JP4548416B2 - 局在プラズモン共鳴センサ及び検査装置 - Google Patents

Description

本発明は、局在プラズモン共鳴センサに関し、特に、特異的なリガンドや抗原等を検出するのに適した局在プラズモン共鳴センサ及び検査装置に関する。

近年、生体分子の相互作用の有無または程度を検出するためのセンサとして、表面プラズモン共鳴センサや局在プラズモン共鳴センサ、全反射蛍光照明センサが用いられている。

図１は従来の全反射蛍光照明センサ１１を示す概略図である。この全反射蛍光照明センサ１１にあっては、ガラス等からなる透明基板１２の上面にＡｕ薄膜等の金属薄膜１３を形成し、金属薄膜１３の上に多数の受容体１４を固定している。また、透明基板１２の下面にはプリズム１６が密着している。

この全反射蛍光照明センサ１１は、受容体１４が分析試料液の流れる流路１７に直接接するように設置される。この分析試料液内のリガンド１５には、予め蛍光分子によって修飾が施されている。そして、透明基板１２と金属薄膜１３との界面における入射角が当該界面における全反射角よりも大きな角度となるようにして、光源１８からプリズム１６に向けて励起光が出射される。このとき、プリズム１６及び透明基板１２を透過した励起光は、金属薄膜１３と透明基板１２の界面で全反射する。そして、金属薄膜１３の裏面にはエバネッセント光が発生し、エバネッセント光の電界は金属薄膜１３や受容体１４を透過して広がる。さらに、エバネッセント光により励起された金属薄膜１３内の表面プラズモンにより、さらに大きな電界が発生する。このエバネッセント光や表面プラズモンによる電界は、受容体１４に結合したリガンド１５の蛍光分子を励起して発光させる。よって、受容体１４に対向配置された光検出器１９によって発光強度を計測することにより、受容体１４に結合した特異的なリガンド１５の有無、もしくは受容体１４に結合したリガンド１５の量を計測することができる。

しかし、エバネッセント光等による電界は、図１に示すように、透明基板１２の表面から２００〜３００ｎｍの距離まで染み出しているので、受容体１４と結合したリガンド１５ばかりでなく、受容体１４と結合していないリガンド１５の蛍光分子までが励起されてしまい、計測データに対してノイズとなる。特に、分析試料液中のリガンド１５の濃度が高いほど、このノイズは大きくなる。生体分子の大きさは数十ｎｍであるため、このノイズは全反射蛍光照明センサの測定精度をかなり低下させる原因となっており、検体１分子程度の検出精度を得ることは困難であった。

また、図２は従来の局在プラズモン共鳴センサ２１を示す概略図である（特許文献３）。この局在プラズモン共鳴センサ２１にあっては、ガラス等の透明基板２２の一方表面に直径１０〜２０ｎｍのＡｕ等の金属微粒子２３を多数固定してセンサユニット２４を構成している。金属微粒子２３が固定された面と反対側では、光源２５からセンサユニット２４に垂直に光ビームを照射しておき、分光光度計２６により金属微粒子２３を透過した光の吸収スペクトルを測定して吸光度を得ることができる。このような局在プラズモン共鳴センサ２１では、波長５２０ｎｍ近傍の光に対して強い吸収ピークが表われる。

この局在プラズモン共鳴センサ２１においては、吸光度の変化から金属微粒子近傍における屈折率の変化を検出することができる。また、図３に示すように、センサユニット２４の透明基板２２に固定された金属微粒子２３の表面に受容体２７を吸着させていると、受容体２７に特異的なリガンド２８が吸着されたとき、金属微粒子２３の周囲の屈折率が変化して金属微粒子２３を透過した光の吸光度が変化するので、特異的なリガンド２８の有無、もしくはその量を検出することができる。

この局在プラズモン共鳴センサでは、金属微粒子を透過した透過光の吸光率を測定するので、全反射蛍光照明センサのようにプリズムを必要とせず、小型化が可能である。また、金属微粒子を用いた場合には、金属薄膜（全反射蛍光照明センサ）に比べて電界が局在化するので、金属微粒子近傍の変化のみを検出することができ、微小領域における検体の測定が可能になると共に、金属微粒子から離れた箇所における検体の影響を小さくすることができる。

しかしながら、この方式によると、屈折率の変化はほんのわずかなため、吸光度の変化も非常に小さなものとなる。よって、このような局在プラズモン共鳴センサでも、１分子程度の検出精度を得ることは困難であった。

特開２０００−１３１２３７号公報 特許第３４５２８３７号 特開平６−２７０２３号公報

本発明は上記のような技術的課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、従来例に比べて検出精度を高めることができる新規な構成の局在プラズモン共鳴センサ及び検査装置を提供することにある。

本発明にかかる第１の局在プラズモン共鳴センサは、透明な基板の表面に複数の凸部を有する金属層が形成され、かつ、特異的な検体を吸着する分子認識機能物質が前記基板又は前記金属層に固定されたセンサユニットを備え、前記凸部を有する金属層は、前記基板の表面に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜の上に間隔をあけて固定された金属微粒子とからなり、前記センサユニットの前記金属層及び前記分子認識機能物質が設けられた面を発光分子で修飾された検体を含んだ分析試料液に接触させ、前記センサユニットの他方の面に前記基板の表面で全反射する入射角で励起光を照射させるようにしたことを特徴としている。

本発明にかかる第２の局在プラズモン共鳴センサは、透明な基板の表面に複数の凸部を有する金属層が形成され、かつ、特異的な検体を吸着する分子認識機能物質が前記基板又は前記金属層に固定されたセンサユニットを備え、前記凸部を有する金属層は、前記基板の表面に間隔をあけて固定された金属微粒子と、前記金属微粒子の上から前記基板表面に形成された金属薄膜とからなり、前記センサユニットの前記金属層及び前記分子認識機能物質が設けられた面を発光分子で修飾された検体を含んだ分析試料液に接触させ、前記センサユニットの他方の面に前記基板の表面で全反射する入射角で励起光を照射させるようにしたことを特徴としている。

本発明にかかる第３の局在プラズモン共鳴センサは、透明な基板の表面に複数の凸部を有する金属層が形成され、かつ、特異的な検体を吸着する分子認識機能物質が前記基板又は前記金属層に固定されたセンサユニットを備え、前記凸部は、スタンパにより前記基板表面に形成された金属薄膜に型押しすることによって形成されており、前記センサユニットの前記金属層及び前記分子認識機能物質が設けられた面を発光分子で修飾された検体を含んだ分析試料液に接触させ、前記センサユニットの他方の面に前記基板の表面で全反射する入射角で励起光を照射させるようにしたことを特徴としている。

第１、第２又は第３の局在プラズモン共鳴センサにおいて、検体とはリガンドや抗原などを指すが、生体分子に限らない。分子認識機能物質とは、特異的な検体を選択的に結合させる働きをするものであって、受容体、抗体、酵素などのタンパク質である。分子認識機能物質として生体高分子を用いればバイオセンサとして用いることができるが、局在プラズモン共鳴センサとしては、生体高分子に限らない。発光分子としては、光又は電磁界を照射されたときに蛍光や燐光等のルミネッセンス光を発生するものであればよく、例えばフルオレセイン、チオフラビン、エオシン、ローダミンＢ等がある。

本発明の第１、第２又は第３の局在プラズモン共鳴センサでは、検体は発光分子で修飾されているので、分析試料液に特異的な検体が含まれていて特異的な検体が分子認識機能物質に吸着されると、特異的な検体を修飾している発光分子が金属層の近傍に捕捉される。このとき金属層が形成されている面と反対側の面に基板の表面で全反射する入射角で励起光を照射すると、基板表面で全反射した励起光は基板表面から金属層側にしみ出してエバネッセント光となるので、エバネッセント光と金属層の凸部とが結合し、励起光と凸部との結合効率が向上する。そして、金属層の凸部で局在プラズモンが励起され、その周囲に強い電界が発生する。そのため、その近傍に発光分子が捕捉されていると発光分子がルミネッセンス光を出す。よって、このルミネッセンス光を観測することにより、分子認識機能物質に吸着されている特異的な検体の有無やその量を計測することができる。

また、この局在プラズモン共鳴センサにあっては、捕捉された発光分子の発光を観測するので、強いシグナルを得ることができ、特異的な検体の測定精度を高くすることができる。しかも、透明基板に凸部を有する金属層を形成しているので、励起光を照射したとき電界は金属層の凸部の周囲の小さな領域に局在しており、均一な厚みの金属薄膜を用いた場合のように２００〜３００ｎｍといった広い範囲（しみ出し距離）に電界が広がることがない。よって、分子認識機能物質に捕捉されていない検体で発光する発光分子が少なくなり、シグナルのノイズを小さくすることができる。この結果、本発明の第１、第２又は第３の局在プラズモン共鳴センサにあっては、検体を修飾する発光分子と凸部を有する金属層の組み合わせにより、高いＳ／Ｎ比を得ることができて高い測定精度を達成することが可能になる。特に、分子認識機能物質に捕捉されている検体１分子の検出も可能になる。

本発明において用いられている凸部を有する金属層は、基板表面に形成された金属薄膜の上に間隔をあけて金属微粒子を固定したものでもよい。あるいは、前記基板の表面に間隔をあけて固定された金属微粒子の上から前記基板表面に金属薄膜を形成したものでもよい。また、凸部を有する金属層は、スタンパにより基板表面に形成された金属薄膜に型押しすることによって凸部を形成したものであってもよい。

本発明にかかる第１又は第２の局在プラズモン共鳴センサのある実施態様では、前記凸部を有する金属層は、直径が１０〜３０ｎｍの金属微粒子が互いに平均で直径の２倍以上４倍以下の間隔をあけて固定されることによって形成されており、前記基板の表面で全反射する前記励起光により前記基板の表面に発生したエバネッセント光と、前記金属層とがプラズモン共鳴することにより前記金属層の周囲の電界を局所的に増強させ、前記電界によって、前記検体のうち前記分子認識機能物質に吸着した検体の発光分子から励起発光したルミネッセンス光を検出することにより、前記分子認識機能物質に吸着した検体の有無やその濃度を計測するようにしている。かかる実施態様によれば、効率よく局在プラズモン共鳴を発生させることができる。

また、前記センサユニットの前記金属層及び前記分子認識機能物質を設けられた面に対向する側には、レンズを介して前記ルミネッセンス光を検出する光検出器を配置してもよい。レンズ（例えば、対物レンズ、顕微鏡光学系など）を介して光検出器で発光分子のエバネッセント光を観測することにより、狭い領域の発光を観察することができ、検体１分子程度の分解能を得ることが可能になる。

本発明にかかる第１、第２又は第３の局在プラズモン共鳴センサの別な実施態様では、前記基板の裏面にプリズムを密着させて配置している。プリズムとしては、測定の態様に応じて、三角プリズム、半円形又は半球状のプリズム（ガラスブロック）を用いることができる。基板の裏面にプリズムを密着させて配置することにより、励起光の反射を少なくし、基板へ励起光を効率よく導くことができる。

本発明にかかる第１、第２又は第３の局在プラズモン共鳴センサのさらに別な実施態様では、前記発光分子の発光波長と前記励起光の波長とを異ならせている。励起光の波長と発光分子の発光波長とを異ならせておくことにより、励起光と発光分子のエバネッセント光とを容易に分離することができ、測定精度を向上させることができる。その場合、励起光の波長の光を遮断し発光分子の発光波長の光だけを透過させるカットフィルタを光検出器の前に配置してもよい。このようなカットフィルタを設けることにより、光検出器に励起光が入射するのを防止することができ、測定信号のノイズをさらに減らすことができる。

また、前記金属層の材料としては、ＡｕまたはＡｇを用いるのが望ましい。他の金属材料でも差し支えないが、ＡｕやＡｇを用いれば、可視光領域で効率よく局在プラズモン共鳴を起こさせることができると共に、金属層と分析試料液とが反応しにくく安定性がよい。

前記凸部の高さ及び幅は、いずれも１５０ｎｍ以下とすれば、効率よく局在プラズモン共鳴を発生させることができる。また、前記凸部の形状は、球、楕円球または球もしくは楕円球の一部とすることにより、効率よく局在プラズモン共鳴を発生させることができる。

また、本発明の第１、第２又は第３のさらに別な実施態様においては、前記基板又は前記金属層の一部領域に親水処理、疎水処理又は帯電処理を施しておき、当該処理を施されていない領域に前記分子認識機能物質を固定したことを特徴としている。プロテイン等の生体分子は親水性、疎水性、帯電性などの性質を有しているので、所定の領域に基板に親水処理、疎水処理、帯電処理などを施しておくことにより、所望の領域に分子認識機能物質として生体分子を配列させることができ、分子認識機能物質の整列化が容易になる。

また、分析試料液における前記発光分子のモル濃度が１００ｎＭ（＝１０^−７モル／リットル）以上で測定することができるので、生体的な検体濃度で検体の測定を行うことができる。

また、局在プラズモン共鳴センサに前記分析試料液を通過させるための流路を設け、前記分子認識機能物質が流路内に面するようにしておけば、分析試料液を分子認識機能物質の固定されている領域へ容易に導入することができる。

また、本発明の第１、第２又は第３のさらに別な実施態様においては、前記センサユニットが、分析試料液を導入することのできる複数の領域を有しており、それぞれの領域に互いに異なる分子認識機能物質が固定されている。かかる実施態様によれば、複数の異なる検査を同時に実施することが可能になる。

本発明の検査装置は、本発明の第１、第２又は第３の局在プラズモン共鳴センサと、前記センサの出力データに基づいて分析試料液を解析する手段とを備えている。かかる検査装置によれば、発光分子が出すルミネッセンス光を観測することにより、分子認識機能物質に吸着されている特異的な検体の有無やその量を高いＳ／Ｎ比で計測することができる。

本発明の計測方法は、本発明の第１、第２又は第３の局在プラズモン共鳴センサを用いた計測方法であって、前記測定対象の溶液と発光分子を混合して分析試料液を作成するステップと、前記試料液を前記センサユニットの前記金属層及び前記分子認識機能物質が設けられた面に接触させるステップと、前記センサユニットの前記金属層及び前記分子認識機能物質が設けられていない面に励起光を照射するステップと、前記励起光によって生じた電界によって発光させられた前記発光分子の発光強度を検出するステップと、前記発光強度から検体の有無やその濃度を算出するステップとを含むことを特徴としている。ここで、測定対象は、主として生体分子であり、生体分子のなかでも、遺伝子、タンパク質、糖鎖または細胞のうち少なくとも一つを含むものである。例えば人や動物の体液が前記測定対象の溶液となる。但し、測定対象は必ずしも生体分子に限るものではない。分子認識機能物質とは、特異的な検体を選択的に結合させる働きをするものであって、受容体、抗体、酵素などのタンパク質である。分子認識機能物質として生体高分子を用いればバイオセンサとして用いることができるが、局在プラズモン共鳴センサとしては生体高分子に限らない。発光分子としては、光又は電磁界を照射されたときに蛍光や燐光等のルミネッセンス光を発生するものであればよく、例えばフルオレセイン、チオフラビン、エオシン、ローダミンＢ等がある。

かかる計測方法によれば、上記局在プラズモン共鳴センサと同様にして、発光分子が出すルミネッセンス光を観測することにより、分子認識機能物質に吸着されている特異的な検体の有無やその量を高いＳ／Ｎ比で計測することができる。

なお、本発明の以上説明した構成要素は、可能な限り任意に組み合わせることができる。

図１は、従来の全反射蛍光照明センサを示す概略図である。 図２は、従来の局在プラズモン共鳴センサを示す概略図である。 図３は、図２の局在プラズモンセンサにおいて、透明基板の金属微粒子表面に固定さえれた受容体にリガンドが吸着されている様子を示す図である。 図４は、本発明の一実施形態による局在プラズモン共鳴センサの概略構成図である。 図５は、図４の一部を拡大した概略図である。 図６は、本発明の局在プラズモンセンサの変形例を示す概略構成図である。 図７は、透明基板の表面に金属薄膜を形成している場合において、強い電界の生成する範囲を示す図である。 図８（ａ）、図８（ｂ）及び図８（ｃ）は、図４の局在プラズモン共鳴センサにおいて、強い電界の生成する範囲を説明するための図である。 図９は、グースヘンシェン効果を説明する図である。 図１０は、エバネッセント光と金属微粒子との結合を説明する図である。 図１１は、透明基板の界面で光が全反射するときの電界の分布を表わした図である。 図１２は、表面に金属薄膜を形成された透明基板の界面で光が全反射するときの電界の分布を表わした図である。 図１３は、表面に金属微粒子を形成された透明基板の界面で光が全反射するときの電界の分布を表わした図である。 図１４は、透明基板の上に金属微粒子を設けた図４のような局在プラズモン共鳴センサにおいて、入射光の波長λと界面における反射率との関係を表した図である。 図１５は、励起光の照射体積と、発光分子のモル濃度と、１分子検出可能なリガンド濃度との関係を表した図である。 図１６は、照射体積の意味を説明する図である。 図１７（ａ）は、金属微粒子の別な形状を表した図である。図１７（ｂ）は、金属薄膜の上に金属微粒子を形成した凸部を示す図である。 図１８（ａ）は、透明基板上の金属微粒子を金属薄膜で被覆して凸部を形成した図である。図１８（ｂ）は、金属薄膜に凹部を形成した図である。 図１９（ａ）は、突起部を形成された透明基板の表面を金属薄膜で覆って凸部を形成した図である。図１９（ｂ）は、窪み部を形成された透明基板の表面を金属薄膜で覆って凹部を形成した図である。 図２０（ａ）〜図２０（ｄ）は、凹部をスタンパにより成形する工程を表した概略図である。 図２１は、本発明の局在プラズモン共鳴センサを用いた検査装置の構成を示すブロック図である。 図２２は、図２１に示した検査装置のセンサユニットを示す断面図である。 図２３は、図２２に示した検査装置内部の流路を示す概略斜視図である。

以下、本発明の実施形態を図面に従って詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

図４は本発明の一実施形態による局在プラズモン共鳴センサ３１の概略構成図であり、図５はその一部を拡大した概略図である。この局在プラズモン共鳴センサ３１は、主としてセンサユニット３４、光源３７及び光検出器４１からなる。センサユニット３４においては、ガラス基板等の透明な基板３２の表面に多数の金属微粒子３３が固定されていて、金属層が形成されている。この金属微粒子３３は直径数十ｎｍ（特に、直径１０〜３０ｎｍ）のＡｕ、Ａｇ等のナノレベルの金属粒子であって、ほとんど凝集することなく、互いに離れた状態で固定されている。金属微粒子３３の配置は、規則的である必要はなく、ランダムに分散していてよい。

金属微粒子３３は、互いの間隔（中間のスペースの大きさ）が金属微粒子３３の直径の２倍以上４倍以下であるものが望ましい。例えば、金属微粒子３３の密度は、１μｍ^２あたり約３７０個とすれば、被覆率に換算すると約０.１７となる。また、この透明基板３２及び金属微粒子３３の表面には、分子認識機能物質として所定の種類の受容体３５が固定されている。

受容体３５は透明基板３２の一部領域に固定してあってもよく、あるいは、区分的に固定してあってもよい。また、１種類の受容体３５を用いていてもよく、２種類以上の受容体３５を区分けして固定していてもよい。透明基板３２の一部に受容体３５を固定しようとする場合には、受容体３５を固定しようとする領域以外の領域に親水処理、疎水処理、帯電処理などの前処理を行を行っておいてもよい。そのための前処理剤としては、例えばシランカップリング剤を用いることができる。前処理を行う方法としては、インクジェット式プリンタによる薬剤塗布、フォトリソグラフィによる被膜形成、レーザー照射や電子ビーム照射等による帯電処理などの方法がある。生体高分子である受容体３５は帯電、親水性、疎水性などの性質があるので、受容体３５の特性に応じていずれかの前処理を行えば、受容体３５を固定しようとする領域以外の領域に受容体３５が固定されないようにすることができる。

また、透明基板３２の裏面には、マッチングオイル等を挟んでプリズム３６の上面が密着させられている。図示例では、三角プリズムの上面を透明基板３２の裏面に密着させているが、入射光の入射角度を変化させて測定を行う場合には、半円状又は半球状をしたプリズム（ガラスブロック）を透明基板３２の裏面に密着させていてもよい。

センサユニット３４の裏面側には、励起光（後述の発光分子を励起して発光させることのできる波長域の光）を出射させるための光源３７と、黒色板等の光吸収板３８とが配置されている。光源３７としては、半導体レーザー（ＬＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、ランプ等を利用できる。光源３７から出射される光の波長は、発光分子の発光波長と異なった波長領域のものが用いられる。あるいは、フィルタ４５を光源３７の前面に配置し、フィルタ４５により光源３７から出射された光のうち発光分子の発光波長域の光を除去してもよい。また、光源２５は、その出射光が透明基板３２の表面に全反射角よりも大きな入射角で入射するように配置されている。

また、金属微粒子３３及び受容体３５が設けられている透明基板３２の表面に対向させて、対物レンズや顕微鏡光学系などのレンズ３９、励起光の波長の光を遮断して発光分子の発光波長域の光を透過させるカットフィルタ４０、フォトダイオード（ＰＤ）やＣＣＤ等の光検出器４１をこの順序で配置している。

透明基板３２の表面側には、分析試料液４２を導入して分析試料液４２が受容体３５と接触できるようにしている。分析試料液４２を簡単に導入できるようにするためには、図６に示すように、透明基板３２の表面側に分析試料液４２の流れる流路４６を形成するのが望ましい。なお、図６では流路４６の上面を覆っているが、流路４６の上面は開放されていても差し支えない。分析試料液４２は、例えば人や動物などの血液等の体液であって、そこに含まれるリガンドは予め発光分子によって修飾されている。発光分子とは、光又は電磁界を照射されたときに蛍光や燐光等のルミネッセンス光を発生するものであって、例えばフルオレセイン、チオフラビン、エオシン、ローダミンＢ等がある。

しかして、この局在プラズモン共鳴センサ３１にあっては、リガンドを含んだ分析試料液４２が透明基板３２の表面側に導入されると、分析試料液４２が受容体３５に触れる。図５に示すように、透明基板３２の表面側に導入された分析試料液４２中に受容体３５と結合する特異的なリガンド４３が含まれていると、特異的なリガンド４３の一部は受容体３５に吸着される。また、特異的でないリガンド４４が分析試料液４２に含まれていても、このリガンド４４は受容体３５に吸着されることなく、分析試料液４２中に分散している。

図４に示すように、光源３７から出射された励起光は、プリズム３６の斜面に入射し、プリズム３６及び透明基板３２を透過して透明基板３２の表面で全反射し、再び透明基板３２及びプリズム３６を透過してプリズム３６の斜面から外部へ出射される。プリズム３６から出た励起光は、散乱してノイズとならないよう光吸収板３８によって吸収される。

このとき励起光が透明基板３２の表面で全反射することにより透明基板３２の表面にはエバネッセント光が発生しており、エバネッセント光と各金属微粒子３３とが局在プラズモン共鳴し、金属微粒子３３の周囲には強い局所的な電界が生成される。このような局在プラズモン共鳴によれば、金属微粒子３３の周囲に発生する電界は、金属微粒子３３のサイズ程度の領域に閉じ込められている。分析試料液４２に特異的なリガンド４３が含まれていて受容体３５に特異的なリガンド４３が吸着されていると、そのリガンド４３を修飾している発光分子が金属微粒子３３の局所的な電界領域内にあり、発光分子からルミネッセンス光が発生する。

従って、対物レンズ等のレンズ３９を通して発光分子から発光するルミネッセンス光を観察することにより、分析試料液４２に特異的なリガンド４３が含まれているか否かを判定することができる。また、発光分子の発光強度を測定することにより、あるいは、発光分子による輝点を数えることにより、受容体３５に吸着されている特異的なリガンド４３の量や濃度等を計測することができる。

図７及び図８は透明基板１２の表面に金属薄膜１３を形成している場合と本実施形態による局在プラズモン共鳴センサ３１との作用を比較して示す図である。図７は透明基板１２の表面に均一な厚みの金属薄膜１３を形成している場合（１番目の従来例）の電界の広がりを表しており、図８（ａ）、図８（ｂ）及び図８（ｃ）は透明基板３２の表面に金属微粒子３３が固定されている場合（本実施形態）の電界の分布を説明している。よく知られているように、金属薄膜１３の場合には、図７に示すようにエバネッセント光によって励起された表面プラズモンの電界は、指数関数的に減衰しながら、透明基板１２の表面から２００〜３００ｎｍ（しみ出し距離）くらいまで広がっている。そのため、受容体１４に吸着されていないリガンドにまで金属薄膜１３の電界が届き、図７でドットを施したリガンド１５のように受容体１４から比較的遠くの距離にあるリガンド１５を修飾する発光分子までが発光してノイズとなり、測定精度を低下させる。

これに対し、本実施形態のように金属微粒子３３を透明基板３２の表面に形成している場合には、原理的には、図８（ａ）に示すように金属微粒子３３の位置でのみ強い電界が発生する。しかし、この電界は図８（ｂ）に示すように平均化されるので、金属微粒子３３の位置における電界が弱くなる。特に、金属微粒子３３の場合には、図８（ｃ）に示すように電界は金属微粒子３３の近傍に閉じ込められる。金属微粒子に光を垂直に照射した際の局在プラズモン共鳴に関する研究によれば、この電界は金属微粒子のサイズ程度の領域に閉じ込められることが知られている。よって、図８（ｃ）においてドットを施したリガンド４３を修飾する発光分子のように、受容体３５に吸着された特異的なリガンド４３を修飾している発光分子は、この局所電界により発光させられる。しかし、受容体３５に吸着されていない特異的なリガンド４３や非特異的なリガンド４４は発光せず、ノイズが発生しにくいために受容体３５に吸着されている特異的なリガンド４３の有無又はその量を精度良く測定することができる。

また、従来の局在プラズモン共鳴（２番目の従来例参照）では、光を金属微粒子に垂直に照射して光（進行波）と金属微粒子とを直接に局在プラズモン共鳴させていたが、このような局在プラズモン共鳴の方法では、金属微粒子の断面積と等しい光束断面の光しか金属微粒子とカップリングできず、光と金属微粒子との結合効率が低い。そこで、本実施形態では、エバネッセント光と金属微粒子とをカップリングさせて局在プラズモン共鳴させることにより、光と金属微粒子との結合効率を向上させている点も本実施例の特徴である。

本実施形態では、透明基板３２に斜め方向から励起光を照射して透明基板３２の表面で励起光を全反射させている。このように光を界面で全反射させる場合、図９に示すように、界面における入射点と反射光の出射点との間には飛びが発生する。この現象は、グースヘンシェン効果として知られており（例えば、ジャクソン電磁気学第３版（上巻）、吉岡書店、Ｐ.４２６〜４２９）、この飛びはグースヘンシェンシフトと言われる。このとき、図９に破線で示すように、界面で全反射する光は界面よりも外に染み出して界面近傍に閉じ込められており、これがエバネッセント光である。

本実施形態のように、金属微粒子３３を固定された透明基板３２に対して斜め方向から光を照射して全反射させた場合には、図１０に示すように、透明基板３２から金属微粒子３３側に向かう励起光が金属微粒子３３を励起すると共に、金属微粒子３３側から透明基板３２へ戻る励起光も金属微粒子３３を励起することになり、金属微粒子３３と励起光との結合効率は垂直照射の場合よりも向上する。

これは次のように異なる説明の仕方をすることもできる。図９に示されているように、エバネッセント光は界面の近傍で界面と平行に移動している。したがって、金属微粒子の断面よりも大きな光束断面の光が界面に斜め入射して全反射しているとすると、この大きな光束断面の光は、エバネッセント光として界面近傍に閉じ込められて界面と平行に移動している。このエバネッセント光が金属微粒子に当たってカップリングすれば、実効的には金属微粒子の断面よりも大きな光束断面の光が金属微粒子にカップリングしていることになり、光と金属微粒子との結合効率が大きくなる。

よって、本実施形態によれば、金属微粒子３３と励起光との結合効率を高めることで、金属微粒子３３の近傍により強い電界を発生させることが可能になり、発光分子をより強く発光させることができ、シグナルのＳ／Ｎ比をより向上させることができる。

ただし、グースヘンシェンシフトが大きくなると、光と金属微粒子との結合は大きくなるが、エバネッセント光のしみ出し距離が大きくなるので、励起光の波長や透明基板３２の屈折率など望ましい条件が存在するが、これらは実験的に決めることができる。

図１１〜図１２は、透明基板に垂直な断面において、透明基板の界面で光が全反射するときの様子をシミュレーションした結果を表しており、濃淡の度合いが電界の強さを表している。図１１は屈折率１．７３２のガラス基板（透明基板）の表面に水（屈折率１.３３）を接触させただけで、金属薄膜も金属微粒子も設けられていないときのシミュレーションを表している。この場合には、反射波の電界強度が比較的高く、エバネッセント光は６００ｎｍ程度しみ出している。図１２は屈折率１.７３２ガラス基板の表面に厚さ５０ｎｍのＡｕ薄膜（金属薄膜）を形成し、その上に水を接触させたときのシミュレーションを表している。この場合には、金属薄膜を設けていない場合とほとんど変わりがなく、エバネッセント光は２００〜３００ｎｍ程度しみ出している。図１３は屈折率１.７３２のガラス基板（透明基板）の表面に直径６００ｎｍのＡｇ微粒子を１８０ｎｍの間隔をあけて配置し、表面に水を接触させたときのシミュレーションを表している。この場合には、光がＡｇ微粒子に吸収されて反射光の電界強度が弱くなっており、電界もＡｇ微粒子の近傍に閉じ込められている。また、Ａｇ微粒子の近傍の電界は、金属微粒子も金属薄膜もない場合と比較して１０倍以上に大きくなっている。よって、このシミュレーションによれば、金属微粒子にエバネッセント光を作用させることにより、金属薄膜よりも狭い領域に電界を閉じ込めると共に大きな電界強度を得ることができることが分かる。

また、図１４は、図１３のシミュレーションと同じ条件において、ガラス基板の表面に金属微粒子の直径の３倍の間隔をあけて２５％の被覆率でＡｇ微粒子を形成したものについて、入射光の波長λと界面における反射率との関係を求めたシミュレーション結果を示している。また、図１４では金属微粒子の上から基板上に厚さ２０〜３０ｎｍ、屈折率１.４２の誘電体膜を形成した場合と、誘電体膜を形成していない場合とを示しており、誘電体が付着して屈折率が高くなると反射率が高くなることが分かる。また、このシミュレーションによれば、８０〜８５％程度の光吸収率（反射率１５〜２０％程度）となっており（回折等の影響を含む。）、光と金属微粒子の結合が高くなっていることが分かる。

図１５は励起光の照射体積と、発光分子のモル濃度と、１分子検出可能なリガンド濃度との関係を表した図であって、横軸が励起光の照射体積[ｆＬ＝１０^−１５リットル]を示し、縦軸が発光分子のモル濃度[ｎＭ＝ナノモル／リットル]を示している。ここで、照射体積とは、図１６に示すように、底面が所定の単位面積で高さが電界の及ぶ距離（しみ出し距離）である立体の体積であって、この照射体積の立体内にある発光分子は励起発光させられる。図１５において、直線Ｌ１よりも上方の領域は体液等に含まれる生理的なリガンド濃度の領域を示し、直線Ｌ２よりも左下方の領域は１分子のリガンドを検出可能な領域を表している。したがって、体液等の生理的なリガンド濃度の分析試料液を対象として、１分子のリガンドを検出可能とするためには、図１５における直線Ｌ１よりも上方にあり、かつ、直線Ｌ２の左下方に位置する三角形の領域で測定を行う必要がある。

ここで、共焦点の顕微鏡では励起光の照射体積は、約０.２ｆＬであり、また、金属薄膜の上に受容体を設けたものでは、照射体積は約０.０８ｆＬである。よって、これらの照射体積を示す垂直線上には、生理的なリガンド濃度で１分子を検出可能な領域は存在しない。これに対し、透明基板３２の上に金属微粒子３３と受容体３５を固定した本発明実施形態の局在プラズモン共鳴センサ３１では、励起光の照射体積は約０.００８ｆＬとなるので、図１５の領域ＡＲの当たりでは、生理的なリガンド濃度の分析試料液を対象として１分子のリガンドを検出することができる。

上記実施形態では、金属層の凸部として球形の金属微粒子３３を用いたが、金属微粒子３３としては楕円形のものであってもよい。あるいは、図１７（ａ）に示すような球又は楕円の一部分を金属微粒子３３としてもよい。

また、上記実施形態では、透明基板３２の上に直接金属微粒子３３を形成していたが、図１７（ｂ）に示すように、透明基板３２の上に金属薄膜４７を形成し、金属薄膜４７の上に金属微粒子３３を設けてもよい。あるいは、図１８（ａ）に示すように、透明基板３２の上に金属微粒子３３を固定し、金属微粒子３３の上から透明基板３２の表面を金属薄膜４７で被覆してもよい。

また、図１８（ｂ）に示す変形例では、透明基板３２の表面に形成した金属薄膜４７に部分的に窪みを形成して金属層の凹部４８としている。あるいは、図１９（ａ）に示すように、透明基板３２の表面に突起部４９を設けておき、その表面を金属薄膜４７で覆うことによって金属層の凸部５０を形成してもよく、図１９（ｂ）に示すように、透明基板３２の表面に窪み部５１を設けておき、その表面を金属薄膜４７で覆うことによって金属層の凹部４８を形成してもよい。もっとも、凸部間や凹部間がつながっていると、容易に予測されるように、孤立した金属微粒子の場合に比べて効率は低下する。

上記のような種々の凸部や凹部、突起部４９、窪み部５１などを成形するためには、スタンパを用いた型押しによって行うことができる。例えば、図２０（ａ）〜図２０（ｄ）は、図１８（ｂ）のような凹部４８をスタンパにより成形する場合を説明している。まず、透明基板３２の表面に金属薄膜４７を堆積させた（図２０（ａ））後、金属薄膜４７の上からスタンパ５２で押さえる（図２０（ｂ））。スタンパ５２の下面には、成形用突部５３が設けられているので、スタンパ５２で金属薄膜４７を押すと、金属薄膜４７の表面には成形用突部５３によって凹部４８が転写される（図２０（ｃ））。ついで、スタンパ５２を離型すると、金属薄膜４７の表面にはナノスケールの凹部４８が成形される。

次に、本発明の局在プラズモン共鳴センサを用いた検査装置５８の構成を説明する。図２１は、当該検査装置５８の構成を示すブロック図、図２２はそのセンサユニット３４の断面図、図２３はセンサユニット３４の内部の検体が流れる流路を示す概略斜視図である。局在プラズモン共鳴センサ３１の全体的構成については、既に説明したとおりである。センサユニット３４においては、ガラス基板等の基板３２の表面に多数の金属微粒子３３が固定されて金属層が形成されている。また、透明基板３２及び金属微粒子３３の表面には、分子認識機能物質として所定の種類の受容体が固定されている。基板３２の上には、スペーサ５９を介してカバー６０が重ね合わされており、スペーサ５９及びカバー６０内には図２３に示すような流路４６が形成されている。カバー６０の両端部には、それぞれ注入路４６ａと排出路４６ｃが形成されており、カバー６０及び基板３２間においてスペーサ５９内には複数本の分岐流路４６ｂが形成されている。すなわち、流路４６は、１本の注入路４６ａが複数本に分岐して互いに分離した分岐通路４６ｂとなっており、再び各分岐通路４６ｂの他端で合流して１本の排出路４６ｃとなっている。各分岐流路４６ｂ内においては、所定の受容体３５が固定されている。

分析試料液を注入路４６ａに滴下し、ポンプや電気浸透流などの手法により分析試料液を流路４６に流すと、分析試料液は各分岐流路４６ｂに分かれて流れ、再び排出路４６ｃに集まって外部へ排出される。このとき、分析試料液が各分岐流路４６ｂを流れる際に、特異的なリガンドが受容体３５と結合し、それ以外のものは分岐通路４６ｂを通過して排出路４６ｃに導かれる。

流路制御部５４は、センサユニット３４の流路に供給する分析試料液の供給速度を調整し、均一な速度で分析試料液が流れるよう制御する。データ処理部５５は、光検出器４１で取得した測定データを、判定処理部５６において取り扱うことのできるデータ形式に変換して判定処理部５６へ送り出す。判定処理部５６は、ハードディスク等の記憶装置５７から格納されている判定用データを読み出し、データ処理部５５から受け取った処理データと判定用データを比較し、所定のアルゴリズムに従って分析試料液中の特異的なリガンドの有無や特異的なリガンドの濃度等を分析する。データ処理部５５の出力データや判定処理部５６の判定結果は、出力端末などへ出力される。

このような検査装置５８を用いてセンサユニット３４からのエバネッセント光を測定すれば、分析試料液中のリガンドの有無、量、分子間相互作用、結合力、平衡定数を評価することができる。例えば、プローブＤＮＡが高密度に固定された透明基板上に、蛍光色素等で標識されたサンプルＤＮＡを流すと、互いに相補的なＤＮＡは結合する。よって、透明基板上の各位置での信号を検出すれば、各プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとの相互作用の有無、または程度を評価することができる。

しかも、流路４６は図１３に示すように複数の分岐流路４６ｂに分岐しているので、各分岐流路４６ｂ毎に異なる種類の受容体を固定しておけば、異なる分岐流路４６ｂ毎に異なる特異的なリガンドを検査することができる。よって、１回の分析試料液の滴下で複数の異なる検査を同時に実施することが可能となる。

また、検査対象にはＤＮＡだけでなく、タンパク質、糖鎖、細胞なども含まれる。この方法を用いれば、遺伝子配列の決定、特定遺伝子、タンパク質、糖鎖などの生体分子の有無の確認、特定生体分子の発現レベルの測定、生体間相互作用解析などが可能となる。さらに、本発明を用いることで、高濃度すなわち生体濃度下での生体分子の挙動を検出することができるため、生体の本来の活動機能を解析することが可能となる。

本発明による局在プラズモン共鳴センサや検査装置の他の用途としては、(i)ＳＮＰ（単一性塩基多型）の解析、(ii)実験用マウスに投与した物質の代謝、吸収、排泄の経路または状態の確認、（iii）細胞内のイオン濃度測定、(iv)タンパク質の同定または機能解析などが挙げられる。

また、本発明による分析方法を用いれば、唾液や血液から抗原や抗体を検出して個人の健康状態を判別したり、各個人の遺伝子情報を読み取ったり、遺伝子レベルで医療診断を行なったりすることができる。たとえば、唾液や血液を本システムの流路の挿入部に滴下することによって、癌細胞やウイルスなどの抗原、ウイルスなどに対する抗体を検出することにより個人の健康状態を判別して健康診断を行なうことができる。よって、本発明による分析方法を用いた結果、薬の副作用の有無を調べたり、誤診の恐れをできるだけ少なくし、高度な医療診断を実現可能とすることができる。

他のアプリケーションとして、各個人内に存在する特有の遺伝子や生体分子などの情報を読み取ることによって高精度なセキュリティシステムを構築することができ、さらには食品内や、環境中すなわち空気中や水中に含まれる微粒子の検出などにも利用することが可能となる。

３１ 局在プラズモン共鳴センサ
３２ 透明基板
３３ 金属微粒子
３４ センサユニット
３５ 受容体
３６ プリズム
３７ 光源
３８ 光吸収板
３９ レンズ
４０ カットフィルタ
４１ 光検出器
４２ 分析試料液
４３ 特異的なリガンド
４５ フィルタ
４６ 流路
４７ 金属薄膜
４８ 凹部
５０ 凸部
５２ スタンパ
５８ 検査装置

Claims (18)

1. 透明な基板の表面に複数の凸部を有する金属層が形成され、かつ、特異的な検体を吸着する分子認識機能物質が前記基板又は前記金属層に固定されたセンサユニットを備え、
   前記凸部を有する金属層は、前記基板の表面に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜の上に間隔をあけて固定された金属微粒子とからなり、
   前記センサユニットの前記金属層及び前記分子認識機能物質が設けられた面を発光分子で修飾された検体を含んだ分析試料液に接触させ、前記センサユニットの他方の面に前記基板の表面で全反射する入射角で励起光を照射させるようにした局在プラズモン共鳴センサ。
2. 透明な基板の表面に複数の凸部を有する金属層が形成され、かつ、特異的な検体を吸着する分子認識機能物質が前記基板又は前記金属層に固定されたセンサユニットを備え、
   前記凸部を有する金属層は、前記基板の表面に間隔をあけて固定された金属微粒子と、前記金属微粒子の上から前記基板表面に形成された金属薄膜とからなり、
   前記センサユニットの前記金属層及び前記分子認識機能物質が設けられた面を発光分子で修飾された検体を含んだ分析試料液に接触させ、前記センサユニットの他方の面に前記基板の表面で全反射する入射角で励起光を照射させるようにした局在プラズモン共鳴センサ。
3. 透明な基板の表面に複数の凸部を有する金属層が形成され、かつ、特異的な検体を吸着する分子認識機能物質が前記基板又は前記金属層に固定されたセンサユニットを備え、
   前記凸部は、スタンパにより前記基板表面に形成された金属薄膜に型押しすることによって形成されており、
   前記センサユニットの前記金属層及び前記分子認識機能物質が設けられた面を発光分子で修飾された検体を含んだ分析試料液に接触させ、前記センサユニットの他方の面に前記基板の表面で全反射する入射角で励起光を照射させるようにした局在プラズモン共鳴センサ。
4. 前記凸部を有する金属層は、直径が１０〜３０ｎｍの金属微粒子が互いに平均で直径の２倍以上４倍以下の間隔をあけて固定されることによって形成されており、
   前記基板の表面で全反射する前記励起光により前記基板の表面に発生したエバネッセント光と、前記金属層とがプラズモン共鳴することにより前記金属層の周囲の電界を局所的に増強させ、
   前記電界によって、前記検体のうち前記分子認識機能物質に吸着した検体の発光分子から励起発光したルミネッセンス光を検出することにより、前記分子認識機能物質に吸着した検体の有無やその濃度を計測するようにした、請求項１又は２に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
5. 前記センサユニットの前記金属層及び前記分子認識機能物質を設けられた面に対向する側に、レンズを介して前記ルミネッセンス光を検出する光検出器を配置したことを特徴とする、請求項４に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
6. 前記基板の裏面にプリズムを密着させて配置したことを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
7. 前記発光分子の発光波長と前記励起光の波長とが異なっていることを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
8. 励起光の波長の光を遮断するためのカットフィルタを前記光検出器の前に配置したことを特徴とする、請求項７に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
9. 前記凸部の高さ及び幅が、いずれも１５０ｎｍ以下であることを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
10. 前記金属微粒子の形状は、球、楕円球または球もしくは楕円球の一部であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
11. 前記金属層は、ＡｕまたはＡｇからなることを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
12. 前記基板又は前記金属層の一部領域に親水処理、疎水処理又は帯電処理を施しておき、当該処理を施されていない領域に前記分子認識機能物質を固定したことを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
13. 前記発光分子のモル濃度が１００ｎＭ以上であることを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
14. 前記分析試料液を通過させるための流路を備え、前記分子認識機能物質が流路内に面していることを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
15. 前記センサユニットは、分析試料液を導入することのできる複数の領域を有しており、それぞれの領域に互いに異なる分子認識機能物質が固定されていることを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の局在プラズモン共鳴センサ。
16. 請求項１、２又は３に記載の局在プラズモン共鳴センサと、前記センサの出力データに基づいて分析試料液を解析する手段とを備えた検査装置。
17. 請求項１、２又は３に記載された局在プラズモン共鳴センサを用いた計測方法であって、
    測定対象の検体を含む溶液と発光分子を混合して前記発光分子に修飾された検体を含む分析試料液を作成するステップと、
    前記試料液を前記センサユニットの前記金属層および前記分子認識機能物質が設けられた面に接触させるステップと、
    前記センサユニットの前記金属層および前記分子認識機能物質が設けられていない面に前記基板の表面で全反射する入射角で励起光を照射して前記基板の表面にエバネッセント光を発生させるステップと、
    前記エバネッセント光と前記金属層とがプラズモン共鳴することにより前記金属層の周囲の電界を局所的に増強させるステップと、
    前記電界によって、前記試料液中の前記発光分子に修飾された検体のうち前記分子認識機能物質に吸着した検体の前記発光分子から励起発光したルミネッセンス光の発光強度を検出するステップと、
    前記発光強度から検体の有無やその濃度を算出するステップと、
    を含む計測方法。
18. 前記測定対象の溶液は人や動物の体液であり、前記検体は、遺伝子、タンパク質、糖鎖または細胞のうち少なくとも一つを含む生体分子であることを特徴とする、請求項１７に記載の計測方法。

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