JP4535615B2 - 核酸増幅のモニター及び検出のための蛍光定量法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、標的ポリヌクレオチド（ポリ核酸としても知られる）の増幅を検出、好ましくは定量的に検出する方法及び前記方法における使用のためのプローブを提供する。
既知の蛍光PCRモニタリング技術は鎖特異的及び一般的DNAインターカレート技術を含むが、これらは少数の第二世代PCR熱サイクルデバイスにおいて使用することができるものであった。
一般的方法は、二本鎖DNA種に結合したときに蛍光の増加を示すDNAインターカレート色素を利用する。増幅の間のDNAの容積濃度の増加による蛍光の増大を使用して反応の進行を測定し、標的分子のコピー数を決定することができる。しかしながら、これらの方法は準鎖特異的である。なぜならば、生じるすべての非特異的増幅が二本鎖DNAを生成し、これがシグナルを増加させるからである。
鎖特異的方法は追加のポリヌクレオチド反応成分を利用して、増幅反応の進行をモニターする。これらの方法は検出の基礎として蛍光共鳴移動（fluorescence resonance transfer）（FRET）を使用する。１以上のポリヌクレオチドプローブを蛍光分子であるドナー分子及びアクセプター分子（それぞれ、リポーター分子及びクエンチ分子としても知られる）で標識する。通常は蛍光発光波長を示す特定波長の光により、ドナー分子は励起される。アクセプター分子は発光波長で高度に励起され、アクセプター分子とドナー分子がきわめて近接に存在するとき（例えば、同一又は隣接分子）には、共鳴移動によりドナー分子の発光エネルギーを受容することができる。FRET検出の基本は、ドナー及びアクセプターの発光波長の変化をモニターすることにある。２つのタイプのFRETプローブが存在する。一つはポリヌクレオチドプローブの加水分解を使用してドナーをアクセプターから分離するものであり、他方はハイブリダイゼーションを使用してドナー及びアクセプター分子の空間的な関係を変化させるものである。
加水分解プローブは TaqManTM（登録商標）プローブとして市販されている。これは、ドナー及びアクセプター分子で標識されたDNAオリゴヌクレオチドから構成される。このプローブはPCR生成物の一方の鎖の特定の領域に結合するように設計されている。PCRプライマーの鎖へのアニーリング後、Taq酵素は５’から３’方向へのポリメラーゼ活性によりDNAを延長する。更にTaq酵素は５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性も示す。TaqManTM（登録商標）プローブは３’末端においてリン酸化により保護されており、Taqによる延長のプライム（prime）を阻止している。TaqManTM（登録商標）プローブがプローブを加水分解する伸長するTaq分子よりも生成物鎖とハイブリダイズする場合、検出の基礎としてのドナーがアクセプターから遊離する。
【０００２】
ハイブリダイゼーションプローブは多くの外観で利用可能である。分子ビーコン（beacon）は、ヘアピンループを形成する相補的な５’及び３’配列を有するオリゴヌクレオチドである。ヘアピン構造を形成したとき、末端蛍光標識はきわめて近接して存在してFRETが起こる。分子ビーコンの相補配列へのハイブリダイゼーションの後、蛍光標識は分離し、そのため検出の基礎としてのFRETは生じない。このようなシステムの修飾は、分子ビーコンを増幅プライマーに結合することである（Nucl. Acids. Res. (1997) 25, 12, 2516-2521）。
しかしながら、前記の配列により生成するシグナルはプローブの長さにより制限され、これは達成されるシグナル−ノイズ比のレベルにおける限定因子を形成する。
本発明者等は、増幅反応を含む特定の反応の正確な検出及び／又はモニタリングを許容するシステムを開発した。
したがって本発明は、サンプル内の反応をモニターする方法であって、蛍光ドナー及び蛍光アクセプター分子が、ポリヌクレオチドの長さにそって、ドナーからの蛍光がアクセプターにより減少する距離で間隔をおいている蛍光ドナー及びアクセプター分子を有する二本鎖ポリヌクレオチドを供給又は形成する工程、該ドナー及び該アクセプター分子の中間（intermediate）の部位で該ポリヌクレオチドを切断する制限酵素を該分子に適用する工程、及び該サンプルの蛍光をモニターする工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
本発明の方法を使用して、モニターされる反応には、例えば増幅反応による二本鎖ポリヌクレオチドの形成が含まれ、サンプルが二本鎖ポリヌクレオチドを含むことが知られている場合、モニターすることができる反応は制限酵素の活性である。
特に本発明は、核酸増幅を検出する方法であって、
（ａ）核酸ポリメラーゼ、（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるプライマー及び（ｃ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブの存在下で該標的ポリヌクレオチドの核酸増幅を行う工程であって、該プローブは蛍光ドナー分子、蛍光アクセプター分子及び一本鎖配列であって二本鎖形態にあるときに該配列を切断する制限酵素により認識される配列を含み、該配列がドナー及びアクセプター分子の中間に位置している工程、
制限酵素を増幅生成物に適用して、二本鎖増幅生成物を切断し、アクセプター分子をドナー分子から遊離させる工程、及び、
反応混合物からの蛍光シグナルを検出する工程
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０００３】
本発明の方法を使用して、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。増幅が本発明の方法において検出される場合、標的ポリヌクレオチドはサンプル内に存在し、鋳型として作用する。
制限酵素を使用してドナー分子をアクセプター分子から遊離させることにより、例えば分離を達成するために複数の加水分解反応が必要とされるときに受ける時間の遅延が回避される。
更にドナー分子からのアクセプター分子の分離はプローブの長さにより制限されないので、良好な信号−雑音比が達成されるだろう。
本発明の方法を使用してエンドポイント（end point）を検出してもよい。この場合、増幅反応後に酵素を添加してもよく、又は、酵素が増幅反応の間じゅう存在していてもよい。後者は、リアルタイムに増幅反応をモニターする可能性を許容する。しかしながら、ある場合においては、酵素が消化をするために必要とされる試薬が増幅反応を阻害するかもしれない。これらの場合、別々の管におけるエンドポイント検出が望まれるだろう。
オリゴヌクレオチドプローブは、アンプリコン（amplicon）領域内に制限酵素に対する部位を含むように設計されるだろう。この場合、増幅の検出は、制限酵素を完了時に反応物へ添加することにより行われる。酵素は、プローブのドナー及びアクセプター分子の間で増幅生成物を切断し、ドナー分子を遊離し、エンドポイントシグナルを生成する。これは in situ PCRに使用されるだろう。しかしながら、その使用は、アンプリコン内におけるプローブとハイブリダイズする部位の存在に依存する。更に、完全長のアンプリコンの全単離は、この態様における検出後では不可能であろう。
好ましい態様において、プローブは、オリゴヌクレオチドプローブが、標的ポリヌクレオチドと該標的ポリヌクレオチドの３’末端の領域においてハイブリダイズし、ポリメラーゼの存在下で延長し、相補鎖二本鎖DNAにオリゴヌクレオチドプローブを提供することができるように設計される。制限部位は延長領域内に適切に位置する。この場合、標的ポリヌクレオチド自体は鎖延長反応の間、延長用プライマーとして作用し、ポリヌクレオチド配列はプローブの長さにしたがって延長し、これにより二本鎖になるだろう。これが起こると、制限酵素は延長領域を切断することができ、これによりアクセプターがプローブから放出されてシグナルを形成する。
【０００４】
適切にはプローブの３’末端は、例えばリン酸化により「ブロック」されており、増幅サイクルの延長段階の間にポリヌクレオチドの方向には延長しない。
このことは、ポリメラーゼ延長反応は、プローブのオーバーハング（overhang）領域に相補的な領域において標的ポリヌクレオチド鎖の延長を引き起こし、この領域における二本鎖制限部位の生成を引き起こすことを意味する。制限部位がアンプリコン以外に見いだされない酵素を選択する場合、制限酵素の適用により標的ポリヌクレオチド配列内では切断は起こらず、完全長の生成物が後に単離されるだろう。
代わりに、プローブを増幅プライマーに結合させてもよい。この場合、アクセプター及びドナー分子は好ましくはプライマーの非結合領域内に存在する。生成したアンプリコンは続いてその他のプライマーの影響下で延長サイクルを受けるとき、延長反応にはプローブの全領域が含まれ、制限部位を二本鎖にし、これにより制限酵素による切断を受けやすくなるだろう。
更に、制限酵素が増幅反応の間じゅう存在する場合、増幅反応自体の進行はモニターされるだろう。なぜなら、ドナー分子は、増幅反応の毎サイクルにおいて反応混合物中に存在するアンプリコンに比例した量で遊離するからである。ドナー分子からのシグナルにおける増進（build up）が観察され、増加をTaqManTM（登録商標）システムに関して周知の計算方法を使用して、開始時におけるサンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド量を計算するために使用してもよい。
制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖DNA分子を制限又は認識部位として知られる特異的な塩基対配列に結合して切断する酵素である。３種類の制限酵素が存在する。各タイプは２つの特異的酵素活性を有している。DNAメチラーゼ及び二本鎖DNAの切断及び分離を触媒するエンドヌクレアーゼである。
Ｉ型制限酵素は同一分子内にメチラーゼ活性及びATP依存性ヌクレアーゼ活性を有している。メチル化は認識部位で起こり、切断はDNAが結合酵素周囲にループを形成するとき、認識部位から離れた部位で起こる。Ｉ型及びIII型酵素は類似している。III型酵素も同一分子内にメチラーゼ活性及びヌクレアーゼ活性を有している。しかしながら、この酵素はATPを要求せず、切断部位は認識部位に接近している。II型制限酵素は制限部位で切断する。この酵素は長さ４又はそれ以上のヌクレオチド構造を認識する。各タイプの酵素は異なって切断する。酵素は両方の鎖を同一の場所で正確に切断し、DNAに平滑末端を形成することができる。その他の酵素は各DNA鎖を対称的な部位で切断し、一本鎖オーバーハング又は「付着末端」を有する断片を生成することができる。これらは３’オーバーハング及び５’オーバーハングを有する断片を作成することができる。
【０００５】
既知の制限酵素のどれもが本発明に使用されるだろう。特に、すべての増幅反応の終了時に添加され、特定の反応生成物のみを回収する場合、酵素により認識される内部領域を含まない。反応に使用する条件、例えば増幅反応に耐えることができる制限酵素は、熱安定性酵素である。
本発明の方法における使用に特に適切な制限酵素はTaq1である。この制限酵素はTAQポリメラーゼ様であり、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）より得ることができる。それゆえ、増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等で行われるサイクルの間に見られる条件に耐えるだろう。この種の更なる酵素は熱安定性制限酵素「PspG1」（New England Biolabs）である。この酵素はピロコッカス種（Pyrococcus sp）より単離され、CCWGGを認識し、最初のCの前で切断する。安定性は９５℃で２時間であり、ブロックPCRの３０回のサイクルに耐えるだろう。
PCR反応は本発明において好ましい増幅反応である。
適切には、アンプリコン及び／又は制限酵素は、酵素によって認識される部位がアンプリコン内に現れないように選択されるだろう。必要な場合には、利用可能な制限酵素を単離し、突然変異させ、操作して、必要とされる反応温度において熱安定性にすることができる。
適切には、本発明の方法に使用する核酸ポリメラーゼは、熱安定性酵素、例えばTAQポリメラーゼである。
本発明の方法に使用するプローブは分子ビーコンの形態をとり、標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの前にヘアピン形状を形成してもよい。この場合、プローブは５’領域及び３’領域において相補的配列を有し、標的ポリヌクレオチド配列への結合前は５’領域と３’領域が互いに結合している。この場合、制限はプローブの非相補的領域に位置し、プローブが標的配列へハイブリダイズする前は一本鎖配列のままであろう。
適切には、ドナー分子はプローブの一本の末端に配置され、アクセプターは他の末端に配置される。したがって、ドナー分子はプローブの５’末端に配置され、アクセプターは逆に３’末端（逆もまた同様）に配置されるだろう。この場合、分子ビーコンのヘアピンの配置は特に効果的である。なぜなら、標的配列へのハイブリダイゼーションの前はドナー及びアクセプターが近接しているからである。それゆえ、ドナー分子からの好ましくないバックグラウンドシグナルの危険性が低減される。
【０００６】
プローブが標的配列へハイブリダイズすると、ヘアピンが開き、これによりアクセプターはドナー分子から空間的に分離され、シグナルを生成する。しかしながら、本発明の場合、制限酵素がプローブ−標的配列ハイブリッド中間体を切断し、したがって、ドナー及びアクセプター分子はこれらの部分から更に離れ、シグナルは強くなる。
この更なる修飾において、プローブはその一方の末端において増幅プライマーに結合する。プローブはヘアピンの形態をとっていてもよく、とっていなくてもよい。しかしながら、ドナー及びアクセプター分子を含む領域は、プライマーの３’末端の上流に配置されるべきである。プライマーの延長は、その５’末端における結合したプローブを有するアンプリコンを導く。続く増幅サイクルの間、相補鎖が形成され、その他の増幅プライマーのアンプリコンの遠方の末端への結合が起こる。この相補鎖は、鎖延長の間に、標的鎖の長さに沿って延長するだけではなく、プローブを横切って延長する。これにより二本鎖となり、制限酵素により切断されやすくなる。
本発明の更なる態様においては、増幅反応は、制限酵素による切断に耐性を有する修飾ヌクレオチドを使用して行われる。このようなヌクレオチドの例はメチル化ヌクレオチドである。この場合、この方法に使用するプローブは修飾ヌクレオチドを含まないだろう。これは、反応において生成するアンプリコンが制限酵素耐性であることを意味する。
しかしながら、プローブがアンプリコンにハイブリダイズするとき、制限酵素により認識され、制限部位で切断されるだろう。しかしながら、相補鎖は切断されず、二本鎖DNAは「ニック（nick）」となるだろう。続くプローブの融解時に、アクセプターはドナー分子から離れて、これにより検出可能な修飾シグナルが生成する。
この態様をエンドポイント検出において使用してもよく、この場合、制限酵素は増幅の完了時に添加する。例えば増幅をモニター及び／又は定量するための反応過程において使用するとき、増幅の開始前に制限酵素が標的分子（通常、制限に対して耐性ではないだろう）を切断しないことが必要になるだろう。これは種々の方法で達成されるだろう。増幅の少なくとも第１ラウンドが起こるまで制限酵素の送達を遅らせてもよい。これは、例えば「ホットスタート」技術を使用して自動的に行われるだろう。この場合、ポリメラーゼ酵素は、例えばワックスバリヤー（wax barrier）を使用して反応混合物の残部から離れた状態で維持される。ワックスバリヤーは、所望の温度レベルに到達した後に溶解し、酵素を放出する。類似の方法を本発明のアッセイに使用して、必要とされるまで制限酵素を抑制してもよい。代わりに、その他の反応抑制手段を使用することができる。例えば反応混合物に制限酵素に対する抗体を含ませる。この場合、抗体は酵素活性を阻害するが、抗体自体は所望の温度で変性する。又は、酵素、特に当該技術分野において既知の修飾酵素、例えばTAQ GoldTM（登録商標）を使用する。この酵素は活性化される前に特定のレベルに加熱することを要求する。
【０００７】
本発明のこの態様を使用するとき、プローブがアンプリコンに結合する位置は重要ではない。アンプリコン鎖が切断される位置がなく、たとえプローブがアンプリコン内の中央の位置に位置していたとしても、アンプリコンの損失はなく、続く増幅サイクルにおける鋳型鎖の使用に利用可能なままである。
ドナー及びアクセプター分子の適切な組合せは、当該技術分野において既知である。例えば、ドナー分子はフルオレセイン色素を含んでいてもよく、アクセプター分子はローダミン色素である。
増幅反応を行うことができる適切な条件は、当該技術分野において周知である。最適条件は、含まれる特定のアンプリコン、使用するプライマーの性質及び使用する酵素に依存して、各ケースにおいて変化するだろう。各ケースにおける最適条件は、当業者により決定されるだろう。典型的な変性温度は９５℃のオーダーであり、典型的なアニール温度は５５℃のオーダーであり、延長温度は７２℃のオーダーである。
本発明の方法を、酵素が制限エンドヌクレアーゼである場合の酵素の品質管理における使用に適合させてもよい。現在、酵素の品質管理は、活性な酵素の特定のレベルについて濃度を決定する単位活性を使用している。しかしながら、酵素を、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在又は量が既知の場合の本発明の方法において制限酵素として使用する場合、酵素の品質は、蛍光プローブからのシグナルの分離を表示する蛍光シグナルを生成する能力により判断することができ、これにより活性のより正確な測定が提供される。
前記の方法におけるオリゴヌクレオチドプローブの使用は、本発明の更なる側面を形成する。特に、これらのプローブは、ドナー分子、アクセプター分子及びドナー及びアクセプター分子の中間に位置する特定の二本鎖DNA配列で切断する制限酵素に対する部位を含むだろう。
プローブは前記に概略したその他の特徴を含むだろう。例えば、プローブは分子ビーコンの形態にあり、５’領域及び３’領域において互いに結合する相補鎖を有していてもよい。
適切なドナー分子にはフルオレセイン色素、例えばフルオレセインが含まれ、アクセプター分子はローダミン色素又はその他の色素、例えばCy5であろう。しかしながら、FRET相互作用を受けることができるその他の色素の組合せを使用することができる。
【０００８】
本発明の更なる側面には、前記の方法を行うためのキットが含まれる。キットは、前記のプローブ並びにアクセプター及びドナー分子の中間でプローブを切断することができる制限酵素を含んでいる。更にキットは、増幅反応に使用する１以上の試薬、例えば制限酵素に耐性を有するヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドを生成することができる１以上の修飾ヌクレオチドを適宜含んでいてもよい。
本発明は、添付図面を参照しながら実施例により詳細に説明されるだろう。
示した増幅反応において、DNA分子（１）最初に一本鎖にする（１Ｂ）。増幅プライマー（２）、（３）の対を、周知の増幅反応においてフォワード（forward）及びリバース（reverse）プライマーとして結合させる。結果として、標的配列のみを含むアンプリコン生成物（４）が生じる。この生成物を続く増幅フェーズの間に融解すると、ドナー分子（６）及びアクセプター分子（７）を含むプローブ（５）は、標的配列の３’末端に結合する（１Ｄ）。DNAポリメラーゼの存在下、標的配列はプローブのオーバーハング領域に沿って延長し、矢印で示される制限酵素に対する二本鎖部位を作成する。
次いで制限酵素は延長した鎖を切断し、アクセプター分子（７）をドナー分子（６）から遊離させることができ、これによりシグナルが生成する（１Ｆ）。
図２の代替の態様において、プローブ（８）は分子ビーコンの形態をとり、増幅プライマー（９）の５’末端において融合している。プローブ−プライマー複合体は、存在して、一本鎖形態へ融解したとき、標的配列の一方の末端に結合する。第１のサイクルにおけるプライマーの延長により、その５’末端に結合した分子ビーコン構造を有するアンプリコン鎖（１０）が得られる。続く増幅サイクルの間、反対側の増幅プライマーは、アンプリコン鎖（１０）の３’末端に結合するだろう。この鎖の延長により分子ビーコン構造が開き、その長さに沿って二本鎖になる。したがって形成した制限酵素に対する二本鎖部位は、制限酵素により切断され（２Ｄ）、これによりドナー分子はアクセプター分子から分離され（２Ｅ）、増強した蛍光シグナルが生成するだろう。
図３に示す代替の態様において、増幅反応は、修飾ヌクレオチド（１１）、例えばメチル化ヌクレオチドを使用して行われる。結果として、アンプリコン鎖（１２）は制限酵素に対して耐性を有する。ただし、二本鎖形態にあるときは酵素はその制限部位を認識するだろう（陰影を付けた矢印により示す、３Ｄ）。アンプリコン鎖（１２）が修飾ヌクレオチドを含まないプローブにハイブリダイズするとき、プローブには「ニック」（１３）が生じるが、一方、アンプリコン鎖は無傷のままであろう。続く溶解において（３Ｆ）、ドナー及びアクセプター分子は分離して、ドナー分子が検出される増強されたシグナルを生成することを許容するだろう。
制限酵素による切断は、アクセプターのドナー分子からの分離の急速かつ効果的な手段を提供し、検出スピードを改善する。更に、アクセプターのドナー分子からの迅速かつ完全な分離を保証することにより、信号−雑音比が従来の分子ビーコン技術を使用したときと比較して増加する。
下記の実施例は説明目的で提供される。
【０００９】
実証１
試験増幅反応
エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）のアンチコアギュラーゼ（anticoagulase）遺伝子の１０４塩基対からなるアンプリコンをpBluescript SKベクター（Stratagene）へクローニングし、pYP100MLファージミド構築物を作成した。pYP100MLを下記の配列を有するフォワードプライマーYPPA155：
dATGACGCAGAAACAGGAAGAAAGATCAGCC（配列番号１）
及び下記のリバースプライマーYPP229R：
dGGTCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT（配列番号２）
を使用して増幅した。
PCR反応条件は下記の通りであった。
プライマー（各々） １μＭ（最終）
dNTP（各々） ２００μＭ（最終）
TAQ ０．０２５Ｕ／μｌ（終濃度）
緩衝液：２５０ｎｇ／μｌウシ血清アルブミン、５００ｍＭ Tris、ｐＨ８．３、２０ｍＭマグネシウム。
次いで、混合物を下記条件の３０回のサイクルに付した。
増幅は６分間で起こった。
【００１０】
実証２
プローブ（YPPAMP）の５’末端をドナーとしてフルオレセインで標識し、その１０ｂｐ下流にアクセプターCy5標識を作成した。プローブの配列は下記の通りであった。
5'T/CGAT/CCAGGXCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT（配列番号３）
（XはCy5の位置を示す。）
このプローブは前記に詳述したPCR反応においてリバースプライマーとして作用することができた。これら２つの蛍光分子の間に、Taq1制限部位（TCGA）がある（配列中の「/」で示す）。３’末端はリン酸化されていないので、PCR反応において延長することができた。
Taq1エンドヌクレアーゼ（Sigma）、II型酵素は、二本鎖DNAをこの特定の領域で切断した。その場合、フルオレセインドナーはCy5アクセプターから分離し、検出の基礎を作成した。プローブは、余分のヌクレオチドを５’末端に含むように設計し、得られたpYP100ML生成物は変化しなかった。この場合のアンプリコンはTaq1部位を含まなかった。
ドナー及びアクセプター分子は、FRETが起こるのに十分に近接して位置していた。しかしながら、Taq1酵素がアンプリコンを切断すると、ドナーは遊離して、FRETはもはや起こらなかった。
YPPAMPプローブを利用してPCR反応を最適化した。Perkin Elmer 9700を使用して、２μＭのYPPAMPプローブをpYP100ML増幅に含めた。プログラムは下記の工程の３０サイクルからなった。
生成物をアガロースゲル電気泳動により分析した。アガロースゲル電気泳動により、生成物のバンドは、１０４ｂｐのpYP100MLネガティブ断片よりも大きいことが示された。このことはプローブが首尾よく標的を増幅したことを示唆している。
【００１１】
実施例１
その後、前記の実証１に記載した増幅反応を、YPPAMPプローブをYPP229Rリバースプライマーで置き換えて用いて繰り返した。
増幅後、制限酵素Taq1を、dNTP及びパレット緩衝液ブラック（palette buffer black）（Sigma）と共にPCR生成物へ添加した。パレット緩衝液ブラックは、Taq1エンドヌクレアーゼ活性に要求されるＮａＣｌを含んでいた。反応は以下の工程の１サイクルを行った。
このプログラムは、断片の末端を切断するエンドヌクレアーゼの切断活性を活性化した。負の対照は酵素なしに行い、断片をゲル電気泳動により分析した。得られたバンドパターンは、断片が制限酵素により切断されたことを示した。
酵素切断及び対照サンプルを蛍光光度計を使用して分析した。PCR生成物を希釈し、反応物中のプローブ濃度を０．１μＭにした。高濃度下においては、蛍光シグナルはLightCyclerTM（登録商標）検出器にとって強すぎるものであった。試験サンプル中フルオレセイン蛍光シグナルはCy5よりも高かった。このことは、フルオレセインが遊離したが、Cy5はその蛍光エネルギーをクエンチするのに十分に近接していなかったことを示している。
対照サンプルは高いCy5蛍光読み値を示した。このことは、FRETが生じていたことを示唆している。結果は、プローブは増幅され、エンドヌクレアーゼは断片末端の除去に有効であったことを示している。
【００１２】
実施例２
前記のYPPAMPプローブ及びTaq1エンドヌクレアーゼを、LightCyclerTM（登録商標）を使用して増幅反応に含めた。プログラムは下記の工程の４０サイクルであった。
延長のための時間を、通常のpYP100ML増幅よりも増加させ、酵素が断片を切断する時間を設けた。
蛍光の読みはサイクル毎に行い、結果を図４に示す。生成物がフルオレセイン蛍光を増加させたことは、蛍光分子が分離したことを示唆している。
【００１３】
実施例３
シグナルを改善するために、０．５μＭのYPPAMPプローブを、Taq1なしの実施例２に記載の反応に類似のする２つ増幅反応に使用した。更に負の対照をDNAの非存在下で行った。プログラムはpYP100ML用の通常の増幅プログラムであった。下記の工程の３０サイクルからなった。
PCR増幅後、PCR生成物、Taq1、dNTP及びパレット緩衝液ブラックを用いて消化を行った。消化プログラムは下記の工程の１サイクルからなった。
図５は、フルオレセイン／Cy5（Ｆ１／Ｆ２）の蛍光シグナル比対時間として示した結果である。時間が増加するにつれ、蛍光が、陽性のサンプルである２つの高い線（Ａ）及び（Ｂ）において増加した。図６は、Ｆ１／１対時間の形態で示した結果である。Taq1が断片の末端を消化し、フルオレセインを遊離したとき、フルオレセイン蛍光における連続的な上昇が明確に観察された。おそらくコンタミネーションによって、負のサンプルの蛍光（線Ｃ）がわずかに上昇したが、一方、蛍光は正のサンプルサンプルよりも明らかに低かった。pYP100MLアンプリコンが周囲空気中に存在し、周囲空気由来のアンプリコンのできるだけ少量が増幅反応に必要とされた。
Ｆ２／１対時間のグラフの形態で予想したとき（図７）、フルオレセインとCy5との間のFRETが停止したときの蛍光の減少は明らかであった。
【００１４】
実施例４
プローブ消化実験
YPPAMPプローブのサンプルを、実施例３に概説した条件下、Taq1により６０分間消化した。
図８は、プローブを制限酵素により自然に切断したときのドナー及びアクセプターの波長における蛍光を示している。
最初は、プローブは高いCy5シグナル（Ｂ）及び低いフルオレセインシグナルを有する無傷のものであった。プローブを切断したとき、フルオレセインシグナル（Ａ）はプローブから遊離するにつれて上昇し、Cy5シグナルはもはやFRETが起こるために近接しなくなるにつれて低下した。図９は、時間に対する相対的蛍光Ｆ１／Ｆ２（フルオレセイン／Cy5）を示している。この図は、プローブの切断の結果、全体として連続的に上昇したことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の好ましい態様を形成する反応の図式の段階を示している。
【図２】 図２は、本発明の代替の態様を示している。
【図３】 図３は、本発明の更なる態様を示している。
【図４】 図４は、本発明にしたがうPCR反応におけるドナー分子からの蛍光対時間を示すグラフである。
【図５】 図５は、本発明のエンドポイントPCRアッセイにおけるドナーの蛍光／アクセプターの蛍光の比のグラフである。（Ａ）及び（Ｂ）は陽性反応を示し、（Ｃ）は負の対照を示している。
【図６】 図６は、本発明のエンドポイントPCRアッセイにおけるアクセプターの蛍光／ドナーの蛍光の比のグラフである。（Ａ）及び（Ｂ）は陽性反応を示し、（Ｃ）は負の対照を示している。
【図７】 図７は、本発明のエンドポイントPCRアッセイにおけるドナーの蛍光対時間を示すグラフである。（Ａ）及び（Ｂ）は陽性反応を示し、（Ｃ）は負の対照を示している。
【図８】 図８は、ドナー及びアクセプターの間で切断する制限酵素の存在下における、ドナー（Ａ）及びアクセプター（Ｂ）の蛍光の時間に対する変化を示すグラフである。
【図９】 図９は、図８に示す反応過程における累積的な蛍光の増加を示すグラフである。
本発明は、標的ポリヌクレオチド（ポリ核酸としても知られる）の増幅を検出、好ましくは定量的に検出する方法及び前記方法における使用のためのプローブを提供する。
既知の蛍光PCRモニタリング技術は鎖特異的及び一般的DNAインターカレート技術を含むが、これらは少数の第二世代PCR熱サイクルデバイスにおいて使用することができるものであった。
一般的方法は、二本鎖DNA種に結合したときに蛍光の増加を示すDNAインターカレート色素を利用する。増幅の間のDNAの容積濃度の増加による蛍光の増大を使用して反応の進行を測定し、標的分子のコピー数を決定することができる。しかしながら、これらの方法は準鎖特異的である。なぜならば、生じるすべての非特異的増幅が二本鎖DNAを生成し、これがシグナルを増加させるからである。
鎖特異的方法は追加のポリヌクレオチド反応成分を利用して、増幅反応の進行をモニターする。これらの方法は検出の基礎として蛍光共鳴移動（fluorescence resonance transfer）（FRET）を使用する。１以上のポリヌクレオチドプローブを蛍光分子であるドナー分子及びアクセプター分子（それぞれ、リポーター分子及びクエンチ分子としても知られる）で標識する。通常は蛍光発光波長を示す特定波長の光により、ドナー分子は励起される。アクセプター分子は発光波長で高度に励起され、アクセプター分子とドナー分子がきわめて近接に存在するとき（例えば、同一又は隣接分子）には、共鳴移動によりドナー分子の発光エネルギーを受容することができる。FRET検出の基本は、ドナー及びアクセプターの発光波長の変化をモニターすることにある。２つのタイプのFRETプローブが存在する。一つはポリヌクレオチドプローブの加水分解を使用してドナーをアクセプターから分離するものであり、他方はハイブリダイゼーションを使用してドナー及びアクセプター分子の空間的な関係を変化させるものである。
加水分解プローブは TaqManTM（登録商標）プローブとして市販されている。これは、ドナー及びアクセプター分子で標識されたDNAオリゴヌクレオチドから構成される。このプローブはPCR生成物の一方の鎖の特定の領域に結合するように設計されている。PCRプライマーの鎖へのアニーリング後、Taq酵素は５’から３’方向へのポリメラーゼ活性によりDNAを延長する。更にTaq酵素は５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性も示す。TaqManTM（登録商標）プローブは３’末端においてリン酸化により保護されており、Taqによる延長のプライム（prime）を阻止している。TaqManTM（登録商標）プローブがプローブを加水分解する伸長するTaq分子よりも生成物鎖とハイブリダイズする場合、検出の基礎としてのドナーがアクセプターから遊離する。
【０００２】
ハイブリダイゼーションプローブは多くの外観で利用可能である。分子ビーコン（beacon）は、ヘアピンループを形成する相補的な５’及び３’配列を有するオリゴヌクレオチドである。ヘアピン構造を形成したとき、末端蛍光標識はきわめて近接して存在してFRETが起こる。分子ビーコンの相補配列へのハイブリダイゼーションの後、蛍光標識は分離し、そのため検出の基礎としてのFRETは生じない。このようなシステムの修飾は、分子ビーコンを増幅プライマーに結合することである（Nucl. Acids. Res. (1997) 25, 12, 2516-2521）。
しかしながら、前記の配列により生成するシグナルはプローブの長さにより制限され、これは達成されるシグナル−ノイズ比のレベルにおける限定因子を形成する。
本発明者等は、増幅反応を含む特定の反応の正確な検出及び／又はモニタリングを許容するシステムを開発した。
したがって本発明は、サンプル内の反応をモニターする方法であって、蛍光ドナー及び蛍光アクセプター分子が、ポリヌクレオチドの長さにそって、ドナーからの蛍光がアクセプターにより減少する距離で間隔をおいている蛍光ドナー及びアクセプター分子を有する二本鎖ポリヌクレオチドを供給又は形成する工程、該ドナー及び該アクセプター分子の中間（intermediate）の部位で該ポリヌクレオチドを切断する制限酵素を該分子に適用する工程、及び該サンプルの蛍光をモニターする工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
本発明の方法を使用して、モニターされる反応には、例えば増幅反応による二本鎖ポリヌクレオチドの形成が含まれ、サンプルが二本鎖ポリヌクレオチドを含むことが知られている場合、モニターすることができる反応は制限酵素の活性である。
特に本発明は、核酸増幅を検出する方法であって、
（ａ）核酸ポリメラーゼ、（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるプライマー及び（ｃ）該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブの存在下で該標的ポリヌクレオチドの核酸増幅を行う工程であって、該プローブは蛍光ドナー分子、蛍光アクセプター分子及び一本鎖配列であって二本鎖形態にあるときに該配列を切断する制限酵素により認識される配列を含み、該配列がドナー及びアクセプター分子の中間に位置している工程、
制限酵素を増幅生成物に適用して、二本鎖増幅生成物を切断し、アクセプター分子をドナー分子から遊離させる工程、及び、
反応混合物からの蛍光シグナルを検出する工程
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０００３】
本発明の方法を使用して、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。増幅が本発明の方法において検出される場合、標的ポリヌクレオチドはサンプル内に存在し、鋳型として作用する。
制限酵素を使用してドナー分子をアクセプター分子から遊離させることにより、例えば分離を達成するために複数の加水分解反応が必要とされるときに受ける時間の遅延が回避される。
更にドナー分子からのアクセプター分子の分離はプローブの長さにより制限されないので、良好な信号−雑音比が達成されるだろう。
本発明の方法を使用してエンドポイント（end point）を検出してもよい。この場合、増幅反応後に酵素を添加してもよく、又は、酵素が増幅反応の間じゅう存在していてもよい。後者は、リアルタイムに増幅反応をモニターする可能性を許容する。しかしながら、ある場合においては、酵素が消化をするために必要とされる試薬が増幅反応を阻害するかもしれない。これらの場合、別々の管におけるエンドポイント検出が望まれるだろう。
オリゴヌクレオチドプローブは、アンプリコン（amplicon）領域内に制限酵素に対する部位を含むように設計されるだろう。この場合、増幅の検出は、制限酵素を完了時に反応物へ添加することにより行われる。酵素は、プローブのドナー及びアクセプター分子の間で増幅生成物を切断し、ドナー分子を遊離し、エンドポイントシグナルを生成する。これは in situ PCRに使用されるだろう。しかしながら、その使用は、アンプリコン内におけるプローブとハイブリダイズする部位の存在に依存する。更に、完全長のアンプリコンの全単離は、この態様における検出後では不可能であろう。
好ましい態様において、プローブは、オリゴヌクレオチドプローブが、標的ポリヌクレオチドと該標的ポリヌクレオチドの３’末端の領域においてハイブリダイズし、ポリメラーゼの存在下で延長し、相補鎖二本鎖DNAにオリゴヌクレオチドプローブを提供することができるように設計される。制限部位は延長領域内に適切に位置する。この場合、標的ポリヌクレオチド自体は鎖延長反応の間、延長用プライマーとして作用し、ポリヌクレオチド配列はプローブの長さにしたがって延長し、これにより二本鎖になるだろう。これが起こると、制限酵素は延長領域を切断することができ、これによりアクセプターがプローブから放出されてシグナルを形成する。
【０００４】
適切にはプローブの３’末端は、例えばリン酸化により「ブロック」されており、増幅サイクルの延長段階の間にポリヌクレオチドの方向には延長しない。
このことは、ポリメラーゼ延長反応は、プローブのオーバーハング（overhang）領域に相補的な領域において標的ポリヌクレオチド鎖の延長を引き起こし、この領域における二本鎖制限部位の生成を引き起こすことを意味する。制限部位がアンプリコン以外に見いだされない酵素を選択する場合、制限酵素の適用により標的ポリヌクレオチド配列内では切断は起こらず、完全長の生成物が後に単離されるだろう。
代わりに、プローブを増幅プライマーに結合させてもよい。この場合、アクセプター及びドナー分子は好ましくはプライマーの非結合領域内に存在する。生成したアンプリコンは続いてその他のプライマーの影響下で延長サイクルを受けるとき、延長反応にはプローブの全領域が含まれ、制限部位を二本鎖にし、これにより制限酵素による切断を受けやすくなるだろう。
更に、制限酵素が増幅反応の間じゅう存在する場合、増幅反応自体の進行はモニターされるだろう。なぜなら、ドナー分子は、増幅反応の毎サイクルにおいて反応混合物中に存在するアンプリコンに比例した量で遊離するからである。ドナー分子からのシグナルにおける増進（build up）が観察され、増加をTaqManTM（登録商標）システムに関して周知の計算方法を使用して、開始時におけるサンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド量を計算するために使用してもよい。
制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖DNA分子を制限又は認識部位として知られる特異的な塩基対配列に結合して切断する酵素である。３種類の制限酵素が存在する。各タイプは２つの特異的酵素活性を有している。DNAメチラーゼ及び二本鎖DNAの切断及び分離を触媒するエンドヌクレアーゼである。
Ｉ型制限酵素は同一分子内にメチラーゼ活性及びATP依存性ヌクレアーゼ活性を有している。メチル化は認識部位で起こり、切断はDNAが結合酵素周囲にループを形成するとき、認識部位から離れた部位で起こる。Ｉ型及びIII型酵素は類似している。III型酵素も同一分子内にメチラーゼ活性及びヌクレアーゼ活性を有している。しかしながら、この酵素はATPを要求せず、切断部位は認識部位に接近している。II型制限酵素は制限部位で切断する。この酵素は長さ４又はそれ以上のヌクレオチド構造を認識する。各タイプの酵素は異なって切断する。酵素は両方の鎖を同一の場所で正確に切断し、DNAに平滑末端を形成することができる。その他の酵素は各DNA鎖を対称的な部位で切断し、一本鎖オーバーハング又は「付着末端」を有する断片を生成することができる。これらは３’オーバーハング及び５’オーバーハングを有する断片を作成することができる。
【０００５】
既知の制限酵素のどれもが本発明に使用されるだろう。特に、すべての増幅反応の終了時に添加され、特定の反応生成物のみを回収する場合、酵素により認識される内部領域を含まない。反応に使用する条件、例えば増幅反応に耐えることができる制限酵素は、熱安定性酵素である。
本発明の方法における使用に特に適切な制限酵素はTaq1である。この制限酵素はTAQポリメラーゼ様であり、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）より得ることができる。それゆえ、増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等で行われるサイクルの間に見られる条件に耐えるだろう。この種の更なる酵素は熱安定性制限酵素「PspG1」（New England Biolabs）である。この酵素はピロコッカス種（Pyrococcus sp）より単離され、CCWGGを認識し、最初のCの前で切断する。安定性は９５℃で２時間であり、ブロックPCRの３０回のサイクルに耐えるだろう。
PCR反応は本発明において好ましい増幅反応である。
適切には、アンプリコン及び／又は制限酵素は、酵素によって認識される部位がアンプリコン内に現れないように選択されるだろう。必要な場合には、利用可能な制限酵素を単離し、突然変異させ、操作して、必要とされる反応温度において熱安定性にすることができる。
適切には、本発明の方法に使用する核酸ポリメラーゼは、熱安定性酵素、例えばTAQポリメラーゼである。
本発明の方法に使用するプローブは分子ビーコンの形態をとり、標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの前にヘアピン形状を形成してもよい。この場合、プローブは５’領域及び３’領域において相補的配列を有し、標的ポリヌクレオチド配列への結合前は５’領域と３’領域が互いに結合している。この場合、制限はプローブの非相補的領域に位置し、プローブが標的配列へハイブリダイズする前は一本鎖配列のままであろう。
適切には、ドナー分子はプローブの一本の末端に配置され、アクセプターは他の末端に配置される。したがって、ドナー分子はプローブの５’末端に配置され、アクセプターは逆に３’末端（逆もまた同様）に配置されるだろう。この場合、分子ビーコンのヘアピンの配置は特に効果的である。なぜなら、標的配列へのハイブリダイゼーションの前はドナー及びアクセプターが近接しているからである。それゆえ、ドナー分子からの好ましくないバックグラウンドシグナルの危険性が低減される。
【０００６】
プローブが標的配列へハイブリダイズすると、ヘアピンが開き、これによりアクセプターはドナー分子から空間的に分離され、シグナルを生成する。しかしながら、本発明の場合、制限酵素がプローブ−標的配列ハイブリッド中間体を切断し、したがって、ドナー及びアクセプター分子はこれらの部分から更に離れ、シグナルは強くなる。
この更なる修飾において、プローブはその一方の末端において増幅プライマーに結合する。プローブはヘアピンの形態をとっていてもよく、とっていなくてもよい。しかしながら、ドナー及びアクセプター分子を含む領域は、プライマーの３’末端の上流に配置されるべきである。プライマーの延長は、その５’末端における結合したプローブを有するアンプリコンを導く。続く増幅サイクルの間、相補鎖が形成され、その他の増幅プライマーのアンプリコンの遠方の末端への結合が起こる。この相補鎖は、鎖延長の間に、標的鎖の長さに沿って延長するだけではなく、プローブを横切って延長する。これにより二本鎖となり、制限酵素により切断されやすくなる。
本発明の更なる態様においては、増幅反応は、制限酵素による切断に耐性を有する修飾ヌクレオチドを使用して行われる。このようなヌクレオチドの例はメチル化ヌクレオチドである。この場合、この方法に使用するプローブは修飾ヌクレオチドを含まないだろう。これは、反応において生成するアンプリコンが制限酵素耐性であることを意味する。
しかしながら、プローブがアンプリコンにハイブリダイズするとき、制限酵素により認識され、制限部位で切断されるだろう。しかしながら、相補鎖は切断されず、二本鎖DNAは「ニック（nick）」となるだろう。続くプローブの融解時に、アクセプターはドナー分子から離れて、これにより検出可能な修飾シグナルが生成する。
この態様をエンドポイント検出において使用してもよく、この場合、制限酵素は増幅の完了時に添加する。例えば増幅をモニター及び／又は定量するための反応過程において使用するとき、増幅の開始前に制限酵素が標的分子（通常、制限に対して耐性ではないだろう）を切断しないことが必要になるだろう。これは種々の方法で達成されるだろう。増幅の少なくとも第１ラウンドが起こるまで制限酵素の送達を遅らせてもよい。これは、例えば「ホットスタート」技術を使用して自動的に行われるだろう。この場合、ポリメラーゼ酵素は、例えばワックスバリヤー（wax barrier）を使用して反応混合物の残部から離れた状態で維持される。ワックスバリヤーは、所望の温度レベルに到達した後に溶解し、酵素を放出する。類似の方法を本発明のアッセイに使用して、必要とされるまで制限酵素を抑制してもよい。代わりに、その他の反応抑制手段を使用することができる。例えば反応混合物に制限酵素に対する抗体を含ませる。この場合、抗体は酵素活性を阻害するが、抗体自体は所望の温度で変性する。又は、酵素、特に当該技術分野において既知の修飾酵素、例えばTAQ GoldTM（登録商標）を使用する。この酵素は活性化される前に特定のレベルに加熱することを要求する。
【０００７】
本発明のこの態様を使用するとき、プローブがアンプリコンに結合する位置は重要ではない。アンプリコン鎖が切断される位置がなく、たとえプローブがアンプリコン内の中央の位置に位置していたとしても、アンプリコンの損失はなく、続く増幅サイクルにおける鋳型鎖の使用に利用可能なままである。
ドナー及びアクセプター分子の適切な組合せは、当該技術分野において既知である。例えば、ドナー分子はフルオレセイン色素を含んでいてもよく、アクセプター分子はローダミン色素である。
増幅反応を行うことができる適切な条件は、当該技術分野において周知である。最適条件は、含まれる特定のアンプリコン、使用するプライマーの性質及び使用する酵素に依存して、各ケースにおいて変化するだろう。各ケースにおける最適条件は、当業者により決定されるだろう。典型的な変性温度は９５℃のオーダーであり、典型的なアニール温度は５５℃のオーダーであり、延長温度は７２℃のオーダーである。
本発明の方法を、酵素が制限エンドヌクレアーゼである場合の酵素の品質管理における使用に適合させてもよい。現在、酵素の品質管理は、活性な酵素の特定のレベルについて濃度を決定する単位活性を使用している。しかしながら、酵素を、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在又は量が既知の場合の本発明の方法において制限酵素として使用する場合、酵素の品質は、蛍光プローブからのシグナルの分離を表示する蛍光シグナルを生成する能力により判断することができ、これにより活性のより正確な測定が提供される。
前記の方法におけるオリゴヌクレオチドプローブの使用は、本発明の更なる側面を形成する。特に、これらのプローブは、ドナー分子、アクセプター分子及びドナー及びアクセプター分子の中間に位置する特定の二本鎖DNA配列で切断する制限酵素に対する部位を含むだろう。
プローブは前記に概略したその他の特徴を含むだろう。例えば、プローブは分子ビーコンの形態にあり、５’領域及び３’領域において互いに結合する相補鎖を有していてもよい。
適切なドナー分子にはフルオレセイン色素、例えばフルオレセインが含まれ、アクセプター分子はローダミン色素又はその他の色素、例えばCy5であろう。しかしながら、FRET相互作用を受けることができるその他の色素の組合せを使用することができる。
【０００８】
本発明の更なる側面には、前記の方法を行うためのキットが含まれる。キットは、前記のプローブ並びにアクセプター及びドナー分子の中間でプローブを切断することができる制限酵素を含んでいる。更にキットは、増幅反応に使用する１以上の試薬、例えば制限酵素に耐性を有するヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドを生成することができる１以上の修飾ヌクレオチドを適宜含んでいてもよい。
本発明は、添付図面を参照しながら実施例により詳細に説明されるだろう。
示した増幅反応において、DNA分子（１）最初に一本鎖にする（１Ｂ）。増幅プライマー（２）、（３）の対を、周知の増幅反応においてフォワード（forward）及びリバース（reverse）プライマーとして結合させる。結果として、標的配列のみを含むアンプリコン生成物（４）が生じる。この生成物を続く増幅フェーズの間に融解すると、ドナー分子（６）及びアクセプター分子（７）を含むプローブ（５）は、標的配列の３’末端に結合する（１Ｄ）。DNAポリメラーゼの存在下、標的配列はプローブのオーバーハング領域に沿って延長し、矢印で示される制限酵素に対する二本鎖部位を作成する。
次いで制限酵素は延長した鎖を切断し、アクセプター分子（７）をドナー分子（６）から遊離させることができ、これによりシグナルが生成する（１Ｆ）。
図２の代替の態様において、プローブ（８）は分子ビーコンの形態をとり、増幅プライマー（９）の５’末端において融合している。プローブ−プライマー複合体は、存在して、一本鎖形態へ融解したとき、標的配列の一方の末端に結合する。第１のサイクルにおけるプライマーの延長により、その５’末端に結合した分子ビーコン構造を有するアンプリコン鎖（１０）が得られる。続く増幅サイクルの間、反対側の増幅プライマーは、アンプリコン鎖（１０）の３’末端に結合するだろう。この鎖の延長により分子ビーコン構造が開き、その長さに沿って二本鎖になる。したがって形成した制限酵素に対する二本鎖部位は、制限酵素により切断され（２Ｄ）、これによりドナー分子はアクセプター分子から分離され（２Ｅ）、増強した蛍光シグナルが生成するだろう。
図３に示す代替の態様において、増幅反応は、修飾ヌクレオチド（１１）、例えばメチル化ヌクレオチドを使用して行われる。結果として、アンプリコン鎖（１２）は制限酵素に対して耐性を有する。ただし、二本鎖形態にあるときは酵素はその制限部位を認識するだろう（陰影を付けた矢印により示す、３Ｄ）。アンプリコン鎖（１２）が修飾ヌクレオチドを含まないプローブにハイブリダイズするとき、プローブには「ニック」（１３）が生じるが、一方、アンプリコン鎖は無傷のままであろう。続く溶解において（３Ｆ）、ドナー及びアクセプター分子は分離して、ドナー分子が検出される増強されたシグナルを生成することを許容するだろう。
制限酵素による切断は、アクセプターのドナー分子からの分離の急速かつ効果的な手段を提供し、検出スピードを改善する。更に、アクセプターのドナー分子からの迅速かつ完全な分離を保証することにより、信号−雑音比が従来の分子ビーコン技術を使用したときと比較して増加する。
下記の実施例は説明目的で提供される。
【０００９】
実証１
試験増幅反応
エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）のアンチコアギュラーゼ（anticoagulase）遺伝子の１０４塩基対からなるアンプリコンをpBluescript SKベクター（Stratagene）へクローニングし、pYP100MLファージミド構築物を作成した。pYP100MLを下記の配列を有するフォワードプライマーYPPA155：
dATGACGCAGAAACAGGAAGAAAGATCAGCC（配列番号１）
及び下記のリバースプライマーYPP229R：
dGGTCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT（配列番号２）
を使用して増幅した。
PCR反応条件は下記の通りであった。
プライマー（各々） １μＭ（最終）
dNTP（各々） ２００μＭ（最終）
TAQ ０．０２５Ｕ／μｌ（終濃度）
緩衝液：２５０ｎｇ／μｌウシ血清アルブミン、５００ｍＭ Tris、ｐＨ８．３、２０ｍＭマグネシウム。
次いで、混合物を下記条件の３０回のサイクルに付した。
【００１０】
実証２
プローブ（YPPAMP）の５’末端をドナーとしてフルオレセインで標識し、その１０ｂｐ下流にアクセプターCy5標識を作成した。プローブの配列は下記の通りであった。
5'T/CGAT/CCAGGXCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT（配列番号３）
（XはCy5の位置を示す。）
このプローブは前記に詳述したPCR反応においてリバースプライマーとして作用することができた。これら２つの蛍光分子の間に、Taq1制限部位（TCGA）がある（配列中の「/」で示す）。３’末端はリン酸化されていないので、PCR反応において延長することができた。
Taq1エンドヌクレアーゼ（Sigma）、II型酵素は、二本鎖DNAをこの特定の領域で切断した。その場合、フルオレセインドナーはCy5アクセプターから分離し、検出の基礎を作成した。プローブは、余分のヌクレオチドを５’末端に含むように設計し、得られたpYP100ML生成物は変化しなかった。この場合のアンプリコンはTaq1部位を含まなかった。
ドナー及びアクセプター分子は、FRETが起こるのに十分に近接して位置していた。しかしながら、Taq1酵素がアンプリコンを切断すると、ドナーは遊離して、FRETはもはや起こらなかった。
YPPAMPプローブを利用してPCR反応を最適化した。Perkin Elmer 9700を使用して、２μＭのYPPAMPプローブをpYP100ML増幅に含めた。プログラムは下記の工程の３０サイクルからなった。
【００１１】
実施例１
その後、前記の実証１に記載した増幅反応を、YPPAMPプローブをYPP229Rリバースプライマーで置き換えて用いて繰り返した。
増幅後、制限酵素Taq1を、dNTP及びパレット緩衝液ブラック（palette buffer black）（Sigma）と共にPCR生成物へ添加した。パレット緩衝液ブラックは、Taq1エンドヌクレアーゼ活性に要求されるＮａＣｌを含んでいた。反応は以下の工程の１サイクルを行った。
酵素切断及び対照サンプルを蛍光光度計を使用して分析した。PCR生成物を希釈し、反応物中のプローブ濃度を０．１μＭにした。高濃度下においては、蛍光シグナルはLightCyclerTM（登録商標）検出器にとって強すぎるものであった。試験サンプル中フルオレセイン蛍光シグナルはCy5よりも高かった。このことは、フルオレセインが遊離したが、Cy5はその蛍光エネルギーをクエンチするのに十分に近接していなかったことを示している。
対照サンプルは高いCy5蛍光読み値を示した。このことは、FRETが生じていたことを示唆している。結果は、プローブは増幅され、エンドヌクレアーゼは断片末端の除去に有効であったことを示している。
【００１２】
実施例２
前記のYPPAMPプローブ及びTaq1エンドヌクレアーゼを、LightCyclerTM（登録商標）を使用して増幅反応に含めた。プログラムは下記の工程の４０サイクルであった。
蛍光の読みはサイクル毎に行い、結果を図４に示す。生成物がフルオレセイン蛍光を増加させたことは、蛍光分子が分離したことを示唆している。
【００１３】
実施例３
シグナルを改善するために、０．５μＭのYPPAMPプローブを、Taq1なしの実施例２に記載の反応に類似のする２つ増幅反応に使用した。更に負の対照をDNAの非存在下で行った。プログラムはpYP100ML用の通常の増幅プログラムであった。下記の工程の３０サイクルからなった。
Ｆ２／１対時間のグラフの形態で予想したとき（図７）、フルオレセインとCy5との間のFRETが停止したときの蛍光の減少は明らかであった。
【００１４】
実施例４
プローブ消化実験
YPPAMPプローブのサンプルを、実施例３に概説した条件下、Taq1により６０分間消化した。
図８は、プローブを制限酵素により自然に切断したときのドナー及びアクセプターの波長における蛍光を示している。
最初は、プローブは高いCy5シグナル（Ｂ）及び低いフルオレセインシグナルを有する無傷のものであった。プローブを切断したとき、フルオレセインシグナル（Ａ）はプローブから遊離するにつれて上昇し、Cy5シグナルはもはやFRETが起こるために近接しなくなるにつれて低下した。図９は、時間に対する相対的蛍光Ｆ１／Ｆ２（フルオレセイン／Cy5）を示している。この図は、プローブの切断の結果、全体として連続的に上昇したことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の好ましい態様を形成する反応の図式の段階を示している。
【図２】 図２は、本発明の代替の態様を示している。
【図３】 図３は、本発明の更なる態様を示している。
【図４】 図４は、本発明にしたがうPCR反応におけるドナー分子からの蛍光対時間を示すグラフである。
【図５】 図５は、本発明のエンドポイントPCRアッセイにおけるドナーの蛍光／アクセプターの蛍光の比のグラフである。（Ａ）及び（Ｂ）は陽性反応を示し、（Ｃ）は負の対照を示している。
【図６】 図６は、本発明のエンドポイントPCRアッセイにおけるアクセプターの蛍光／ドナーの蛍光の比のグラフである。（Ａ）及び（Ｂ）は陽性反応を示し、（Ｃ）は負の対照を示している。
【図７】 図７は、本発明のエンドポイントPCRアッセイにおけるドナーの蛍光対時間を示すグラフである。（Ａ）及び（Ｂ）は陽性反応を示し、（Ｃ）は負の対照を示している。
【図８】 図８は、ドナー及びアクセプターの間で切断する制限酵素の存在下における、ドナー（Ａ）及びアクセプター（Ｂ）の蛍光の時間に対する変化を示すグラフである。
【図９】 図９は、図８に示す反応過程における累積的な蛍光の増加を示すグラフである。
Claims (31)
- サンプル内の核酸増幅を検出する方法であって、
（ａ）核酸ポリメラーゼ、（ｂ）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるプライマー及び（ｃ）該標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブの存在下で該標的ポリヌクレオチドについての核酸増幅を行う工程であって、該プローブは、蛍光ドナー分子及び蛍光アクセプター分子及び一本鎖配列であって二本鎖形態にあるときに該配列を切断する制限酵素により認識される一本鎖配列を含み、該配列がドナー及びアクセプター分子の中間に位置している工程、
制限酵素を増幅生成物に適用して、二本鎖増幅生成物を切断し、アクセプター分子をドナー分子から遊離させる工程、及び、
サンプルからの蛍光シグナルを検出する工程、
を含み、
(1)該オリゴヌクレオチドプローブが、該標的ポリヌクレオチドの３’末端領域で該標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズして、該ポリヌクレオチドの３’末端が増幅の間に延長して、該プローブの相補領域を形成することができ；又は
(2)該プローブは３’末端でブロックされて、増幅サイクルの間延長せず、かつ５’領域及び３’領域において相補配列を有し、標的ポリヌクレオチド配列へ結合する前は該プローブの５’領域及び３’領域が互いに結合しており；又は
(3)増幅反応が、制限酵素による切断に耐性を有する修飾ヌクレオチドを用いて行われるポリメラーゼ連鎖反応であり、これにより生成したアンプリコンが制限酵素による切断に対して抵抗する方法。 - 該オリゴヌクレオチドプローブが、該標的ポリヌクレオチドの３’末端領域で該標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドの３’末端が増幅の間に延長して、該プローブの相補領域を形成することができる、請求項１に記載の方法。
- 該制限酵素が増幅反応の間じゅう存在し、増幅反応の進行を該ドナー分子からのシグナルの増加を測定することによりモニターする、請求項２に記載の方法。
- 該制限酵素がTaq1である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 核酸ポリメラーゼが熱安定性ポリメラーゼである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- プローブが５’領域及び３’領域において相補配列を有し、標的ポリヌクレオチド配列へ結合する前は５’領域及び３’領域が互いに結合している、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 該プローブが、増幅プライマーの５’末端で、該プライマーに結合している、請求項６に記載の方法。
- 該ドナー分子がフルオレセイン色素を含んでいる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- 該アクセプター分子がローダミン色素又はCy5である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
- 該ドナー分子がプローブの３’末端領域でヌクレオチドへ結合し、該アクセプター分子がプローブの５’末端領域で結合している、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
- 該ドナー分子がプローブの５’末端領域でヌクレオチドへ結合し、該アクセプター分子がプローブの３’末端領域でヌクレオチドへ結合している、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
- 増幅反応を、制限酵素による切断に耐性を有する修飾ヌクレオチドを使用して行う、請求項１又は２に記載の方法。
- 該修飾ヌクレオチドがメチル化ヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
- 増幅反応が進行し、少なくともあるアンプリコン生成物が存在するまで制限酵素の作用が阻害される、請求項１２又は１３に記載の方法。
- あるアンプリコン生成物が得られるまで、制限酵素が反応混合物の残部から離れて維持される、請求項１４に記載の方法。
- 制限酵素が溶解可能なバリヤーにより抑制される、請求項１５に記載の方法。
- 制限酵素が抗体の存在により阻害される、請求項１４に記載の方法。
- 制限酵素が、特定の温度に曝露されるときのみ活性になる酵素である、請求項１４に記載の方法。
- 増幅反応をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して行う、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
- プローブが増幅プライマーの５’末端で結合している、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
- ドナー分子、アクセプター分子並びに該ドナー及び該アクセプター分子の中間に位置している特定の二本鎖DNA配列を切断する制限酵素により認識される配列を含むオリゴヌクレオチドプローブの、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法における使用。
- プローブが５’領域及び３’領域において相補配列を有し、標的ポリヌクレオチド配列へ結合する前は５’領域及び３’領域が互いに結合している、請求項２１に記載の使用。
- 該ドナー分子がフルオレセイン色素を含み、該アクセプター分子がローダミン色素又はCy5である、請求項２１又は２２に記載の使用。
- 該プローブ内において、該ドナー分子が該アクセプター分子から少なくとも１５ヌクレオチド離れている、請求項２１〜２３のいずれかに記載の使用。
- 該ドナー分子がプローブの３’末端領域でヌクレオチドへ結合し、該アクセプター分子がプローブの５’末端領域でヌクレオチドへ結合している、請求項２１〜２４のいずれかに記載の使用。
- 該ドナー分子がヌクレオチドへプローブの５’末端領域で結合し、該アクセプター分子がプローブの３’末端領域でヌクレオチドへ結合している、請求項２１〜２５のいずれかに記載の使用。
- 増幅プライマーの５’末端で結合している、請求項２１〜２６のいずれかに記載のプローブの使用。
- 請求項１〜２０のいずれかに記載の方法を行うためのキットであって、
標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズすることができ、かつ、蛍光ドナー分子、蛍光アクセプター分子及び一本鎖配列であって二本鎖形態にあるときに該配列を切断する制限酵素により認識される一本鎖配列を含み、該配列はドナー及びアクセプター分子の中間に位置している配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと、
該アクセプターと該ドナー分子の中間で該プローブを切断することができる制限酵素を含み、
(1)該オリゴヌクレオチドプローブが、該標的ポリヌクレオチドの３’末端領域で該標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズして、該ポリヌクレオチドの３’末端が増幅の間に延長して、該プローブの相補領域を形成することができ；又は
(2)該プローブは３’末端でブロックされて、増幅サイクルの間延長せず、かつ５’領域及び３’領域において相補配列を有し、標的ポリヌクレオチド配列へ結合する前は該プローブの５’領域及び３’領域が互いに結合しており；又は
(3)該キットが、さらに、ポリメラーゼ連鎖反応を行うために必要とされる１以上の試薬、及び生成するアンプリコンが制限酵素による切断に抵抗する修飾ヌクレオチドを含む、ことを特徴とするキット。 - 更に増幅反応に使用する１又はそれ以上の試薬を含む、請求項２８に記載のキット。
- 該試薬が、制限酵素に耐性を有するヌクレオチド鎖を生成することができる修飾ヌクレオチドを含んでいる、請求項２９に記載のキット。
- 該修飾ヌクレオチドがメチル化ヌクレオチドを含んでいる、請求項３０に記載のキット。
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