JP4481527B2

JP4481527B2 - Microorganism measuring device

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Publication number: JP4481527B2
Application number: JP2001166807A
Authority: JP
Inventors: 彰守川; 健一稲富
Original assignee: Mitsubishi Electric Corp
Current assignee: Mitsubishi Electric Corp
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2021-06-01
Also published as: JP2002355024A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被測定試料（試料液）に含まれている微生物の存在態様ないしは数、あるいは被測定試料の微生物汚染の程度等を、高精度かつ低コストで迅速に検出ないしは測定することが可能な微生物測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
液状の被測定試料に含まれている微生物の数ないしは濃度を測定する方法としては、従来、寒天培地上に微生物のコロニー（集落）を形成させ、このコロニーの数を数えることにより微生物数を計測するといった方法（以下、「コロニー計数法」と呼ぶ。）が広く用いられている。このコロニー計数法は、例えば被測定試料そのものまたは該被測定試料の希釈液を、寒天培地上に微生物が均一に分散するように塗布し、または混釈を行い、栄養分を含む培地上で該微生物を培養することにより各微生物を判別可能な大きさのコロニーにまで増殖させてコロニー数を計数し、このコロニー数から微生物数を得るといった手法である。しかし、コロニー計数法では、一般に２０時間以上の培養時間を必要とするので、微生物数の測定を迅速かつ自動的に行うことは不可能であるといった問題がある。
【０００３】
そこで、近年、微生物種が特異的に持つ酵素の活性を測定し、その測定結果に基づいて微生物数の計数を迅速に行うようにした微生物測定方法が提案されている。例えば、対象とする微生物が大腸菌群に属する細菌（以下、「大腸菌群」と略称する。）の場合、大腸菌群が持つ酵素であるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの加水分解特性を測定することにより大腸菌群数を計測するといった測定方法が提案されている。
【０００４】
具体的には、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素触媒作用により惹起されるオルトニトロフェノール−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）の酵素加水分解により生成されたオルトニトロフェノールの黄色着色による吸光光度を検出するといった測定方法や、同じくβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素触媒作用により惹起される、蛍光酵素基質である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４−ＭＵＧ）の酵素加水分解により生成された４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）の蛍光強度を測定するといった測定方法が提案されている。これらはいずれも酵素反応の速度を測定することにより大腸菌群数を測定することができる。
【０００５】
蛍光酵素基質を用いる従来の大腸菌群数測定法では、例えば米国特許第５,２９２,６４４号あるいは米国特許第５,５１８,８９４号等に開示されているように、被測定試料中に含まれている大腸菌群を、該大腸菌群が通過できないフィルタ上にろ過操作等により濃縮して保持させ、大腸菌群を保持しているフィルタを、蛍光酵素基質を含む試薬溶液と接触させ、大腸菌群が保持している酵素により分解された蛍光物質の量を測定することにより、大腸菌群数を測定することができる。この測定方法では、フィルタ上に大腸菌群を捕捉して濃縮することにより検出感度の向上を図るようにしている。
【０００６】
また、フローインジェクション法を用いて水中の物質濃度を測定するといった測定方法（分析方法）も知られている。例えば特開平９−９０３６６号公報には、フローインジェクション法を用いてアンモニウムイオン濃度を定量するようにした測定方法が開示されている。この測定方法では、反応試薬の注入により試薬溶液（次亜塩素酸ナトリウム）を流路用細管中で連続して流下させながら、この流れの中にアンモニウムイオンを含む試料水を定流量ポンプの駆動により連続投入し、これと同時に空気を定流量ポンプの駆動により連続投入し、これらを混合コイル内で反応させるようにしている。そして、得られた反応生成物を、気化分離器により気体として分離した上で、これを加熱酸化炉により一酸化窒素に酸化する。さらに、この一酸化窒素をオゾンと反応させた時に生じる化学発光強度を検出し、その信号強度の出力を変換・演算することにより、信号強度をアンモニウムイオン濃度に換算する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、例えば米国特許第５,２９２,６４４号あるいは米国特許第５,５１８,８９４号等に開示されている従来の大腸菌群数測定方法では、大腸菌群を一旦フィルタ上に濃縮して保持させた後で蛍光酵素基質と反応させて測定を行うため、測定操作が非常に煩雑であり、測定装置の構成が複雑なものとなり、連続測定が困難となるといった問題がある。
【０００８】
また、蛍光酵素基質法を用いる場合は、蛍光を検出する検出部において蛍光物質を励起させる光源として一般的に使われているキセノンランプの寿命は１０００時間程度しかない。このため、連続測定を行う場合は、頻繁にランプを取り換える必要があり、メンテナンス面で大きな負荷となるといった問題がある。
【０００９】
フローインジェクション法を微生物数の測定に用いる場合は、反応試薬に含まれている成分、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドのような蛍光酵素基質が一般に水に溶けにくい物質であるため、これを単純に混合部において混合しても、試料水に溶かすことは困難である。このため酵素加水分解反応が起きにくくなり、感度が低下するといった問題がある。
【００１０】
また、蛍光酵素基質は一般に熱ないしは高温に弱く、他方界面活性剤を高濃度に含む液体は低温では凝結することがある。このため、蛍光酵素基質と界面活性剤とを予め混合した溶液を利用する場合、測定装置を設置する環境によっては反応試薬が変質して所定の反応を行わせることができなくなり、感度が低下するといった問題がある。
【００１１】
一般に、触媒酵素反応を行わせる温度は３０℃以上であるが、試料水の温度はそれより低く２５℃以下のことが多いので、反応試薬と混合する際には試料水の温度を上げなければならない。しかしながら、反応部内では試料水の温度は急には上がらないので、直ちに触媒酵素反応を行うことができない。このため、微生物測定の感度が低下するか、あるいは測定時間が長くなるといった問題がある。
【００１２】
また、大腸菌群が持つ酵素であるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素加水分解特性を測定するようにした従来の測定方法では、例えば下水の処理水について測定を行う場合は大腸菌群以外のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを持つ微生物、例えば真菌類（カビを含む）や糸状菌が処理水中に存在するので、試料水にこれらが存在すると、測定誤差が生じるといった問題がある。
【００１３】
さらに、試料水には微生物測定を妨害する濁度成分が混入していることがあるが、これらが混入した試料水を測定すると測定誤差が生じる。また、検出部のフローセルに汚れが付着するので、頻繁に感度を補正する必要がある。このため、メンテナンス面での負荷が大きくなるといった問題がある。
【００１４】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされたものであって、フローインジェクション法により液中の微生物の存在態様、数等を測定する際に、長時間にわたるメンテナンスフリーの連続測定が可能であり、濁度成分等の妨害要因の影響を受けず、高感度で迅速に測定を行うことができる簡便な微生物測定装置を提供することを目的ないしは解決すべき課題とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するためになされた本発明の第１の態様にかかる微生物測定装置は、（ｉ）第１の反応試薬と微生物を含む試料液とをポンプの駆動により混合する第１の混合部と、第１の混合部の後段（下流側）において第１の反応試薬と前記微生物がもつ物質との反応を行わせる反応部と、反応部の後段（下流側）において前記反応の生成物の検出を行う検出部とが設けられているフローインジェクション方式の微生物測定装置において、（ii）反応部を所定温度に保持する保温手段と、（iii）第１の反応試薬と試料液との混合物を反応部に所定時間留まらせておき、該混合物が所定の量で検出部に送られるよう該混合物の流れを制御する制御手段とが設けられていることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明の第２の態様にかかる微生物測定装置は、制御手段が、前記混合物の一部が断続的（間欠的）または連続的に順次検出部に送られるよう該混合物の流れを制御するようになっていることを特徴とするものである。
【００１７】
本発明の第３の態様にかかる微生物測定装置は、第１の反応試薬が、前記反応により蛍光を発する物質を生成する物質、水素イオン濃度を一定にする緩衝液および界面活性剤のうちの少なくとも１つを含有することを特徴とするものである。
【００１８】
本発明の第４の態様にかかる微生物測定装置は、反応部がコイル状の管で形成されていることを特徴とするものである。
【００１９】
本発明の第５の態様にかかる微生物測定装置は、検出部が、蛍光光度計であって、励起光源として、紫外線ランプ、ブラックライトまたはキセノンフラッシュランプのいずれかを用いることを特徴とするものである。
【００２０】
本発明の第６の態様にかかる微生物測定装置は、反応部と検出部との間に、検出部の感度を高める第２の反応試薬を注入する第２の混合部が設けられていることを特徴とするものである。
【００２１】
本発明の第７の態様にかかる微生物測定装置は、反応部と検出部との間に、第１の反応試薬と前記微生物がもつ前記物質との反応を停止させる第２の反応試薬を注入する第２の混合部が設けられていることを特徴とするものである。
【００２２】
本発明の第８の態様にかかる微生物測定装置は、第１の混合部または反応部において、その管径と、第１の反応試薬と試料液との混合物の流速とが、レイノルズ数が１０００以上（好ましくは２０００以上）となるように設定または制御されることを特徴とするものである。
【００２３】
本発明の第９の態様にかかる微生物測定装置は、反応部において、第１の反応試薬と試料液との混合物の流速が、反応温度におけるレイノルズ数が１０００以上（好ましくは２０００以上）となるように設定されることを特徴とするものである。
【００２４】
本発明の第１０の態様にかかる微生物測定装置は、第１の混合部の前段において試料液を一旦貯留する貯留槽と、該貯留槽および第１の混合部の少なくとも一方を所定温度に保持する手段とが設けられていることを特徴とするものである。
【００２５】
本発明の第１１の態様にかかる微生物測定装置は、第１の反応試薬を保留する容器を所定温度に保持する容器用保温手段が設けられていることを特徴とするものである。
【００２６】
本発明の第１２の態様にかかる微生物測定装置は、容器用保温手段が、第１の反応試薬の温度を１０℃以上２０℃以下に保持するようになっていることを特徴とするものである。
【００２７】
本発明の第１３の態様にかかる微生物測定装置は、第１の混合部の前段に、測定対象となる微生物を通過させる一方、測定対象外の微生物または浮遊性粒子物質を通過させない第１のフィルタ部が設けられていることを特徴とするものである。
【００２８】
本発明の第１４の態様にかかる微生物測定装置は、第１の混合部の前段に、前記すべての微生物を通過させない第２のフィルタ部と、第２のフィルタ部とは別流路をなす配管と、第２のフィルタ部と前記配管とについて流路を切り換える切換え弁とが設けられていることを特徴とするものである。
【００２９】
本発明の第１５の態様にかかる微生物測定装置は、第１の混合部の前段に、第１のフィルタ部とは別流路をなし前記すべての微生物を通過させない第２のフィルタ部と、第１のフィルタ部と第２のフィルタ部とについて流路を切り換える切換え弁とが設けられていることを特徴とするものである。
【００３０】
本発明の第１６の態様にかかる微生物測定装置は、反応部における前記反応が触媒酵素反応であり、第１の反応試薬が、測定対象となる微生物の触媒酵素反応を阻害せず、測定対象外の微生物の触媒酵素反応を阻害する抗生物質を含有していることを特徴とするものである。
【００３１】
【発明の実施の形態】
実施の形態１．
以下、本発明の実施の形態１を説明する。
図１は、本発明の実施の形態１にかかる微生物測定装置のシステム構成図である。この微生物測定装置は、下水処理における塩素またはオゾンによる消毒前の水を試料水として用い、試料水中の大腸菌群の濃度を測定するようになっている。なお、この実施の形態１にかかる微生物測定装置は、下水中の大腸菌群の濃度を測定することを主たる目的としているが、その測定対象はこれに限られるわけではなく、例えば大腸菌群以外の一般微生物の数ないしは濃度等を測定する場合にも適用可能である。
【００３２】
図１に示すように、この微生物測定装置においては、槽１内で滞留または流動している試料水が、配管２ａ及び配管２ｂを介して、ポンプ３によって貯水槽４に供給されるようになっている。ここで、貯水槽４は、試料水をオーバーフローさせる機構を有し、貯水槽４の余剰の試料水は配管５を介して槽１に返送されるようになっている。ベルヌイの定理からも理解されるように、槽１の試料水を採取する高さにより、ポンプ３周辺の配管２ａ、２ｂの内圧が変わる。したがって、貯水槽４を設けず、配管２ｂを直接的に測定装置本体側に接続すると、測定装置内の試料水流量を、予め設定された値に維持できなくなるおそれがある。そこで、試料水を一旦大気圧下に置くために、大気圧開放式の貯水槽４が設けられている。
【００３３】
貯水槽４内の試料水中には、配管６の一端（下端）が差し込まれ、配管６の他端（上端）は第１三方電磁弁７の第１の接続端に接続されている。そして、第１三方電磁弁７の第２の接続端は配管８の一端に接続され、配管８の他端はイオン交換水保管容器９に接続されている。また、第１三方電磁弁７の第３の接続端は、ペリスタポンプ１１が介設された配管１０の一端に接続され、配管１０の他端は第１混合部１２の第１の流入口に接続されている。
【００３４】
イオン交換水保管容器９に貯留されているイオン交換水は、該微生物測定装置の感度校正や配管内部の洗浄を行う時に使用される。第１三方電磁弁７は、電圧が印加されない通常状態ではａ−ｂ側を連通させるように設定されているが、電圧が印加されて作動させられたときにはａ−ｂ’側を連通させる。第１混合部１２としては、通常、Ｔ字型またはＹ字型の三方管が用いられる。ここで、混合特性を向上させるためにオリフィスを利用してもよいが、この場合は配管内部の圧力が高くなる。したがって、第１混合部１２の混合特性と、ペリスタポンプ１１のトルクと、配管系の耐圧とのバランスを考慮して、三方管およびオリフィスのどちらかを選択すればよい。
【００３５】
また、この微生物測定装置には、混合試薬容器１３と校正用混合試薬容器１４とが設けられている。混合試薬容器１３に貯留されている混合試薬は、蛍光酵素基質として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、「４−ＭＵＧ」という。）を含有し、反応時の水素イオン濃度を一定に保持するリン酸緩衝液を含有し、かつ微生物の細胞膜を軟化させて細胞内の酵素であるβ−ガラクトシダーゼが容易に４−ＭＵＧと反応することを可能にする役割と後段で蛍光強度を測定する際の感度向上の役割とを果たす界面活性剤としてラウリル硫酸ナトリウムを含有している。混合試薬容器１３には配管１５の一端が接続され、配管１５の他端は第２三方電磁弁１６の第１の接続端に接続されている。
【００３６】
校正用混合試薬容器１４には、該微生物測定装置の校正用の、蛍光物質と緩衝液と界面活性剤との混合液が貯留されている。ここで、蛍光物質としては４−メチルウンベリフェロンが用いられている。なお、緩衝液および界面活性剤は、混合試薬容器１３内の混合試薬の場合と同様である。校正用混合試薬容器１４には配管１７の一端が接続され、配管１７の他端は第２三方電磁弁１６の第２の接続端に接続されている。また、第２三方電磁弁１６の第３の接続端は、ペリスタポンプ１９が介設された配管１８の一端に接続され、配管１８の他端は二方電磁弁２０の第１の接続端に接続されている。第２三方電磁弁１６は、電圧が印加されない通常状態ではｃ−ｄ側を連通させるように設定されているが、電圧が印加されて作動させられたときにはｃ−ｄ’側を連通させる。
【００３７】
二方電磁弁２０は、電圧が印加されない通常状態では閉じているが、電圧が印加されると開くように設定されている。なお、二方電磁弁２０の第２の接続端は配管２１の一端に接続され、配管２１の他端は第１混合部１２の第２の流入口に接続されている。第１混合部１２の出口部は配管２２の一端に接続され、配管２２の他端は第１反応部２３の上流端に接続されている。
【００３８】
なお、前記各配管の材質であるが、ペリスタポンプ１１、１９が介設されていない配管２ａ、２ｂ、６、８、１５、１７、２１は、一般的で安価なシリコンチューブやタイゴンチューブなどでもよい。しかしながら、ペリスタポンプ１１、１９が介設されている配管１０、１８は、該ペリスタポンプが指定する肉厚のある専用チューブが用いられる。第１反応部２３は、一般にテフロンと称されるフッ素系樹脂からなる管をコイル状に成形したものであり、その大部分は恒温槽２４内に収容されている。なお、管内径は１.６ｍｍである。
【００３９】
このように第１反応部２３をコイル状に成形するのは、第１反応部２３およびこれを収納する恒温槽２４の省スペース化を図り、かつ試料水と混合試薬との混合攪拌を促進して感度を向上させるためである。恒温槽２４は一定の温度に保たれる。ここでは、大腸菌群の測定であるため、この温度は３７℃とされているが、測定対象とする微生物に応じて変化する。第１反応部２３の下流端は、第２混合部２５の第１の流入口に接続されている。
【００４０】
また、該微生物測定装置にはアルカリ液容器２６が設けられ、このアルカリ液容器２６内にはアルカリ液が貯留されている。ここでは、アルカリ液として、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液が用いられている。アルカリ液容器２６には、ペリスタポンプ２８が介設された配管２７の一端（下端）が接続され、この配管２７の他端（上端）は二方電磁弁２９の第１の接続端に接続されている。なお、二方電磁弁２９の第２の接続端は配管３０の一端に接続され、配管３０の他端は第２混合部３０の第２の流入口に接続されている。二方電磁弁２９は電圧が印加されていない通常状態では閉じているが、電圧が印加されると開くように設定されている。
【００４１】
第２混合部２５の構造は、第１混合部１２と同様である。また配管２７、３０の材料には、水素イオン濃度（以下、「ｐＨ」という。）が１３以上といった強アルカリに耐えられるようなものが使用されている。第２混合部２５の流出口には、第２反応部３１の上流端が接続されている。第２反応部３１は、第１反応部２３と同様の、テフロンからなるコイル状の構造のものであるが、長さは０.５ｍ以下でよい。第２反応部３１の下流端は検出部３２内のフローセル３３の上端部に接続されている。
【００４２】
この検出部３２において、励起光源である励起用ランプ３４には、キセノンランプが使用されている。また、検出部３２には、励起光及び蛍光の波長スペクトルのうち有効な波長のみを通過させるバンドパス式のフィルタ３５、３６（光学フィルタ）と、フローセル３３で発生した蛍光を検出する光電子増倍管３７とが設けられている。なお、フィルタの３５、３６の代わりにモノクロメータを利用してもよいが、ここでは急峻かつ単色に近いフィルタ特性である必要性はないので、明るさの大きいフィルタであるのが好ましい。また、蛍光の励起波長は３６０ｎｍに設定され、蛍光測定波長は４５０ｎｍに設定されている。フローセル３３の下端部には配管３８の一端が接続され、この配管３８の他端は廃液容器３９に接続されている。
【００４３】
光電子増倍管３７の出力は、ケーブル４０を介してＡＤ変換ボード４１に入力され、ここでデジタル信号に変換され、この後ケーブル４２を介してコンピュータ４３に入力される。さらに、ケーブル４４を介してＲＳ−２３２Ｃ形式によりコンピュータ４３と接続されるシーケンサ４５が設けられている。このシーケンサ４５は、ポンプ３、各三方電磁弁７、１６、各二方電磁弁２０、２９および各ペリスタポンプ１１、１９、２８の動作／停止を制御するようにプログラムされている。コンピュータ４３は、シーケンサ４５に測定開始トリガの発信を行い、シーケンサ４５の状態監視およびデータ処理の役割を果たしている。
【００４４】
以下、上記構成を備えた微生物測定装置の測定動作を説明する。この測定動作においては、ポンプ３により槽１から消毒前の水が試料水として吸引され、この試料水は貯水槽４に一旦保持される。なお、貯水槽４をオーバーフローした試料水は、配管５を介して槽１に返送される。そして、両三方電磁弁７、１６が、それぞれ、ａ−ｂ側とｃ−ｄ側とが連通するように切り換えられ（ないしはセットされ）、二方電磁弁２０が開かれ、両ペリスタポンプ１１、１９が駆動される（動作する）。かくして、試料水と混合試薬とが、第１混合部１２ないし配管２２で混合された後、第１反応部２３に送られる。第１反応部２３の配管内には、前回測定した時の試料水が残留しているので、これが今回測定すべき試料水で完全に置換されるまで、両ペリスタポンプ１１、１９が駆動される。
【００４５】
このようにして前回の試料水が完全に置換された状態で両ペリスタポンプ１１、１９が停止され、二方電磁弁２０が閉じられる。この時点が酵素触媒反応の開始時とされ、この時点でタイマの保持値（カウント値）が０分に設定（セット）される。以下では、このタイマが保持する時間を「反応〜分時」と呼ぶことにする。例えば、タイマがカウントを開始してから１分後の時点を「反応１分時」と呼ぶ。第１反応部２３では、大腸菌群が持つβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの触媒加水分解反応により、４−ＭＵＧはガラクトースと４−メチルウンベリフェロンとに分解される。
【００４６】
かくして、タイマが反応１分時となったときに、二方電磁弁２０が閉じられた状態で、二方電磁弁２９が開かれる。そして、両ペリスタポンプ１１、２８が駆動され、第２反応部３１とフローセル３３とに反応液が送液される。アルカリ液容器２６から吸引され、第２混合部２５を経由して第２反応部３１に供給される水酸化ナトリウム溶液により、第１反応部２３から第２混合部２５を介して第２反応部３１に送られる反応液はアルカリ性となり、これにより酵素触媒反応は停止する。
【００４７】
なお、両ペリスタポンプ１１、２８の駆動時間（動作時間）は、第２反応部３１とフローセル３３とに反応液が十分に行き渡るまでの時間とされているので、第１反応部２３内の全反応液のうちの一部のみが第２反応部３１とフローセル３３とに送られることになる。励起用ランプ３４（キセノンランプ）から発せられた光は、フィルタ３５により３６０ｎｍ付近を中心強度とする励起光となって、フローセル３３内の反応液に照射される。これにより、反応液中の４−メチルウンベリフェロンが励起され、４５０ｎｍ付近の蛍光が発せられる。この蛍光は光電子増倍管３７によって検出され、その出力はＡＤ変換ボード４１によりアナログ信号からデジタル信号に変換される。変換された信号の強度は、コンピュータ４３によりデータとして記録される。
【００４８】
以上が反応１分時における微生物測定装置の動作であるが、反応１０分時、反応２０分時、反応３０分時にもこれと同様の動作が行われる。すなわち、二方電磁弁２０が閉じられ、二方電磁弁２９が開かれた状態で、ペリスタポンプ１１、２８が駆動され、第２反応部３１およびフローセル３３に残留している反応液が順次一定量ずつ送液される。その後の動作については、反応１分時の場合と同様である。フローセル３３から排出された液は、配管３８を介して廃液容器３９に導かれ、ここに貯留される。この廃液はアルカリ性であるため、廃棄するときは、塩酸などで中和して下水管に放流する必要がある。
【００４９】
以上の動作における微生物測定装置の効果を説明する。上記動作により、反応１分時、反応１０分時、反応２０分時、反応３０分時の蛍光強度が自動的にコンピュータ４３に記録される。コンピュータ４３は、Ｃ、ＢＡＳＩＣ、ＦＯＲＴＲＡＮ等のプログラミング言語を用いたプログラムにより自動的に動作ないしは演算を行うようになっている。したがって、３０分間の４−メチルウンベリフェロンの生成速度を計算することができる。この生成速度は試料水に元々含まれていたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの量に比例する。
【００５０】
このため、４−メチルウンベリフェロンの生成速度を観測することにより、あらかじめ設定された検量線から、大腸菌群数を計算して求めることができる。なお、検量線は従来の寒天培養法によって測定された大腸菌群数と４−メチルウンベリフェロン生成速度との関係（検量性）を示すものであり、該当する試料水の採取現場で過去に取得したデータ等に基づいて、実際に測定して求めるのが望ましい。
【００５１】
実施の形態２．
以下、本発明の実施の形態２を説明する。なお、実施の形態２にかかる微生物測定装置の基本構成ないしは機械的構成は、図１に示す実施の形態１にかかる微生物測定装置のそれと同様であり、その動作が異なるだけである。そこで、説明の重複を避けるため、以下では主として実施の形態１と異なる部分について説明する。
【００５２】
実施の形態２にかかる微生物測定装置では、実施の形態１にかかる微生物測定装置における動作の途中で、タイマの保持値が０分に設定されたとき、すなわち反応０分時となったときに二方電磁弁２０が閉じられ、二方電磁弁２９が開かれる。そして、ペリスタポンプ１１、２８が駆動され、第２反応部３１とフローセル３３とに反応液が順次連続的に送液される。実施の形態１においては、反応液の送液は、反応１分時、反応１０分時、反応２０分時、反応３０分時と断続的であったが、実施の形態２では、反応液が連続的に送液される。実施の形態２は、実施の形態１とこの点で異なる。
【００５３】
そして、実施の形態２では、各ペリスタポンプ１１、２８の流量は、実施の形態１の場合よりも小さい値に設定される。具体的には、この流量は、反応３０分時においても第１反応部２３に反応０分時の反応液が多少残存するように設定される。また、検出部３２における４−メチルウンベリフェロンを検出する動作も連続的に行われる。このようにして得られる４−メチルウンベリフェロン生成速度は断続的なデータではなく連続的なものとなる。このため、実施の形態２では、実施の形態１の場合よりも、データの変動誤差が小さくなるといった利点がある。
【００５４】
実施の形態３．
以下、本発明の実施の形態３を説明する。なお、実施の形態３にかかる微生物測定装置の基本構成ないしは機械的構成は、図１に示す実施の形態１ないし実施の形態２にかかる微生物測定装置の場合とほぼ同様であり、励起用ランプの構成が異なるだけである。そこで、説明の重複を避けるため、以下では主として実施の形態１ないし実施の形態２と異なる部分について説明する。
【００５５】
実施の形態３では、励起用ランプ３４として、キセノンランプよりも長寿命な紫外線ランプが使用されている。キセノンランプの寿命は１０００時間程度であるので、連続して微生物測定装置を運転した場合、頻繁にランプを交換しなければならない。このため、ランプの交換作業に手間がかかり、メンテナンスの負荷が大きくなる。一方、紫外線ランプでは、長寿命のものでは１００００〜２００００時間の寿命を確保できるので、メンテナンスの手間が大幅に軽減される。なお、紫外線ランプは、３６０〜３８０ｎｍ付近に測定に十分な輝度のピークがある仕様のものであればよく、キセノンランプが発するような、短波長の紫外領域の光は、実施の形態３では不要である。
【００５６】
また、紫外線ランプの他に、ブラックライトも使用することが可能である。なお、長寿命で測定に十分な３６０ｎｍ付近の光を放出する光源であれば、これら以外ものでも使用することが可能であるのはいうまでもない。実施の形態３にかかる微生物測定装置の動作は、実施の形態１ないし実施の形態２の場合とほぼ同様であるので、その説明を省略する。
【００５７】
実施の形態４．
以下、本発明の実施の形態４を説明する。なお、実施の形態４にかかる微生物測定装置の基本構成ないしは機械的構成は、図１に示す実施の形態１ないし実施の形態２にかかる微生物測定装置の場合と同様であり、その動作ないしは効果が異なるだけである。そこで、説明の重複を避けるため、以下では主として実施の形態１ないし実施の形態２と異なる部分について説明する。
【００５８】
実施の形態４にかかる微生物測定装置では、ポンプ３により槽１から消毒前の水が試料水として吸引され、この試料水は貯水槽４に一旦保留される。なお、貯水槽４をオーバーフローした試料水は、配管５を介して槽１に返送される。かくして、測定時には、両三方電磁弁７、１６が、それぞれ、ａ−ｂ側とｃ−ｄ側とに切り換えられる（セットされる）。そして、二方電磁弁２０が開かれ、ペリスタポンプ１１、１９が駆動される。両ペリスタポンプ１１、１９の流量は、配管２２ないし第１反応部２３内における反応液のレイノルズ数が１０００以上となるように設定される。
【００５９】
例えば、配管２２および第１反応部２３の管内径が０.６ｍｍであり、ペリスタポンプ１１の流量が２０ｍＬ／分であり、ペリスタポンプ１９の流量が３ｍＬ／分である場合は、温度４０℃の水の粘性係数が０.６５９２ｍＰａ・ｓであるので、次の式１により、レイノルズ数は約１０００となる。
レイノルズ数＝(密度)×(流速)×(管内径)／(粘性係数)…………式１
【００６０】
直管内における液体の流れについては、レイノルズ数を２０００以上、好ましくは３０００以上とした場合は、管内が乱流状態となることが理論的に示されるが、この場合は試料水と混合試薬とが十分に混合され、酵素加水分解反応の加水分解速度が最大となる。ただし、実施の形態４にかかる微生物測定装置では、配管２２から第１反応部２３に至る管路は直管のみで構成されているのではなく、第１反応部２３はコイル状に形成されているので、実際には第１反応部２３も攪拌・混合機能を有している。したがって、第１反応部２３の形状とレイノルズ数の増加のそれぞれが、攪拌・混合作用を増大させるが、このように撹拌・混合作用を向上させることにより、該微生物測定装置が高感度となり、大腸菌群数の測定する下限値が向上するといった利点がある。
【００６１】
図２は、実施の形態４にかかる微生物測定装置を利用して、同じ試料水についてその流量のみを変化させて実験的に測定を行った場合の結果を示すグラフである。図２において、横軸はレイノルズ数を示しているが、ここでは流量のみを変化させているので、横軸の値は流量または流速に比例する。また、縦軸は４-メチルウンベリフェロンの生成速度、すなわちβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性値を示しており、この数値が高いほど高感度であると考えられる。図２によれば、レイノルズ数が上昇するのに伴って感度が上昇してゆくことがわかる。
【００６２】
レイノルズ数を大きくするには、試料水の流量を大きくするか、管内径を小さくするか、水温を高くすればよい。しかしながら、あまり流量を大きくし管内径を小さくすると、両ペリスタポンプ１１、１９に対する要求性能が高くなり、両ペリスタポンプ１１、１９が大型化する。さらに、管内圧が上昇し、反応液が漏れるなどといったトラブルの発生原因となる。また、５０℃以上といった水温の過度の上昇は、酵素加水分解反応を低下させ、場合によってはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ自体の分解が起こるので、好ましくない。したがって、レイノルズ数を大幅に大きくすることは、現状では困難である。
【００６３】
実施の形態５．
以下、図３を参照しつつ、本発明の実施の形態５を説明する。ただし、図３に示す実施の形態５にかかる微生物測定装置は、図１に示す実施の形態１〜３にかかる微生物測定装置と多くの共通点を有する。そこで、説明の重複を避けるため、図３に示す微生物測定装置において、図１に示す微生物測定装置と共通する部材ないしは構成要素には図１の場合と同一の番号を付し、それらの個々の説明は省略する。
【００６４】
図３に示すように、実施の形態５にかかる微生物測定装置では、恒温槽２４の内部に、配管２２と第１混合部１２と貯水槽４とが収容されている。酵素加水分解反応は、温度によって著しい影響を受ける。このため、図１に示す微生物測定装置では、とくに冬季などにおいて試料水が低温の場合は、測定を開始して試料水と混合試薬とを第１反応部２３に送液した時点では、管内の水温はまだ低いままであり、酵素加水分解反応が著しく低くなる。
【００６５】
なお、この場合でも、恒温槽２４の機能ないしは作用により、ある程度時間が経過すれば、水温は第１反応部２３の全体にわたって所定の値となるが、感度の低下あるいは季節による測定誤差が生じるので、好ましいことではない。しかしながら、この実施の形態５では、配管２２と貯水槽４とが恒温槽２４内に収容されているので、上記欠点が緩和され、測定誤差が減少するといった利点がある。ただし、この場合、恒温槽２４が大型化してその消費電力が増加するといった問題点がある。なお、微生物測定装置の動作は、実施の形態１〜３の場合と同様であるので、その説明を省略する。
【００６６】
実施の形態６．
以下、図４を参照しつつ、本発明の実施の形態６を説明する。ただし、図４に示す実施の形態６にかかる微生物測定装置は、図１に示す実施の形態１〜３にかかる微生物測定装置と多くの共通点を有する。そこで、説明の重複を避けるため、図４に示す微生物測定装置において、図１に示す微生物測定装置と共通する部材ないしは構成要素には図１の場合と同一の番号を付し、それらの個々の説明は省略する。
【００６７】
図４に示すように、実施の形態６にかかる微生物測定装置では、混合試薬容器１３および校正用混合試薬容器１４が容器用恒温槽４６内に収容されている。この容器用恒温槽４６内の温度は、恒温槽２４の場合とは異なり、１０℃付近に設定される。この実施の形態６で使用される混合試薬に含有されている４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドは、通常の蛍光酵素基質よりは熱に強いが、それでも温度による影響を受けて徐々に劣化していくので、高温条件下に長時間貯留しておくのは好ましいことではない。
【００６８】
また、同じく混合試薬に含有されているラウリル硫酸ナトリウムは、冬季などの５℃以下の低温状態においては、水溶液中で凝結するといった現象が生じる。そして、ラウリル硫酸ナトリウムが凝結した場合、混合試薬容器１３に貯留されている混合試薬をペリスタポンプ１９で吸引することができなくなる恐れがあるが、これは好ましいことではない。これらのことを勘案すれば、容器用恒温槽４６内の温度は、１０〜１５℃前後であるのが望ましい。このように容器用恒温槽４６を設けることにより、季節による測定誤差が小さくなり、測定停止などのトラブルも減少し、メンテナンス性が向上するといった利点がある。なお、微生物測定装置の動作は、実施の形態１〜３の場合と同様であるので、その説明を省略する。
【００６９】
実施の形態７．
以下、図５を参照しつつ、本発明の実施の形態７を説明する。ただし、図５に示す実施の形態７にかかる微生物測定装置は、図４に示す実施の形態６にかかる微生物測定装置（ないしは、図１に示す微生物測定装置）と多くの共通点を有する。そこで、説明の重複を避けるため、図５に示す微生物測定装置において、図４に示す微生物測定装置と共通する部材ないしは構成要素には図４の場合と同一の番号を付し、それらの個々の説明は省略する。
【００７０】
図５に示すように、実施の形態７にかかる微生物測定装置では、配管６の途中に、第３及び第４の２つの三方電磁弁４７、４８が介設されている。そして、両三方電磁弁４７、４８間に、それぞれ配管４９、５０と配管５１、５２とを介して、第１フィルタ５３と第２フィルタ５４とが挿入されている。第１フィルタ５３および第２フィルタ５４は、いずれも、メッシュが詰まったときに容易に交換することができるカートリッジ式のものであるのが望ましい。
【００７１】
第１フィルタ５３は、メッシュの粗いフィルタであって、公称孔径は５ミクロン程度である。一方、第２フィルタ５４は、メッシュの細かいフィルタであって、公称孔径は０．５ミクロン程度である。第１フィルタ５３の役割は、測定対象とする大腸菌群より大きい物質を除去することである。また、第２フィルタ５４の役割は、大腸菌群を含む全ての微生物を除去することである。
【００７２】
次に、この実施の形態７にかかる微生物測定装置の動作を説明する。ただし、この微生物測定装置の基本的な動作は、実施の形態６（あるいは実施の形態１）の場合と同様であるので、これらと異なる部分のみを説明する。実施の形態７では、実施の形態６（あるいは実施の形態１）にかかる動作が行われる前に、両三方電磁弁４７、４８が、それぞれｅ−ｆ側とｇ−ｈ側とに切り換えられる（セットされる）。そして、第１三方電磁弁７がａ−ｂ側に切り換えられ（セットされ）、ペリスタポンプ１１が駆動される。これに続く一連の動作は、実施の形態６（あるいは実施の形態１）の場合とほぼ同様であり、以下ではこれを「第１の動作」と呼ぶことにする。
【００７３】
そして、第１の動作の終了後、両三方電磁弁４７、４８が、それぞれ、ｅ−ｆ’側とｇ−ｈ’側とに切り換えられ、ここで第１三方電磁弁７がａ−ｂ側にセットされていることが確認されれば、ペリスタポンプ１１が駆動され、同じ動作が繰り返される。以下では、この一連の動作を「第２の動作」と呼ぶことにする。かくして、第１の動作及び第２の動作により求められた４―メチルウンベリフェロンの生成速度の差が算出され、この差から、予め作成されている大腸菌群数の検量線を用いて、大腸菌群数が計算される。
【００７４】
次に、このように動作する実施の形態７にかかる微生物測定装置によって得られる効果を説明する。第１の動作においては、カンジダ菌や糸状菌などのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを持つ微生物は、大腸菌群よりも物理的に大きいので、第１フィルタ５３により除去される。すなわち、大腸菌群の大きさが０.５〜３ミクロン程度であるのに対して、カンジダ菌は５〜１０ミクロン程度の大きさであり、また糸状菌は糸状体が絡まって１０ミクロン以上の大きさとなっているので、カンジダ菌や糸状菌は、公称孔径５ミクロンの第１フィルタ５３で容易に除去することができる。このように、下水中の菌相の変化により誤差要因となる微生物をあらかじめ除外することができるので、測定誤差が小さくなるといった利点がある。
【００７５】
また、第２の動作により、微生物に含まれるのではなく、水中に溶解しているβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性値を求めることができる。したがって、第１の動作で得られる４−メチルウンベリフェロン生成速度から第２の動作で得られる４−メチルウンベリフェロン生成速度を差し引くことにより、バックグラウンドの影響を除去することができ、測定誤差をより小さくすることができる。
【００７６】
実施の形態８．
以下、本発明の実施の形態８を説明する。なお、実施の形態８にかかる微生物測定装置の基本構成ないしは機械的構成は、図５に示す実施の形態７にかかる微生物測定装置の場合と同様であり、混合試薬の組成が異なるだけである。そこで、説明の重複を避けるため、以下では主として実施の形態７と異なる部分について説明する。
【００７７】
実施の形態８にかかる微生物測定装置では、混合試薬容器１３に予め入れておく混合溶液の成分には、４−ＭＵＧ、リン酸緩衝液、界面活性剤のほか、大腸菌群には活性への影響が少なく、かつ真菌類の活性を阻害する抗生物質が含まれる。この点が、実施の形態７と異なる。具体的には、このような抗生物質は、抗真菌剤として知られているアムホテリシンＢ、フルコナゾール等であるのが望ましい。これらの試薬のいずれかを混入させておくことにより、大腸菌群以外のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を持つカンジダ菌などの酵素活性を低減させ、過大に活性値が評価される要因を除去することができるといった効果がある。なお、微生物測定装置の動作は、前記の各実施の形態の場合と同様であるので、その説明を省略する。
【００７８】
【発明の効果】
本発明にかかる各微生物測定装置は、以上に説明したように構成されているので、以下に記載されるような効果を奏する。
本発明の第１の態様にかかる、第１の混合部と反応部と検出部とを備えたフローインジェクション方式の微生物測定装置においては、反応部が所定温度に保持される一方、反応部に所定時間留まっている第１の反応試薬と試料液との混合物が所定の量で検出部に送られる。このため、試料液に含まれている微生物の存在態様ないしは数または濃度、あるいは微生物汚染の程度等を、高精度かつ低コストで迅速に検出ないしは測定することができる。
【００７９】
本発明の第２の態様にかかる微生物測定装置によれば、反応部に所定時間留まっている第１の反応試薬と試料液との混合物の一部が、断続的あるいは連続的に順次検出部に送られるので、測定誤差をより小さくすることができる。
【００８０】
本発明の第３の態様にかかる微生物測定装置によれば、第１の反応試薬が、蛍光を発する物質を生成する物質、水素イオン濃度を一定にする緩衝液および界面活性剤のうちの少なくとも１つを含有するので、測定誤差をより小さくすることができる。
【００８１】
本発明の第４の態様にかかる微生物測定装置によれば、反応部がコイル状の管で形成されるので、高感度な測定を行うことができ、かつ省スペースな装置とすることができる。
【００８２】
本発明の第５の態様にかかる微生物測定装置によれば、励起光源として、紫外線ランプ、ブラックライト、キセノンフラッシュライトのいずれかが用いられるので、メンテナンスの負荷が軽減され、長寿命な測定装置を得ることができる。
【００８３】
本発明の第６の態様にかかる微生物測定装置によれば、反応部と検出部との間に、検出部の感度を高める第２の反応試薬を注入する第２の混合部が設けられるので、高感度な自動測定を行うことが可能である。
【００８４】
本発明の第７の態様にかかる微生物測定装置によれば、反応部と検出部との間に、反応試薬と微生物がもつ物質との反応を停止させる第２の反応試薬を注入する第２の混合部が設けられるので、高感度な自動測定を行うことが可能である。
【００８５】
本発明の第８の態様にかかる微生物測定装置によれば、第１の混合部または反応部において、その管径と、第１の反応試薬と試料液との混合物の流速とが、レイノルズ数が１０００以上（好ましくは、２０００以上）となるように設定または制御されるので、高感度な自動測定を行うことが可能である。
【００８６】
本発明の第９の態様にかかる微生物測定装置によれば、反応部において、第１の反応試薬と試料液との混合物の流速が、反応温度におけるレイノルズ数が１０００以上（好ましくは、２０００以上）となるように設定されるので、高感度な自動測定を行うことが可能である。
【００８７】
本発明の第１０の態様にかかる微生物測定装置によれば、第１の混合部の前段において試料液を一旦貯留する貯留槽と、該貯留槽および第１の混合部の少なくとも一方を所定温度に保持する手段とが設けられているので、高感度な自動測定を行うことが可能である。
【００８８】
本発明の第１１の態様にかかる微生物測定装置によれば、第１の反応試薬を保留する容器を所定温度に保持する容器用保温手段が設けられるので、メンテナンスの負荷が軽減され、長寿命な装置とすることが可能となる。
【００８９】
本発明の第１２の態様にかかる微生物測定装置によれば、第１の反応試薬が１０℃以上２０℃以下に保たれるように制御されるので、メンテナンスの負荷が軽減され、長寿命な装置とすることが可能となる。
【００９０】
本発明の第１３の態様にかかる微生物測定装置によれば、測定対象となる微生物を通過させる一方、測定対象外の微生物または浮遊性粒子物質を通過させない第１のフィルタ部が設けられるので、季節による微生物相の変動を受けにくく、測定変動誤差の小さい測定を行うことが可能となる。
【００９１】
本発明の第１４の態様にかかる微生物測定装置によれば、すべての微生物を通過させない第２のフィルタ部と、第２のフィルタ部とは別流路をなす配管と、第２のフィルタ部と前記配管とについて流路を切り換える切換え弁とが設けられるので、高感度な測定を行うことが可能となる。
【００９２】
本発明の第１５の態様にかかる微生物測定装置によれば、第１の混合部の前段に、第１のフィルタ部とは別流路をなしすべての微生物を通過させない第２のフィルタ部と、第１のフィルタ部と第２のフィルタ部とについて流路を切り換える切換え弁とが設けられるので、高感度な測定を行うことが可能となる。
【００９３】
本発明の第１６の態様にかかる微生物測定装置によれば、第１の反応試薬が、測定対象となる微生物の触媒酵素反応を阻害せず、測定対象外の微生物の触媒酵素反応を阻害する抗生物質を含有しているので、季節による微生物相の変動を受けにくく、測定誤差の少ない測定を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１〜４にかかる微生物測定装置のシステム構成図である。
【図２】本発明の実施の形態４にかかる微生物測定装置における、β−ガラクトシダーゼ活性値とレイノルズ数との関係を示すグラフである。
【図３】本発明の実施の形態５にかかる微生物測定装置のシステム構成図である。
【図４】本発明の実施の形態６にかかる微生物測定装置のシステム構成図である。
【図５】本発明の実施の形態７〜８にかかる微生物測定装置のシステム構成図である。
【符号の説明】
１槽、２ａ配管、２ｂ配管、３ポンプ、４貯水槽、５配管、６配管、７第１三方電磁弁、８配管、９イオン交換水保管容器、１０配管、１１ペリスタポンプ、１２第１混合部、１３混合試薬容器、１４校正用混合試薬容器、１５配管、１６第２三方電磁弁、１７配管、１８配管、１９ペリスタポンプ、２０二方電磁弁、２１配管、２２配管、２３第１反応部、２４恒温槽、２５第２混合部、２６アルカリ液容器、２７配管、２８ペリスタポンプ、２９二方電磁弁、３０配管、３１第２反応部、３２検出部、３３フローセル、３４励起用ランプ、３５フィルタ、３６フィルタ、３７光電子増倍管、３８配管、３９廃液容器、４０ケーブル、４１ＡＤ変換ボード、４２ケーブル、４３コンピュータ、４４ケーブル、４５シーケンサ、４６容器用恒温槽、４７第３三方電磁弁、４８第４三方電磁弁、４９配管、５０配管、５１配管、５２配管、５３第１フィルタ、５４第２フィルタ。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention can rapidly detect or measure the presence or number of microorganisms contained in a sample to be measured (sample solution) or the degree of microbial contamination of the sample to be measured with high accuracy and low cost. The present invention relates to a simple microorganism measuring apparatus.
[0002]
[Prior art]
As a method for measuring the number or concentration of microorganisms contained in a liquid sample to be measured, a microorganism colony (colon) is conventionally formed on an agar medium, and the number of microorganisms is counted by counting the number of colonies. Such a method (hereinafter referred to as “colony counting method”) is widely used. In this colony counting method, for example, a sample to be measured or a diluted solution of the sample to be measured is applied so that the microorganisms are uniformly dispersed on the agar medium, or mixed and mixed, and the microorganisms are added to the nutrient-containing medium. In this method, each microorganism is grown to a colony having a size that can be distinguished by counting the number of colonies, and the number of microorganisms is obtained from the number of colonies. However, since the colony counting method generally requires a culture time of 20 hours or more, there is a problem that it is impossible to measure the number of microorganisms quickly and automatically.
[0003]
Therefore, in recent years, a microorganism measuring method has been proposed in which the activity of an enzyme specifically possessed by a microorganism species is measured, and the number of microorganisms is rapidly counted based on the measurement result. For example, when the target microorganism is a bacterium belonging to the coliform group (hereinafter abbreviated as “coliform group”), the coliform group is measured by measuring the hydrolysis characteristics of β-D-galactosidase, which is an enzyme of the coliform group. Measurement methods such as measuring numbers have been proposed.
[0004]
Specifically, the absorptivity of yellow coloration of orthonitrophenol produced by enzymatic hydrolysis of orthonitrophenol-β-galactopyranoside (ONPG) caused by enzyme catalysis of β-D-galactosidase is detected. And enzymatic hydrolysis of 4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside (4-MUG), which is a fluorescent enzyme substrate, also caused by the enzyme catalysis of β-D-galactosidase A measurement method is proposed in which the fluorescence intensity of 4-methylumbelliferone (4-MU) produced by the above is measured. All of these can measure the number of coliforms by measuring the rate of enzyme reaction.
[0005]
In the conventional method for measuring the number of coliform bacteria using a fluorescent enzyme substrate, it is contained in a sample to be measured as disclosed in, for example, US Pat. No. 5,292,644 or US Pat. No. 5,518,894. The Escherichia coli group is concentrated and retained on a filter through which the coliform group cannot pass, such as by filtration. The filter retaining the coliform group is brought into contact with a reagent solution containing a fluorescent enzyme substrate, and the coliform group is retained. The number of coliforms can be measured by measuring the amount of the fluorescent substance decomposed by the enzyme. In this measurement method, the detection sensitivity is improved by capturing and concentrating coliform bacteria on a filter.
[0006]
In addition, a measurement method (analysis method) in which a substance concentration in water is measured using a flow injection method is also known. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-90366 discloses a measurement method in which the ammonium ion concentration is quantified using a flow injection method. In this measurement method, a reagent solution (sodium hypochlorite) is continuously flowed down in a flow channel by injection of a reaction reagent, and sample water containing ammonium ions in this flow is driven by a constant flow pump. At the same time, air is continuously supplied by driving a constant flow pump, and these are reacted in the mixing coil. And after separating the obtained reaction product as gas with a vaporization separator, this is oxidized to nitric oxide with a heating oxidation furnace. Further, the chemiluminescence intensity generated when this nitric oxide reacts with ozone is detected, and the signal intensity is converted into the ammonium ion concentration by converting and calculating the output of the signal intensity.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the conventional method for measuring the number of coliforms disclosed in, for example, US Pat. No. 5,292,644 or US Pat. No. 5,518,894, the coliforms are once concentrated and retained on the filter. Since the measurement is performed later by reacting with a fluorescent enzyme substrate, the measurement operation is very complicated, the configuration of the measurement apparatus becomes complicated, and continuous measurement becomes difficult.
[0008]
When the fluorescent enzyme substrate method is used, the lifetime of a xenon lamp that is generally used as a light source for exciting a fluorescent substance in a detection unit for detecting fluorescence is only about 1000 hours. For this reason, when performing continuous measurement, it is necessary to replace the lamp frequently, and there is a problem that a heavy load is imposed on maintenance.
[0009]
When the flow injection method is used to measure the number of microorganisms, components contained in the reaction reagent, for example, a fluorescent enzyme substrate such as 4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside is generally difficult to dissolve in water. Since it is a substance, even if it is simply mixed in the mixing section, it is difficult to dissolve it in the sample water. For this reason, there is a problem that the enzyme hydrolysis reaction hardly occurs and the sensitivity is lowered.
[0010]
In addition, fluorescent enzyme substrates are generally vulnerable to heat or high temperatures, while liquids containing high concentrations of surfactants may condense at low temperatures. For this reason, when using a solution in which a fluorescent enzyme substrate and a surfactant are mixed in advance, depending on the environment in which the measuring device is installed, the reaction reagent may be altered to prevent a predetermined reaction from occurring, resulting in a decrease in sensitivity. There is a problem.
[0011]
In general, the temperature at which the catalytic enzyme reaction is performed is 30 ° C. or higher, but the temperature of the sample water is lower than that and often 25 ° C. or lower, so the temperature of the sample water must be increased when mixing with the reaction reagent. Don't be. However, since the temperature of the sample water does not rise suddenly in the reaction part, the catalytic enzyme reaction cannot be performed immediately. For this reason, there exists a problem that the sensitivity of microorganisms measurement falls or measurement time becomes long.
[0012]
Moreover, in the conventional measuring method which measured the enzyme hydrolysis characteristic of (beta) -D-galactosidase which is an enzyme which coliform bacteria have, when measuring about the treated water of sewage, for example, (beta) -D- other than coliform bacteria group is measured. Since microorganisms having galactosidase, for example, fungi (including molds) and filamentous fungi are present in the treated water, there is a problem that measurement errors occur when these are present in the sample water.
[0013]
Furthermore, turbidity components that interfere with microbial measurement may be mixed in the sample water. However, if sample water mixed with these components is measured, a measurement error occurs. Moreover, since dirt adheres to the flow cell of the detection unit, it is necessary to frequently correct the sensitivity. For this reason, there is a problem that the load on maintenance becomes large.
[0014]
The present invention has been made to solve the above-described conventional problems, and allows maintenance-free continuous measurement over a long period of time when measuring the presence and number of microorganisms in a liquid by the flow injection method. Therefore, an object of the present invention is to provide a simple microorganism measuring apparatus that can be measured quickly with high sensitivity without being affected by interference factors such as turbidity components.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The microorganism measuring apparatus according to the first aspect of the present invention, which has been made to solve the above problems, includes (i) a first mixing unit that mixes a first reaction reagent and a sample solution containing microorganisms by driving a pump. And a reaction part that causes the reaction between the first reaction reagent and the substance possessed by the microorganism in the latter part (downstream side) of the first mixing part, and the reaction product in the latter part (downstream side) of the reaction part. In a flow injection type microorganism measuring apparatus provided with a detection unit for performing detection, (ii) a heat retaining means for holding the reaction unit at a predetermined temperature, and (iii) a mixture of the first reaction reagent and the sample liquid. Control means for controlling the flow of the mixture so that the mixture is allowed to stay in the reaction unit for a predetermined time and is sent to the detection unit in a predetermined amount is provided.
[0016]
In the microorganism measuring apparatus according to the second aspect of the present invention, the control means controls the flow of the mixture so that a part of the mixture is intermittently (intermittently) or continuously sent to the detector. It is characterized by becoming.
[0017]
In the microorganism measuring apparatus according to the third aspect of the present invention, the first reaction reagent includes at least one of a substance that generates a substance that emits fluorescence by the reaction, a buffer that makes a hydrogen ion concentration constant, and a surfactant. It is characterized by containing one.
[0018]
The microorganism measuring apparatus according to the fourth aspect of the present invention is characterized in that the reaction part is formed of a coiled tube.
[0019]
The microorganism measuring apparatus according to the fifth aspect of the present invention is characterized in that the detection unit is a fluorometer, and any one of an ultraviolet lamp, a black light, and a xenon flash lamp is used as an excitation light source. is there.
[0020]
In the microorganism measuring apparatus according to the sixth aspect of the present invention, a second mixing unit for injecting a second reaction reagent for increasing the sensitivity of the detection unit is provided between the reaction unit and the detection unit. It is a feature.
[0021]
In the microorganism measuring apparatus according to the seventh aspect of the present invention, the second reaction reagent for stopping the reaction between the first reaction reagent and the substance of the microorganism is injected between the reaction unit and the detection unit. A second mixing unit is provided.
[0022]
In the microorganism measuring apparatus according to the eighth aspect of the present invention, in the first mixing section or the reaction section, the tube diameter and the flow rate of the mixture of the first reaction reagent and the sample liquid have a Reynolds number of 1000 or more. It is set or controlled to be (preferably 2000 or more).
[0023]
In the microorganism measuring apparatus according to the ninth aspect of the present invention, in the reaction part, the flow rate of the mixture of the first reaction reagent and the sample solution is such that the Reynolds number at the reaction temperature is 1000 or more (preferably 2000 or more). It is characterized by being set to.
[0024]
In the microorganism measuring apparatus according to the tenth aspect of the present invention, the storage tank that temporarily stores the sample liquid in the first stage of the first mixing unit, and at least one of the storage tank and the first mixing unit is held at a predetermined temperature. And a means is provided.
[0025]
The microorganism measuring apparatus according to the eleventh aspect of the present invention is characterized in that a container heat retaining means for retaining a container for retaining the first reaction reagent at a predetermined temperature is provided.
[0026]
The microorganism measuring apparatus according to the twelfth aspect of the present invention is characterized in that the container heat retaining means holds the temperature of the first reaction reagent at 10 ° C. or higher and 20 ° C. or lower. .
[0027]
A microorganism measuring apparatus according to a thirteenth aspect of the present invention is a first filter that allows microorganisms to be measured to pass through the first stage of the first mixing unit, but does not allow microorganisms that are not to be measured or suspended particulate matter to pass through. A part is provided.
[0028]
According to a fourteenth aspect of the present invention, in the microorganism measuring apparatus, the second filter unit that does not allow all the microorganisms to pass through the first stage of the first mixing unit, and a pipe that forms a separate flow path from the second filter unit. And a switching valve for switching the flow path between the second filter section and the pipe.
[0029]
A microorganism measuring apparatus according to a fifteenth aspect of the present invention includes a second filter unit that is separate from the first filter unit and does not allow all of the microorganisms to pass before the first mixing unit, A switching valve for switching the flow path between the first filter unit and the second filter unit is provided.
[0030]
In the microorganism measuring apparatus according to the sixteenth aspect of the present invention, the reaction in the reaction unit is a catalytic enzyme reaction, and the first reaction reagent does not inhibit the catalytic enzyme reaction of the microorganism to be measured, and is not measured. It contains an antibiotic that inhibits the catalytic enzyme reaction of microorganisms.
[0031]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiment 1 FIG.
Embodiment 1 of the present invention will be described below.
FIG. 1 is a system configuration diagram of the microorganism measuring apparatus according to the first embodiment of the present invention. This microorganism measuring apparatus measures the concentration of coliform bacteria in sample water using water before disinfection with chlorine or ozone in sewage treatment as sample water. The microorganism measuring apparatus according to the first embodiment is mainly intended to measure the concentration of coliform bacteria in the sewage, but the measurement target is not limited to this, for example, general bacteria other than coliform bacteria. The present invention is also applicable when measuring the number or concentration of microorganisms.
[0032]
As shown in FIG. 1, in this microbe measurement apparatus, the sample water staying or flowing in the tank 1 is supplied to the water storage tank 4 by the pump 3 through the pipe 2a and the pipe 2b. ing. Here, the water storage tank 4 has a mechanism for overflowing the sample water, and surplus sample water in the water storage tank 4 is returned to the tank 1 via the pipe 5. As understood from Bernoulli's theorem, the internal pressure of the pipes 2a and 2b around the pump 3 varies depending on the height at which the sample water in the tank 1 is collected. Therefore, if the water tank 4 is not provided and the pipe 2b is directly connected to the measuring device main body, the sample water flow rate in the measuring device may not be maintained at a preset value. Therefore, in order to place the sample water under atmospheric pressure once, an atmospheric pressure open water storage tank 4 is provided.
[0033]
One end (lower end) of the pipe 6 is inserted into the sample water in the water tank 4, and the other end (upper end) of the pipe 6 is connected to the first connection end of the first three-way solenoid valve 7. The second connection end of the first three-way solenoid valve 7 is connected to one end of the pipe 8, and the other end of the pipe 8 is connected to the ion exchange water storage container 9. The third connection end of the first three-way solenoid valve 7 is connected to one end of a pipe 10 provided with a peristaltic pump 11, and the other end of the pipe 10 is connected to the first inlet of the first mixing unit 12. Has been.
[0034]
The ion-exchanged water stored in the ion-exchanged water storage container 9 is used when performing sensitivity calibration of the microorganism measuring apparatus and cleaning of the inside of the pipe. The first three-way solenoid valve 7 is set to communicate with the ab side in a normal state where no voltage is applied, but communicates with the ab ′ side when operated with voltage applied. As the first mixing unit 12, a T-shaped or Y-shaped three-way tube is usually used. Here, an orifice may be used to improve the mixing characteristics, but in this case, the pressure inside the pipe increases. Therefore, it is only necessary to select one of the three-way pipe and the orifice in consideration of the balance between the mixing characteristics of the first mixing unit 12, the torque of the peristaltic pump 11, and the pressure resistance of the piping system.
[0035]
Further, the microorganism measuring apparatus is provided with a mixed reagent container 13 and a calibration mixed reagent container 14. The mixed reagent stored in the mixed reagent container 13 contains 4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside (hereinafter, referred to as “4-MUG”) as a fluorescent enzyme substrate. Role and latter stage containing a phosphate buffer solution that maintains a constant hydrogen ion concentration and softening the cell membrane of microorganisms to allow β-galactosidase, an intracellular enzyme, to easily react with 4-MUG It contains sodium lauryl sulfate as a surfactant that plays a role of improving sensitivity when measuring fluorescence intensity. One end of a pipe 15 is connected to the mixed reagent container 13, and the other end of the pipe 15 is connected to the first connection end of the second three-way solenoid valve 16.
[0036]
The calibration mixed reagent container 14 stores a mixture of a fluorescent substance, a buffer solution, and a surfactant for calibration of the microorganism measuring apparatus. Here, 4-methylumbelliferone is used as the fluorescent substance. The buffer solution and the surfactant are the same as in the case of the mixed reagent in the mixed reagent container 13. One end of a pipe 17 is connected to the calibration mixed reagent container 14, and the other end of the pipe 17 is connected to a second connection end of the second three-way solenoid valve 16. The third connection end of the second three-way solenoid valve 16 is connected to one end of the pipe 18 provided with the peristaltic pump 19, and the other end of the pipe 18 is connected to the first connection end of the two-way solenoid valve 20. Has been. The second three-way solenoid valve 16 is set to communicate with the cd side in a normal state where no voltage is applied, but communicates with the cd ′ side when operated with voltage applied.
[0037]
The two-way solenoid valve 20 is closed in a normal state where no voltage is applied, but is set to open when a voltage is applied. The second connection end of the two-way solenoid valve 20 is connected to one end of the pipe 21, and the other end of the pipe 21 is connected to the second inflow port of the first mixing unit 12. The outlet of the first mixing unit 12 is connected to one end of the pipe 22, and the other end of the pipe 22 is connected to the upstream end of the first reaction unit 23.
[0038]
The pipes 2a, 2b, 6, 8, 15, 17, and 21 that are the materials of the pipes but are not provided with the peristaltic pumps 11 and 19 may be general and inexpensive silicon tubes or Tygon tubes. . However, for the pipes 10 and 18 in which the peristaltic pumps 11 and 19 are interposed, a dedicated tube having a thickness specified by the peristaltic pump is used. The first reaction unit 23 is a tube made of a fluororesin generally called Teflon formed into a coil shape, and most of the first reaction unit 23 is accommodated in a thermostatic chamber 24. The inner diameter of the tube is 1.6 mm.
[0039]
In this way, the first reaction part 23 is formed into a coil shape in order to save the space of the first reaction part 23 and the thermostatic chamber 24 in which the first reaction part 23 is stored, and to promote the mixing and stirring of the sample water and the mixed reagent. This is to improve the sensitivity. The thermostat 24 is kept at a constant temperature. Here, since the measurement is performed for coliform bacteria, this temperature is set to 37 ° C., but varies depending on the microorganism to be measured. The downstream end of the first reaction unit 23 is connected to the first inflow port of the second mixing unit 25.
[0040]
The microorganism measuring apparatus is provided with an alkaline liquid container 26, and the alkaline liquid is stored in the alkaline liquid container 26. Here, a 2M sodium hydroxide aqueous solution is used as the alkaline solution. One end (lower end) of a pipe 27 provided with a peristaltic pump 28 is connected to the alkaline liquid container 26, and the other end (upper end) of the pipe 27 is connected to a first connection end of a two-way electromagnetic valve 29. Yes. The second connection end of the two-way solenoid valve 29 is connected to one end of the pipe 30, and the other end of the pipe 30 is connected to the second inflow port of the second mixing unit 30. The two-way solenoid valve 29 is closed in a normal state where no voltage is applied, but is set to open when a voltage is applied.
[0041]
The structure of the second mixing unit 25 is the same as that of the first mixing unit 12. The pipes 27 and 30 are made of a material that can withstand strong alkali such as a hydrogen ion concentration (hereinafter referred to as “pH”) of 13 or more. The upstream end of the second reaction unit 31 is connected to the outlet of the second mixing unit 25. The second reaction unit 31 has a coil-like structure made of Teflon similar to the first reaction unit 23, but the length may be 0.5 m or less. The downstream end of the second reaction unit 31 is connected to the upper end of the flow cell 33 in the detection unit 32.
[0042]
In the detection unit 32, a xenon lamp is used as the excitation lamp 34 which is an excitation light source. The detection unit 32 includes bandpass filters 35 and 36 (optical filters) that pass only effective wavelengths of excitation light and fluorescence wavelength spectra, and photomultiplier that detects fluorescence generated in the flow cell 33. A tube 37 is provided. A monochromator may be used in place of the filters 35 and 36, but it is not necessary here that the filter characteristics are steep and close to a single color, and therefore a filter with high brightness is preferable. The excitation wavelength of fluorescence is set to 360 nm, and the fluorescence measurement wavelength is set to 450 nm. One end of a pipe 38 is connected to the lower end portion of the flow cell 33, and the other end of the pipe 38 is connected to a waste liquid container 39.
[0043]
The output of the photomultiplier tube 37 is input to the AD conversion board 41 via the cable 40, where it is converted into a digital signal, and then input to the computer 43 via the cable 42. Furthermore, a sequencer 45 connected to the computer 43 in the RS-232C format via the cable 44 is provided. The sequencer 45 is programmed to control the operation / stop of the pump 3, the three-way solenoid valves 7, 16, the two-way solenoid valves 20, 29, and the peristaltic pumps 11, 19, 28. The computer 43 transmits a measurement start trigger to the sequencer 45 and plays a role in monitoring the state of the sequencer 45 and data processing.
[0044]
Hereinafter, the measurement operation of the microorganism measuring apparatus having the above configuration will be described. In this measurement operation, water before disinfection is sucked as sample water from the tank 1 by the pump 3, and this sample water is once held in the water storage tank 4. The sample water that has overflowed the water storage tank 4 is returned to the tank 1 via the pipe 5. The three-way solenoid valves 7 and 16 are switched (or set) so that the ab side and the cd side communicate with each other, the two-way solenoid valve 20 is opened, and the two peristaltic pumps 11 and 19 are connected. Is driven (operates). Thus, the sample water and the mixed reagent are mixed by the first mixing unit 12 or the pipe 22 and then sent to the first reaction unit 23. Since the sample water at the previous measurement remains in the pipe of the first reaction unit 23, both the peristaltic pumps 11 and 19 are driven until the sample water is completely replaced with the sample water to be measured this time.
[0045]
In this way, the two peristaltic pumps 11 and 19 are stopped and the two-way solenoid valve 20 is closed with the previous sample water completely replaced. This point in time is set as the start of the enzyme-catalyzed reaction, and at this point, the holding value (count value) of the timer is set (set) to 0 minutes. Hereinafter, the time held by this timer will be referred to as “reaction to minutes”. For example, a time point one minute after the timer starts counting is referred to as “1 minute reaction time”. In the 1st reaction part 23, 4-MUG is decomposed | disassembled into galactose and 4-methylumbelliferone by the catalytic hydrolysis reaction of (beta) -D-galactosidase which Escherichia coli group has.
[0046]
Thus, when the timer reaches 1 minute of reaction, the two-way solenoid valve 29 is opened with the two-way solenoid valve 20 closed. Then, both peristaltic pumps 11 and 28 are driven, and the reaction solution is sent to the second reaction unit 31 and the flow cell 33. The second reaction unit is drawn from the first reaction unit 23 through the second mixing unit 25 by the sodium hydroxide solution sucked from the alkaline liquid container 26 and supplied to the second reaction unit 31 through the second mixing unit 25. The reaction solution sent to 31 becomes alkaline, thereby stopping the enzyme-catalyzed reaction.
[0047]
Note that the drive time (operation time) of the two peristaltic pumps 11 and 28 is the time required for the reaction liquid to sufficiently reach the second reaction section 31 and the flow cell 33, so that the entire reaction in the first reaction section 23 is performed. Only a part of the liquid is sent to the second reaction unit 31 and the flow cell 33. The light emitted from the excitation lamp 34 (xenon lamp) becomes excitation light having a central intensity around 360 nm by the filter 35 and is irradiated to the reaction liquid in the flow cell 33. Thereby, 4-methylumbelliferone in the reaction solution is excited, and fluorescence near 450 nm is emitted. This fluorescence is detected by the photomultiplier tube 37, and its output is converted from an analog signal to a digital signal by the AD conversion board 41. The intensity of the converted signal is recorded as data by the computer 43.
[0048]
The above is the operation of the microorganism measuring apparatus at the reaction time of 1 minute. The same operation is performed at the reaction time of 10 minutes, the reaction time of 20 minutes, and the reaction time of 30 minutes. That is, the peristaltic pumps 11 and 28 are driven in a state where the two-way solenoid valve 20 is closed and the two-way solenoid valve 29 is opened, and the reaction liquid remaining in the second reaction unit 31 and the flow cell 33 is sequentially fixed in a certain amount. Liquid is fed one by one. About subsequent operation | movement, it is the same as that of the case of reaction 1 minute. The liquid discharged from the flow cell 33 is guided to the waste liquid container 39 through the pipe 38 and stored therein. Since this waste liquid is alkaline, when it is discarded, it must be neutralized with hydrochloric acid or the like and discharged into a sewer pipe.
[0049]
The effect of the microorganism measuring apparatus in the above operation will be described. By the above operation, the fluorescence intensity at the time of reaction 1 minute, reaction 10 minutes, reaction 20 minutes, reaction 30 minutes is automatically recorded in the computer 43. The computer 43 is automatically operated or operated by a program using a programming language such as C, BASIC, or FORTRAN. Therefore, the production rate of 4-methylumbelliferone for 30 minutes can be calculated. This production rate is proportional to the amount of β-D-galactosidase originally contained in the sample water.
[0050]
Therefore, by observing the production rate of 4-methylumbelliferone, it is possible to calculate and determine the number of coliforms from a preset calibration curve. The calibration curve shows the relationship (calibration) between the number of coliforms measured by the conventional agar culture method and the 4-methylumbelliferone production rate, and was obtained in the past at the sampling site of the sample water. It is desirable to actually measure and obtain based on the obtained data.
[0051]
Embodiment 2. FIG.
The second embodiment of the present invention will be described below. The basic configuration or mechanical configuration of the microorganism measuring apparatus according to the second embodiment is the same as that of the microorganism measuring apparatus according to the first embodiment shown in FIG. 1, and only the operation thereof is different. Therefore, in order to avoid duplication of explanation, portions different from those of the first embodiment will be mainly described below.
[0052]
In the microorganism measuring apparatus according to the second embodiment, during the operation of the microorganism measuring apparatus according to the first embodiment, when the timer holding value is set to 0 minutes, that is, when the reaction time is 0 minutes, The two-way solenoid valve 20 is closed and the two-way solenoid valve 29 is opened. Then, the peristaltic pumps 11 and 28 are driven, and the reaction liquid is sequentially and continuously sent to the second reaction unit 31 and the flow cell 33. In the first embodiment, the reaction solution was intermittently delivered at the time of 1 minute of reaction, at the time of reaction of 10 minutes, at the time of reaction of 20 minutes, and at the time of reaction of 30 minutes. The liquid is sent continuously. The second embodiment is different from the first embodiment in this point.
[0053]
In the second embodiment, the flow rates of the peristaltic pumps 11 and 28 are set to values smaller than those in the first embodiment. Specifically, this flow rate is set so that the reaction liquid at the time of reaction 0 minutes remains in the first reaction part 23 even at the time of reaction 30 minutes. Moreover, the operation | movement which detects 4-methylumbelliferone in the detection part 32 is also performed continuously. The production rate of 4-methylumbelliferone thus obtained is not intermittent data but continuous. Therefore, the second embodiment has an advantage that the data variation error is smaller than that of the first embodiment.
[0054]
Embodiment 3 FIG.
The third embodiment of the present invention will be described below. The basic configuration or mechanical configuration of the microorganism measuring apparatus according to the third embodiment is substantially the same as that of the microorganism measuring apparatus according to the first or second embodiment shown in FIG. Only the configuration is different. Therefore, in order to avoid duplication of explanation, portions different from those in the first and second embodiments will be mainly described below.
[0055]
In the third embodiment, an ultraviolet lamp having a longer life than the xenon lamp is used as the excitation lamp 34. Since the lifetime of a xenon lamp is about 1000 hours, when the microorganism measuring apparatus is continuously operated, the lamp must be frequently replaced. For this reason, it takes time to replace the lamp, and the load of maintenance increases. On the other hand, in the case of an ultraviolet lamp having a long life, a life of 10,000 to 20000 hours can be secured, so that the labor of maintenance is greatly reduced. Note that the ultraviolet lamp has only to have a specification with a luminance peak sufficient for measurement in the vicinity of 360 to 380 nm, and light in the short wavelength ultraviolet region that is emitted by the xenon lamp is not required in the third embodiment. It is.
[0056]
In addition to the ultraviolet lamp, black light can also be used. Needless to say, other light sources can be used as long as they have a long life and emit light near 360 nm sufficient for measurement. Since the operation of the microorganism measuring apparatus according to the third embodiment is substantially the same as that in the first or second embodiment, the description thereof is omitted.
[0057]
Embodiment 4 FIG.
Embodiment 4 of the present invention will be described below. The basic configuration or mechanical configuration of the microorganism measuring apparatus according to the fourth embodiment is the same as that of the microorganism measuring apparatus according to the first or second embodiment shown in FIG. It is only different. Therefore, in order to avoid duplication of explanation, portions different from those in the first and second embodiments will be mainly described below.
[0058]
In the microorganism measuring apparatus according to the fourth embodiment, water before disinfection is sucked as sample water from the tank 1 by the pump 3, and this sample water is temporarily held in the water storage tank 4. The sample water that has overflowed the water storage tank 4 is returned to the tank 1 via the pipe 5. Thus, at the time of measurement, the three-way solenoid valves 7 and 16 are switched (set) to the ab side and the cd side, respectively. Then, the two-way solenoid valve 20 is opened and the peristaltic pumps 11 and 19 are driven. The flow rates of the two peristaltic pumps 11 and 19 are set so that the Reynolds number of the reaction liquid in the pipe 22 or the first reaction unit 23 is 1000 or more.
[0059]
For example, when the pipe inner diameter of the pipe 22 and the first reaction unit 23 is 0.6 mm, the flow rate of the peristaltic pump 11 is 20 mL / min, and the flow rate of the peristaltic pump 19 is 3 mL / min, Since the viscosity coefficient is 0.6592 mPa · s, the Reynolds number is about 1000 according to the following equation 1.
Reynolds number = (Density) x (Flow velocity) x (Pipe inner diameter) / (Viscosity coefficient) ………… Equation 1
[0060]
Regarding the flow of liquid in the straight pipe, when the Reynolds number is 2000 or more, preferably 3000 or more, it is theoretically shown that the inside of the pipe is in a turbulent state. In this case, the sample water and the mixed reagent are mixed. Thoroughly mixed to maximize the hydrolysis rate of the enzymatic hydrolysis reaction. However, in the microorganism measuring apparatus according to the fourth embodiment, the pipe line extending from the pipe 22 to the first reaction unit 23 is not configured only by a straight pipe, but the first reaction unit 23 is formed in a coil shape. Therefore, in practice, the first reaction unit 23 also has a stirring / mixing function. Therefore, each of the shape of the first reaction unit 23 and the increase in the Reynolds number increases the stirring / mixing action. By improving the stirring / mixing action in this manner, the microorganism measuring apparatus becomes highly sensitive, and There is an advantage that the lower limit value for measuring the number of groups is improved.
[0061]
FIG. 2 is a graph showing a result when the measurement is performed experimentally by changing only the flow rate of the same sample water using the microorganism measuring apparatus according to the fourth embodiment. In FIG. 2, the horizontal axis indicates the Reynolds number. However, since only the flow rate is changed here, the value on the horizontal axis is proportional to the flow rate or the flow velocity. The vertical axis indicates the production rate of 4-methylumbelliferone, that is, the β-D-galactosidase activity value. The higher this value, the higher the sensitivity. FIG. 2 shows that the sensitivity increases as the Reynolds number increases.
[0062]
In order to increase the Reynolds number, the flow rate of the sample water is increased, the inner diameter of the tube is decreased, or the water temperature is increased. However, if the flow rate is increased too much and the inner diameter of the pipe is reduced, the required performance for both the peristaltic pumps 11 and 19 increases, and both the peristaltic pumps 11 and 19 become larger. Furthermore, the internal pressure of the tube rises, causing troubles such as leakage of the reaction solution. Further, an excessive increase in water temperature such as 50 ° C. or more is not preferable because it degrades the enzyme hydrolysis reaction and, in some cases, the degradation of β-D-galactosidase itself occurs. Therefore, it is difficult to increase the Reynolds number significantly at present.
[0063]
Embodiment 5 FIG.
Hereinafter, the fifth embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. However, the microorganism measuring apparatus according to the fifth embodiment shown in FIG. 3 has many common points with the microorganism measuring apparatus according to the first to third embodiments shown in FIG. Therefore, in order to avoid duplication of explanation, in the microorganism measuring apparatus shown in FIG. 3, members or components common to the microorganism measuring apparatus shown in FIG. 1 are assigned the same numbers as those in FIG. Description is omitted.
[0064]
As shown in FIG. 3, in the microorganism measuring apparatus according to the fifth embodiment, a pipe 22, a first mixing unit 12, and a water storage tank 4 are accommodated in a thermostatic chamber 24. Enzymatic hydrolysis reactions are significantly affected by temperature. For this reason, in the microbe measurement apparatus shown in FIG. 1, particularly when the sample water is at a low temperature, such as in winter, the measurement is started and the sample water and the mixed reagent are fed to the first reaction unit 23. The water temperature remains low and the enzymatic hydrolysis reaction is significantly reduced.
[0065]
Even in this case, if a certain amount of time elapses due to the function or action of the thermostatic chamber 24, the water temperature becomes a predetermined value throughout the entire first reaction unit 23. However, since sensitivity decreases or measurement errors due to the season occur. This is not preferable. However, in the fifth embodiment, since the pipe 22 and the water storage tank 4 are accommodated in the thermostat 24, the above disadvantages are alleviated and measurement errors are reduced. However, in this case, there is a problem that the constant temperature bath 24 is enlarged and its power consumption is increased. In addition, since the operation | movement of a microorganisms measuring apparatus is the same as that of the case of Embodiment 1-3, the description is abbreviate | omitted.
[0066]
Embodiment 6 FIG.
The sixth embodiment of the present invention will be described below with reference to FIG. However, the microorganism measuring apparatus according to the sixth embodiment shown in FIG. 4 has many common points with the microorganism measuring apparatus according to the first to third embodiments shown in FIG. Therefore, in order to avoid duplication of description, in the microorganism measuring apparatus shown in FIG. 4, members or components common to the microorganism measuring apparatus shown in FIG. 1 are assigned the same numbers as those in FIG. Description is omitted.
[0067]
As shown in FIG. 4, in the microorganism measuring apparatus according to the sixth embodiment, the mixed reagent container 13 and the calibrated mixed reagent container 14 are accommodated in a container thermostat 46. Unlike the case of the thermostat 24, the temperature in the container thermostat 46 is set to around 10 ° C. Although 4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside contained in the mixed reagent used in this Embodiment 6 is more resistant to heat than a normal fluorescent enzyme substrate, it is still affected by temperature. It is not preferable to store for a long time under a high temperature condition because it gradually deteriorates.
[0068]
Similarly, sodium lauryl sulfate contained in the mixed reagent is condensed in an aqueous solution at a low temperature of 5 ° C. or lower such as in winter. When sodium lauryl sulfate is condensed, the mixed reagent stored in the mixed reagent container 13 may not be sucked by the peristaltic pump 19, but this is not preferable. Considering these things, it is desirable that the temperature in the thermostat 46 for containers is around 10 to 15 ° C. By providing the container thermostat 46 in this manner, there are advantages that measurement errors due to seasons are reduced, troubles such as measurement stoppage are reduced, and maintainability is improved. In addition, since the operation | movement of a microorganisms measuring apparatus is the same as that of the case of Embodiment 1-3, the description is abbreviate | omitted.
[0069]
Embodiment 7 FIG.
Hereinafter, Embodiment 7 of the present invention will be described with reference to FIG. However, the microorganism measuring apparatus according to the seventh embodiment shown in FIG. 5 has many common points with the microorganism measuring apparatus according to the sixth embodiment shown in FIG. 4 (or the microorganism measuring apparatus shown in FIG. 1). Therefore, in order to avoid duplication of explanation, in the microorganism measuring apparatus shown in FIG. 5, members or components common to the microorganism measuring apparatus shown in FIG. 4 are assigned the same numbers as those in FIG. Description is omitted.
[0070]
As shown in FIG. 5, in the microorganism measuring apparatus according to the seventh embodiment, third and fourth three-way electromagnetic valves 47 and 48 are interposed in the middle of the pipe 6. A first filter 53 and a second filter 54 are inserted between the three-way solenoid valves 47 and 48 via pipes 49 and 50 and pipes 51 and 52, respectively. Both the first filter 53 and the second filter 54 are desirably of a cartridge type that can be easily replaced when the mesh is clogged.
[0071]
The first filter 53 is a coarse mesh filter, and the nominal pore diameter is about 5 microns. On the other hand, the second filter 54 is a fine mesh filter, and the nominal pore diameter is about 0.5 microns. The role of the first filter 53 is to remove substances larger than the coliform group to be measured. The role of the second filter 54 is to remove all microorganisms including coliform bacteria.
[0072]
Next, the operation of the microorganism measuring apparatus according to the seventh embodiment will be described. However, since the basic operation of this microorganism measuring apparatus is the same as that in the sixth embodiment (or the first embodiment), only the parts different from these will be described. In the seventh embodiment, before the operation according to the sixth embodiment (or the first embodiment) is performed, both the three-way solenoid valves 47 and 48 are switched to the ef side and the gh side, respectively ( Set). Then, the first three-way solenoid valve 7 is switched (set) to the ab side, and the peristaltic pump 11 is driven. The subsequent series of operations is almost the same as in the case of the sixth embodiment (or the first embodiment), and will be referred to as a “first operation” below.
[0073]
And after completion | finish of 1st operation | movement, both the three-way solenoid valves 47 and 48 are each switched to the ef 'side and the gh' side, and here, the 1st three-way solenoid valve 7 is the ab side. Is confirmed, the peristaltic pump 11 is driven and the same operation is repeated. Hereinafter, this series of operations will be referred to as a “second operation”. Thus, the difference in the production rate of 4-methylumbelliferone determined by the first operation and the second operation is calculated, and from this difference, the previously prepared calibration curve for the number of E. coli groups is used. The number of groups is calculated.
[0074]
Next, effects obtained by the microorganism measuring apparatus according to the seventh embodiment that operates in this manner will be described. In the first operation, microorganisms having β-D-galactosidase, such as Candida and filamentous fungi, are physically larger than the coliforms, and therefore are removed by the first filter 53. That is, the size of the coliform group is about 0.5 to 3 microns, whereas Candida is about 5 to 10 microns, and the filamentous fungus is entangled with filaments and is about 10 microns or more. Therefore, Candida and filamentous fungi can be easily removed by the first filter 53 having a nominal pore diameter of 5 microns. As described above, since the microorganisms that cause the error can be excluded in advance due to the change in the microflora in the sewage, there is an advantage that the measurement error is reduced.
[0075]
Moreover, the activity value of (beta) -D-galactosidase which is not contained in microorganisms but is melt | dissolving in water by 2nd operation | movement can be calculated | required. Therefore, by subtracting the 4-methylumbelliferone production rate obtained in the second operation from the 4-methylumbelliferone production rate obtained in the first operation, the influence of the background can be removed and measured. The error can be further reduced.
[0076]
Embodiment 8 FIG.
Embodiment 8 of the present invention will be described below. The basic configuration or mechanical configuration of the microorganism measuring apparatus according to the eighth embodiment is the same as that of the microorganism measuring apparatus according to the seventh embodiment shown in FIG. 5, and only the composition of the mixed reagent is different. Therefore, in order to avoid duplication of explanation, portions different from those of the seventh embodiment will be mainly described below.
[0077]
In the microorganism measuring apparatus according to the eighth embodiment, the components of the mixed solution previously placed in the mixed reagent container 13 include 4-MUG, phosphate buffer, surfactant, and the effect on the activity of coliforms. And antibiotics that inhibit fungal activity. This point is different from the seventh embodiment. Specifically, it is desirable that such an antibiotic is amphotericin B, fluconazole or the like known as an antifungal agent. By mixing any of these reagents, enzyme activities such as Candida bacteria having β-D-galactosidase activity other than coliforms can be reduced, and the factor that the activity value is excessively evaluated can be removed. There is an effect that can be done. Note that the operation of the microorganism measuring apparatus is the same as that in each of the embodiments described above, and a description thereof will be omitted.
[0078]
【The invention's effect】
Since each microorganism measuring device according to the present invention is configured as described above, the following effects can be obtained.
In the flow injection type microorganism measuring apparatus including the first mixing unit, the reaction unit, and the detection unit according to the first aspect of the present invention, the reaction unit is maintained at a predetermined temperature, while the reaction unit has a predetermined value. A mixture of the first reaction reagent and the sample solution remaining for a certain period of time is sent to the detection unit in a predetermined amount. For this reason, it is possible to rapidly detect or measure the presence mode, number, or concentration of microorganisms contained in the sample solution, the degree of microbial contamination, or the like with high accuracy and low cost.
[0079]
According to the microorganism measuring apparatus of the second aspect of the present invention, a part of the mixture of the first reaction reagent and the sample solution remaining in the reaction unit for a predetermined time is intermittently or continuously sequentially supplied to the detection unit. Since it is sent, the measurement error can be further reduced.
[0080]
According to the microorganism measuring apparatus of the third aspect of the present invention, the first reaction reagent is at least one of a substance that generates a fluorescent substance, a buffer solution that maintains a constant hydrogen ion concentration, and a surfactant. Measurement error can be further reduced.
[0081]
According to the microorganism measuring apparatus of the fourth aspect of the present invention, since the reaction part is formed of a coiled tube, highly sensitive measurement can be performed and a space-saving apparatus can be obtained.
[0082]
According to the microorganism measuring apparatus of the fifth aspect of the present invention, any one of an ultraviolet lamp, a black light, and a xenon flash light is used as an excitation light source. Obtainable.
[0083]
According to the microorganism measuring apparatus of the sixth aspect of the present invention, the second mixing unit for injecting the second reaction reagent for increasing the sensitivity of the detection unit is provided between the reaction unit and the detection unit. It is possible to perform highly sensitive automatic measurement.
[0084]
According to the microorganism measurement apparatus of the seventh aspect of the present invention, the second reaction reagent for injecting the second reaction reagent for stopping the reaction between the reaction reagent and the substance possessed by the microorganism between the reaction part and the detection part. Since the mixing section is provided, it is possible to perform highly sensitive automatic measurement.
[0085]
According to the microorganism measuring apparatus of the eighth aspect of the present invention, in the first mixing section or the reaction section, the tube diameter and the flow rate of the mixture of the first reaction reagent and the sample liquid are such that the Reynolds number is Since it is set or controlled to be 1000 or more (preferably 2000 or more), highly sensitive automatic measurement can be performed.
[0086]
According to the microorganism measuring apparatus of the ninth aspect of the present invention, the flow rate of the mixture of the first reaction reagent and the sample liquid is 1000 or more (preferably 2000 or more) at the reaction temperature. Therefore, it is possible to perform highly sensitive automatic measurement.
[0087]
According to the microorganism measuring apparatus of the tenth aspect of the present invention, the storage tank that temporarily stores the sample solution in the previous stage of the first mixing unit, and at least one of the storage tank and the first mixing unit is set to a predetermined temperature. Since the holding means is provided, it is possible to perform highly sensitive automatic measurement.
[0088]
According to the microorganism measuring apparatus of the eleventh aspect of the present invention, since the container heat retaining means for retaining the container for retaining the first reaction reagent at a predetermined temperature is provided, the load of maintenance is reduced and the service life is long. It becomes possible to make it an apparatus.
[0089]
According to the microorganism measuring apparatus of the twelfth aspect of the present invention, since the first reaction reagent is controlled so as to be maintained at 10 ° C. or higher and 20 ° C. or lower, the maintenance load is reduced and the apparatus has a long life. It becomes possible.
[0090]
According to the microorganism measuring apparatus of the thirteenth aspect of the present invention, since the first filter unit that allows the microorganisms to be measured to pass but does not allow the microorganisms other than the objects to be measured or the suspended particulate matter to pass therethrough is provided. Therefore, it is possible to perform measurement with a small measurement variation error.
[0091]
According to the microorganism measuring apparatus of the fourteenth aspect of the present invention, the second filter unit that does not allow all microorganisms to pass through, the pipe that forms a separate flow path from the second filter unit, the second filter unit, Since a switching valve for switching the flow path with respect to the pipe is provided, highly sensitive measurement can be performed.
[0092]
According to the microorganism measuring apparatus according to the fifteenth aspect of the present invention, the second filter unit that does not allow all the microorganisms to pass through the flow path different from the first filter unit, upstream of the first mixing unit, Since the switching valve for switching the flow path between the first filter unit and the second filter unit is provided, highly sensitive measurement can be performed.
[0093]
According to the microorganism measuring apparatus of the sixteenth aspect of the present invention, the first reaction reagent does not inhibit the catalytic enzyme reaction of the microorganism to be measured, but inhibits the catalytic enzyme reaction of the microorganism not to be measured. Since it contains a substance, it is less susceptible to seasonal microbiota changes, and it is possible to perform measurements with little measurement error.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a system configuration diagram of a microorganism measuring apparatus according to first to fourth embodiments of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the relationship between the β-galactosidase activity value and the Reynolds number in the microorganism measuring apparatus according to the fourth embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a system configuration diagram of a microorganism measuring apparatus according to a fifth embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a system configuration diagram of a microorganism measuring apparatus according to a sixth embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a system configuration diagram of the microorganism measuring apparatus according to the seventh to eighth embodiments of the present invention.
[Explanation of symbols]
1 tank, 2a piping, 2b piping, 3 pump, 4 water storage tank, 5 piping, 6 piping, 7 1st three-way solenoid valve, 8 piping, 9 ion exchange water storage container, 10 piping, 11 perista pump, 12 1st mixing part , 13 Mixed reagent container, 14 Calibration mixed reagent container, 15 Pipe, 16 Second three-way solenoid valve, 17 Pipe, 18 Pipe, 19 Peristaltic pump, 20 Two-way solenoid valve, 21 Pipe, 22 Pipe, 23 First reaction part, 24 constant temperature bath, 25 second mixing section, 26 alkaline liquid container, 27 piping, 28 perista pump, 29 two-way solenoid valve, 30 piping, 31 second reaction section, 32 detection section, 33 flow cell, 34 excitation lamp, 35 filter 36 Filter, 37 Photomultiplier tube, 38 Piping, 39 Waste container, 40 Cable, 41 AD conversion board, 42 Cable, 43 Computer, 44 cable, 45 sequencer, 46 thermostat for container, 47 third three-way solenoid valve, 48 fourth three-way solenoid valve, 49 pipe, 50 pipe, 51 pipe, 52 pipe, 53 first filter, 54 second filter.

Claims

A first mixing unit that mixes a first reaction reagent and a sample solution containing microorganisms by driving a pump, and a reaction between the first reaction reagent and a substance possessed by the microorganisms is performed after the first mixing unit. In a flow injection type microorganism measuring apparatus provided with a reaction part to be detected and a detection part for detecting a product of the reaction in a subsequent stage of the reaction part,
Heat retaining means for maintaining the reaction part at a predetermined temperature;
Control means is provided for controlling the flow of the mixture so that the mixture of the first reaction reagent and the sample solution stays in the reaction unit for a predetermined time and the mixture is sent to the detection unit in a predetermined amount. ,
In the first mixing part or the reaction part, the tube diameter and the flow rate of the mixture of the first reaction reagent and the sample liquid are set or controlled so that the Reynolds number is 1000 or more. Microorganism measuring device.

The microorganism measuring apparatus according to claim 1, wherein the flow rate of the mixture of the first reaction reagent and the sample solution is set so that the Reynolds number at the reaction temperature is 1000 or more in the reaction unit.

The microorganism according to claim 1 or 2, wherein the control means controls the flow of the mixture so that a part of the mixture is intermittently or continuously sent to the detection unit sequentially. measuring device.

The first reaction reagent contains at least one of a substance that generates a substance that emits fluorescence by the reaction, a buffer solution that maintains a constant hydrogen ion concentration, and a surfactant. 4. The microorganism measuring apparatus according to any one of 3.

The second mixing unit for injecting a second reaction reagent for increasing the sensitivity of the detection unit is provided between the reaction unit and the detection unit. The microorganism measuring apparatus as described.

A second mixing section for injecting a second reaction reagent for stopping the reaction between the first reaction reagent and the substance of the microorganism is provided between the reaction section and the detection section. The microorganism measuring apparatus according to any one of claims 1 to 4 .

The microorganism measuring apparatus according to any one of claims 1 to 6, further comprising a container heat retaining means for retaining a container for retaining the first reaction reagent at a predetermined temperature.

8. The microorganism measuring apparatus according to claim 7 , wherein the container heat retaining means keeps the temperature of the first reaction reagent at 10 ° C. or higher and 20 ° C. or lower.

The first filter unit is provided with a first filter unit that allows microorganisms to be measured to pass through, but does not allow microorganisms that are not to be measured or suspended particulate matter to pass through, in front of the first mixing unit. The microbe measurement apparatus as described in any one of -8.