JP4501537B2

JP4501537B2 - 電気泳動方法

Info

Publication number: JP4501537B2
Application number: JP2004166809A
Authority: JP
Inventors: 信博花房; 哲生飯田; 大古田
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2004-06-04
Filing date: 2004-06-04
Publication date: 2010-07-14
Anticipated expiration: 2024-06-04
Also published as: JP2005345334A

Description

本発明は、生体高分子の２次元電気泳動方法に関する。

２次元電気泳動法は、サンプル溶液に対して二段階に分けて別種の電気泳動を適用することにより該サンプル溶液中の試料分子を高度に分離する方法であり、その高い分解能からタンパク質、核酸等の生体高分子の分析に広く用いられている。

上記２次元電気泳動法としては、例えばタンパク質をサンプルとして１次元目に等電点電気泳動、２次元目にドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を適用する方法があり、タンパク質の網羅的解析を目的とした近年のプロテオーム解析において、タンパク質の分離・同定や発現解析に中心的な役割を担っている。

２次元電気泳動は、「１次元目のゲルへのサンプルの浸透」、「１次元目の電気泳動」、「２次元目の電気泳動」、「染色」の大きく分けて４つの工程からなる。
上述のようなタンパク質の２次元電気泳動の場合、１次元目の電気泳動の支持体としては、一般的に固定化pH勾配を有する市販の乾燥短冊状ゲル（ストリップゲル）が用いられ、これをサンプル溶液に浸漬して膨潤させることによって、サンプルをゲル全体に浸透させる。その後、該ゲルを専用の電気泳動容器に移して両端部に電圧をかけることで、サンプルを該ゲルの長手方向に等電点に基づいて分離し（１次元目の電気泳動）、分離されたサンプルを含むストリップゲルをＳＤＳバッファーで平衡化した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の平板状ゲル（スラブゲル）の一辺に装着し、該ストリップゲルおよびスラブゲルに対して１次元目の泳動方向と直交する向きに電圧をかけることで、上記１次元目の電気泳動によって分離されたサンプル分子を更に分子量で分離する（２次元目の電気泳動）。以上によりサンプル溶液に含まれる複数種類のタンパク質が等電点および分子量に基づいて上記スラブゲルの平面上にスポット状に展開される。その後、これらのタンパク質スポットはクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色や銀染色などによって可視化される。

しかし、このような従来の２次元電気泳動法では、サンプルの浸透および１次元目の電気泳動に多くの時間が掛かっていた。例えば、最も一般的に用いられているＢｉｏ−Ｒａｄ社製のストリップゲルの場合、サンプルの浸透におよそ１０時間、その後の１次元目の電気泳動にはおよそ１２時間を要し、この二つの工程で２次元電気泳動の全工程に掛かる時間の大部分を占めていた。

更に、ゲルの取り扱いや配置が難しく、ゲルの下に空気が入ったり、１次元目の電気泳動の際に、電極ワイヤの上にストリップゲルがフィットしていなかったりすると正常に泳動が行われない場合がある。また、サンプル溶液中のタンパク質量が多い場合や、サンプル分子が疎水性のタンパク質であったり、１００ｋＤａ以上の高分子であったりする場合には、ストリップゲルに十分浸透しない場合もある。しかし、サンプル分子は染色によって初めて可視化されるため、一連の操作の途中でサンプルの浸透状態や泳動状態を確認することができず、多大な時間を掛けた末に解析が失敗に終わることもあった。

本発明の解決しようとする課題は、生体高分子の２次元電気泳動において、１次元目のゲルへのサンプルの浸透に要する時間と１次元目の電気泳動に要する時間を短縮する方法を提供すること、および２次元電気泳動の各工程毎にその成否を確認できるようにする方法を提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明に係る電気泳動方法は、生体高分子サンプルの２次元電気泳動において、１次元目の電気泳動を行う前に、１次元電気泳動用ゲルとサンプル溶液の間に電圧を印加することにより、サンプルを前記１次元電気泳動用ゲルに浸透させるものであって、前記１次元電気泳動用ゲルの中央部付近のみに電圧を印加することにより、ゲルの中央部に局所的にサンプルを浸透させることを特徴とする。

なお、本発明において生体高分子とは、タンパク質およびそれに付随する修飾物としての糖・脂質などを含むものとする。

また、本発明に係る電気泳動方法は、更に生体高分子サンプルの２次元電気泳動において、視認可能なｐHマーカーを予めサンプル溶液に加えるものとすることが望ましい。

なお、視認可能なｐHマーカーとは、肉眼または蛍光検出などによって確認できる等電点（ｐI）が既知の物質であり、該ｐIが１次元目の泳動に使用するゲルのｐH範囲内に収まるものであればいかなるものを用いてもよい。このような視認可能なｐHマーカーとしては、例えば市販のｐHマーカータンパク質に色素を結合したものなどを用いることができる。

電圧の印加によってサンプルをゲルに浸透させることにより、１次元目のゲルへのサンプルの浸透に要する時間を大幅に短縮することができると共に、従来の方法ではゲルへの浸透が困難であったサンプルの浸透率を向上させることができる。
また、このときストリップゲルの中央部付近に局所的にサンプルをしみ込ませるようにすることで、等電点電気泳動の際のサンプルの移動距離が短くて済み、１次元目の泳動時間を短縮することができる。

更に、視認可能なpHマーカーを予めサンプル溶液に混ぜておくことにより、１次元目のゲルへのサンプル浸透後や、１次元目の泳動完了時、２次元目の泳動完了時などに目視によって各工程の成否をチェックすることができるため、膨大な時間を費やして実験が失敗に終わるといった事態を避けることができる。

以下、実施例を用いて本発明を実施するための最良の形態について説明する。

［実施例］
本実施例は、本発明の電気泳動方法をタンパク質の２次元電気泳動に適用した例を示す。図１は本実施例の電気泳動方法における１次元目のサンプル導入方法を示す断面図であり、図３は、本実施例の電気泳動方法における１次元目および２次元目の電気泳動の概要を示す斜視図である。

まず、タンパク質を含むサンプル溶液１１に、肉眼で視認可能なｐHマーカー（以下、有色ｐHマーカーと表記する）１２を加えて混合しておく。サンプル溶液１１に加える有色ｐHマーカー１２は、１種類のみでもよく、あるいはｐIの異なる複数の有色ｐHマーカー１２を混合したものであってもよい。

その後、上記サンプル溶液１１を、サンプル浸透用のトレー１３に設けられた溝１４に移し、該サンプル溶液１１に乾燥状態の固定化pH勾配ストリップゲル１５を浸漬し、該ストリップゲル１５およびサンプル溶液１１の上下に電極プレート１６を配置して電圧を印加する。
このように、ストリップゲル１５とサンプル溶液１１の間に電圧を印加し、サンプルをゲル１５に浸透させることにより、これまで１０時間程度掛かっていたサンプルの浸透を数十分で完了することができる。なお、このとき図２に示すように、上記電極プレート１６の幅を小さくしてストリップゲル１５の中央部に配置し、タンパク質がゲル１５の中央部に局所的に浸透するようにすれば、サンプルをゲルの全体に分散させた場合に比べて泳動時のサンプルの移動距離が短くなり、１次元目の電気泳動時間を短縮することができるためより望ましい。

また、予めサンプル溶液１１に有色ｐHマーカー１２を加えておいたことによりストリップゲル１５にサンプルが十分浸透したかどうかを肉眼で確認することができる。

続いて、専用の泳動容器内で該ストリップゲル１５の両端に電圧を印加することにより電気泳動を行う。これによりサンプル溶液１１に含まれるタンパク質は、それぞれ固有の等電点に基づいて分離される。１次元目の泳動終了後、有色ｐHマーカー１２によって電気泳動が正しく行われたことを確認した後、該ゲルをＳＤＳバッファーで平衡化し、２次元目の電気泳動を開始する。

２次元目の電気泳動を行う際には、図３に示すように、上記ストリップゲル１５をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のスラブゲル１７の端面に装着し、１次元目の泳動方向と直交する向きに電圧を印加する。これにより上記１次元目の電気泳動で等電点に基づいて分離された各タンパク質が、分子量に基づいて更に分離される。２次元目の電気泳動が完了したら再び有色ｐHマーカー１２によって２次元目の泳動が正しく行われたことを確認した後、ＣＢＢ染色等によりスラブゲル１７上に展開された各タンパク質のスポットを可視化する。

本実施例の電気泳動方法により、ゲルへのサンプルの浸透や、１次元目の電気泳動に要する時間を短縮し、２次元電気泳動のスループットを向上することができると共に、サンプルの浸透、１次元目の電気泳動、２次元目の電気泳動の各工程の成否をその都度確認することができるため、ミスがあった場合には、それ以降の操作を中止し、速やかにやり直しを行うといったことが可能となる。

本発明の実施例に係る電気泳動方法における１次元目のゲルへのサンプルの浸透方法を示す断面図。同実施例においてゲルの中央部に局所的にサンプルを浸透させる場合を示す上面図。同実施例の電気泳動方法における２次元電気泳動の概要を示す斜視図。

符号の説明

１１…サンプル溶液
１２…有色ｐHマーカー
１３…トレー
１４…溝
１５…ストリップゲル
１６…電極プレート
１７…スラブゲル

Claims

生体高分子サンプルの２次元電気泳動において、
１次元目の電気泳動を行う前に、１次元電気泳動用ゲルとサンプル溶液の間に電圧を印加することにより、サンプルを前記１次元電気泳動用ゲルに浸透させるものであって、前記１次元電気泳動用ゲルの中央部付近のみに電圧を印加することにより、ゲルの中央部に局所的にサンプルを浸透させることを特徴とする生体高分子の電気泳動方法。
生体高分子サンプルの２次元電気泳動において、
視認可能なｐHマーカーを予めサンプル溶液に加えておくことを特徴とする請求項１に記載の生体高分子の電気泳動方法。