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JPH0641934B2 - 二次元電気泳動法 - Google Patents
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JPH0641934B2 - 二次元電気泳動法 - Google Patents

二次元電気泳動法

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JPH0641934B2
JPH0641934B2 JP62306174A JP30617487A JPH0641934B2 JP H0641934 B2 JPH0641934 B2 JP H0641934B2 JP 62306174 A JP62306174 A JP 62306174A JP 30617487 A JP30617487 A JP 30617487A JP H0641934 B2 JPH0641934 B2 JP H0641934B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、二次元電気泳動法、特に改良された一次元ゲ
ル作成工程を含む二次元電気泳動法に関するものであ
る。
従来の技術 従来、試料を一次元ゲル中で電気的に泳動させ、これに
より得られた一次元サンプルゲル柱を二次元ゲルの上端
に載せて、さらに電気泳動させることからなる二次元電
気泳動法において、試料溶液は円柱状の一次元ゲルに加
えられ、その泳動により成分分離(一次元分離)され、
その状態で固定された円柱状ゲルを二次元ゲルの上端に
載置し、二次元泳動を行うものであった。
発明が解決しようとする問題点 この場合、円柱型の一次元分離済ゲルを、二次元ゲルの
上端に置くため、両ゲルの接触面の両脇に隙間ができ、
これが泳動の乱れの一因となっていた。
問題点を解決するための手段 このような問題点を解決するため、本発明は、二次元電
気泳動法において、矩形断面を有する互いに平行した複
数本の棒状ゲル室を配列してなる一次元ゲル作成装置に
おける少くとも一つの前記棒状ゲル室内に一次元ゲルを
用意し、 試料を前記棒状一次元ゲル中において電気泳動させるこ
とにより矩形断面を有する試料の一次元分離済ゲルを作
成し、 前記一次元分離済ゲルを二次元ゲルの上端に横たえるこ
とにより、一次元分離済ゲルの下側面と、二次元ゲルの
上端面とを隙間なく密着させた状態において電気泳動さ
せることを特徴とする二次元電気泳動法を構成したもの
である。
作用 本発明は、上記の構成において、一次元分離済ゲルが二
次元ゲルに対して隙間なく密着するようにしたものであ
り、この密着性は、接続面の両脇に隙間を生じ、泳動が
乱れるという従来の円柱型一次元ゲルの欠点を完全に解
消するものである。
本発明の好ましい発展形式によれば、一次元泳動の前段
階として言わば零次元泳動を行わせることにより、例え
ば、蛋白質試料を分析する場合において、試料中の蛋白
分子が個々にフリーラジカルと遭遇するのを避けるよう
に試料を濃縮し、これにより一次元泳動、さらには二次
元泳動の効果的な実施を可能にするものである。
したがって、以下に述べる実施例は、試料前処理として
の“零次元泳動”を含む二次元泳動法について適用した
ものである。
実施例の説明 零次元泳動 ここにいう零次元泳動とは、一次元泳動において一次元
ゲルに試料溶液を注入する代わりに同ゲル中に挿入され
るサンプルゲルを電気泳動法により濃縮形成する処理の
ことである。この零次元泳動は、第1図(a)に示すよう
な角柱状のゲル室(1)を、一例又は二列以上形成したゲ
ルコンテナGCを上部バッファー槽(2)及び下部バッ
ファー槽(3)間に装着し、ゲル室(1)内には、例えば蛋白
試料の泳動媒体としてポリアクリルアミドゲルを収容
し、その上部より試料溶液を導入して行うものである。
この場合、上部バッファー槽(2)に設けられた陽極A及
び下部バッファー槽(3)に設けられた陰極B間には適当
な電圧が印加される。この泳動前においてポリアクリル
アミドゲルにはラジカル捕捉剤としての2−メルカプト
エチルアミンを前泳動させ、これによって試料蛋白の消
耗を防止できるようになっている。また、前記試料溶液
の泳動中においては、還元剤としてのシステインも共に
泳動させ、これによって前記蛋白分子のS−S架橋を防
止するものである。このようにして泳動濃縮された試料
はゲルコンテナGCから摘出又はそのコンテナの解体
により取出された後、その濃縮ゲル部分(4)の適当部位
を切り取って一次元ゲルのためのサンプルゲル片SGと
する。
なお、この零次元泳動に用いられた上部バッファー槽
(2)及び下部バッファー槽(3)は次に述べる一次元泳動用
の上部バッファー槽及び下部バッファー槽とそれぞれ同
様な構造を有するものであり、零次元泳動は試料を濃縮
するため、一次元泳動よりも全長の短いゲルコンテナを
用いたことが機構上の唯一の相違点である。ゲルコンテ
ナGCの両板間の距離、すなわちゲルの厚みはこの場
合約3mmとしたが、1mm程度から3mmを越えるものまで
その用途に応じて、作成することができる。一次元泳動
及び二次元泳動のゲル厚についても同様である。
一次元泳動 一次元泳動用ゲルコンテナGCは第2図(a)に示すよ
うな角柱状、すなわち矩形断面をもった複数列のゲル室
(10)を有すると共に、一側面の比較的高レベル位置にお
いて各ゲル室(10)に通ずるサンプル挿入窓(11)を形成し
たものである。前記零次元処理によるサンプルゲル片
は、この窓の縦寸法よりやや低い高さを有するが、零次
元及びこの一次元のゲル室幅及び奥行は同じであるた
め、この窓からゲル室(10)に挿入された各サンプルゲル
片SGは、同室内の泳動用ポリアクリルアミドゲルにお
けるこの窓に対応した切除部に入り、その上下切断端の
全面によく密着する。第2図(b)に示すSGCはサンプ
ルゲルカバー板であり、前記ゲルコンテナGCの各窓
(11)に対応する複数の窓栓(12)を有するものである。各
窓栓(12)は対応する各窓(11)内に挿入され、これにより
ゲル室(10)内において対応する位置にあるサンプルゲル
片SGの側面を支持及び被覆するものである。サンプル
ゲルカバーSGCを装着したゲルコンテナGCは第3
図に示すように、その上端及び下端を上部バッファー槽
ABV及び下部バッファー槽CBVに装着し、陽極
A及び陰極C間に適当な電圧を印加することにより、サ
ンプルゲルの泳動分離を行うものである。ゲルコンテナ
GCへのサンプルゲルカバーSGCの装着は、例えば
第4図に示すようなクリップ(13)を用いて行われる。ま
た、上部バッファー槽ABV及び下部バッファー槽C
BVの内部構造も同じく第4図に示す通りである。
上記の一次元泳動におけるポリアクリルアミドゲルは、
サンプルゲル片SGの挿入前において、ラジカル捕捉剤
としての2−メルカプトプロピオン酸を前泳動させたも
のであり、さらに前記サンプルゲルの泳動中においては
還元剤としてラジカル捕捉剤と同じ2−メルカプトプロ
ピオン酸が同時に泳動処理され、ゲル中を強い還元状態
に維持するようになっている。
上記のようにサンプルゲル片を一次元ゲルとは別に作成
し、これを一次元ゲル中に挿入する方式は本発明におい
てのみ採用された独自の方式であり、これによってラジ
カル捕捉剤の前泳動処理と相俟って残存ラジカルによる
試料消耗の問題が解決したものである。
二次元泳動 二次元泳動のゲルコンテナは、第5図に示すような3種
類のゲルコンテナ板LP、MP、RPを組み合わせ、こ
れにより形成したゲルコンテナ構体を上下バッファー槽
と接続することにより行われる。二次元ゲル室は複数枚
用いた場合のMP−MP板面間及び左側コンテナ板LP
の右側面とこれに対応するコンテナ板MPの左側面並び
に、右側コンテナ板RPの左側面とこれに対応するコン
テナ板MPの右側面との間に形成される。
コンテナ構体GCと上部バッファー槽ABV及び下
部バッファー槽CBVを組み合わせた構造の断面は第
6図に示す通りであり、各ゲル室には上端に一次元泳動
済ゲルを載置できるだけの余裕を残して二次元泳動用ゲ
ルBGが挿入される。コンテナ板MPの上端にはスロッ
トDが形成されると共に、左側コンテナ板LP及び右
側コンテナ板RPの上端外側面と上部バッファー槽AB
の下端に形成された突起との間には同様なスロット
が形成される。コンテナ構体GCの各ゲル室の上
端からは一次元泳動済ゲルSGが挿入されると共に、
コンテナ構体GCの上端にはガーゼが当てがわれ、各
スロットD及びDにはガーゼGの上から平板くさび
PWが挿入され、これにより緊張されるガーゼにより一
次元泳動済ゲルSGの上側縁が押圧され、二次元泳動
用ゲルBGの上端と好ましく密着するようになってい
る。
第7図はコンテナ構体GCを維持するための締結部材
H及び上部バッファー槽ABV及び下部バッファー槽
CBVの内部構造が示されている。
この二次元泳動においても、泳動媒体であるポリアクリ
ルアミドゲルには試料ゲル柱SG成分の泳動前におい
て、ラジカル捕捉剤としての2−メルカプトエチルアミ
ンを泳動させることにより残存するフリーラジカルを除
去し、また試料ゲル柱成分の泳動中においは、電荷をも
った還元剤としてシステインを共に泳動させ、二次元ゲ
ル内を強い還元的状態に維持するようにした。同時に、
前泳動で同ゲル内の塩基性ラジカル促進剤を除去すると
共に、下部、すなわち負電極バッファー槽CBVには
塩酸を加えることにより、ゲルのpHを通常の4.5から
約0.9低下させて3.6となるようにした。
第8図は“零次元泳動”を含む本発明の方法を実施して
得られた試料蛋白の分子量と泳動距離との関係を示すグ
ラフである。この場合、移動度に対する電荷の効果の差
を消去すれば、分子量の対数値はほぼ完全に移動度に比
例しており、分子量の測定が可能となったことを示して
いる。
上記第8図のグラフ及び第9図に示した二次元ゲルの分
離モデルから明らかな通り、二次元ゲルの塩基性領域か
らは、既知のスポット以外に4個の未知の蛋白質による
スポット(A、B、C、D)が検出された。第9図にお
いて、スポットAはL33の右下に、スポットBはL34の
左下に、スポットCはL29とL27の中間に、そしてスポ
ットDはL32の直下において見いだされる。なお、A、
B、Cは50S亜粒子に、Dは30S亜粒子に存在する。な
お、還元剤を用いずに、本発明の方法を実施した場合に
は、スポットA、B、Cが消失するが、BとCの消失に
伴ってその近傍にスポットB′とC′が見いだされた。
一方、Dは還元剤の有無と無関係に同一位置においてス
ポットを形成する。
また、A、B、C、Dの分子量を二次元移動度を用いて
求めると、それぞれ6400、4900、8200及び
5900となった。なお、14Cアミノ酸標識によってコ
ピー数を測定し、それぞれ0.6、0.4、0.3及び
0.1の値を得たものである。
発明の効果 本発明の方法は、以上の如く構成されたため、二次元電
気泳動において試料成分を正確、かつ明瞭に分離・分析
することが可能である。
【図面の簡単な説明】
第1図(a)及び(b)はそれぞれ零次元泳動用ゲルコンテナ
及びその使用状態を示す縦断面図、 第2図(a)及び(b)はそれぞれ本発明の方法を実施するた
めの一次元泳動用ゲルコンテナ及びサンプルゲルカバー
を示す斜視図、 第3図は一次元泳動用ゲルコンテナ及びこれに装着され
た上下電極槽を示す縦断面図、 第4図はその分解斜視図、 第5図は二次元泳動用の各種ゲルコンテナ板を分離して
示す斜視図、 第6図は第5図のゲルコンテナ板を組み合わせてコンテ
ナ構体とし、これに上下電極槽を装着した構造を示す縦
断面図、 第7図はその分解斜視図、 第8図は本発明の実施例により得られた分子量−泳動距
離特性を示すグラフ、 第9図は二次元ゲルの分離モデルを示す図である。 (1)……ゲル室 (2)……上部(陽極)バッファー槽 (3)……下部(陰極)バッファー槽 (4)……泳動用ゲル A……陽極 B……陰極 SG……サンプルゲル SGC……サンプルゲルカバー ABV……上部(陽極)バッファー槽 CBV……下部(陰極)バッファー槽 LP……左側コンテナ板 MP……中央コンテナ板 RP……右側コンテナ板 D……コンテナ間のスロット G……ガーゼ PW……平板くさび GS……ゲルスペーサ H……締結具

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】二次元電気泳動法において、矩形断面を有
    する互いに平行した複数本の棒状ゲル室を配列してなる
    一次元ゲル作成装置における少くとも一つの前記棒状ゲ
    ル室内に一次元ゲルを用意し、 試料を前記棒状一次元ゲル中において電気泳動させるこ
    とにより矩形断面を有する試料の一次元分離済ゲルを作
    成し、 前記一次元分離済ゲルを二次元ゲルの上端に横たえるこ
    とにより、一次元分離済ゲルの下側面と、二次元ゲルの
    上端面とを隙間なく密着させた状態において電気泳動さ
    せることを特徴とする二次元電気泳動法。
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