JP4437652B2 - 組換え型ビリルビン酸化酵素及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、臨床検査分析用試薬として重要な酵素であるビリルビン酸化酵素、特に組換え型ビリルビン酸化酵素及びその製造方法に関し、さらには、組換え型ビリルビン酸化酵素の臨床分析利用としてのビリルビンの定量測定方法に関する。
ビリルビン酸化酵素は、ビリルビンの定量を目的として臨床検査分析の場において使用されており、従来、不完全糸状菌ミロテシウムベルカリアＭＴ−１（Myrothecium verrucaria MT-1）から抽出して部分精製した酵素標品［以下、野生型酵素（wtBO）と称する。］が使用されてきた。
しかしながら、この野生型酵素は、酵素活性が不安定であるという問題を抱えている。このため、ビリルビン酸化酵素を安定化するための一案として、アミノ酸と有機酸塩を組み合わせて添加する方法（例えば、特許文献１を参照）や、ポリカルボン酸類の添加によって解決しようとする方法（例えば、特許文献２を参照）が試みられてきた。
一方、ビリルビン酸化酵素の遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列の決定と、それをコードするＤＮＡを組み込んだ酵母による発現系を構築し、発現酵素を採取することも試みられている(例えば、特許文献３や非特許文献１を参照)。
特開平６−２８４８８６号公報
特開平８−６６１９６号公報
特開平５−１９９８８２号公報
Koikeda, S., Ando, K., Kaji, H., Inoue, T., Murao, S., Takeuti, K., and Samejima, T., Molecular cloning of the gene for bilirubin oxidase from Myrothecium verrucaria and its expression in yeast. (1993) J.Biol.Chem. 268, 18801-09.
しかしながら、前者のように、安定化のために添加物を添加する方法では、添加物が測定に悪影響を及ぼす虞れがあり、また、必ずしも十分な安定化は実現されていない。一方、後者のように、公開されている手法に基づいた場合では、ビリルビン酸化酵素の発現量は低く、その発現酵素を単離・精製しての臨床検査分析への実用化には至っていない。すなわち、これまで、臨床検査の為に重要な組換え型のビリルビン酸化酵素は市場には供給されていない。
前述した如く、従来から臨床検査等に使用されてきたビリルビン酸化酵素が不安定である欠点を有することから、より安定な活性を有し臨床検査の条件に適したビリルビン酸化酵素を供給する方法が必要であった。そこで、本発明は、このような実情に鑑みて提案されたものであり、従来用いられてきたビリルビン酸化酵素よりも安定な活性を有する組換え型のビリルビン酸化酵素を提供することを目的とし、これを用いたビリルビンの定量測定方法を提供することを目的とする。さらには、かかる組換え型ビリルビン酸化酵素を容易に単離し精製することが可能で、大量生産し得るビリルビン酸化酵素の製造方法を提供することを目的とする。
本発明のビリルビン酸化酵素は、組換え型ビリルビン酸化酵素であり、配列番号１記載の不完全糸状菌ミロテシウムベルカリアＭＴ−１（Myrothecium verrucaria MT-1）由来ビリルビン酸化酵素遺伝子をピキア（pichia）属の酵母であるPichia pastoris GS115株に導入し発現させて得られ、アミノ末端配列がY-V-E-F-V-A-Q-I-S-P-Qであることを特徴とする。
例えばピキア（Pichia）属酵母を宿主細胞とし、不完全糸状菌ミロテシウムベルカリアＭＴ−１（Myrothecium verrucaria MT-1）由来のビリルビン酸化酵素遺伝子（配列番号１）を導入し形質転換することにより、従来用いられていた酵素標品である野生型酵素（wtBO）と比べて、若しくは従来の不完全糸状菌を宿主とした組換え型酵素（rBOAspergillus）と比べて、安定で失活しにくい組換え型ビリルビン酸化酵素が実現される。
一方、本発明のビリルビン酸化酵素の製造方法は、組換え型ビリルビン酸化酵素を製造する方法であり、配列番号１記載の不完全糸状菌ミロテシウムベルカリアＭＴ−１（Myrothecium verrucaria MT-1）由来ビリルビン酸化酵素遺伝子を、ピキア（pichia）属の酵母であるPichia pastoris GS115株を宿主動物として導入し形質転換を行うことを特徴とする。
酵母を宿主細胞とし、前記遺伝子を導入し形質転換することにより、前述の安定な組換え型ビリルビン酸化酵素が大量に且つ効率よく製造される。宿主となる酵母株の選択は、製造効率を上げる目的で行われる。
さらに、本発明のビリルビンの定量測定方法は、前述の安定な組換え型ビリルビン酸化酵素を用いて水溶液中、特に血液、血清、血漿、胆汁液または尿中に含まれるビリルビンを定量することを特徴とする。
前述した安定な組換え型ビリルビン酸化酵素を用いることにより、水溶液中に存在するビリルビンを容易に定量できる。また、同酵素は血液、胆汁液等に含まれるビリルビンを測定する為の臨床検査試薬として用いることができる。
本発明によれば、遺伝子組換え操作の宿主細胞として酵母を用いることにより、従来よりも安定な酵素活性を有する組換え型ビリルビン酸化酵素を得ることが出来る。また、本発明のビリルビン酸化酵素の製造方法によれば、非常に簡単で、経済的な方法により前記安定なビリルビン酸化酵素を大量に提供することが出来る。従って、例えば臨床検査の場において、ビリルビン酸化酵素を試薬として使用する重要な臨床検査測定を安価な費用で行うことが可能となる。
以下、本発明を適用したビリルビン酸化酵素、その製造方法、さらにはビリルビンの定量測定方法について説明する。
本発明の組換え型ビリルビン酸化酵素を作製するには、先ず、不完全糸状菌Myrothecium verrucaria MT-1株より全ＲＮＡを抽出し、非特許文献１に記載されるビリルビン酸化酵素ｃＤＮＡ配列よりデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、逆転写反応によりビリルビン酸化酵素のｃＤＮＡを合成する。同ｃＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した後、増幅遺伝子断片をプラスミドに連結し、本酵素遺伝子を組み込んだ第一次のプラスミドを構築する。ここで用いるプラスミドの候補としては、操作の簡便性から、pBluescriptII SK- (Stratagene社製)等が挙げられる。また、ここで、第一次のプラスミドの塩基配列を解析し、挿入されたビリルビン酸化酵素遺伝子が既報の配列と同一であることを確認することが望ましい。
前記構築したビリルビン酸化酵素遺伝子を含むプラスミドを異種の宿主細胞に導入してビリルビン酸化酵素を大量に発現させるために、目的の宿主細胞に適したベクターを再構築する。構築したベクターを、例えばエレクトロポレーション法により宿主細胞に導入した後、遺伝子導入細胞のセレクションを行う。ここで、宿主動物としては、大量発現という点から、酵母菌が望ましく、特にPichia属の酵母が望ましい。また、発現ベクターとしては、pPIC9K (Invitrogen社製)が望ましく、さらに、遺伝子導入細胞のセレクションを容易にする為にベクター内に選択マーカーを設けることが望ましい。選択マーカーの例としては、例えば、薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。
以下の文中においては酵母を宿主として用いた場合について記述する。前記遺伝子導入細胞（酵母）を培養し、培養上清中に存在する組換え型ビリルビン酸化酵素を回収することが出来る。ここで、培養に用いる培地としては、０．２ｍＭのＣｕＣｌ2を含むＢＭＭ最小培地が望ましく、さらに同培地中には、発現誘導基質として終濃度０．５％のメタノールが存在することが望ましい。
回収した培養上清から、組換え型ビリルビン酸化酵素を精製することができる。精製方法の例としては、疎水性カラムへの吸着、塩濃度逆勾配クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーによる分離が挙げられ、これらを組み合わせることにより良好な分離精製の結果が得られる。
分離後の組換え型ビリルビン酸化酵素の分子量測定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、またはゲルろ過法により行うことができる。また、同酵素のアミノ末端配列を分析することにより、デザイン通りのアミノ酸末端配列であることを確認する事が出来る。さらに、同酵素の至適ｐＨとｐＨ安定性は、緩衝液中において、ｐＨ値を変動させつつ反応速度を測定することにより検証することができる。加えて、同酵素の至適温度と熱安定性は、緩衝液中において温度を変動させつつ酵素活性の変化を測定することにより検証する事ができる。
以上の操作により製造した組換え型ビリルビン酸化酵素は野生型酵素よりも高い安定性を有し、臨床検査用試薬として水溶液中、特に血液、血清、血漿、胆汁液または尿中に含まれるビリルビンの定量を行う際に極めて有用である。
次に、本発明の具体的実施例について、実験結果を基に説明する。なお、本発明が、これら実施例に限定されるものでないことは言うまでもない。
１．ビリルビン酸化酵素のｃＤＮＡクローニング
不完全糸状菌Myrothecium verrucaria MT-1株を非特許文献１の方法に従い培養した後、集菌して、湿菌体を液体窒素下で摩砕した。約１００ｍｇの凍結菌体粉末からDynabeads mRNA DIRECT Kit (Dynal社製)を用い、添付のマニュアルに従って全ｍＲＮＡ抽出溶液２０μｌを調製した。その全量を用いて、マニュアルに従ってFirst-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences社製)により逆転写反応を行った。逆転写反応液（全量33μl）の内5μlを鋳型にして、非特許文献１記載のビリルビン酸化酵素ｃＤＮＡの塩基配列よりデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマー BO-EcoN（配列番号２）とBO-PstC（配列番号３）を用いて、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行った。
不完全糸状菌Myrothecium verrucaria MT-1株を非特許文献１の方法に従い培養した後、集菌して、湿菌体を液体窒素下で摩砕した。約１００ｍｇの凍結菌体粉末からDynabeads mRNA DIRECT Kit (Dynal社製)を用い、添付のマニュアルに従って全ｍＲＮＡ抽出溶液２０μｌを調製した。その全量を用いて、マニュアルに従ってFirst-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences社製)により逆転写反応を行った。逆転写反応液（全量33μl）の内5μlを鋳型にして、非特許文献１記載のビリルビン酸化酵素ｃＤＮＡの塩基配列よりデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマー BO-EcoN（配列番号２）とBO-PstC（配列番号３）を用いて、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行った。
プライマーBO-EcoNは、成熟ビリルビン酸化酵素のアミノ末端Valをコードするコドンの5'側にEcoRI切断配列（下線部）を加えたものである。プライマーBO-PstCは、成熟ビリルビン酸化酵素の終止コドンの3'側にPstI切断配列（下線部）を加えたものである。ＰＣＲ反応液組成は、逆転写反応液５μｌ、プライマーBO-EcoNが５μｌ、プライマーBO-PstCが５μｌ、dNTP mixtureが４μｌ、10X EX Taq bufferが５μｌ、Takara EX Taq DNA polymerase (Takara Biochemicals社製)が０．２５μｌ、蒸留水が３０．７５μｌ、全量５０μｌである。ＰＣＲ反応は変性９４℃、３０秒、アニーリング５０℃、１分、伸長反応７２℃、５分を１サイクルとして２６サイクルの反応を行った。その結果、増幅した１，６２０ｂｐの成熟ビリルビン酸化酵素をコードする遺伝子ＤＮＡ断片を得た。
次に、このＰＣＲ増幅遺伝子断片を制限酵素EcoRI，PstIで消化した後、同酵素で消化し、精製したプラスミドpBluescriptII SK- (Stratagene社製)に連結して、プラスミドpBSBOを作製した。pBSBOの塩基配列はThermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences社製)を用いて、日立SQ5500E型DNA Sequencerにより解析して、ビリルビン酸化酵素遺伝子が既報の配列と同一であることを確認した。
２．ビリルビン酸化酵素のPichia pastoris による異種発現系の構築
前記pBSBOを制限酵素EcoRIおよび Not Iで消化後、アガロースゲル電気泳動により生成物ＤＮＡを分離した後、Prep-A-Gene DNA Purification Kit (Bio-Rad社製)を用いてビリルビン酸化酵素遺伝子断片(1,650 bp、配列番号１)を抽出し精製した。この抽出ＤＮＡ断片を同じ制限酵素で消化し、精製したプラスミドpPIC9K (Invitrogen社製)に連結して酵母形質転換用プラスミド（pPICBO）を作製した。
前記pBSBOを制限酵素EcoRIおよび Not Iで消化後、アガロースゲル電気泳動により生成物ＤＮＡを分離した後、Prep-A-Gene DNA Purification Kit (Bio-Rad社製)を用いてビリルビン酸化酵素遺伝子断片(1,650 bp、配列番号１)を抽出し精製した。この抽出ＤＮＡ断片を同じ制限酵素で消化し、精製したプラスミドpPIC9K (Invitrogen社製)に連結して酵母形質転換用プラスミド（pPICBO）を作製した。
図１に製作したpPICBOの構造略図を示す。図中、符号１は、アンピシリン耐性遺伝子（ampr）であり、符号２は、複製開始点（ColE1ori）であり、符号３は、アルコール酸化酵素遺伝子断片（3'AOX1）であり、符号４は、カナマイシン耐性遺伝子（kanr）であり、符号５は、ヒスチジン生産遺伝子（his4）であり、符号６は、転写終結配列（terminator）であり、符号７は、ビリルビン酸化酵素遺伝子（bo）であり、符号８は、α因子分泌シグナルコード配列（α-signal）であり、符号９は、アルコール酸化酵素遺伝子断片（5'AOX1）である。Multi-Copy Pichia Expression Kit (Invitrogen社製)のマニュアルに従い、pPICBOを制限酵素Bpu1102Iで開環し、エレクトロポレーション法により酵母Pichia pastoris GS115株(Research Corporation Technologies, Inc.社製)を形質転換した。この形質転換酵母はHis+（ヒスチジン非要求性）株である。
３．形質転換菌の培養と形質転換菌のスクリーニング
前記形質転換酵母(His+)の適量をＭＤ寒天平板培地（表１）に塗布し、３０℃で一晩培養し十分生育させた。このプレートに滅菌水を加え形質転換酵母を懸濁後、適量の抗生物質G418を含むＹＰＤ寒天平板培地（表１）に、一枚あたり１０5個の細胞を塗布して３０℃で培養した。
前記形質転換酵母(His+)の適量をＭＤ寒天平板培地（表１）に塗布し、３０℃で一晩培養し十分生育させた。このプレートに滅菌水を加え形質転換酵母を懸濁後、適量の抗生物質G418を含むＹＰＤ寒天平板培地（表１）に、一枚あたり１０5個の細胞を塗布して３０℃で培養した。
２５ｍｇ／ｍｌのG418を含むＹＰＤ寒天平板培地に生育した形質転換酵母を、制限酵素Bpu1102Iで開環したpPICBOにより再度形質転換して、同様の操作により１．５ｍｇ／ｍｌのG418に耐性を示すコロニー（G418高耐性株）をスクリーニングした。
４．組換え型ビリルビン酸化酵素（rBO Pichia ）の発現
前記G418高耐性株を４ｍｌのＹＰＤ液体培地に接種して、試験管中で３０℃、２４時間震盪培養して種培養とした。種培養酵母懸濁液４ｍｌを５００ｍｌ坂口フラスコ中の１００ｍｌのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃で２４時間震盪培養し前培養とした。前培養酵母を遠心分離により集菌して適量のＢＭＭ最小液体培地で再懸濁後、０．２ｍＭのＣｕＣｌ2を含む１ＬのＢＭＭ最小培地（５Ｌ三角フラスコ）に全量を接種した。２４時間ごとに終濃度０．５％のメタノールを発現誘導基質として添加しながら２５℃で５日間震盪培養した。このメタノール誘導により組換え型ビリルビン酸化酵素（rBOPichia）を誘導発現させて培養液中に放出させた。全量１６Ｌの培養液から遠心分離により菌体を除き、培養上清液を回収して粗酵素液とした。
前記G418高耐性株を４ｍｌのＹＰＤ液体培地に接種して、試験管中で３０℃、２４時間震盪培養して種培養とした。種培養酵母懸濁液４ｍｌを５００ｍｌ坂口フラスコ中の１００ｍｌのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃で２４時間震盪培養し前培養とした。前培養酵母を遠心分離により集菌して適量のＢＭＭ最小液体培地で再懸濁後、０．２ｍＭのＣｕＣｌ2を含む１ＬのＢＭＭ最小培地（５Ｌ三角フラスコ）に全量を接種した。２４時間ごとに終濃度０．５％のメタノールを発現誘導基質として添加しながら２５℃で５日間震盪培養した。このメタノール誘導により組換え型ビリルビン酸化酵素（rBOPichia）を誘導発現させて培養液中に放出させた。全量１６Ｌの培養液から遠心分離により菌体を除き、培養上清液を回収して粗酵素液とした。
５．rBO Pichia の精製
前記培養上清液に終濃度３０％の硫酸アンモニウムを添加して、３０％の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）であらかじめ平衡化したTOYOPEARL-Butyl 650Mカラム（φ４．６×１６ｃｍ, TOSOH社製）に重層した。同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液の硫酸アンモニウム濃度を３０％から０％まで変化させる直線濃度勾配法（全容量1 L）によりrBOPichiaを溶出させた。活性画分を集め限外ろ過により濃縮した。次に、濃縮した活性画分を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したHiLoad Superdex 200 pg 26/60カラム（φ２．６×６０ｃｍ, Amersham Biosciences社製）に重層した。同緩衝液を用い流速２ｍｌ／ｍｉｎでゲルろ過クロマトグラフィーを行った。活性画分を集めＳＤＳ電気泳動により純度を検定したところ、分子量６６ｋＤａの単一バンドを確認したことから、本画分を精製酵素標品とした。精製酵素の収量は培養液１Ｌ当たり３０ｍｇであり、従来の方法に比べ非常に簡便に高活性な酵素を大量に得ることが出来た。
前記培養上清液に終濃度３０％の硫酸アンモニウムを添加して、３０％の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）であらかじめ平衡化したTOYOPEARL-Butyl 650Mカラム（φ４．６×１６ｃｍ, TOSOH社製）に重層した。同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液の硫酸アンモニウム濃度を３０％から０％まで変化させる直線濃度勾配法（全容量1 L）によりrBOPichiaを溶出させた。活性画分を集め限外ろ過により濃縮した。次に、濃縮した活性画分を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したHiLoad Superdex 200 pg 26/60カラム（φ２．６×６０ｃｍ, Amersham Biosciences社製）に重層した。同緩衝液を用い流速２ｍｌ／ｍｉｎでゲルろ過クロマトグラフィーを行った。活性画分を集めＳＤＳ電気泳動により純度を検定したところ、分子量６６ｋＤａの単一バンドを確認したことから、本画分を精製酵素標品とした。精製酵素の収量は培養液１Ｌ当たり３０ｍｇであり、従来の方法に比べ非常に簡便に高活性な酵素を大量に得ることが出来た。
６．rBO Pichia のアミノ末端配列と分子量
精製酵素標品１３０ｐｍｏｌを用い、Applied Biosystems Model 476A protein sequencerを用いてアミノ末端配列を決定した。この結果、Y-V-E-F-V-A-Q-I-S-P-Qの配列が得られ、この配列は、pPIC9Kにコードされるα因子分泌シグナルコード配列中のSte13シグナル切断部位から制限酵素EcoRI認識配列に対応するY-V-E-Fの４残基が、ビリルビン酸化酵素成熟タンパク質のアミノ末端配列V-A-Q-I-S-P-Q-に付加した配列に一致した。従って、精製酵素はデザイン通りのアミノ末端配列を有することが明らかになった。精製酵素の分子量をSuperose 12 HR 10/30カラム（φ１．０×３０ｃｍ, Amersham Biosciences社製）を用いて決定したところ、６５ｋＤａとなり、ＳＤＳゲル電気泳動で得られた分子量測定結果である６６ｋＤａとよく一致した。従って精製酵素標品rBOPichiaは単量体の可溶性タンパク質であった。
精製酵素標品１３０ｐｍｏｌを用い、Applied Biosystems Model 476A protein sequencerを用いてアミノ末端配列を決定した。この結果、Y-V-E-F-V-A-Q-I-S-P-Qの配列が得られ、この配列は、pPIC9Kにコードされるα因子分泌シグナルコード配列中のSte13シグナル切断部位から制限酵素EcoRI認識配列に対応するY-V-E-Fの４残基が、ビリルビン酸化酵素成熟タンパク質のアミノ末端配列V-A-Q-I-S-P-Q-に付加した配列に一致した。従って、精製酵素はデザイン通りのアミノ末端配列を有することが明らかになった。精製酵素の分子量をSuperose 12 HR 10/30カラム（φ１．０×３０ｃｍ, Amersham Biosciences社製）を用いて決定したところ、６５ｋＤａとなり、ＳＤＳゲル電気泳動で得られた分子量測定結果である６６ｋＤａとよく一致した。従って精製酵素標品rBOPichiaは単量体の可溶性タンパク質であった。
７．rBO Pichia の分光学的性質
(イ)吸収スペクトル：１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）におけるrBOPichiaの吸収スペクトルを、図２に示した。rBOPichiaのスペクトルは、既報（Gotoh. Y., et al., J. Biochem. 106, 621-626, 1989）のwtBOや従来の組換え型酵素rBOAspergillusのスペクトルと同様に、Cys(S-)からCu2+への電荷移動吸収に対応する６００ｎｍに吸収極大を示し、その分子吸光係数（ε＝４，３００）はwtBOと同様の値を示した。また、タイプ３銅に由来する３３０ｎｍ付近のショルダーピークも観察された。
(イ)吸収スペクトル：１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）におけるrBOPichiaの吸収スペクトルを、図２に示した。rBOPichiaのスペクトルは、既報（Gotoh. Y., et al., J. Biochem. 106, 621-626, 1989）のwtBOや従来の組換え型酵素rBOAspergillusのスペクトルと同様に、Cys(S-)からCu2+への電荷移動吸収に対応する６００ｎｍに吸収極大を示し、その分子吸光係数（ε＝４，３００）はwtBOと同様の値を示した。また、タイプ３銅に由来する３３０ｎｍ付近のショルダーピークも観察された。
(ロ)ＥＰＲスペクトル：１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）におけるrBOPichiaのＥＰＲスペクトルを、図３に示した。rBOPichiaのＥＰＲスペクトルは、rBOAspergillusのスペクトルとよく一致し、タイプ１銅のパラメーターは、g//=2.22、A//=8.33x10-3cm-1、タイプ2銅のパラメーターは、g//=2.31、A//=10.2x10-3cm-1と変化はなかった。
(ハ)原子吸光スペクトル：原子吸光スペクトル分析の結果、rBOPichiaは１分子当たり３．５個の銅イオンを含むことが明らかになった。従って、wtBOおよびrBOAspergillusと同様に、酵素１分子当たりタイプ１銅１個、タイプ２銅１個、タイプ３銅２個の合計４個の銅イオンを全て含んでいると考えられた。以上の分光学的測定結果から、rBOPichiaはwtBOおよびrBOAspergillusと同様の銅活性中心構造を取っていることが明らかとなった。
８．BO Pichia 標品の酵素化学的諸性質
（ア）酵素活性：酵素活性は、５０ｍＭ Tris−Ｈ2ＳＯ4緩衝液（ｐＨ７．８）／３０μＭビリルビンの基質溶液を用い、３７℃で４４０ｎｍの吸収の減少の経時変化をモニターすることにより測定した。１分間において１μｍｏｌのビリルビンを酸化する酵素量を１unitと定義した。また、タンパク質の定量には、BCA Protein Assay Reagent(PIERCE社製)を用い、ウシ血清アルブミンを標準として作成した検量線により濃度を決定した。精製したrBOPichiaの活性は２６Ｕ／ｍｇであり、既報のwtBOおよびrBOAspergillusと同等以上の活性を示した。また、反応速度の基質濃度依存性を検討したところ、図４に示すようなシグモイド型の曲線を示した。また、Hillプロットから、rBOPichiaはHill定数１．５６を示し、Hill定数１．１４のwtBOと比較して高い正の協同性を示すことが明らかになった。
（ア）酵素活性：酵素活性は、５０ｍＭ Tris−Ｈ2ＳＯ4緩衝液（ｐＨ７．８）／３０μＭビリルビンの基質溶液を用い、３７℃で４４０ｎｍの吸収の減少の経時変化をモニターすることにより測定した。１分間において１μｍｏｌのビリルビンを酸化する酵素量を１unitと定義した。また、タンパク質の定量には、BCA Protein Assay Reagent(PIERCE社製)を用い、ウシ血清アルブミンを標準として作成した検量線により濃度を決定した。精製したrBOPichiaの活性は２６Ｕ／ｍｇであり、既報のwtBOおよびrBOAspergillusと同等以上の活性を示した。また、反応速度の基質濃度依存性を検討したところ、図４に示すようなシグモイド型の曲線を示した。また、Hillプロットから、rBOPichiaはHill定数１．５６を示し、Hill定数１．１４のwtBOと比較して高い正の協同性を示すことが明らかになった。
(イ)至適ｐＨとｐＨ安定性：イオン強度を０．２Ｍに調整したMES-Bicine-CAPS混合緩衝液を用い、ｐＨ６〜ｐＨ１１における反応速度をプロットしたところ、図５に示すようにrBOPichiaとwtBOの両方でｐＨ７．５付近を頂点としたベル型の曲線が得られ、両酵素の至適ｐＨは一致した。また、同じ緩衝液（ｐＨ４〜ｐＨ１２）を用い、２５℃、１０分の処理におけるrBOPichiaのpH安定性をwtBOと比較した結果、図６に示すように、両酵素ともｐＨ６〜ｐＨ１１において失活は見られず、このｐＨ域で安定であることが明らかになった。
(ウ)熱安定性：５０ｍＭ Tris−Ｈ2ＳＯ4緩衝液（ｐＨ ７．８）におけるrBOPichiaの熱安定性を調べた結果、野生型酵素で失活が起こる５０℃、１０分間の処理ではrBOPichiaの活性の低下は観察されなかった。また、５０ｍＭTris−Ｈ2ＳＯ4緩衝液（ｐＨ７．８）中、６０℃の熱処理における酵素活性の経時変化を検討した結果、rBOPichiaの活性半減期(t1/2)は９０分と長く、wtBOの１５分の６倍の値である。これらの結果より、rBOPichiaはwtBOより高い熱安定性を有することが明らかである。
以上に示した如く、本発明の組換え型ビリルビン酸化酵素の製造方法によれば、野生型酵素または従来の手法により製造された組換え型酵素に比べ熱に安定な組換え型酵素を簡便に且つ大量に製造できることが明らかとなった。また、本発明の組換え型ビリルビン酸化酵素が示した安定性は、分子量測定及びアミノ酸配列分析等により解析した結果、糖鎖修飾の違いによって生じているものと考えられた。
また、本発明の組換え型ビリルビン酸化酵素は、従来の野生型酵素と比べて安定性が高い為、臨床検査用試薬として水溶液中、特に血液、血清、血漿、胆汁液または尿中に含まれるビリルビンの定量を行う際に極めて有用である。
１ アンピシリン耐性遺伝子（ampr）
２ 複製開始点（ColE1ori）
３ アルコール酸化酵素遺伝子断片（3'AOX1）
４ カナマイシン耐性遺伝子（kanr）
５ ヒスチジン生産遺伝子（his4）
６ 転写終結配列（terminator）
７ ビリルビン酸化酵素遺伝子（bo）
８ α因子分泌シグナルコード配列(α-signal）
９ アルコール酸化酵素遺伝子断片（5'AOX1）
２ 複製開始点（ColE1ori）
３ アルコール酸化酵素遺伝子断片（3'AOX1）
４ カナマイシン耐性遺伝子（kanr）
５ ヒスチジン生産遺伝子（his4）
６ 転写終結配列（terminator）
７ ビリルビン酸化酵素遺伝子（bo）
８ α因子分泌シグナルコード配列(α-signal）
９ アルコール酸化酵素遺伝子断片（5'AOX1）
Claims (4)
- 組換え型ビリルビン酸化酵素であり、配列番号１記載の不完全糸状菌ミロテシウムベルカリアＭＴ−１（Myrothecium verrucaria MT-1）由来ビリルビン酸化酵素遺伝子をピキア（pichia）属の酵母であるPichia pastoris GS115株に導入し発現させて得られ、アミノ末端配列がY-V-E-F-V-A-Q-I-S-P-Qであることを特徴とするビリルビン酸化酵素。
- 組換え型ビリルビン酸化酵素を製造する方法であり、配列番号１記載の不完全糸状菌ミロテシウムベルカリアＭＴ−１（Myrothecium verrucaria MT-1）由来ビリルビン酸化酵素遺伝子を、ピキア（pichia）属の酵母であるPichia pastoris GS115株を宿主動物として導入し形質転換を行うことを特徴とするビリルビン酸化酵素の製造方法。
- 請求項１記載のビリルビン酸化酵素を用いて水溶液中のビリルビンを定量することを特徴とするビリルビンの定量測定方法。
- 前記水溶液が血液、血清、血漿、胆汁液または尿であることを特徴とする請求項３記載のビリルビンの定量方法。
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