JP4486508B2 - Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａからの肝保護剤アクテオシドの単離 - Google Patents

Description

（発明の分野）
植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａからの高肝保護の純粋なアクテオシドの単離プロセスであって、このプロセスは、この植物の空中部分を乾燥させる工程、この乾燥させた部分を粉末に粉砕する工程、この粉末に水またはエタノールを３〜４回浸透させて抽出物を得る工程、この抽出物を、懸濁した粒子を取り除くためにろ過して上清を得る工程、この上清を約４５℃〜５５℃で乾燥させて残渣を得る工程、この残渣をクロロホルム、酢酸エチルおよびブタノールを連続的に用いて分画する工程、ブタノール画分にメタノールを添加した後、この画分をＳｉＯ_２の吸着クロマトグラフィーに供する工程、この吸着した画分をガラスカラムに充填する工程、このカラムを、次第に増加する極性のメタノール：クロロホルムの溶媒で溶出して、さらなる画分を得る工程、およびこのプロセスをもう１回繰り返す工程、この画分をカラムクロマトグラフィーに供して画分を得る工程、この画分を減圧下で濃縮してアクテオシドを残渣として得る工程を包含する、プロセス；ならびに植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａ由来の純粋なアクテオシドを用いて被験体を有効に肝保護する方法であって、適切な低用量のアクテオシドを被験体に投与する工程を包含する上記方法。

（発明の背景）
フェニルエタノイドは、Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａおよびフジウツギ種のような植物に存在すると報告されているクラスの化合物である（Ｑｕａｎｂｏ Ｘｉｎｇ、Ｋｏｊｉ Ｈａｓｅら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ、６４、１２０〜１２５（１９９８）；Ｐｅｔｅｒ Ｊ．ＨｏｕｇｈｔｏｎおよびＨｉｒｏｓｈｉ Ｈｉｋｉｎｏ．Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ、５５巻、１２３〜１２６（１９８９））。

フェニルエタノイド−ベルバスコシド（アクテオシドまたはクサギニン（ｋｕｓａｇｉｎｉｎ）とも呼ばれる）が、著者らによりＣｏｌｅｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａから単離され、ラットおよびマウスにおいて非常に低い用量（１．２５ｍｇ／ｋｇと２．５ｍｇ／ｋｇとの間）で非常に強い抗肝毒性／肝保護性活性を保有することが見出されたのは、初めてである。

Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａ由来の多数のフラボノイドおよび糖フラボノイドの存在が、これまでに文献に報告されている（Ｓ．Ａｚｉｚ Ａｈｍｅｄ、Ｓ．Ａ．ＳｉｄｄｉｑｕｉおよびＡｓｉｆ Ｚａｍａｎ、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２ １３２７〜２８（１９７４）；Ｓ．Ａ．ＰａｔｗａｒｄｈａｎおよびＡ．Ｓ．Ｇｕｐｔａ、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０Ｂ、６２７、（１９８１）；Ｆａｎ Ｙａｎｋ、Ｘｉｎｇ−Ｌｉ、ＨＡＮ−Ｑｉｎｇ ＷａｎｇおよびＣｈｏｎｇ−Ｒｅｎ Ｙａｎｇ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２、８６７〜６９（１９９６））。しかし、この植物由来のアクテオシドの存在は、初めて報告される。

特に、精巣細胞集団動力学に関して、この植物の雄性ラットにおける避妊活性が、以前に報告されている（Ｒ．Ｓ．Ｇｕｐｔａ、Ｒ．Ｊ．Ｙａｄａｖ、Ｖ．Ｐ．ＤｉｘｉｔおよびＭ．Ｐ．Ｄｏｂｈａｌ、Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ、７２、２３６〜４５（２００１））。

他の二種（すなわち、ニクジュヨウ種およびフジウツギ種）から単離されたアクテオシド（ベルバスコシド）の肝保護／抗肝毒性活性は報告されている（Ｑｕａｎｂｏ Ｘｉｎｇ、Ｋｏｊｉ Ｈａｓｅら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ、６４、１２０〜１２５（１９９８）；Ｐｅｔｅｒ Ｊ．ＨｏｕｇｈｔｏｎおよびＨｉｒｏｓｈｉ Ｈｉｋｉｎｏ、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ、５５巻、１２３〜１２６（１９８９））が、本発明は、別の供給源、すなわち、Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａを報告するだけでなく、ラットにおいて、１．５ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｍｇ／ｋｇの間の非常に低い用量で所望の活性が達成されることも報告する。

既に上記に記載したように、アクテオシドの肝臓保護活性／抗肝毒性活性が、インビトロおよびインビボの両方で報告されている（Ｑｕａｎｂｏ Ｘｉｎｇ，Ｋｏｊｉ Ｈａｓｅら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，６４，１２０〜１２５（１９９８））。しかし、本発明は、上記化合物が、先行技術において既に報告されたもの（Ｑｕａｎｂｏ Ｘｉａｎｇ，Ｋｏｊｉ Ｈａｓｅら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，６４．１２０〜１２５（１９９８）；Ｐｅｔｅｒ Ｊ．ＨｏｕｇｈｔｏｎおよびＨｉｒｏｓｈｉ Ｈｉｋｉｎｏ．Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，Ｖｏｌ．５５，１２３〜１２６（１９８９））のほぼ１２分の１〜２５分の１の用量で抗肝毒性活性／肝臓保護活性を示す様式での、これまでに報告されていなかった供給源からのアクテオシドの単離を記載する。さらに、先行技術において評価されたパラメーターは、ＡＬＴ（インビボ）ならびにＡＳＴおよびＭＤＡ（インビトロ）に限定されるが、一方で、本発明は、任意の肝臓保護生成物または抗肝毒性生成物の効力に関する明確な決定をもたらす全ての重要なパラメーターにおいて、実用的にアクテオシドの影響を記載する。

先行技術において報告された用量と比較したそのような低い用量でのアクテオシドの活性の理由は、その具体的単離方法が、より高純度の生成物を生じることが明確であることに起因し得る。植物化学物質中の混入物は、純粋な活性化合物の活性を深刻に脅かすことが充分に実証されているが、その相乗作用もまた存在し得る。しかし、その相乗作用について、先行技術においては何の言及も指示も存在しない。

（本発明の目的）
本発明の主要な目的は、植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａから肝臓保護物質を単離することである。

本発明の別の目的は、植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａからのアクテオシドの単離プロセスを開発することである。

本発明のなお別の目的は、Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａを使用して、被験体の肝臓を保護する方法を開発することである。

（発明の要旨）
植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａからの高肝保護の純粋なアクテオシドの単離プロセスであって、そのプロセスは、
その植物の空中部分を乾燥させる工程、
その乾燥させた部分を粉末へと粉砕する工程、
その粉末に水またはエタノールを３〜４回浸透させて、抽出物を得る工程、
その抽出物を、懸濁した粒子を取り除くためにろ過して、上清を得る工程、
その上清を約４５℃〜５５℃で乾燥させて、残渣を得る工程、
その残渣を、クロロホルム、酢酸エチルおよびブタノールを連続的に用いて分画する工程、
ブタノール画分にメタノールを添加した後、ブタノール画分をＳｉＯ_２の吸着クロマトグラフィーに供する工程、
その吸着した画分をガラスカラムに充填する工程、
そのカラムを、極性が漸増するメタノール：クロロホルムの溶媒で溶出して、さらなる画分を得る工程、およびこのプロセスを１回以上繰り返す工程、
それらの画分をカラムクロマトグラフィーに供して画分を得る工程、
それらの画分を減圧下で濃縮してアクテオシドを残渣として得る工程、
を包含する、プロセス。植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａ由来の純粋なアクテオシドを使用して、有効に被験体の肝臓を保護する方法であって、この方法は、その被験体に、適切な低用量の上記アクテオシドを投与する工程を包含する、方法。

（本発明の詳細な説明）
植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａから高肝保護の純粋なアクテオシドの単離プロセスであって、そのプロセスは、
その植物の空中部分を乾燥させる工程、
その乾燥させた部分を粉末へと粉砕する工程、
その粉末に水またはエタノールを３〜４回浸透させて、抽出物を得る工程、
その抽出物を、懸濁した粒子を取り除くためにろ過して、上清を得る工程、
その上清を約４５℃〜５５℃で乾燥させて、残渣を得る工程、
その残渣を、クロロホルム、酢酸エチルおよびブタノールを連続的に用いて分画する工程、
ブタノール画分にメタノールを添加した後、ブタノール画分をＳｉＯ_２の吸着クロマトグラフィーに供する工程、
その吸着した画分をガラスカラムに充填する工程、
そのカラムを、極性が漸増するメタノール：クロロホルムの溶媒で溶出して、さらなる画分を得る工程、およびこのプロセスを１回以上繰り返す工程、
それらの画分をカラムクロマトグラフィーに供して画分を得る工程、
それらの画分を減圧下で濃縮してアクテオシドを残渣として得る工程、
を包含する、プロセス。植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａ由来の純粋なアクテオシドを使用して、有効に被験体の肝臓を保護する方法であって、この方法は、その被験体に、適切な低用量の上記アクテオシドを投与する工程を包含する。

本発明の一実施形態において、植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａ由来の純粋なアクテオシドの単離プロセスであって、そのプロセスは、
その植物の空中部分を乾燥させる工程、
その乾燥させた部分を粉末へと粉砕する工程、
その粉末に水またはエタノールを３〜４回浸透させて、抽出物を得る工程、
その抽出物を、懸濁した粒子を取り除くためにろ過して、上清を得る工程、
その上清を約４５℃〜５５℃で乾燥させて、残渣を得る工程、
その残渣を、クロロホルム、酢酸エチルおよびブタノールを連続的に用いて分画する工程、
ブタノール画分にメタノールを添加した後、ブタノール画分をＳｉＯ_２の吸着クロマトグラフィーに供する工程、
その吸着した画分をガラスカラムに充填する工程、
そのカラムを、極性が漸増するメタノール：クロロホルムの溶媒で溶出して、さらなる画分を得る工程、およびこのプロセスを１回以上繰り返す工程、
それらの画分をカラムクロマトグラフィーに供して画分を得る工程、
それらの画分を減圧下で濃縮してアクテオシドを残渣として得る工程、
を包含する。

本発明の別の実施形態において、上記プロセスによって得たアクテオシドは、他の供給源から得たアクテオシドと比較して１２分の１〜２５分の１の低投薬量で肝保護性活性を示す。

本発明のなお別の実施形態において、上記抽出物は、水性抽出物およびアルコール抽出物である。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、全抽出物の約１．０（重量）％である。

本発明のなお別の実施形態において、植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａ由来の純粋なアクテオシドを用いて、被験体を有効に肝保護する方法であって、この方法は、その被験体に、適切な低用量の上記アクテオシドを投与する工程を包含する、方法。

本発明のなお別の実施形態において、上記投薬量は、０．５〜１０．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、経口経路を介して投与される。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、異常に増加した血清グルタミントランスフェラーゼ（ＧＰＴ）レベルを低減させる。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、異常に増加した血清グルタミントランスフェラーゼ（ＧＯＴ）レベルを低減させる。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、異常に増加した血清アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベルを低減させる。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、異常に増加した血清ビリルビンレベルを低減させる。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、異常に増加した血清トリグリセリド（ＴＧ）レベルを低減させる。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、異常に増加した脂質ペルオキシダーゼ（ＬＰ）レベルを低減させる。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、異常に減少したアルブミンレベルを増加させる。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、異常に減少した還元型グルタチオンレベルを増加させる。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、市販の肝保護剤と比較して約１０〜２０倍有効である。

本発明のなお別の実施形態において、上記アクテオシドは、肝毒性に対して約４０〜８５％の保護を提供する。

本発明は、Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａと命名された植物から最初に単離され、そして報告された、ベルバスコシドと命名された（アクテオシドまたはクサギニンともまた称される）フェニルエタノイドの、普通でなく非常に低い投薬量の抗肝毒性／肝保護性活性に関する。本発明は、特定の様式でのベルバスコシドの単離を記載し、そして異なる毒素に対する非常に低い用量での抗肝毒性／肝保護性活性を実証する。

活性化合物である、植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａ由来のアクテオシド（ベルバスコシド）は、本発明の著者らによって、最初に報告される。本著者らによって単離されたアクテオシドの確実性は、文献（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１，１１２３−１１２７（１９８２））において報告されたものと類似の^１Ｈ ＮＭＲデータおよび^１３Ｃ ＮＭＲデータによって確認された。

植物の異なる抽出物（９５％ ａｌｃ．、５０％ ａｌｃ．および水性）からのアクテオシドの単離のプロセスが、別紙１として本明細書に添付された実施例において記載される。純度を確認するＨＰＬＣグラフが、図１として含まれる。

この化合物は、別紙２として本明細書に添付された総合的な研究設計を使用することによって、肝保護性／抗肝毒性活性について生物的に評価された。生物効力および最適な用量を確立するために、この生物評価の間に研究されたパラメータは、キット（Ｃｌｏｎｉｔａｌ，ＩｔａｌｙおよびＡｃｃｕｒｅｘ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ Ｔｈａｎｅ）を使用して、好ましかった。これらのパラメータの列挙が、本明細書に添付される別紙２に与えられる。シリマリンおよびグリシルリジンを含む標準的な薬物と比較した、異なるパラメータに関する用量応答グラフが、本明細書に添付される別紙３に与えられる。

参照材料（すなわち、シリマリン、グリシルリジン）および必要とされるコントロールと比較した場合の、アクテオシドの各用量についての生物評価データが、表１に与えられ、この表は、本発明に添付されている。図２および表１から明らかであるように、肝毒素ＣＣｌ_４の投与後に比較された全てのパラメータは、１．２５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまでのアクテオシドの用量の正常レベルまで戻る、非常によい傾向を有する。本発明において研究されたすべてのパラメータを参照して、アクテオシドによって提供された全体の保護の百分率は、一般に、４０〜８０％であり、そして１０〜２０倍の投薬量のアクテオシドにおいてさえも、シリマリンによって得られるより良好である。

本発明のアクテオシドを用いてこの保護を達成するために最適な用量は、１．２５ｍｇ／ｋｇと２．５ｍｇ／ｋｇとの間である。１．２５ｍｇ／ｋｇの用量のデータが５ｍｇ／ｋｇの用量と比較される場合を除いて、統計的には、３つの用量（すなわち、１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）の間には、有意な差は観察されない（表２）。しかし、より高い用量の間（すなわち、２．５ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇとの間）では、統計学的有意性は観察されない。同時に、類似の観察が、１．２５ｍｇ／ｋｇと２．５ｍｇ／ｋｇとの間での用量の影響について、十分によく維持される。

上記発明は、実施例の形態でさらに詳細に調べられ、そして本発明の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。

（実施例１）
植物材料Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａの乾燥した空中部分（５００ｇ）を、粗い粉末に粉砕した。この粉末を、９５％エタノールで１４時間浸出した。抽出プロセスを、合計９リットルの９５％エタノールを使用して、４回繰り返した（３．０ｌ＋２．０ｌ＋２．０ｌ＋２．０ｌで４回の抽出）。４つの抽出物の全てをプールし、そして濾過して、懸濁した粒子を清澄化した。その上清を、ワイプトフィルムエバポレーター（ｗｉｐｅｄ ｆｉｌｍ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で、５０±５℃で、乾固するまでエバポレートした。得られた残渣は６０．０ｇであり（ＲＪＭ／０８６２／Ｐ０８／Ａ００１と称した）、抽出値は１２％であった。

この抽出物を、ＣＨＣｌ_３、ＥｔＯＡｃおよびｎ−ＢｕＯＨ（各々２×１リットル）で連続的に分画した。１５．０ｇのｎ−ＢｕＯＨ抽出物を、最少量のＭｅＯＨに溶解し、ＳｉＯ_２ゲル（１００〜２００メッシュ（１００ｇ））に吸着させた後に吸着クロマトグラフィーに供した。溶媒を完全に除去して、自由に流動する材料を得た。この吸着された抽出物を、内径３７．５ｍｍのガラスカラムに充填した。このカラムを、ＣＨＣｌ_３中のＭｅＯＨの百分率を次第に増加させることによって、溶媒で溶出した。各１００ｍｌの１０５の画分を収集し、そして移動相としてＥｔＯＡｃ：ＨＣＯＯＨ：Ｈ_２Ｏ：：８：１：１を使用することによって確認したＴＬＣパターンに基づいて、プールした。スポットを、新たに調製したホウ酸−ＰＥＧ ４０００溶液［ＭｅＯＨ中２−アミノエチルジフェニルボリネートの１％溶液およびＥｔＯＨ中ポリエチレングリコール４０００の５％溶液（スプレーする前に１：１ ｖ／ｖで混合した）］をスプレーすることによって、可視化した。

同じＴＬＣパターンを示す画分のうちの７つをプールし、乾燥させ、そして１００〜２００メッシュのＳｉＯ_２ゲルカラム（１：２０比）を使用する、次第に増加する極性のＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ混合物で溶出する再クロマトグラフィーに供した。各２００ｍｌの６０の画分すべてにおいて、収集した。これらの画分のうちの８つを、ＴＬＣに基づいてプールし、乾燥し、そして再度、カラムクロマトグラフィーに供した。各１００ｍｌの３０の画分を収集した。６つの画分を、減圧下で濃縮した。残渣をＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３から無色の非晶質粉末として結晶化させ、ＭｅＯＨに溶解した。Ｒｆ ０．４２（溶媒系ＥｔＯＡｃ：ＨＣＯＯＨ：Ｈ_２Ｏ：：８：１：１）において見出された化合物を、８６２−ＩＩと称した。８６２−ＩＩの純度を、以下の操作条件を使用するＨＰＬＣに基づいて確証した。
カラム：ＲＰ−１８ｅ（Ｅ−Ｍｅｒｃｋ，５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）、
移動相：アセトニトリル（Ｂ）：水中１．５％酢酸（Ａ）
流速：１ｍｌ／分
λｍａｘ：３３５ｎｍ。

この化合物を、ＮＭＲ（^１Ｈおよび^１３Ｃ）ならびにＦＡＢＭＳのデータに基づいて、ベルバスコシドとして確証した。

（実施例２）
Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａの乾燥した空中部分（５００ｇ）を粉砕し、そして５０％水性エタノールで４回（５０％ＥｔＯＨ、４×２．５ｌ）、それぞれ１４時間浸出した。４つの抽出物の全てをプールした。プールした水性抽出物を遠心分離し、透明な上清を、ワイプトフィルムエバポレーターで、５０±５℃で、乾固するまでエバポレートした。その残渣（９０ｇ）を、ＲＪＭ／０８６２／Ｐ０８／Ａ００２と称し（抽出値１８％）、ＣＨＣｌ_３、ＥｔＯＡｃおよびｎ−ＢｕＯＨで連続的に分画した。

ｎ−ＢｕＯＨ抽出物を、ＣＨＣｌ_３中ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲル（６０〜１２０メッシュ）のカラムで、クロマトグラフィーで分離した。ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ（５：１）での溶出物を、溶媒としてＣＨＣｌ_３−ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ（６：１：０．１を使用するシリカゲル（１００〜２００メッシュ）カラムで再クロマトグラフィーで分離した。ＴＬＣ上で類似の画分をプールし、乾燥させ、そしてセファデックスＬＨ−２０カラムに充填し、ＭｅＯＨで溶出して、各５００ｍｌの２つの画分を生じた。主として目標化合物（８６２−ＩＩ）を含有する第二の画分を、セファデックスＬＨ−２０でのさらなる精製に供した。カラムをＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ（３：２）で溶出して、画分を得、この画分は、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３からの結晶化の際に、無色の非晶質粉末（ＭｅＯＨに可溶、Ｒｆ ０．４２（溶媒系ＥｔＯＡｃ：ＨＣＯＯＨ：Ｈ_２Ｏ：：８：１：１））を生じた。

抽出されたＲＪＭ／０８６２／Ｐ０８／Ａ００２の標定を、８６２−ＩＩに基づいて、以下の操作条件を使用するＨＰＬＣによって実施した：
カラム：ＲＰ−１８ｅ（Ｅ−Ｍｅｒｃｋ，５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）、
移動相：アセトニトリル（Ｂ）：水中１．５％酢酸（Ａ）
流速：１ｍｌ／分
λｍａｘ：３３５ｎｍ。

この化合物を、ＮＭＲ（^１Ｈおよび^１３Ｃ）ならびにＦＡＢＭＳのデータに基づいて、ベルバスコシドとして確証した。

抽出物ＲＪＭ／０８６２／Ｐ０８／Ａ００２中の８６２−ＩＩの百分率は、０．８６であることがわかった。

（実施例３）
Ｃｏｌｅｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａ気生部分（５００ｇ）を、粗い粉末に粉砕し、次いで、２時間、９８±１℃で、脱イオン水で抽出した。抽出プロセスを、合計の水（１＋３×０．７リットル、４回の抽出）を使用して、４回繰り返した。４回の抽出物全てをプールした。プールした抽出物を遠心分離し、透明な濾液を凍結乾燥して、淡黄色無定形粉末を得た（収量９５ｇｍ）。水性抽出残渣をＲＪＭ／０８６２／Ｐ０８／Ａ００３としてコード化し（抽出値１９％）、ＣＨＣｌ_３、ＥｔＯＡｃおよびｎ−ＢｕＯＨで連続的に分画した。

ｎ−ＢｕＯＨ抽出物をＳｉＯ_２ゲル、６０−１２０メッシュ（１５０ｇｍ）の吸着クロマトグラフィーに供した。溶媒を完全に除去して、自由に流動する物質を得た。１．５インチ直径のガラスカラムに、１００ｇｍ ＳｉＯ_２ゲル、６０−１２０メッシュ（ＥｔＯＨ中）を詰めた。吸着された物質をカラムに充填した。カラムをＥｔＯＡｃで、ＭｅＯＨの割合を次第に増加させて溶出した。各々１００ｍｌの全ての１２０の画分を集め、ＴＬＣパターンに基づいてプールした（展開溶媒として、ＥｔＯＡｃ：ＨＣＯＯＨ：Ｈ_２Ｏ：：８：１：１）。新たに調製したＢｏｒｉｎａｔｅ−ＰＥＧ４０００溶液［ＭｅＯＨ中の２−アミノエチルジフェニルボリネートの１％溶液およびＥｔＯＨ中のポリエチレングリコール４０００の５％溶液（噴霧する前に１：１ｖ／ｖに混合した）］を噴霧することによってスポットを可視化した。

ＥｔＯＡｃおよび１０％ＭｅＯＨ中に溶出した画分は、同じＴＬＣパターンを示した。これらの画分をプールし、乾燥し、次いで、最小量のＭｅＯＨ中に溶解した。結晶化をメタノール溶液に少量ずつＣＨＣｌ_３を添加することによって行い、８６２−ＩＩとして特徴付けられる無色の無定形粉末を得た。

抽出物ＲＪＭ／０８６２／Ｐ０８／Ａ００３の標準化を、以下の操作条件を使用するＨＰＬＣによって、８６２−ＩＩに基づいて行った：
カラム ：ＲＰ−１８ｅ（Ｅ−Ｍｅｒｃｋ，５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）において
移動相 ：アセトニトリル（Ｂ）：１．５％酢酸（水中）（Ａ）
流速 ：１ｍｌ／分
λｍａｘ：３３５ｎｍ
この化合物をＮＭＲ（^１Ｈおよび^１３Ｃ）ならびにＦＡＢＭＳデータに基づいて、ベルバスコシドとして確立した。

抽出物ＲＪＭ／０８６２／Ｐ０８／Ａ００３中の８６２−ＩＩのパーセンテージが０．２２であることを見出した。

８６２−ＩＩ、無定形粉末、融点１４５〜１４６℃、［α］^２１−８５．６［Ｃ０．５％ＭｅＯＨ］、ＭＳ：ＦＡＢＭＳ、［Ｍ＋Ｎａ］^＋ｍ／ｚ６４７が、公知のフェニルプロパノイド、すなわち、ベルバスコシド（アクテオシド）；［β−（３’，４’−ジヒドロキシフェニル）エチル−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル（１→３）−β−Ｄ−（４−Ｏ−カフェオイル）−グルコピラノシド］であることを見出した。構造を、文献（Ａｎｄａｒｙ Ｃ．，Ｗｙｌｄｅ，Ｒ．Ｌａｆｆｉｔｅ Ｃ．，Ｐｒｉｖａｔ Ｇ．およびＷｉｎｔｅｒｎｉｔｚ Ｆ．；Ｌａｂｏｒａｔｉｅ ｄｅ Ｂｏｔａｎｉｑｕｅ ｅｔ Ｃｒｙｐｔｏｇａｍｉｅ，Ｆａｃｕｌｔｅ ｄｅ Ｐｈａｒｍａｃｉｅ．３４０００ Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ．Ｆｒａｎｃｅ；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１（５），１１２３−１１２７（１９８２））に報告されるデータと類似の^１Ｈ ＮＭＲデータおよび^１３Ｃ ＮＭＲデータによって最終的に確認した。

研究設計
１．動物：シロネズミ（Ｗｉｓｔａｒ，１５０〜１８０ｇ）いずれかの性別
シロマウス（Ｓｗｉｓｓ，２５〜３０ｇ）いずれかの性別
２．肝細胞毒素：四塩化炭素（ＣＣｌ_４）
３．研究：予防
４．処置スケジュール：毒素の４８時間前、２４時間前、０２時間前、および毒素の０６時間後；試験物質／参照標準の最後の処置の１８時間後に血液および肝臓サンプルを収集
５．用量：
アクテオシド：０．６２５ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、および５．０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．
シリマリン（Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）：５０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．
グリシルヒジン（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ）：１００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．
ＣＣｌ_４：流動パラフィン中１ｍｌ／ｋｇ ｐ．ｏ．（１：１）
６．パラメータ
血清
ビリルビン：Ｃｌｏｎｉｔａｌ，２４０３０−Ｃａｒｖｉｃｏ（ＢＧ）−Ｉｔａｌｙによって供給されるキットを使用することによるＪｅｎｄｒａｓｓｉｋ法
トリグリセリド：Ａｃｃｕｒｅｘ ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｖｔ．Ｌｔｄ．，Ｔｈａｎｅによって供給されるキットによる酵素的ＧＰＯ−ＰＯＤ法
アルブミン：Ａｃｃｕｒｅｘ ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｖｔ．Ｌｔｄ．，Ｔｈａｎｅによって供給されるキットによる比色Ｂ．Ｃ．Ｇ．法
トランスアミナーゼ（ＡＬＴ，＆ ＡＳＴ）：アミノ基転移反応によって形成されるピルベートを、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンとの反応後に分光光度的に決定した（ＲｅｉｔｍａｎおよびＦｒａｎｋｅｌ，１９５７）
ＡＬＰ：アルカリ性溶媒中で形成されるｐ−ニトロフェノールを、基質としてリン酸ｐ−ニトロフェニルを使用して分光光度的に測定した（ＷａｌｅｒおよびＳｃｈｕｔｔ，１９７４）。
肝臓ホモジネート：
ＧＳＨ：これは、ＤＴＮＢとの反応による除タンパク質後に決定した（Ｄａｖｉｄ１９８７によって改変されたＥｌｌｍａｎ１９５９）
脂質過酸化：チオバルビツール酸反応物質を、５３５ｎｍで分光光度的に決定した。ＢｕｅｇｅおよびＡｕｓｔ（１９７８）の方法による。
肝臓保護活性：
肝臓保護活性（Ｈ）を以下の式によって計算した：
Ｈ＝［１−（ＴＣ−Ｖ／ＶＣ−Ｖ）］×１００
ここで、ＴＣ、ＶＣ、およびＶは、それぞれ、薬物＋毒素処置群の動物、ビヒクル＋毒素の処置群の動物、およびビヒクル処置群の動物である。

図１は、純度を確認するＨＰＬＣグラフを示す。 図２は、アクテオシド、シリマリン、およびグリシリジアの比較の肝保護性活性（％）を示す。

Claims (3)

1. 植物Ｃｏｌｅｒｂｒｏｏｋｅａ ｏｐｐｏｓｉｔｉｆｏｌｉａからのアクテオシドの単離方法であって、該方法は、以下：
   ａ．該植物の空中部分を乾燥させる工程、
   ｂ．該乾燥させた部分を粉末に粉砕する工程、
   ｃ．該粉末に水またはエタノールを３〜４回浸透させて、抽出物を得る工程、
   ｄ．該抽出物を、懸濁した粒子を取り除くためにろ過して、上清を得る工程、
   ｅ．該上清を４５℃〜５５℃で乾燥させて、残渣を得る工程、
   ｆ．該残渣を、クロロホルム、酢酸エチルおよびブタノールを連続的に用いて分画する工程、
   ｇ．ブタノール画分にメタノールを添加した後、該画分をＳｉＯ_２の吸着クロマトグラフィーに供する工程、
   ｈ．該吸着した画分をガラスカラムに充填する工程、
   ｉ．該カラムを、次第に増加する極性のメタノール：クロロホルムの溶媒で溶出して、さらなる画分を得る工程、
   ｊ．工程ｉ由来の画分をさらにゲルカラムクロマトグラフィーに供し、該ゲルカラムを次第に増加する極性のメタノール：クロロホルムの溶媒で溶出して、さらなる画分を得る工程、
   ｋ．工程ｉの画分および工程ｊの画分を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に基づいてプールする工程、
   ｌ．工程ｋの画分をカラムクロマトグラフィーに供して画分を得る工程、
   ｍ．該画分を減圧下で濃縮してアクテオシドを残渣として得る工程、
   を包含する、方法。
2. 工程（ｃ）で得られる前記抽出物が、水性エタノールに浸透される、請求項１に記載の方法。
3. 前記アクテオシドが、前記抽出物の１．０％（重量％）である、請求項１に記載の方法。

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