JP4567490B2 - スーパーオキシドアニオンラジカルの測定方法 - Google Patents

Description

本発明はスーパーオキシドアニオンラジカルの測定方法に関し、更に詳細には、従来提供されている方法に比べ、感度および選択性の向上したスーパーオキシドアニオンラジカルの測定方法に関する。

スーパーオキシドアニオンラジカル(Ｏ₂ ^-・）などの活性酸素種は生体の維持に不可欠なものであるが、一方では、各種の疾患、癌、老化などの要因になることが知られており、医療等の分野において、その正確な量の計測法が種々検討されている。

従来は、ケミルネッセンス法等の分光法が使用されていたが、近年は、シトクロムｃ（ｃｙｔ．ｃ）固定化電極によりスーパーオキシドアニオンラジカルのアンペロメトリーでの電気化学的検出が可能であることが示され、イン・ビボ(in vivo)測定への応用例が報告されている（非特許文献１）。しかし、シトクロムｃは酵素であるため、数日間で失活してしまい、長期の使用は不可能であるという欠点があった。また、エチレンオキサイドガス（ＥＯＧ）滅菌ができないため、実質的にイン・ビボでの使用は困難であった。

一方、本発明者は、先に全合成型の長期間安定なポルフィリン電解重合膜系センサー（ＰＥＰセンサー）を作製し、これをスーパーオキシドアニオンラジカル作用極として用いて三電極式セルを組み、スーパーオキシドアニオンラジカルが計測できることを報告した（特許文献１）。

上記方法により、安定してスーパーオキシドアニオンラジカル量を測定し、医療分野における利用が可能となったが、試料の種類や、測定条件によっては、未だ感度が不十分な場合があり、より検出感度を向上させることが求められていた。
ＷＯ ０３／０５４５３６ Ａ１ Calum J. McNeil J.Electroanal. Chem. 347, 267,(1993)

従って、医療等におけるスーパーオキシドアニオンラジカル測定方法の利用範囲を広げるためには、より検出感度を向上させたスーパーオキシドアニオンラジカルの測定方法の提供が求められていた。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、従来のスーパーオキシドアニオンラジカルの測定方法について検討を行ったところ、従来法で使用するアンペロメトリーでは、検出電流がｐＡやｎＡレベルの極微弱電流となるとノイズの影響を受ける結果、検出感度に限界があることを知った。

そこで、更に検討を行っていたところ、ポテンシオメトリーを利用することにより、ノイズの影響を防ぐことができ、従来の方法に比べ、高感度でスーパーオキシドアニオンラジカルを測定できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、ポルフィリン電解重合膜修飾センサー、対極および比較電極を含む三電極式セルを利用するスーパーオキシドアニオンラジカルの測定方法であって、検体中のスーパーオキシドアニオンラジカルに対するポルフィリン電解重合膜修飾センサーの反応時間を測定することを特徴とするスーパーオキシドアニオンラジカルの測定方法である。

本発明方法は、従来法に比べ、高感度でスーパーオキシドアニオンラジカルを測定できるので、医療分野等、正確なスーパーオキシドアニオンラジカルの測定が求められる分野において、病気の診断、研究などに利用可能である。

本発明方法を実施するために使用される装置は、図１に示すようなシステムで構成された、ポルフィリン電解重合膜修飾センサー、対極および比較電極を含む三電極式セルとポテンショメーターである。

図１中、１は三電極式セル、２はポテンシオスタット、３はコンピュータ、４は撹拌子、５は被測定溶液、６はマイクロシリンジ、７はポルフィリン電解重合膜修飾センサー、８は対極、９は比較電極を示す。

この三極式セル１のうち、ポルフィリン電解重合膜修飾センサー７は、導電性部材の表面に金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成したものであり、例えば、上記特許文献１（WO 03/054536 A1）に活性酸素種用電極として公知のものである。本発明においては、この電極を開示のものをポルフィリン電解重合膜修飾センサー７として使用することができる。

上記ポルフィリン電解膜修飾センサー７のうち、本発明の目的に特に好ましいものとしては、金属ポルフィリン錯体として、ブロモ鉄５,１０,１５,２０−テトラキス（３−チオフリル）ポルフィリンまたはブロモ鉄５,１０,１５,２０−テトラキス（２−チオフリル）ポルフィリンを使用したものである。

一方、三極式セル１において使用される対極８としては、不溶解性の電極が使用され、その例としては、白金電極等の貴金属電極、チタン電極、カーボン類電極、ステンレス電極等が挙げられる。

また、比較電極９としては、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）、銀−塩化銀電極等が用いられる。

上記の三極式セルを用いるＯ₂ ^-・の測定は、検体中のスーパーオキシドアニオンラジカルに対するポルフィリン電解重合膜修飾センサーの反応の長さを、ポテンショメーター２を用いて測定することにより行われる。具体的には、ポルフィリン電解重合膜修飾ディスク電極を作用極、Ｐｔ線を対極、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を比較電極とする３電極式セルを組み、ポテンショガルバノスタットを用い、閉回路電圧を測定することにより、スーパーオキシドアニオンラジカル発生時の反応の長さを測定することにより行われる。この際、コンピュータ３により、ポテンショスタットが制御され、得られたデータが保存、解析される。

上記の反応の長さの測定は、例えば、図２に示すように、ポルフィリン電解重合膜修飾センサー７がスーパーオキシドアニオンラジカルに接することにより、電位が下がるが、ポテンショメーター２により、この電位の低下の開始から電位が上昇に転じるまでの時間（以下、「反応時間」という）を求めることにより行う。

ついで、所定の試料の反応時間を、あらかじめ所定濃度のスーパーオキシドアニオンラジカルと反応時間の関係から作成した検量線等と比較し、これから発生した試料中のスーパーオキシドアニオンラジカルを求めることができる。

なお、本発明方法においては、前処理として、ポルフィリン電解重合膜修飾センサー７にあらかじめ電圧を印加することで、測定時の再現性が著しく向上する。この前処理で印加する電圧は、１００ないし５００ｍＶ程度、好ましくは２５０ｍＶ程度であり、前処理時間は、１ないし１５分程度、好ましくは、５分間程度である。

以上説明した本発明方法により、μＭないしｎＭオーダーのスーパーオキシドアニオンラジカルを、再現性良く測定することが可能となり、血液、血清、血漿、尿等の体液試料や、工業用水、飲料水等の環境試料中のスーパーオキシドアニオンラジカルを定量測定することができる。

また、本発明方法では、従来のスーパーオキシドアニオンラジカル測定法では阻害成分となる過酸化水素の影響は全く受けず、また、尿素の影響もほとんど受けない。

次に参考例および実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに何ら制約されるものではない。

参 考 例 １
ポルフィリン電解重合膜センサーの作製：
（１）アドラーら(Adler et. al.,)の方法(Inog. Nucl. Chem. 32, 2443(1970))を参考に、鉄テトラキス（３-チオフリル）ポルフィリン（ＦｅＢｒ（Ｔ３ＴｈＰ））を合成し、ＵＶ−ｖｉｓ、^１Ｈ−ＮＭＲおよびＦＡＢ−Ｍａｓｓを測定してその構造を同定した。

ＦｅＢｒ（Ｔ３ＴｈＰ）にＮ−メチルイミダゾール（Ｉｍ）を配位させ、電解重合することで外径１.０ｍｍのグラッシーカーボン電極上にＦｅＢｒ（Ｉｍ）_２（Ｔ３ＴｈＰ）重合薄膜を被覆し、ポルフィリン電解重合膜センサー（ＰＥＰセンサー）を作製した。重合条件は、次のとおりである。

電解質： ＦｅＢｒ（Ｔ３ＴｈＰ） ４７ｍＭ
Ｉｍ ２５０ｍＭ
支持電解質： ＴＢＡＰ ０.０１Ｍ
溶 媒： ジクロロメタン
セ ル： アルゴン雰囲気
電解条件： 走引速度 ５０ｍＶ／ｓｅｃ
電 位 ０〜２.０Ｖ
（ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）
重合時間 ３０分

（２）上記で得られたＰＥＰセンサー（修飾電極）の電気化学的特性を、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）およびディファレンシャルパルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）によって評価した。Ｏ₂ ^-・検出は、キサンチンを含む測定溶液にキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）を添加することでＯ₂ ^-・を発生させ、そのときのポテンシオメトリーでの電位変化を調べることにより行った。

ＤＶＰの結果、鉄ポルフィリンのII価／III価に基づくピークが見られ（図３）、電極にＦｅＢｒ（Ｉｍ）_２（Ｔ３ＴｈＰ）が修飾されていることを確認した。この結果等から、電解重合により、グラッシ−カーボン作用極表面に緻密なＦｅＢｒ（Ｉｍ）_２（Ｔ３ＴｈＰ）薄膜が形成されていると判断された。

実 施 例 １
ポテンショメトリー：
参考例１で得られたＰＥＰセンサーに、まず、前処理として２５０ｍＶの電圧を５分間印加した。次いで、前処理を施したＰＥＰセンサー、０.３ｍｍφ白金線（対極）およびＡｇ／ＡｇＣｌ電極（比較電極）を用いて、三極式セルを構成し、ポテンショスタットに取り付けた。

この三極式セルを、スターラーで撹拌（３００ｒｐｍ）されているキサンチン１００μＭを含むリン酸塩緩衝測定溶液に浸漬した。ポテンシオメトリーで開回路電圧の変化を測定した。基準となるベースラインをしばらく測定した後に、上記測定溶液中にＸＯＤ ５８ｍＵ／ｍｌを加えてＯ₂ ^-・を発生させた。

Ｏ₂ ^-・の発生ともに、電位が直ちに卑にシフトし始めた。この電位の卑へのシフトは、発生したＯ₂ ^-・は電極上の鉄ポルフィリンに電子を供給しようとするが、開回路測定であるため電流は流れず、セルに溶存しているＯ₂／Ｏ₂-・の濃度比が変化してポテンシオメトリーでの開回路電圧として検出されるためと考えられた。

さらに、上記測定溶液に、Ｏ₂ ^-・の消去酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）３６８Ｕを加えると直ちに電位は貴にシフトし始め、電位は元のベースラインに戻ることが明らかになった（図４）。

実 施 例 ２
検量線の作成：
実施例１で使用したＯ₂ ^-・測定装置を用い、検量線を作成した。まず、キサンチンを、０、１０、５０、１００、２００および３００μＭを含むリン酸塩緩衝測定溶液に、Ｏ₂ ^-・の発生源であるＸＯＤを５８ｍＵ／ｍｌ加え、電位が卑となった時から電位回復までの時間（反応時間）を測定した。

リン酸塩緩衝測定溶液中のキサンチンの量（すなわち、ＸＯＤを加えた後に、Ｏ₂ ^-・の量となる）と反応時間をプロットしたところ、直線性のある検量線が得られた（図５）。この結果から、ポテンシオメトリーを用いた本発明方法により、Ｏ₂ ^-・を定量的にできることが明らかとなった。

本発明方法により、従来法の検出限界の１／１０〜１／３程度の低濃度のＯ₂ ^-・まで測定することが可能となった。

従って、本発明方法は、治療や疾病研究の医療分野や、環境科学の分野において有利に利用できるものである。

本発明において使用される装置の構成を示す図面である。 電位の低下の開始から電位が上昇に転じるまでの時間（反応時間）の求め方を示す図面である。 ＰＥＰセンサーのディファレンシャルパルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）の結果を示す図面である。 Ｏ₂ ^-・の発生と消失による電位の変化を示す図面である。 ＸＯＤの量と反応時間から求めた検量線を示す図面である。

符号の説明

１ … … 三電極式セル
２ … … ポテンシオスタット
３ … … コンピュータ
４ … … 撹拌子
５ … … 被測定溶液
６ … … マイクロシリンジ
７ … … ポルフィリン電解重合膜修飾センサー
８ … … 対極
９ … … 比較電極

Claims (2)

1. ポルフィリン電解重合膜修飾センサー、対極および比較電極を含む三電極式セルを利用するスーパーオキシドアニオンラジカルの測定方法であって、検体中のスーパーオキシドアニオンラジカルに対するポルフィリン電解重合膜修飾センサーの反応時間を測定することを特徴とするスーパーオキシドアニオンラジカルの測定方法。
2. 検体中のスーパーオキシドアニオンラジカルに対するポルフィリン電解重合膜修飾センサーの反応時間の測定に先立ち、１００ないし５００ｍＶの電圧を１ないし１５分間印加する請求項１記載のスーパーオキシドアニオンラジカルの測定方法。

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