェノンを添加し、２８℃で９０分培養し、ＴＲＸ２−ｌａｃＺに起因するβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。酸性側ではβ−ガラクトシダーゼ活性の誘導はほとんど観察されなかった（データ示さず）が、ｐＨ７以上ではｐＨの上昇とともにβ−ガラクトシダーゼ活性が誘導され、ｐＨ７．６のとき最大（約１１２Ｕ／ｍｇタンパク質）となり、サンフェノンを添加しない場合と比較して約６．５倍増加した（図１）。また、サンフェノンを添加せずに、ｐＨをアルカリ側に調整するのみではＴＲＸ２−ｌａｃＺの発現は観察されなかった。さらに、ＴＲＸレベルを抗ＴＲＸ２抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検討した結果、β−ガラクトシダーゼ活性の検出と同様に、ＴＲＸタンパクの発現を確認できた（図２）。したがって、ＴＲＸ２−ｌａｃＺレポーター遺伝子を発現させる培養条件で得られる結果は、ＴＲＸの発現の結果に反映されると言える。

実施例３ サンフェノンの添加濃度および添加時間によるＴＲＸの発現への影響
ＳＤ培地でＯＤ６１０＝１まで培養した菌体をｐＨ７．６に調整したＨ培地に懸濁し、各濃度のサンフェノンを添加して２８℃で９０分培養した。ＴＲＸ２−ｌａｃＺの発現は、添加したサンフェノンの濃度が０．１％（最終濃度）のときにで最大となった（図３）。なお、それよりも高濃度のサンフェノンを加えても誘導効果はみられす、また沈殿のようなものが析出した（データ示さず）。したがって、以下の実施例では、サンフェノンの濃度を０．１％として使用した。

さらに、サンフェノンの添加時間を検討する目的で、上記で調製した菌体をＨ培地に懸濁し、最終濃度が０．１％となるようにサンフェノンを添加して、２８℃で４５分、６０分、および９０分間培養した。その結果、ＴＲＸ２−ｌａｃＺの発現は６０分でほぼ最大に達した（図４）。

実施例４ 培地の種類によるＴＲＸの発現への影響
ＳＤ培地でＯＤ６１０＝１まで培養した菌体を、ｐＨ７．６に調整したＨ培地、ＹＰＤ培地、およびＳＤ培地のそれぞれに懸濁した。各培地に最終濃度が０．１％となるようサンフェノンＢＧを添加して２８℃で４５分および９０分培養した。その結果、Ｈ培地を用いた時に最大の誘導効果がみられ、ＹＰＤ培地ではほとんど誘導は観察されなかった（表１、図５）。そこで、以下の実施例では、Ｈ培地を用いた。

単位：β−ガラクトシダーゼ（Ｕ／ｍｇ）
実施例５ Ｈ培地中のリン酸塩濃度によるＴＲＸの発現への影響
Ｈ培地には、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地とは異なり、０．０３％ Ｋ₂ＨＰＯ₄および０．０３％ ＫＨ₂ＰＯ₄としてリン酸塩が含まれている。そこで、リン酸塩の影響を調べるため、リン酸カリウム緩衝液として最終濃度が０ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭとなるようにＨ培地（ｐＨは７．６に調整）を調製し使用した。ＳＤ培地でＯＤ６１０＝１まで培養した菌体を各Ｈ培地に懸濁し、最終濃度が０．１％となるようにサンフェノンを添加して９０分培養した。その結果、リン酸塩を全く含まない培地においてもβ−ガラクトシダーゼ活性（約８５Ｕ／ｍｇタンパク質）があり、ＴＲＸ２−ｌａｃＺの発現誘導には、培地中のリン酸カリウムの影響は少ないと考えられる（図６）。

実施例６ 異なる添加時期によるＴＲＸの発現への影響
サンフェノンの培地への添加時期がＴＲＸの発現に影響を及ぼすかについて検討した。ＴＲＸ２−ｌａｃＺレポーター遺伝子をもつ株をＳＤ培地で培養し、Ｈ培地で対数期（ＯＤ６１０＝１）、および定常期（２４時間培養）まで培養した。それぞれの菌体培養液にNaOHを滴下してｐＨを７．６に調整した後、最終濃度が０．１％になるようにサンフェノンを添加した。その後、さらに９０分間培養した。その結果、定常期の細胞の方がより誘導がかかる結果となった（表２、図７）。

単位：β−ガラクトシダーゼ（Ｕ／ｍｇ）
実施例７ ＴＲＸ２遺伝子の発現制御
一般に、ＴＲＸ２遺伝子の発現は、Ｙａｐ１とＳｋｎ７という２つの転写因子により制御されていることが知られている。Ｓｋｎ７は常に核に局在するが、Ｙａｐ１は細胞質と核をシャトルしている。そこで、ＧＦＰタグを付加したＹａｐ１を用いて、カテキン、エピガロカテキンガレート、没食子酸、ならびにサンフェノン処理によるＹａｐ１の局在性を蛍光顕微鏡で観察した。

具体的には、Ｙａｐ１タンパク質のＮ末端側にＧＦＰタンパク質を融合させた融合タンパク質「ＧＦＰ−Ｙａｐ１」を利用した。ＧＦＰ−Ｙａｐ１タンパク質発現のためのプラスミドとしては、Ｋｕｇｅ，Ｓ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｎ．＆Ｎｏｍｏｔｏ，Ａ．（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．，１６（７），１７１０−１７２０（非特許文献１１）に記載の方法に従って構築したプラスミド「ｐＲＳ ｃｐ−ＧＦＰ ＨＡ ＹＡＰ１」を用いた。上記プラスミドの宿主細胞への導入方法は、実施例１に記載のＴＲＸ２−ｌａｃＺレポーター遺伝子を含むプラスミドの導入方法と同様に行った。

顕微鏡観察の結果、いずれの薬剤によってもＹａｐ１の核局在が観察されたことから（図８）、サンフェノンによるＴＲＸの誘導は、緑茶抽出物中の主な成分であるカテキンやエピガロカテキンガレートによるものと考えられた。

実施例８ 工業レベルにおける実用菌株を用いたＴＲＸの誘導発現
以上の実験室レベルによる試験により、緑茶成分がＴＲＸ誘導物質であることが示唆された。しかし、この緑茶成分を工業レベルで用いるためには、ＹＰＨ２５０株ではなく、実用菌株に対してもＴＲＸを誘導可能である必要がある。さらに、酵母濃度が高くてもＴＲＸ誘導効果を示すことが重要である。そこで、本実施例では実用菌株においてもこのサンフェノンを用いることでＴＲＸ誘導発現が可能かを検討するため、実用パン酵母であるＯ−１０２（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６９）を用いて以下の検討を行った。

Ｏ−１０２をＳＤ培地（１６φ試験管５ｍｌ）に１白金耳植菌し、３０℃、２日間培養後、Ｈ培地（坂口フラスコ１００ｍＬ）にＯＤ６１０≒０．０５となるように植菌した。３０℃で１４時間培養（ＯＤ６１０≒４．５）後、緑茶成分サンフェノンを終濃度０．０５、０．１、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０％となるように添加し、次いで５Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．６となるように調整をした。その後、３０℃で９０分間振握培養を行った。また、サンフェノン無添加でｐＨ７．６に調整したものと、ｐＨ無調整のものをコントロ一ルとした。培養液を集菌・洗浄し、適量のＭｉｌｌｉＱ水に懸濁した。各サンプルの湿菌体量を測定後、湿菌体３００ｍｇとなるように懸濁液を２ｍｌ容エッペンドルフチューブに分取し、遠心分離（８４００ｇ、２分）し、集菌後、得られた菌体からタンパク質を抽出した。タンパク質抽出は、湿菌体３００ｍｇに９００μｌのＹｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）（以下、ＹＰＥＲ）を添加し、懸濁後２０分間室温放置することにより行った。更に抽出液を遠心分離（３５０００ｇ、１５分、４℃）することにより水溶性画分を分取し、６５℃にて１０分間の熱処理を行ったものをＴＲＸ濃度測定用サンプルとして得た。

なお、試料中のＴＲＸ濃度の測定は、以下の手順により行った。
１） Ｒ１（３００μＬ）と試料（２０μＬ）を混合
２） ２５℃で５分間予備加熱
３） Ｒ２（６μＬ）を添加し、混合
４） ２５℃で１分間インキュベートし、その間におけるＡｂｓ３４０の減少を測定
（ここで、Ｒ１とは、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．８ｍｇ／ｍＬ インシュリン、０．１６ｍＭ ＮＡＤＰＨ溶液のことを指す。またＲ２とは、０．３Ｕ／ｍＬ ＮＴＲ（ＮＡＤＰ依存チオレドキシンレダクターゼ）、０．１M Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）溶液をいう。）
菌体内ＴＲＸ含有量の測定結果を表１に示す。

コントロールのＴＲＸ含有量はｐＨ調整の有無によらずほぼ同等であり、サンフェノン無添加ではｐＨを７．６に調整しても菌体内ＴＲＸ含有量に影響しなかった。また、サンフェノン濃度が０．５％までは、菌体内ＴＲＸ含有量はコントロールとほぼ同等の値を示した。これに対して、サンフェノン濃度を１．０％、２．０％に上昇させることにより、コントロールと比較し菌体内ＴＲＸ含有量がそれぞれ約１．２倍、約１．６倍に増加した（表１及び図９）。これらの結果により、実用菌株においても緑茶抽出物によりＴＲＸの誘導発現が可能であることが明らかとなった。

本発明により、食品素材等として好適なＴＲＸ高含有酵母及びＴＲＸ高含有酵母の破砕物、該ＴＲＸ高含有酵母の製造方法を提供することができる。また、本発明のＴＲＸ高含有酵母は、遺伝子組換えに依らずに製造することが可能であるため、食品として応用するに際して安全性が高く、好適である。

図１は、ＴＲＸ２−ｌａｃＺの発現における培地のｐＨによる影響を検討した結果を示す。ＴＲＸ２−ｌａｃＺを持つ株をＳＤ培地でＯＤ６１０＝１まで培養した後、ｐＨを７．０から８．０まで変化させたＨ培地に菌体を懸濁した。緑茶抽出物として０．１％となるようサンフェノンを添加し、２８℃で９０分培養後、ＴＲＸ２−ｌａｃＺに起因するβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。 図２は、ｐＨを７．０から８．０まで変化させたＨ培地に懸濁した菌体におけるＴＲＸ発現を抗ＴＲＸ２抗体を用いてウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す。 図３は、ＴＲＸ２−ｌａｃＺの発現における添加する緑茶抽出物濃度の影響を検討した結果を示す。ＳＤ培地でＯＤ６１０＝１まで培養した菌体をｐＨ７．６に調整したＨ培地に懸濁し、各濃度のサンフェノンを添加して２８℃で９０分培養後、ＴＲＸ２−ｌａｃＺに起因するβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。 図４は、ＴＲＸ２−ｌａｃＺの発現におけるサンフェノンの添加時間の影響を検討した結果を示す。ＳＤ培地でＯＤ６１０＝１まで培養した菌体をｐＨ７．６に調整したＨ培地に懸濁させた。最終濃度が０．１％となるようにサンフェノンＢＧを添加し、２８℃で所定時間培養後、ＴＲＸ２−ｌａｃＺに起因するβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。 図５は、ＴＲＸ２−ｌａｃＺの発現における各種培地による影響を検討した結果を示す。ＳＤ培地でＯＤ６１０＝１まで培養した菌体をｐＨ７．６に調整したＨ培地、ＹＰＤ培地、およびＳＤ培地にそれぞれ懸濁させた。最終濃度が０．１％となるようにサンフェノンＢＧを添加し、２８℃で４５分又は９０分培養後、ＴＲＸ２−ｌａｃＺに起因するβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。 図６は、ＴＲＸ２−ｌａｃＺの発現におけるリン酸塩による影響を検討した結果を示す。ＳＤ培地でＯＤ６１０＝１まで培養した菌体を、Ｈ培地中のリン酸イオンが所定濃度になるように調製（ｐＨ７．６）した培地に懸濁させた。最終濃度が０．１％となるようにサンフェノンＢＧを添加し、２８℃で９０分培養後、ＴＲＸ２−ｌａｃＺに起因するβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。 図７は、ＴＲＸ２−ｌａｃＺの発現におけるサンフェノンの添加時期による影響を検討した結果を示す。ＴＲＸ２−ｌａｃＺレポーター遺伝子をもつ株をＳＤ培地で培養し、Ｈ培地で対数期（ＯＤ６１０＝１）、および定常期（２４時間培養）まで培養した。それぞれの菌体培養液にＮａＯＨを滴下してｐＨを７．６に調整した後、最終濃度が０．１％になるようにサンフェノンを添加した。その後、さらに９０分間培養し、ＴＲＸ２−ｌａｃＺに起因するβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。 図８は、緑茶抽出物、カテキン類の添加によるＹａｐ１の活性化を蛍光顕微鏡によって観察した結果を示す。 図９は、実用菌体のＴＲＸ含有量におけるサンフェノンの濃度による影響を示す結果である。

Claims (10)

1. 酵母の培養においてストレス負荷を行うことを含み、そして、酵母を培養するための培地がＨ培地であり、培地のｐＨが７．４〜８．０であることを特徴とする、チオレドキシン高含有酵母の製造方法。
2. ストレス負荷によってチオレドキシンの転写因子を活性化することを含む、請求項１に記載のチオレドキシン高含有酵母の製造方法。
3. 酵母の培養開始と同時、対数増殖期、または定常期にストレス負荷を与える、請求項１または２に記載のチオレドキシン高含有酵母の製造方法。
4. ストレス負荷が培地中に茶成分を添加することである、請求項３に記載のチオレドキシン高含有酵母の製造方法。
5. 茶成分が０．０３−４．０％の割合で添加される、請求項４に記載のチオレドキシン高含有酵母の製造方法。
6. 茶成分が茶抽出物、カテキン類、またはこれらの混合物である、請求項４または５に記載のチオレドキシン高含有酵母の製造方法。
7. 培地のｐＨが７．６であることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のチオレドキシン高含有酵母の製造方法。
8. 酵母が食用酵母であることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のチオレドキシン高含有酵母の製造方法。
9. チオレドキシンが内因性チオレドキシン遺伝子から発現される、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のチオレドキシン高含有酵母の製造方法。
10. 湿菌体１ｇ当たりのチオレドキシン含有量をストレス負荷を加えない場合と比較して、少なくとも１．２倍増加させる、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のチオレドキシン高含有酵母の製造方法。