JP4489431B2 - 喘息の診断に用いる方法および組成物 - Google Patents

Description

本発明は、喘息の診断に関するものである。具体的には、本発明は、特定のタイプの治療に反応する喘息患者と反応しない喘息患者とを識別し、それによって前記疾患の治療管理を能率的にするための組成物および方法を提供する。

本明細書では、本発明が関係する技術分野をさらに十分に説明するために、いくつかの出版物を著者名、出版年、出版ジャーナルによって括弧内で参照している。これらの各文献および特許文書の開示は、本明細書において参照によって組み込まれる。

欧米人口の５％もの人が喘息にかかっていると考えられ（Ｆｌｅｍｉｎｇら，ＢＭＪ ２９４：２７９−２８３，１９８７）、喘息は小児期に最も多くみられる慢性疾患であり、全小児の２０〜２５％が今までに喘鳴を経験している。１９世紀および２０世紀の医学の進歩は、喘息を診断できる疾患として確立させたが、喘息は分類が難しい異成分からなる健康問題である（Ｋａｌｉｎｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２５８：２８５１−２８７１，１９８７）。最近の統計では、ワイオミング州が米国で第１位の男性肺疾患の死亡率であることが示されている（Ａｍｏｄｉｏら，Ｌａｄｉｅｓ Ｈｏｍｅ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｐｐ ２００，１９９８）。病因学的分類によれば、喘息には外因性つまりアトピー性喘息と、内因性つまり特発性喘息との２種類が存在する（Ｆａｌｌｉｅｒｓら，Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ｖｏｌ．５３，ｐａｇｅｓ １１３−１１７，１９８４）。現在の研究では、喘息はマスト細胞、Ｔリンパ球（特にＴｈ_２細胞）、マクロファージ、顆粒球、血小板、好塩基球、上皮細胞などの様々な細胞が関与し、気管支の反応性が亢進した慢性炎症性疾患として特徴付けられている（Ｃｈａｎａｒｉｎら，Ｄｒｕｇｓ，Ｖｏｌ．４７，ｐａｇｅｓ １２−２４，１９９４；Ｅｉｎａｒｓｓｏｎら，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｖｏｌ．７６２，ｐａｇｅｓ ８９−１００）。喘息は臨床的にも病理学的にも特徴付けることができる。臨床的には、喘息は間欠的な喘鳴、息切れ、および時に痰の出る咳を生じる再発性の疾患とすることができる。病理学的には、喘息の特徴は、平滑筋の収縮、粘膜の浮腫、炎症、および粘液分泌のために気道が閉塞することなどである（Ｋａｌｉｎｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２５８：２８５１−２８７１，１９８７）。この疾患には太い気道と細い気道のいずれも関与するが、喘息の病態生理学的現象として認識されているのは、細い気道要素（小気管支および細気管支）の減少により、気道に抵抗性が生じ、努力呼気肺活量と流速が低下し、肺の空気トラップが過膨張することである。多数の生物化合物が、喘息の誘発と促進との両方に関与していることが示された。

例えば、喘息反応はアスピリンの摂取と運動によって誘発されうる。喘息反応の症状は、急速な収縮刺激期、後半の持続期、亜急性の慢性炎症期の３段階に分けることができる（Ｈｏｌｇａｔｅら，Ｃｌｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ｖｏｌ．１５，ｐａｇｅｓ ２２１−２３４，１９８５；Ｋａｙ，Ａｓｔｈｍａ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｐｐ １−１０，１９８６）。前記即時型の反応は、通常、いずれもプロスタグランジンおよびロイコトリエン科である、ヒスタミンおよび収縮刺激作用を持つアラキドン酸代謝物が放出される肺のマスト細胞の活性化と関連している。しかし、ヒスタミンと、ロイコトリエンＣ_４、Ｄ_４、およびＥ_４とは重篤な喘息反応で主要な役割を果たしているように思われるが、これだけが関与している媒介物質ではない。いくつかのサイトカインが、直接刺激あるいはそれがない場合は症状の軽減のどちらかによって、喘息に関与しているように思われる。

１９８０年からの公衆衛生統計では、米国における喘息の有病率は４．３％、または９５０万例以上の個々の症例があることが示している。さらに、一般的に、有病率は小児および高齢の成人集団で最も高い（Ｐｅｎｄｅｒｓｅｎら，Ａｌｌｅｒｇｙ，Ｖｏｌ．３６，ｐａｇｅｓ １７５−１８１；Ｗｉｌｄｅｒら，Ｖｉｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ １−４９，１９７３）。喘息の有病率を正確に診断することが難しいのは、診断に様々な方法が用いられていることによる可能性がある。有病率を検討する方法には、質問票、電話調査、身体検査、肺機能検査、アレルゲン皮膚検査、気管支負荷試験を利用するものなどがある（Ｂｏｎｎｅｒ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｓｔ Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．５，ｐａｇｅｓ ５５７−５６５，１９８４）。喘息反応および関与する代謝物はすべての患者において同じではないので、正確な診断はより困難である。明らかに、特定の種類の薬剤を投与することで恩恵を受ける喘息患者を特定するための正確な診断方法が必要である。

本発明によれば、変質したサイトカインおよびロイコトリエンのプロフィールを基にした、改善された喘息の診断法および治療法が提供されている。本発明の方法により、臨床医は、前記疾患の治療に利用できる様々な治療プロトコールから最も利益を受ける可能性の高い喘息患者を正確に特定することができる。

本発明の１つの実施例は、患者がロイコトリエン型喘息患者か、サイトカイン型喘息患者か、あるいは喘息患者かを決定するため、識別を付けて喘息を診断する方法を有する。さらに、本発明は、サイトカイン型喘息患者がＩＬ−４型、ＩＬ−１６型、ＧＭ−ＣＳＦ型かの喘息患者を決定する方法も有する。

１つの実施例では、喘息発作の症状を持つ患者が、サイトカインおよびロイコトリエンレベルの検査を受ける。ロイコトリエンおよびサイトカインはいずれも、直接ＥＬＩＳＡアッセイ、あるいは競合的蛋白結合測定法を用いて測定することができる。血液、痰、気管支洗浄液（ｂｒｏｃｈｉａｌ ｌａｖａｇｅ）、唾液など、これだけに限らないが、あらゆる体液を検査することができる。代わりに、細胞を患者から分離し、ロイコトリエンおよびサイトカインの有無と、そのレベルとを評価することもできる。また、前記方法には、前記患者に肺機能検査を施行することも含み、喘息発作の症状を示している患者の検査も含むことができる。前記方法は、喘息症状が生じた直後に実施することもでき、また適当な期間が経ってから実施される検査を含むこともできる。例えば、肺機能検査あるいは喘息発作の４〜６時間後に、次の検査を実施することができる。

本発明の別の実施例では、本発明の方法を用いた診断後、前記患者に対して適切な治療プロトコールを決定する方法も有する。ロイコトリエン型喘息患者はロイコトリエンを標的とした薬剤で治療するが、サイトカイン型喘息患者には、特定のサイトカインタイプに対する拮抗薬を投与する。そのような拮抗薬が利用できない場合は、従来のステロイド療法を施行する必要がある。

また、本発明は、喘息を識別して診断するキットも含む。このキットは、検出可能な標識を付けることができ、ロイコトリエンに結合する薬剤、またこれだけに限らないが、ＩＬ−４、ＩＬ−１６、およびＧＭ−ＣＳＦのサイトカインに結合する薬剤を制限なく含む。そのような分子は、イムノアッセイあるいはハイブリッド形成法／増幅アッセイを用いて検出可能である。従って、本発明のキットには、抗体と、検出可能な基質あるいは標識と、ポリヌクレオチドのプローブあるいはプライマーおよび管と、そのようなアッセイを行うための容器あるいは固定支持体とを含めることができる。

米国では毎年、１０００万人以上の人が喘息があると検診されている。ほとんどの治療方針が、喘息患者は同質な集団を有するという仮定に基づいている。本発明によれば、非常に明確な代謝の違いが喘息患者の集団には存在することが発見された。また、これらの代謝の違いが、臨床医を特定の治療タイプに導くのに有用であることも発見された。予備研究では、我々は、喘息患者の集団のおよそ半数が食事療法に反応し、それによって薬剤の必要性を低下させることができることを証明した（Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎら，ＡＪＣＮ Ｖｏｌ．６５，ｐａｇｅｓ １０１１−１０１７）。この予備研究では、喘息患者の集団に、メタコリンで誘導される呼吸困難回復に対する、（ｎ−３）多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）摂取の効果を決定した。（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取の効果を予測するためのイコトリエン排泄能が評価された。また、高濃度の（ｎ−３）ＰＵＦＡを摂取した後、患者の呼吸パラメータも評価された。１週間ごとの２４時間尿中ロイコトリエンレベルと共に、努力性肺活量（ＦＶＣ）と、努力呼気肺活量／秒（ＦＥＶ_１）と、最大呼気流量（ＰＥＦ）と、努力呼気流量２５％−７５％（ＦＥＦ_{２５−７５}）とが測定された。（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取が多くなると、被験者（反応者）の４０％以上でメタコリン気管支誘発試験の用量が好転した。ＦＥＶ_１、ＦＶＣ、ＰＥＦ、およびＦＥＦ_{２５−７５}の値を２０％低下させる吸入誘発量（ＰＤ_２０）は、有意な呼吸低下がみられなかったために、計算できなかった。反対に、（ｎ−３）ＰＵＦＡの摂取が増すことで、一部の患者（無反応者）がさらに呼吸容量の低下を示すようになった。高度の（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取による５シリーズのロイコトリエン排泄は、無反応者よりも反応者で有意に大きかった。（ｎ−３）ＰＵＦＡの摂取により、尿中の４シリーズ：５シリーズロイコトリエンの比率が１未満となることで、呼吸器系に利益が得られることが予測できるであろう。この所見と同様に重要なことに、無反応の集団で何が異なるのかを決定し、異なる喘息患者間でどのような先天的代謝の違いが存在しているかを決定することは、同様に重要なことになった。

従って、本発明の１つの実施例では、標準的なプロトコールに従って、患者に肺機能検査を実施する方法が提供されている。手短に言えば、メタコリン負荷を行い、直後に痰のサイトカインおよびロイコトリエンのレベルを測定する。

本発明のさらなる実施例では、様々な用量のメタコリンが患者に投与される。患者から唾液を回収し、前記サンプル中のロイコトリエンを単離し、測定する。その後、様々なメタコリン投与時のロイコトリエンのレベルによって、喘息患者をロイコトリエン陽性（反応者）あるいは陰性（中間あるいは無反応者）に分類する。ロイコトリエンレベルが高い患者はロイコトリエン型喘息とみなし、ロイコトリエンレベルが低い患者は非ロイコトリエン型喘息、つまりサイトカイン型喘息と見なされた。適当な時間の後（４、５、あるいは６時間後など）、採血を行い、血漿のＩＬ−４、ＩＬ−１６、およびＧＭ−ＣＳＦレベルが検査された。血漿、唾液、痰のプロフィールに基づいて、サイトカイン型喘息患者が支配的にＩＬ−４型、ＩＬ−１６型、あるいはＧＭ−ＣＳＦ型喘息かが決定された。

従って、本発明の方法により、臨床医はサイトカインおよびロイコトリエンの発現レベルのプロフィールによって、喘息患者を分類することができ、そのプロフィールを基に、適切な治療プロトコールを考案することができる。

具体的には、ロイコトリエン、インターロイキン（ＩＬ−４、ＩＬ−１６など）、およびＧＭ−ＣＳＦの発現レベルの違いが、インターロイキン型喘息と、特定のサイトカイン型喘息とを識別する方法を提供している。現在、喘息治療の費用は１ヵ月で２００ドルを超える可能性があり、そのような治療は前記診断された症例の約半数において効果がない。本発明の診断法により、臨床医は評価されている喘息患者のタイプを特定することによって、理想的な治療法を特定することができる。従って、本発明の診断法を行うことで、前記患者にとっては大きなお金の節約になり、前記臨床医にとっては治療のための正しい薬剤が選択することができるようになる。
以下の定義は、本発明の理解を促すために提供されている。

"ロイコトリエン"はエイコサノイドの代謝生成物（通常はアラキドン酸）であり、炎症とアレルギー反応の媒介のような生理活性を持つと想定されている。ロイコトリエンは中央に環を持たないという点で、関連するプロスタグランジンおよびトロンボキサンとは異なる。これらの分子は、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）との関連で発見され、共役二重結合を含むため、ロイコトリエンと命名された。文字のＡ〜Ｆは６種類の代謝物を特定し、これまでは、二重結合の数を示す下付き文字で分けられている（例えばロイコトリエンＣ_４）。

"サイトカイン"は低分子量蛋白質と類似したホルモンであり、多種類の細胞から分泌され、免疫反応の強度と持続期間を制御し、細胞間の情報伝達にも関与している。典型的なサイトカインには、インターフェロン、インターロイキン（ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１６）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびリンホカインがある。

"免疫反応"とは、ウイルス抗原などの抗原によって、免疫系が機能している宿主で生じる任意の反応を示す。免疫反応は、免疫グロブリンあるいは抗体の生成が関与する体液性か、様々な種類のＢリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、抗原提示細胞などが関与する細胞性かのどちらか、またはその両方であってもよい。また、免疫反応には、サイトカイン、リンホカインなどの様々なエフェクター分子の生成あるいは産生も関与しうる。免疫反応はｉｎ ｖｉｔｒｏと、様々な細胞系あるいは動物系との両方で測定することもできる。そのような免疫反応は、前記宿主を疾患から守るために重要であり、予防あるいは治療に用いることができる。

"抗体"あるいは"抗体分子"は、抗体やそのフラグメントを含む、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリンである。前記用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、および二重特異性抗体を含む。本明細書で用いられるように、抗体あるいは抗体分子は、そのままの免疫グロブリン分子と、当技術分野でＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）、および遺伝子組換えにより作成したＳｆｖとして知られるそれらの部分のような免疫グロブリン分子の中の免疫活性がある部分と、の両方を考慮する。

抗体に関して、"免疫学的に特異的"という用語は、１つ以上の蛋白質エピトープあるいは対象化合物に結合する抗体を指すが、これは抗原性のある生物分子が混合したサンプル中では、実質的に他の分子を認識、結合することはない。

"直接結合アッセイ"は、当技術分野で一般的に知られており、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）の方法に従って行われる。一般に、直接結合アッセイとは、抗ペプチド抗体あるいはリガンドを含む抗血清を加え、ペプチドに結合させるアッセイを指す。その後、前記抗体あるいはリガンドの結合を直接標識によって検出するか、あるいは１次抗体あるいはリガンドに結合する２次標識抗体あるいはリガンドかによって検出する。

"競合結合アッセイ"は、当技術分野で一般的に知られており、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）の方法に従って行われる。一般に、競合結合アッセイとは、特定の抗体に対する既知の標識リガンドの結合を遮断する能力により、未知物質を検出、定量するアッセイを指す。

本明細書で用いる"固体基質"という表現は、ろ紙、多穴ディッシュ、マイクロチップ、誘導体化した磁粉などを含むが、これだけに限らない。

"タグ"、"タグ配列"、あるいは"蛋白質タグ"という用語は化学成分を指し、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、あるいはアミノ酸のいずれかであり、ペプチド、あるいは蛋白質などの化学物質であり、別の配列に加えた時に、特にその配列あるいは蛋白質の検出または単離にさらに有用性が加わるか、有用な特徴を与える。従って、例えば、プライマーあるいはプローブ配列に、ホモ重合体の核酸配列や、捕捉したオリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を加えることができ、その後、延長した生成物およびハイブリダイズした生成物が単離しやすくなる。蛋白質タグの場合は、ヒスチジン残基（連続した４〜８個のヒスチジン残基）を蛋白質のＮ末端あるいはＣ末端に加えることができ、金属キレートクロマトグラフィーにより蛋白質が単離しやすくなる。代わりに、アミノ酸配列、ペプチド、蛋白質、エピトープを発現した融合パートナー、または特定の抗体や他の分子（例えば、フラグエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、Ａ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素蛋白質、プロテインＡ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合蛋白、マルトース結合蛋白、キチン結合蛋白、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの膜貫通型エピトープ）と反応する結合決定基をタンパク質に加えることができ、アフィニティークロマトグラフィーや免疫親和性クロマトグラフィーなどの方法で蛋白質が単離しやすくなる。化学タグ分子には、ビオチンなどの分子が含まれ、核酸あるいは蛋白質に加え、アビジン試薬などとの相互作用により単離、検出しやすくすることができる。他に多数のタグ成分が知られており、当業者によって想像することができるものである、この定義の範囲内であると考えられる。

"Ｎ−３多価不飽和脂肪酸"は魚に発見され、特定部分の喘息患者集団では、摂取することによりメタコリンで誘導される呼吸困難を回復させることが分かった。

"サンプル"あるいは"患者サンプル"あるいは"生物サンプル"は、一般に特定のロイコトリエンあるいはサイトカインプロフィールを検査することができるサンプルを指す。サンプルには、血液、血清、血漿、尿、唾液、痰、気管支洗浄液などが含まれるが、これだけに限らない。最も好ましくは、前記サンプルは、唾液、痰、血液、および／または血漿サンプルである。

"肺機能検査"は、肺に取り込まれる空気の量と、それがどのくらい速く放出されるかを測定する検査である。肺機能検査は、肺機能に対する様々な疾患や成分の影響を決定するために、実施されることも多い。例えば、肺機能検査は喘息発作の性質を評価、モニターするために用いられ、また喘息発作に対する、ある薬剤に考えられる治療効果を測定するためにも用いることができる。そのような検査のガイドラインは、当技術分野で標準となっており、例えばＴｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏｌ １６１：３０９−３２９，２０００などにみられ、図３で説明している。簡単に述べると、肺機能を変化させる薬剤を投与し、適当な時間、呼吸をモニターする。そのような薬剤には、メタコリン、ヒスチジン、マニトール、アデノシン、ＦＥＬＤ（ネコのふけ）、チリダニアレルゲン、および特定のアレルゲンが含まれるが、これだけに限らない。

"メタコリン負荷"とは、メタコリンを投与し、肺機能を評価する肺機能検査の一種である。本明細書で述べる"メタコリン負荷"は、"従来のメタコリン負荷"あるいは「連続メタコリン負荷」である。典型的には、従来のメタコリン負荷では、図３に示したものと同様のプロトコールを用いる。従来のメタコリン負荷で用いるメタコリンの通常濃度および蓄積量は、０．０２５ｍｇ／ｍｌ（０．１２５単位）、０．２５ｍｇ／ｍｌ（１．３７５単位）、２．５ｍｇ／ｍｌ（１３．８７５単位）、１０ｍｇ／ｍｌ（６３．８７５単位）とすることができ、１単位はメタコリン１ミリグラムに相当する。典型的には、連続メタコリン負荷では、低用量のメタコリンを用いる。連続メタコリン負荷で考えられるメタコリンの濃度と蓄積量は、０．０２５ｍｇ／ｍｌ（０．１２５単位）、０．２５ｍｇ／ｍｌ（１．３７５単位）、０．５ｍｇ／ｍｌ（３．８７５単位）、１ｍｇ／ｍｌ（８．８７５単位）、２ｍｇ／ｍｌ（１８．８７５単位）、２．５ｍｇ／ｍｌ（３１．３７５単位）、１０ｍｇ／ｍｌ（８１．３７５単位）、２５ｍｇ／ｍｌ（２０６．３７５単位）である。連続メタコリン負荷では、メタコリンを単一用量とすることができる。この単一用量の負荷では、メタコリンの総量として１５ｍｇ／ｍｌまたはそれ以下、あるいは８ｍｇ／ｍｌまたはそれ以下を投与する。

Ｉ．ロイコトリエン特異的およびインターロイキン特異的な抗体の調製
本発明では、ロイコトリエンＣ_４、Ｄ_４、およびＥ_４と、インターロイキン４および１６をと含む、ロイコトリエンおよびサイトカインに免疫特異的に結合できる抗体と、本発明の診断法に用いる顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と、を提供する。前記分子を検出する抗体は、標準的なプロトコールに従った一般的な方法で調整したが、Ｒ & Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）およびＡｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．（ミシガン州アナーバー）から市販されているものを購入することもできる。

インターロイキン蛋白質あるいはロイコトリエンを含む、サイトカインに対する免疫特異的なポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体は、喘息患者を評価するために分子を検出、定量するように設計された様々なアッセイで用いられる。そのようなアッセイには、（１）フローサイトメトリック分析、（２）唾液、痰、血液、気管支洗浄液、および血漿を含む、患者の体液中にあるサイトカインおよび／またはロイコトリエンの免疫化学的検出／特定、（３）様々な細胞抽出液の免疫ブロット分析（例えば、ドットブロット、ウエスタンブロット）があるが、これだけに限らない。さらに、抗サイトカイン抗体あるいは抗ロイコトリエン抗体をサイトカイン、インターロイキン蛋白質、および関連するサブユニットの精製（アフィニティーカラム精製、免疫沈降など）に用いることができる。

ＩＩ．前記開示された方法を実施するためのキット
生物サンプル中のＩＬ−４、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦ、ロイコトリエンＣ_４、Ｄ_４、およびＥ_４を含むロイコトリエンおよびサイトカインを検出しやすくするためのキットが提供される。サイトカインおよびロイコトリエンを検出する典型的なアプローチは以下の通りである：
ａ）患者からのサンプル中のＩＬ−４、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびロイコトリエンの有無を決定し、存在する場合には、その分子の発現レベルを決定する。または、
ｂ）これだけに限らないが、サイトカインおよび／またはロイコトリエンに結合する抗体、あるいはその合成に関与する核酸およびハイブリッドを形成し、それを任意に増幅する核酸配列（ｍＲＮＡなど）を含む、サイトカインあるいはロイコトリエンを検出することができる、特定の結合分子を１かそれ以上用いる。サイトカインおよびロイコトリエンは、ＩＬ−４、ＩＬ−１６、ＩＬ−９、ＧＭ−ＣＳＦ、ロイコトリエンＣ_４、ロイコトリエンＤ_４、およびロイコトリエンＥ_４、あるいはそれらの任意の組み合わせから成るグループから選択される。随意的に前記特定の結合分子が標識を有することで、前記特定の結合分子のその結合パートナーへの結合を検出できるようなる。

"特定の結合ペア"は特定の結合分子（ｓｂｍ）および結合パートナー（ｂｐ）を有し、互いに特定の特異性を持ち、通常の状態では、他の分子に優先して互いに結合する。特別な結合ペアの例は、抗原と抗体、リガンドと受容体、および相補的なヌクレオチド配列である。当業者であれば他にも多くの例を知っており、本明細書に記載される必要はない。さらに、"特定の結合ペア"という用語は、前記特定の結合分子および前記結合パートナーのいずれかあるいは両方が、高分子の一部を有する場合にも当てはまる。前記特定の結合ペアが核酸配列である実施例では、前記アッセイの条件下で互いにハイブリッド形成できる長さとし、好ましくは１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは１５あるいは２０ヌクレオチド長以上とする。

ＤＮＡに基づく方法を利用し、サイトカインおよびロイコトリエン型喘息患者を識別する好適な実施例では、前記サンプル中の核酸が例えばＰＣＲを使って最初に増幅され、前記サンプル中にある他の配列と比較される際、分析対象物の量が増加する。このため、標的配列がサンプル中にあれば、高い感度で検出することができる。しかし、この最初の工程は、当技術分野でますます重要になりつつある高感度の配列技術を利用することで、省略することもできる。

さらに別の実施例では、本発明は、結合、精製、除去、定量、あるいは一般的に検出する生物成分のための免疫検出法を提供する。一般に、免疫結合法には、蛋白質あるいはペプチドを含むことが疑われるサンプルを入手し、場合によって、免疫複合体を形成させるのに効果的な条件下で、本発明に従って前記サンプルを抗体と接触させる方法を含む。

前記免疫結合法には、サンプル中の反応を検出するか、あるいはその量を定量する方法が含まれ、この方法では、結合プロセス中に生成された免疫複合体を検出あるいは定量することが必要である。

患者の唾液からのＩＬ−４、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦ、あるいはロイコトリエンＣ_４／Ｄ_４／Ｅ_４の同時分析では、その患者がロイコトリエンＣ_４、Ｄ_４、あるいはＥ_４陽性であれば、ロイコトリエン型喘息患者と特定された。従って、Ｃ_４／Ｄ_４受容体拮抗薬であるアコレート（ザフィルルカスト）、シグレア（Ｓｉｇｕｌａｉｒ）（モンテルカスト）、ジフロ（ジロートン）などの薬剤、あるいは５リポキシゲナーゼ阻害薬および食物ｎ−３脂肪酸がそのような患者に利益をもたらすと考えられる。ＩＬ−１６、ＩＬ−４の発現レベルが上昇し、ロイコトリエンＣ_４の発現レベルが低いことが特定される場合、そのような患者は特定の新規ＩＬ−４受容体拮抗薬を投与することで利益を受けるが、基本的に前記ロイコトリエン型喘息に対する薬剤の投与では利益は得られない可能性が高い。そのような患者は中間反応者と呼ぶ。最後に、ＩＬ−１６レベルが上昇し、ＩＬ−４レベルが中等度で、ロイコトリエンＣ_４レベルが低いことが観察された場合、そのような患者は無反応者と分類される。これらの喘息患者にはＩＬ−１６あるいはＩＬ−４受容体拮抗薬を投与し、標準的なステロイド療法で利益を受ける可能性が最も高い。

抗原の検出に関して、前記分析される生物サンプルは、サイトカイン（インターロイキンを含む）あるいはロイコトリエンを含むことが疑われるすべてのサンプルである。適切なサンプルとしては、唾液、痰、気管支洗浄液、単離細胞、細胞膜の標品、前記蛋白質含有組成物のいずれかを分離あるいは生成した形のもの、あるいは血液およびリンパ液を含む気道組織および接触する生物体液が含まれる。

免疫複合体（１次免疫複合体）を形成させるのに有効な条件下および十分な時間の下で前記選択された前記生物サンプルを抗体と接触させることは、一般的に、単に前記組成物をサンプルに加え、抗体が存在する任意の抗原と免疫複合体を形成し、つまり結合するのに十分な時間の間、その混合液をインキュベートするという問題である。この後、通常は、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロット、あるいはウエスタンブロットの前記サンプルの抗体組成物を洗浄し、非特異的な結合抗体種を除去し、１次免疫複合体内に特異的に結合した抗体のみを検出できるようにする。

一般的に、免疫複合体生成の検出は当技術分野において周知であり、多数のアプローチを応用することで達成可能である。これらの方法は一般的に、放射性、蛍光性、生物学的、あるいは当技術分野で標準的に利用される酵素的なタグあるいは標識、そのような標識あるいはマーカーの検出に基づいている。そのような標識の利用に関する米国特許は、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、第４，３６６，２４１号などであり、それぞれ本明細書の参考文献に盛り込まれている。当然、２次抗体など、２次的に結合するリガンドを用いてさらなる利点に気付くかもしれない。前記２次抗体は、任意に色標識あるいはラテックス標識とすることができる。代わりに、ビオチン／アビジンリガンド結合配列を用いてもよい。これらの標識法および検出法は、すべて当技術分野で既知である。

本発明の免疫検出法は、喘息の診断および特性指摘において、明らかに有用である。ここで、サイトカイン（インターロイキンを含む）あるいはロイコトリエンのいずれかが含まれると疑われた、生物あるいは臨床サンプルが用いられる。

１つの広い捉え方では、本発明は、生物サンプル中のインターロイキンを含むサイトカインのレベルおよびロイコトリエンの発現レベルを検出するために用いるキットを含む。そのようなキットは、ＩＬ−４、ＩＬ−１６、およびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子に対応する核酸を増幅するためのプライマーを１対若しくはそれ以上有する。前記キットはまた、緩衝液、ヌクレオチド塩基、およびハイブリッド形成および／または増幅反応に用いるその他の組成物を有する。各溶液あるいは組成物はバイアル瓶あるいは瓶に入れることができ、すべてのバイアル瓶は市販用に箱に密に詰めておくことができる。本発明の別の実施例では、生物標本中のＩＬ−４、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびロイコトリエン抗原の検出に用いるキットを含む。そのようなキットは、ＩＬ−４、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびロイコトリエンに免疫学的に特異的な抗体あるいは抗体のフラグメントと、およびこれらの分子を含む免疫複合体の形成を評価する手段とを含んでもよい。

以下の例は、本発明の実施例を説明するために示すものであって、決して本発明を限定する意図はない。

例１
以下の資料と方法は、例１の実行を実施しやすくするために提供されている。

被験者
メタコリンに対して非特異的な気管支反応を示し、１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ_１）が７０％以上と予測された、喫煙しないアトピー体質の喘息患者３４名、および喫煙しない非喘息の健常対照被験者１７名をワイオミング州ララミー地区から募集した。全体的な健康状態、血圧に作用する薬剤の使用、喘息およびエイコサノイド合成、および魚（または魚油）の消費について、被験者を審査した。どの量においても魚油サプリメントを摂取していた被験者候補、あるいは魚の摂取パターンが１食／週以上の被験者候補は選択しなかった。出血障害があるか、血液凝固時間が遅延した既往のある患者は、この研究では考察しなかった。喘息被験者は、サルブタモール、ステロイドなどの吸入剤、およびテオフィリンの経口摂取のような様々な治療を受けていた。試験開始前の６週間の間に、上気道感染あるいは喘息の悪化がみられた被験者はいなかった。前記研究中、非ステロイド性抗炎症薬は使用できないようにした。前記研究は、ワイオミング大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｙｏｍｉｎｇ）のヒト被験者審査委員会の承認を受け、研究デザインおよび予想を注意深く説明した後、すべての参加者からインフォームドコンセントを得た。喘息被験者２９名および対照被験者１５名が研究を終了した。

参加者全員について７日間の食事記録を調査し、通常の（ｎ−６）ＰＵＦＡ摂取を決定した。前記研究中、３日間の食事分析を１回ランダムに実施し、食事パターンおよび（ｎ−６）ＰＵＦＡ摂取の変化をモニターした。被験者は１ヵ月の研究に参加し、（ｎ−３）：（ｎ−６）比率が２における、呼吸パラメータ、尿代謝物、および免疫細胞の生成物プロフィールでの（ｎ−３）ＰＵＦＡの効果を検討した。前記療法は、（ｎ−３）：（ｎ−６）ＰＵＦＡ比率を１：２とした１ヵ月の補充療法から成る。魚油の投与は、それぞれの被験者で個別に行い、３日間のランダムに行った食事記録分析を基に試験中必要であれば変更した。カプセル入り魚油は、Ｓｈａｋｌｅｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州ヘイワード）から、惜しみなく寄付された。被験者には、研究週の始めごとに、適当な数の魚油カプセルを１日の割り当て分に分けたものを与えた。

ベースラインのサンプルとするため、前記研究直前の２日前に２４時間の尿サンプルを不透明なビンに２回収集した。サンプルはギ酸で最終濃度が３ｍＭとなるまで酸性とし、最終濃度が１０％になるまでメタノールで希釈した。研究直前にベースラインの値とするため、ＦＶＣ、太い気道の許容量を評価するＦＥＶ_１、中間の気道の許容量を評価するＰＥＦ、および細い気道を評価するＦＥＦ_{２５−７５}の値を得た。４週間の魚油補充療法の期間中、各週の最終日に２４時間の尿標本を入手して、考えられるエイコサノイド代謝の連続的変化をモニターし、食事のコンプライアンスをモニターした。ベースラインと治療中の尿量を測定した後、２００ｍｌ単位でＬＴを抽出し、その後の分析用に−８０℃で冷凍した。

研究プロトコール
ベースライン時および４週間の治療期間後、患者は治験に参加している医師の診察室に行き、メタコリン（Ｐｒｏｖｏｃｈｏｌｉｎｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニュージャージー州ナットレー）負荷後のＦＶＣ、ＦＥＶ_１、ＦＥＦ２５−７５、およびＰＥＦを決定することで、呼吸状態を評価した。Ｓａｌｔｅｒ Ｌａｂシリーズ８９００ネブライザ（Ｓａｌｔｅｒ Ｌａｂｓ、カリフォルニア州アルビン）を用い、流速７〜８Ｌ／ｍｉｎ、投与合計量が０、０．１２５、１．３７５、１３．８８、６３．８８累積単位となるように、連続した濃度で連続５回吸入することで、メタコリンを投与した。すべての呼吸パラメータは５分以内に決定した。ベースラインの食塩水（ＮａＣｌ ０．９％＋フェノール０．４％、ｐＨ７．０）溶液と比較してＦＥＶ_１が２０％若しくはそれ以上低下した場合、または６３．８８累積単位を投与した場合は、前記治療を中止した。ＦＥＶ_１が１５％〜１９％低下した場合、累積単位が６３．８８を越えないところまで、その濃度あるいは次に高い濃度で負荷を繰り返した。メタコリン負荷時のＦＶＣ、ＦＥＶ_１、ＦＥＦ_{２５−７５}、およびＰＥＦの値は、Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ ２０００スパイロメーター（Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ）を使用し、前記主治医が入手した。前記被験者の半数からメタコリン負荷時に痰を採取し、分析まで−７０℃で保存した。

ロイコトリエンの分析
採取したばかりの酸性化尿２００ｍｌからおよび以下に説明する細胞培養液２ｍｌからロイコトリエンを抽出した。プロスタグランジンＢ_１（ＰＧＢ_１）１００ｎｇをその２００ｍｌ単位に加え、内部標準として用いた。メタノール１０ｍｌ、水５ｍｌ、ヘキサン５ｍｌで順次、予洗したＣ１８カートリッジ（Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ−１８，Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．，ペンシルバニア州ベルフォンテ）から固相抽出によりロイコトリエンを、単離した。サンプルをカートリッジに載せた後、カートリッジをメタノール／水１０ｍｌ（１：９、ｖ／ｖ）、水１０ｍｌ、ヘキサン５ｍｌで順次洗浄し、その後メタノール２ｍｌでＬＴを溶出した。溶出した後、その後の分析に用いるため、ＬＴの抽出液を−８０℃でメタノール中に保存した。分析では、サンプルを窒素雰囲気下で蒸発乾燥させ、得られた残留物を５ｍＭの酢酸アンモニウムと１ｍＭ ＥＤＴＡを含むメタノール：水（６５：３５、ｖ／ｖ）、ｐＨ４．６８のＨＰＬＣ溶媒システムに再溶解した。すべてのサンプルは２回分析し、平均を統計分析に用いた。前記ロイコトリエンは、Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ Ｃ−１８カラム（６ｍｍ×１２．５ｃｍ、Ｗｈａｔｍａｎ、オレゴン州ヒルズバロ）の流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分離し、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １０４０９Ａ Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ分光光時計（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、ニューヨーク州リバプール）を使って２８０ｎｍでモニタリングすることによって定量した。すべてのロイコトリエンを、それぞれ特有のＵＶ吸収スペクトルおよび既知の標準との保持時間の比較によって、特定した。ロイコトリエンは、標準物質の吸光係数を用い、内部ＰＧＢ_１標準に対して定量した（Ｏｒｎｉｎｇら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．１２０，ｐａｇｅｓ ４４−４５，１９８１）。ロイコトリエンＥ_４、Ｅ_５、およびＮ−アセチルＬＴＥ_４（Ｎ−ａｃ ＬＴＥ_４）はＣａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミシガン州アナーバー）から購入した。

細胞培養
研究開始時および（ｎ−３）脂肪酸の摂取期間後、抗凝固薬としてヘパリンを用い、各被験者から２１ｍｌの静脈全血を単離した。免疫細胞（１次末梢単球）をフィコール（ｆｉｃｏｌ）の濃度勾配をつけて単離し、ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）緩衝液中、２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで培養した。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）あるいはリポポリサッカライド（ＬＰＳ）で４８時間細胞を刺激し、サイトカイン産生を誘導するか、Ａ２３１８７で４時間刺激し、ロイコトリエン合成を刺激した。ロイコトリエンは上述のとおり分析した。以下の会社から購入したキットを用いて、ＥＬＩＳＡアッセイによって、サイトカイン、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１６を分析した。ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３はＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ニュージャージー州フランダース、ＩＬ−４およびＩＬ−５はＡｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．，ミシガン州アナーバー、ＩＬ−３、ＩＬ−８、およびＩＬ−１６はＢｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州カマリロからそれぞれ購入した。ＥＬＩＳＡアッセイはサンドイッチ法とした。検討するサイトカインに対する一次抗体は、インキュベーションによりマイクロタイタープレートに結合する。次に前記サンプルをウェルに加え、インキュベートして抗原−抗体複合体を形成させる。次に前記ウェルを３回洗い、西洋わさびベルオキシダーゼと結合した二次抗体とインキュベートする。さらに３回洗浄後、前記ウェルに過酸化水素とＴＭＢあるいは別の基質をインキュベートし、色を展開する。このアッセイで色が展開されたものを用い、サイトカインの有無を評価し、色の展開度により生合成レベルを定量する。

統計
各アッセイの複製数は、その検出力を統計的に分析して決定し、治療間の生理学的に有意な違いを検出した。前記デザインで用いた分散の推定値は、これまでの実験から計算している。例えば、食事により１５％低下した場合に、尿中のロイコトリエンレベルに重要な差があると判断した。排泄された総ＬＴを測定する方法の違い、各メタコリン投与量でのＦＶＣ、ＦＥＶ_１、ＦＥＦ２５−７５、およびＰＥＦの減少、これらのパラメータそれぞれのＰＤ_２０をＡＮＯＶＡで評価した。統計分析は、すべてＳＡＳ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州カリー）により行った。全体的に差が検出された時は、ＤｕｎｃａｎのＰＬＳＤ法（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｓｔ）を利用し、特定の治療の差を評価した。有意とはＰ<０．０５とした。値は平均＋ＳＥＭの表記で表し、他に記載がない限り、反応症例は一般的にｎ＝１７、無反応症例はｎ＝１２、喘息のない対照ではｎ＝１５とした。

結果
メタコリン気管支誘発試験中の肺機能検査
（ｎ−３）：（ｎ−６）ＰＵＦＡ比率１：２で（ｎ−３）ＰＵＦＡを摂取した場合、総サンプル集団の呼吸パラメータは、本質的にベースラインの反応と比較して変化がなかった。これらのデータを検討すると、終了した参加者（反応者）１７名では呼吸能が実際に改善し、無反応の喘息被験者１２名では変化がなかったことが明らかとなった。肺に関する結果をさらに検討すると、（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取による反応者のグループの変化は、１５名の被験者で顕著な呼吸器系の改善、２名の被験者で呼吸機能のわずかな改善のみであった。さらに、無反応者をより綿密に精査すると、他の７名でみられた呼吸困難の程度と同様ではなかった無反応者が５名おり、一緒に平均を取ると、すべての喘息患者でみられる平均に近かった。これら後者の無反応者５名、および完全に呼吸器系の利益が得られなかった前述の反応者２名をここで「中間群」と呼ぶグループにひとまとめにした。反応者のデータを別にまとめると、メタコリン負荷を増強することで、メタコリン６３．８８単位でさえも、事実上、呼吸器パラメータの低下はない。前記中間群はメタコリンの蓄積量１３．８８単位を達成することができたが、無反応者群としては、通常メタコリンの蓄積量１３．８８を超えて継続することはできず、メタコリン１．３７５単位で呼吸困難の悪化が示され、これはメタコリンを１３．８８単位に増量すると悪化した。

ロイコトリエンの定量
ベースラインと比較し、反応者の４シリーズＬＴの平均尿中排泄量は低下したが、ＬＴＥ_５排泄は（ｎ−３）ＰＵＦＡの摂取に応じて増加した。逆に、無反応者の４シリーズＬＴの尿中排泄量は軽度にしか低下しなかったが、ＬＴＥ_５の排泄量は有意に増加した。痰のＬＴは明らかであったが、反応者と無反応者を比較すると、顕著に異なる合成パターンを示していた。

サイトカインのプロフィール
サイトカインのプロフィールは有意に異なる症例もあり、非常にわずかしか差がない症例もあった。特に、（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取に応じて培養した免疫細胞では、ＰＨＡ細胞の刺激に応じて、喘息反応者と中間群でＩＬ−３、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３に変化がないか、わずかな増加が示され、無反応の参加者ではわずかな低下が示された。ＬＰＳ刺激に応じて、無反応の集団ではＩＬ−３が変化しなかったが、反応した集団では、（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取に応じて顕著な増加が示された。同時に、ＰＨＡ刺激後に（ｎ−３）ＰＵＦＡを摂取した後、ＩＬ−５の産生は反応者で急速に増加することが示された。ＩＬ−１０は、ＰＨＡの刺激に応じて（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取後に変化がないか、増加したが、ＬＰＳを刺激すると、３群すべてでＩＬ−１０の産生が有意に低下した。ＰＨＡあるいはＬＰＳで細胞を刺激した場合、ＩＮＦ−γは（ｎ−３）ＰＵＦＡの摂取に応じて無反応者で減少した。逆に、ＰＨＡあるいはＬＰＳで細胞を刺激した場合、（ｎ−３）ＰＵＦＡの摂取後、ＩＮＦ−γは反応者といわゆる中間群でいずれも増加した。ＩＬ−４合成は（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取によりすべての群で低下したが、ＰＨＡあるいはＬＰＳで刺激後、ＩＬ−１６は無反応者で低下し、反応者で増加した。中間群では、ＬＰＳ刺激細胞で（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取後、ＩＬ−１６が９倍低下したが、ＰＨＡ刺激細胞では事実上、変化はなかった。

（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取に対する反応よりも重要であったのは、ＰＨＡあるいはＬＰＳによる細胞刺激後の様々なサイトカイン産生の違いであった。（ｎ−３）ＰＵＦＡを摂取した場合、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３はばらつき、一部の症例では、非喘息対照群でかなり異なったが、ベースラインで（ｎ−３）ＰＵＦＡを摂取した場合に反応した喘息患者および無反応の喘息患者では、これらの代謝物の差は有意に異なってはいなかった。これらのサイトカインが異なる場合は、（ｎ−３）ＰＵＦＡの摂取に応じており、ＬＰＳ刺激時のＩＬ−３、あるいはＰＨＡ刺激時のＩＬ−１０でも同様であった。しかし、これらの５つのサイトカインとは異なり、ＩＬ−４、−５、−１６は、ベースラインでの検査時と（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取時のいずれもかなり変化した。より重要なことに、反応者と比較すると、ベースラインでのＩＬ−４は無反応の喘息で１．２５倍高かったが、事実上、（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取後の反応者と同等であった。しかし、中間群はベースライン時に反応者よりも２．２倍高いＩＬ−４レベルを示し、これは（ｎ−３）ＰＵＦＡを摂取することで２．７倍高く上昇した。ＩＬ−５はベースライン時に反応した喘息患者で１．３倍高く、２．２倍まで増加したが、これは（ｎ−３）ＰＵＦＡを摂取した場合、無反応の喘息患者でもみられた。中間群は無反応者と比べ、さらに大きな違いが示され、ベースラインで２倍、（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取で２．３倍高かった。細胞刺激に反応したＩＬ−１６合成は、ベースライン時で反応した喘息患者と比べ、無反応の喘息患者で７．４倍高く、中間の喘息患者で８．６倍高かった。（ｎ−３）ＰＵＦＡが消費された場合、反応者のＩＬ−１６放出が中間群で見られる量よりも３．３倍、無反応者で見られる量よりも１．４倍高くなる程度まで、ＩＬ−１６の放出は中間群と無反応者で有意に減少し、反応者で増加した。

前記喘息患者の痰はこれと同程度のばらつきを示し、ＩＬ−４およびＩＬ−１６の産生ではさらに大きな差が示された。前記無反応の喘息患者の痰には、前記反応した喘息患者で見られる量よりも、それぞれＩＬ−１６が６．４倍、ＩＬ−４が１１倍多く含まれていた。

考察
魚油にみられる（ｎ−３）多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を摂取することで、特定のタイプの喘息患者で呼吸障害の回復に関連する上述の違いを持つ患者において、ＬＴ産生パターンが顕著に変化する。現在、（ｎ−３）ＰＵＦＡは、喘息の管理を助ける重要な食事療法になると考えられている。前記スルフィドペプチドロイコトリエン（ＳＰ−ＬＴ）は、皮膚（乾癬）（Ｂｒａｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．８３，ｐａｇｅｓ ７０−７３，１９８４）、肺（アレルギー性喘息）（Ｃｈａｎａｒｉｎ，Ｄｒｕｇｓ，Ｖｏｌ．４７，ｐａｇｅｓ １２−２４，１９９４）、関節（関節リウマチ）（Ｋｒｅｍｅｒら，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ，Ｖｏｌ． ３３，ｐａｇｅｓ ８１０−８２０，１９９０）、および心臓（心筋梗塞）（Ｂｒａｉｎら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．４６，ｐａｇｅｓ ５７−６６，１９９０）の炎症性疾患と結びつけられてきた。最近の魚あるいは魚製品の消費を増やすようにという奨励は、（ｎ−３）ＰＵＦＡが食事中の（植物油にみられる）（ｎ−６）ＰＵＦＡと食事の比率１：５〜１：２．５で存在する時、病態生理学的に宿主となるリスクを低下させ得るエイコサノイドの全体的な産生を低下させる、と示した研究が発端となっている。

事前研究において、我々は、（ｎ−３）ＰＵＦＡ：（ｎ−６）ＰＵＦＡの比率１：２の魚油の食事サプリメントが、検討した患者の４０％以上で喘息症状を軽減させることを見出した。この研究では、これらの所見が確認され、喘息患者集団の５０％近くに、（ｎ−３）ＰＵＦＡの摂取によって利益がもたらされる可能性があることが示されている。さらに、魚油の平均有効量は、ＥＰＡおよびＤＨＡが１日約３．３ｇであることが示された。

ＤＨＡとＥＰＡを１年間１ｇ／日摂取することで、アレルギー性喘息患者のＦＥＶ_１値を有益に変化させることが事前に報告されていた（Ｄｒｙら，Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．９５，ｐａｇｅｓ １５６−１５７，１９９１）。１日５．４ｇのＥＰＡおよびＤＨＡを１０週間使用した同様の研究では、ヒスタミン負荷後の全被験者集団において、いかなる作用も示されなかった。しかし、１１名中６名の被験者は、軽度の呼吸器改善を示した。その後の研究（Ａｒｍら，Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ，Ｖｏｌ．１３９，ｐａｇｅｓ １３９５−１４００，１９８９）では、ｍａｘ−ＥＰＡ（オメガ−３生成物）として（ｎ−３）ＰＵＦＡを消費した被験者は、ヒスタミン負荷後、すぐに呼吸器系の改善を示さなかったが、回復期に有意な改善を示した。これらの所見は、今回のデータと併せて考察すると、十分長期にわたり、あるいは十分高濃度で消費した場合、喘息患者の集団の一部で（ｎ−３）ＰＵＦＡが喘息パラメータの改善に有益である可能性が示されている。

前記サイトカインに関するデータは、場合によって、つまりＩＬ−３およびＩＬ−１０では、（ｎ−３）ＰＵＦＡの摂取に応じて細胞刺激後のプロフィールが有意に変化し、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、およびＩＮＦ−γではほとんど変化しない可能性を示していた。しかし、無反応の喘息患者、中間の喘息患者、反応した喘息患者の間には、ＩＬ−４、−５、および−１６産生に基本的な有意差があり、無反応者は、反応者にみられるよりもＩＬ−４および−１６レベルが有意に高く、ＩＬ−５レベルが低いことを示している。逆に、中間群の喘息患者では、（ｎ−３）ＰＵＦＡを摂取していない場合に反応者よりもＩＬ−４、−５、および−１６のレベルが有意に高く、（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取後はＩＬ−５レベルが同等で、ＩＬ−１６レベルが低かった。反応を示した喘息患者では、喘息反応の誘発を大きくロイコトリエンに依存しているようにみえたが、無反応および中間群の喘息患者は、（ｎ−３）ＰＵＦＡを摂取することで、ＩＬ−１６と関連すると考えられる利益を示し、その喘息反応は、あまりロイコトリエンに依存していないようにみえる。この所見は、なぜＬＴ受容体拮抗薬およびＬＴの生合成を遮断する薬剤のみが、喘息患者、つまりロイコトリエン型喘息患者の約半数で利益があるようにみえるのかを、一部説明していると考えられる。喘息患者集団の残りの半数は、むしろサイトカイン型喘息と考えられ、これらの結果を基に、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１６、またはその両方の産生増加によって生じている可能性がある。これらの結果と、喘息患者の痰中に喘息前にサイトカインおよびロイコトリエンがあるか否かとに基づき、痰や別の体液に存在する違いを利用し、喘息タイプとデザインのタイプ間で特異的に治療方法を区別することができる。従って、前記治療方法には、ザフィルルカスト、モンテルカストなどのＬＴＣ_４、ＬＴＤ_４、およびＬＴＥ_４結合を遮断する薬剤、あるいはジロートン、つまりＬＴ型喘息患者でＬＴ合成を司る５リポキシゲナーゼの阻害薬を投与することなどが可能性としてあげられる。ＩＬ−４あるいはＩＬ−１６受容体拮抗薬は、サイトカイン型喘息の治療に投与することができる。現在のところ、検討されているＩＬ−４拮抗薬はあるが、ＩＬ−１６拮抗薬は文献で特定されていない。ＩＬ−１６が関与した症例では、ＩＬ−１６拮抗薬が開発されるまで、患者を標準的なステロイド療法で治療することになる。

反応者で報告された呼吸器パラメータの有益な変化は、主に、５シリーズＳＰ−ＬＴ産生の全体的な増加に起因している可能性が高い。５シリーズ：４シリーズの比率が１を超えるまで、５シリーズＬＴの増加が４シリーズＬＴの合成減少と関連しているＬＴ生合成に必要なシフトは、メタコリン負荷に対する反応改善を媒介するために重要であると思われる。さらに、無反応者の（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取が無効であることは、４シリーズＬＴの合成低下よりも５シリーズＬＴ産生の増加がないことによるものと考えられる。異なるタイプの喘息患者で、ＬＴおよびサイトカインプロフィールのいずれにも有意な差があるということは、反応者および無反応者の喘息患者にある違いを説明する上で、新規且つ重要である。モルモットの回腸では、５シリーズＬＴが生物学的にあまり強力ではないことが示され（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２５５，ｐａｇｅｓ ７０９３−７０９４，１９８０）、ＳＰ−ＬＴの放出が亢進している間、エイコサペンタエン酸が、モルモットの肺の実質片でアナフィラキシー性のシクロオキシゲナーゼ産物の放出を抑制することが示されたため（Ｓｉｍｍｅｔら，Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ，Ｖｏｌ．３３５，ｐａｇｅｓ ６５２−６５９，１９８７）、反応者における（ｎ−３）ＰＵＦＡの摂取と関連した呼吸器系の利益は、５シリーズＬＴが喘息反応を誘発できないことと関連しているか、４シリーズＬＴ受容体における５シリーズＬＴの競合阻害によるものである可能性がある。無反応者では、（ｎ−３）ＰＵＦＡ摂取の効果がないことが、サイトカイン型喘息反応か、ロイコトリエンで誘導される喘息反応かの有無に寄与しているかもしれない。

要約すれば、軽度の呼吸問題を軽減するため、ロイコトリエン型喘息では、食事に（ｎ−３）ＰＵＦＡ源、つまり魚や魚油を取り入れることができれば、薬理学的介入は必要ないと考えられる。しかし、これでも改善しない場合は、この喘息患者群はロイコトリエン合成を阻害するか、ロイコトリエンの結合を遮断する薬剤に頼る必要があるかもしれない。その他の喘息患者では、特別な治療薬が開発されるまで、新たにＩＬ−４療法を行うかステロイド療法を継続することが、この喘息を治療する唯一の手段と考えられる。

例２
異なるタイプの喘息患者が様々なサイトカインおよびロイコトリエンプロフィールを示すことを確認するため、また、さらにサイトカイン型喘息のサブカテゴリーを分類するため、以下の実験を行った。

材料および方法：
まず、従来のメタコリン負荷を行った。肺機能検査に用いるメタコリンの通常濃度および蓄積量（括弧内）は、０．０２５ｍｇ／ｍｌ（０．１２５単位）、０．２５ｍｇ／ｍｌ（１．３７５単位）、２．５ｍｇ／ｍｌ（１３．８７５単位）、１０ｍｇ／ｍｌ（６３．８７５単位）とし、ここで１単位はメタコリン１ミリグラムに相当する。メタコリン負荷の直後に、被験者から痰を回収し、ロイコトリエン、ＩＬ−４、およびＩＬ−１６のレベルをアッセイした。

結果：
プロフィールは、前記サイトカインレベルによって評価した。これらの実験結果およびその後の喘息タイプの決定は、表１にまとめている。

従来のメタコリン負荷に反応して高いロイコトリエンレベルを示した患者は、ロイコトリエン型喘息と命名する。メタコリン負荷に反応して、痰中のロイコトリエン産生が低いあるいはない場合は、喘息患者をサイトカイン型喘息と特定した。血漿ＩＬ−４およびＩＬ−１６プロフィールを用い、被験者が主にＩＬ−４型喘息あるいはＩＬ−１６型喘息のどちらかを特定した。

考察：
これらの実験の結果は、ロイコトリエン型喘息患者とサイトカイン型喘息患者を区別し、サイトカイン型喘息患者は異なるサブグループにさらに分類することが可能であることを示している。そのような決定によって、特定の目標とする喘息治療に有益な情報が得られる。

例３
本実施例では２つの目的が達成された。まずは、連続的なメタコリン負荷プロトコールが開発された。このプロトコールでは、最小レベルのメタコリンを利用しており、肺機能検査で喘息反応を誘発する。第２に、様々な時間で様々な体液のサイトカインおよびロイコトリエンレベルを検査し、どの体液およびアッセイプロトコールが喘息サブタイプの決定に最も効果的であるかを決定した。

まず、これらの異なる喘息サブタイプを識別するために必要なメタコリンの最小レベルを決定するため、試験を実施した。様々な用量のメタコリンを投与し、喘息発作を誘導し、測定可能なロイコトリエンおよび／またはサイトカイン（インターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＩＬ−１６、あるいは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））のレベルを示す最小量を決定した。メタコリン負荷の直後、および４〜６時間後に、様々な体液サンプルを採取した。これらのサンプルは、以下に示すとおり、ロイコトリエンおよびサイトカインのレベルを測定した。

材料および方法：
メタコリン試験
典型的に肺機能検査に用いられるメタコリンの通常濃度および蓄積量（括弧内）は、０．０２５ｍｇ／ｍｌ（０．１２５単位）、０．２５ｍｇ／ｍｌ（１．３７５単位）、２．５ｍｇ／ｍｌ（１３．８７５単位）、および１０ｍｇ／ｍｌ（６３．８７５単位）であり、ここで１単位はメタコリン１ミリグラムに相当し、さらに連続的なメタコリン量を検討した。典型的には、多くの喘息患者が低い累積量の範囲で喘息反応を示すため、前記即時のプロトコールで、より低い、連続的なメタコリンの用量を検討した。この修正した検査では、次のメタコリン濃度と蓄積量を検討し、それは、０．０２５ｍｇ／ｍｌ（０．１２５単位）、０．２５ｍｇ／ｍｌ（１．３７５単位）、０．５ｍｇ／ｍｌ（３．８７５単位）、１ｍｇ／ｍｌ（８．８７５単位）、２ｍｇ／ｍｌ（１８．８７５単位）、２．５ｍｇ／ｍｌ（３１．３７５単位）、１０ｍｇ／ｍｌ（８１．３７５単位）、２５ｍｇ／ｍｌ（２０６．３７５単位）であった。

ロイコトリエンおよびサイトカインの測定
メタコリンを投与するごとに、参加者は５ｍｌの蒸留水で口をすすいで、唾液を回収し、内容物を事前にラベルした保存容器に喀出するように依頼した。このサンプルは、ロイコトリエンを保持するＣ−１８カートリッジを用いて濃縮した。ロイコトリエンはＥＬＩＳＡアッセイにより、分離、測定した。次に、異なるメタコリンの検査レベルで分離した複数の唾液サンプルを基に、喘息患者を主にロイコトリエン陽性であるか、ロイコトリエン陰性であるかを定義し、これまで反応者として知られていたロイコトリエン型喘息患者か、あるいはこれまで無反応者あるいは中間喘息患者として知られた非ロイコトリエン型喘息患者かを定義した。唾液が使用に適した体液ではない場合、痰を利用するために必要であれば、等張食塩水を使用し、ネブライザを使用して複数回吸入することで痰を分離し、ロイコトリエンのレベルを決定した。肺機能検査と唾液および痰の分離後４、５、および６時間に、被験者は代謝検査室に戻り、ＥＤＴＡを用いた静脈穿刺（ｖｅｎａｐｕｎｃｔｕｒｅ）で５ｍｌの全血を単離した。分画遠心分離で血漿を分離し、血漿ＩＬ−４、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦレベルをＥＬＩＳＡによって確認した。このアッセイでは血漿を用いたが、全血を用いることもできる。全血を利用する場合は、血液サンプルの分離中に抗凝固剤を含めることが好ましい。メタコリン負荷後４、５、および６時間で採血した血液サンプルを検討し、ピークはどれかを決定することで、血漿サイトカインプロフィールを決定した。

結果：
メタコリン負荷に反応して患者が高いロイコトリエンレベルを示した場合、この患者はロイコトリエン型喘息と判断した。メタコリン負荷に反応して、唾液中のロイコトリエン産生が低いかあるいはない場合は、喘息患者をサイトカイン型喘息と特定した。次に血漿および唾液の血漿ＩＬ−４およびＩＬ−１６プロフィールと、痰のＧＭ−ＣＳＦプロフィールとを用いて、被験者を主にＩＬ−４型喘息、ＩＬ−１６型喘息、またはＧＭ−ＣＳＦ型喘息のいずれかに特定した。

表２は、ロイコトリエン反応を誘導するために投与した、特定のメタコリン用量を示している。表３−５は、測定したサイトカインおよび測定した体液を示している。

Ｎ／Ａ−試験結果が明確に陰性でも陽性でもなかったことを示す。「０」は、反応が決定的であるか、低用量で反応がなかったため、試験が行われなかったことを示す。

この検査では、反応者、中間反応者、無反応者が特有のサイトカインおよびロイコトリエンプロフィールを示し、これにより特定の喘息の診断を決定することができ、従って、最も効果的な治療プロトコールを選択することができる。

表６は、前記研究から得られた様々な患者プロフィールを示している。

表６に示したとおり、特定のメタコリン量でロイコトリエンレベルを決定し、続いてサイトカインレベルを決定すると、臨床医は喘息患者の診断（例えば、ロイコトリエン型、ＩＬ−４型、ＩＬ−１６型、あるいはＧＭ−ＣＳＦ型）が可能となる。これらの決定は、臨床医に適切な治療行為を選択するための重要な基準を提供する。

考察：
前述の研究の結果は図５にまとめてある。喘息発作中あるいはその直後にロイコトリエンレベルの上昇を示した患者は、ロイコトリエン陽性喘息、つまり反応者とみなされる。これらの患者は、ロイコトリエンを標的とした治療で利益を受ける可能性がより高い。ロイコトリエンレベルの上昇は示さなかったが、サイトカインレベルの上昇を示した患者は、サイトカイン型喘息、つまり中間反応者と無反応者とみなされる。これらの患者は、どのサイトカインが最も上昇しているかによって、さらにＩＬ−４喘息、ＩＬ−１６喘息、あるいはＧＭ−ＣＳＦ型と区別することができる。従って、患者は、喘息発作中、および喘息発作の直後に、最も上昇したロイコトリエンあるいはサイトカインを特異的に抑制する治療薬に、反応を示す可能性が最も高い。

また、特にロイコトリエン型喘息で肺機能検査を実施するのに、低用量のメタコリンを用いることを決定した。低レベルのメタコリンを用いることができるということは、２つの利点を告げている。まず、これにより医師は、患者を特別な診断を行う病院に紹介する必要がなく、臨床の場で気管支誘発試験、すなわち喘息の検査を実施することができる。このため、病院で実施する代わりに臨床の場で実施することができれば、より多くの医師が喘息の検査を行い、全体的な検査費用を低く押さえることができる。第２に、低用量のメタコリンを使用することで、喘息に関連したサイトカインおよびロイコトリエンの放出誘導を可能としながら、すべての喘息エピソードが引き起こされる可能性を低くすることができる。これにより、患者に考えられる健康上のリスク、医師の医療責任を減少させ、尚且つ、関係者全員に対するリスクをはるかに低く抑えて、喘息の診断と分類が可能となる。

さらに、唾液あるいは痰中のロイコトリエンは、喘息発作あるいは肺機能検査の誘発直後に測定することが最も正確であることが確認された。しかし、血中あるいは血漿中のサイトカインは、エピソードの約４時間後に最もよく測定できる。前述の臨床パラメータの特定は、喘息患者の診断および管理において、医師の助けとなる。

いくつかの本発明の好適な実施例を上述し、具体的に例示してきたが、本発明をそのような実施例に限定する意図はない。本請求項に示す通り、本発明の本質および範囲から逸脱しない範囲において、そこに様々な修正を加えることができるものである。

図１は、インターロイキン４およびインターロイキン１６に対する反応を基にした喘息患者の分類を示したグラフである。 図２は、ロイコトリエン型喘息患者の評価に用いる基盤の写真である。 図３は、典型的な肺機能検査のプロトコールを示している。 図４は、本発明を実行するために利用できるテストストリップを示している。 図５は、メタコリン負荷後、様々な喘息患者のロイコトリエンおよびサイトカインプロフィールを示した表である。

Claims (31)

1. 喘息患者がロイコトリエン型喘息か、サイトカイン型喘息かを決定する方法であって、
   ａ）前記患者からの生物サンプルを、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦまたはそれらの組み合わせに結合親和性を有する少なくとも一つの第一結合剤、および少なくとも一つのロイコトリエンに結合親和性を有する少なくとも一つの第二結合剤と接触させて複合体を形成させる工程と、
   ｂ）前記複合体を、前記第一結合剤および第二結合剤に結合親和性を有する少なくとも一つの検出可能な標識化試薬と接触させる工程と、
   ｃ）前記生物サンプル中の前記ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦまたはそれらの組み合わせおよび少なくとも一つのロイコトリエンのレベルを、前記検出可能な標識化試薬の結合の関数として決定する工程とからなる、前記方法。
2. さらに、ＩＬ−４に結合親和性を有する第一結合剤を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも一つの第一結合剤がＩＬ−４およびＩＬ−１６に結合親和性を有する、請求項２に記載の方法。
4. 前記少なくとも一つの第一結合剤がＩＬ−４、ＩＬ−１６およびＧＭ−ＣＳＦに結合親和性を有する、請求項２に記載の方法。
5. 少なくとも一つの第一結合剤がＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１６に結合親和性を有する、請求項２に記載の方法。
6. 少なくとも一つの第一結合剤が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６およびＧＭ−ＣＳＦに結合親和性を有する、請求項１に記載の方法。
7. 請求項１の方法に使用するキットであって、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦまたはそれらの組み合わせおよび少なくとも一つのロイコトリエンに結合親和性を有する複数の結合剤；ならびに前記結合剤に結合親和性を有する複数の検出可能な標識化試薬を含む、前記キット。
8. 請求項２の方法に使用するキットであって、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦまたはそれらの組み合わせおよび少なくとも一つのロイコトリエンに結合親和性を有する複数の結合剤；ならびに前記結合剤に結合親和性を有する複数の検出可能な標識化試薬を含む、前記キット。
9. 複数の結合剤が、ＩＬ−１６およびＧＭ−ＣＳＦに結合親和性を有する、請求項７に記載のキット。
10. 複数の結合剤が、ＩＬ−４、ＩＬ−１６およびＧＭ−ＣＳＦに結合親和性を有する、請求項８に記載のキット。
11. 前記結合剤がＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦまたはそれらの組み合わせに結合親和性を有するモノクローナル抗体であり、前記試薬が前記モノクローナル抗体に結合親和性を有する検出可能な標識化第二抗体である、請求項７に記載のキット。
12. 前記結合剤がＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦまたはそれらの組み合わせに結合親和性を有するモノクローナル抗体であり、前記試薬が前記モノクローナル抗体に結合親和性を有する検出可能な標識化第二抗体である、請求項８に記載のキット。
13. 喘息発作を有する患者が、ロイコトリエン型喘息か、サイトカイン型喘息かを決定する方法であって、
    ａ）前記患者からの生物サンプルを、少なくとも一つのサイトカインに結合親和性を有する少なくとも一つの第一結合剤および少なくとも一つのロイコトリエンに結合親和性を有する少なくとも一つの第二結合剤と接触させて複合体を形成させる工程と、
    ｂ）前記複合体を、前記第一結合剤および第二結合剤に結合親和性を有する検出可能な標識化試薬の少なくとも一つと接触させる工程と、
    ｃ）前記生物サンプル中の少なくとも一つのサイトカインおよび少なくとも一つのロイコトリエンのレベルを、前記検出可能な標識化試薬の関数として決定する工程とからなり、ロイコトリエンのレベルの上昇はロイコトリエン型喘息患者であることを示し、サイトカインレベルが上昇し、正常なロイコトリエンレベルを有するサンプルが、サイトカイン型喘息を示す、前記方法。
14. 前記少なくとも一つのサイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記少なくとも一つの第一結合剤がＩＬ−４およびＩＬ−１６に結合親和性を有する、請求項１４に記載の方法。
16. 前記少なくとも一つの第一結合剤がＩＬ−４、ＩＬ−１６およびＧＭ−ＣＳＦに結合親和性を有する、請求項１４に記載の方法。
17. 少なくとも一つの第一結合剤がＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１６に結合親和性を有する、請求項１４に記載の方法。
18. 少なくとも一つの第一結合剤が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６およびＧＭ−ＣＳＦに結合親和性を有する、請求項１４に記載の方法。
19. 前記生物サンプルが、メタコリン、ヒスタミン、マニトール、アデノシン、ＦＥＬＤ（ネコのふけ）、チリダニアレルゲン、特定のアレルゲン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される作用剤の投与を含む肺機能検査後に得られる、請求項１、２、１３および１４のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記結合剤が、前記少なくとも一つのサイトカインおよび前記少なくとも一つのロイコトリエンに親和性を有するモノクローナル抗体であり、前記試薬が、前記モノクローナル抗体に結合親和性を有する検出可能な標識化第二抗体である、請求項１、２、１３および１４のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記生物サンプルが、唾液、痰、血液、気管支洗浄液、血漿およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１、２、１３および１４のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記ロイコトリエンが、ロイコトリエンＣ_４、ロイコトリエンＤ_４およびロイコトリエンＥ_４からなる群より選択される、請求項１、２、１３および１４のいずれか一項に記載の方法。
23. 外因性ロイコトリエンを前記サンプルに添加し、競合結合アッセイで前記患者のサンプルに存在するロイコトリエンの置換を評価する工程をさらに含み、前記外因性ロイコトリエンが検出可能に標識化されている、請求項１、２、１３および１４のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記肺機能検査実施後４〜６時間後に得られた前記生物サンプルを、前記第一結合剤および第二結合剤と接触させる、請求項１９に記載の方法。
25. 請求項１４の方法に使用するキットであって、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦまたはそれらの組み合わせおよび少なくとも一つのロイコトリエンに結合親和性を有する複数の結合剤；ならびに前記結合剤に結合親和性を有する複数の検出可能な標識化試薬を含む、前記キット。
26. 前記検出可能な標識化試薬が固体支持体を含む、請求項７、８および２５のいずれか一項に記載のキット。
27. 複数の結合剤が、ＩＬ−４、ＩＬ−１６およびＧＭ−ＣＳＦに結合親和性を有する、請求項８または２５に記載のキット。
28. 前記少なくとも一つのロイコトリエンが、ロイコトリエンＣ_４、ロイコトリエンＤ_４およびロイコトリエンＥ_４からなる群より選択される、請求項７、８および２５のいずれか一項に記載のキット。
29. さらにメタコリンを含む、請求項７、８および２５のいずれか一項に記載のキット。
30. 検出可能な標識化ロイコトリエンをさらに含む、請求項７、８および２５のいずれか一項に記載のキット。
31. 前記結合剤がＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＧＭ−ＣＳＦまたはそれらの組み合わせに結合親和性を有するモノクローナル抗体であり、前記試薬が前記モノクローナル抗体に結合親和性を有する検出可能な標識化第二抗体である、請求項２５に記載のキット。

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