JP4620786B2

JP4620786B2 - 蛍光検出方法、蛍光検出装置及びプログラム

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Publication number: JP4620786B2
Application number: JP2009033992A
Authority: JP
Inventors: 弘能林
Original assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Co Ltd
Priority date: 2009-02-17
Filing date: 2009-02-17
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2029-02-17
Also published as: US20110309266A1; EP2400290A1; WO2010095386A1; US8405049B2; KR20110118723A; JP2010190652A; CN102317762A

Description

本発明は、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法、蛍光検出装置に関する。また、本発明は、所定の周波数で変調したレーザ光を測定対象物に照射したときに測定対象物の蛍光の受光信号として得られる複数のパルス状の蛍光信号の信号処理をコンピュータに実行させるためのプログラムに関する。

特に、医療、生物分野で用いられるフローサイトメータ等のような細胞やＤＮＡやＲＮＡ等の測定対象物の識別を蛍光色素の発する蛍光を用いて行なって測定対象物の分析等を行なう分析装置に適用される蛍光検出装置に関する。

医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することにより測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍光検出装置が組み込まれている。

具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質を含む混濁液を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒１０ｍ以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してラミナーシースフローを形成する。このフロー中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで測定対象物を特定する。

このフローサイトメータでは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって特定し、特定した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。

例えば、ＤＮＡ等の生体物質をフローサイトメータで分析する場合、この生体物質に予め蛍光試薬により蛍光色素が付着される。そして、この生体物質は、後述するマイクロビーズに付着された蛍光色素と異なる蛍光色素でラベル化され、表面にカルボキシル基等の特異な構造体の設けられた、直径５〜２０μｍのマイクロビーズを含む液体に混ぜられる。上記カルボキシル基等の構造体は、ある既知の構造の生体物質に作用して結合（カップリング）する。したがって、マイクロビーズからの蛍光と生体物質の蛍光とを同時に検出した場合、生体物質は、マイクロビーズの構造体と結合していることがわかる。これにより、生体物質の特性を分析することができる。多種多様なカップリング用の構造体を備える多種のマイクロビーズを用意して生体物質の特性を短時間に分析するには、極めて多種類の蛍光色素が必要となる。

特許文献１には、マイクロビーズ等を測定対象物とし、この測定対象物に所定の周波数で強度変調したレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光の蛍光緩和時間を求めることが記載されている。この蛍光緩和時間は、蛍光色素の種類によって異なるため、この蛍光緩和時間を用いて、蛍光の種類、さらには測定対象物の種類を識別することができる。

特開２００６−２２６６９８号公報

上記特許文献１では、蛍光緩和時間に基づいて短時間に効率よく蛍光を識別することはできるが、蛍光緩和時間の測定精度は必ずしも高いものではなかった。例えば、受光する蛍光が弱く、受光信号が複数のパルス状の蛍光信号で離散的に構成されているとき、蛍光緩和時間を求めるのに必要な位相差を求めることができない。

本発明は、上記問題を解決するために、蛍光が弱く、受光信号が複数のパルス状の蛍光信号で離散的に構成されている場合に、精度の高い蛍光緩和時間を求めることのできる蛍光検出方法、蛍光検出装置及びそのプログラムを提供することを目的とする。

本発明の蛍光検出方法は、移動する測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行うフローサイトメータにおける蛍光検出方法であって、
所定の周波数で変調したレーザ光を測定対象物に照射する工程と、
前記測定対象物が発する蛍光を受光して、パルス状の蛍光信号を複数出力する工程と、
前記レーザ光の一部を受光して得られる信号を参照信号とするとき、前記参照信号と前記蛍光信号とに対して、前記周波数に対応する周期単位の基準タイミングを設定する工程と、
前記基準タイミングに基づいて、前記パルス状の蛍光信号の各々が出力されるまでの発生時間を取得する工程と、
前記パルス状の蛍光信号の発生頻度と前記発生時間との関係を示す累積蛍光信号を生成する工程と、
前記累積蛍光信号に対して前記参照信号を時間軸に沿ってずらしながら、前記累積蛍光信号と前記参照信号との相関値を求め、前記相関値が最大となる時間に基づいて、前記参照信号と前記累積蛍光信号との位相差を求める工程と、
前記位相差を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める工程と、を有することを特徴とする。

本発明の蛍光検出装置は、移動する測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行うフローサイトメータを用いた蛍光検出装置であって、
所定の周波数で変調したレーザ光を測定対象物に照射するレーザ光源部と、
前記測定対象物が発する蛍光を受光して、パルス状の蛍光信号を複数出力する受光部と、
前記レーザ光を測定対象物に照射することにより前記受光部で出力された蛍光信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める処理部と、を有し、
前記処理部は、
前記レーザ光の一部を受光して得られる信号を参照信号とするとき、前記参照信号と前記蛍光信号とに対して、前記周波数に対応する周期単位の基準タイミングを設定する基準タイミング設定部と、
前記基準タイミングに基づいて、前記パルス状の蛍光信号の各々が出力されるまでの発生時間を取得するパルス発生時間取得部と、
前記パルス状の蛍光信号の発生頻度と前記パルス発生時間との関係を示す累積蛍光信号を生成する累積蛍光信号生成部と、
前記累積蛍光信号に対して前記参照信号を時間軸に沿ってずらしながら、前記累積蛍光信号と前記参照信号との相関値を求め、前記相関値が最大となる時間に基づいて、前記参照信号と前記累積蛍光信号との位相差を求める位相差取得部と、
前記位相差取得部で求めた位相差を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める蛍光緩和時間取得部と、を有することを特徴とする。

また、本発明のプログラムは、フローサイトメータにおいて所定の周波数で変調したレーザ光を移動する測定対象物に照射したときに測定対象物の蛍光の受光信号として得られる複数のパルス状の蛍光信号の信号処理をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、
前記レーザ光の一部を受光して得られる信号を参照信号とするとき、前記参照信号と前記蛍光信号とに対して、前記周波数に対応する周期単位の基準タイミングを設定する手順と、
前記基準タイミングに基づいて、前記パルス状の蛍光信号の各々が出力されるまでの発生時間を取得する手順と、
前記パルス状の蛍光信号の発生頻度と前記発生時間との関係を示す累積蛍光信号を生成する手順と、
前記累積蛍光信号に対して前記参照信号を時間軸に沿ってずらしながら、前記累積蛍光信号と前記参照信号との相関値を求め、前記相関値が最大となる時間に基づいて、前記参照信号と前記累積蛍光信号との位相差を求める手順と、
前記位相差を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める手順と、をコンピュータに実行させることを特徴とする。

本発明によれば、精度の高い蛍光緩和時間を求めることができる。

本発明の蛍光検出装置の一実施例であるフローサイトメータの概略構成図である。図１に示す蛍光検出装置に用いられる制御・処理部の一例を示す概略構成図である。図１に示す蛍光検出装置に用いられる分析装置の一例を示す概略構成図である。（ａ）及び（ｂ）は、図１に示す分析装置のメモリに記憶される信号の一例を示す図である。（ａ）は、図１に示す蛍光検出装置で得られる参照信号の一例を示す図である。（ｂ）は、図３に示す分析装置の累積蛍光信号生成ユニットで取得される信号の一例を示す図である。（ｃ）は、分析装置の相関値算出ユニットで取得される信号の一例を示す図である。本発明の蛍光検出方法の一実施例を示すフローチャートである。図１に示す蛍光検出装置に用いられる分析装置の一例を示す概略構成図である。本発明の蛍光検出方法の一実施例を示すフローチャートである。

以下、本発明の蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータを基に詳細に説明する。

＜第１の実施形態＞
（フローサイトメータの全体構成）
図１は、本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。

フローサイトメータ１０は、信号処理装置２０と、分析装置５０と、を備える。信号処理装置２０は、測定対象とするマイクロビーズや細胞等の試料１２にレーザ光が照射されることで、試料１２中に設けられた蛍光色素が発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理を行う。分析装置５０は、信号処理装置２０で得られた処理結果から試料１２中の測定対象物の分析を行なう。

信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２５、２６と、制御・処理部２８と、管路３０と、を備える。制御・処理部２８は、レーザ光源部２２からのレーザ光を強度変調させる光源制御部４０（図２参照）と、試料１２からの蛍光信号をＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換器４６（図２参照）とを含む。管路３０は、高速流を形成するシース液に試料１２を含ませて流し、ラミナーシースフローを形成する。このフローは、例えば１００μｍの流路径に１〜１０ｍ／秒の流速を有する。また、試料１２としてマイクロビーズを用いる場合、マイクロビーズの球径は数μｍ〜３０μｍである。管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。

レーザ光源部２２は、所定の周波数で強度変調したレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料１２の測定点を形成する。

（レーザ光源部）
レーザ光源部２２は、強度が一定のＣＷ（連続波）レーザ光を出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を変調してレーザ光を出射する。レーザ光源部２２から出射したレーザ光は、不図示のレンズ系により管路３０中の測定点に集束させる。

これらのレーザ光を出射する光源として、例えば半導体レーザを用いることができる。レーザ光の出力としては、例えば５〜１００ｍＷ程度とすることができる。レーザ光の波長としては、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光帯域のものを用いることができる。

レーザ光源部２２は、制御・処理部２８に接続されている。制御・処理部２８は、所定の周波数で変調された変調信号を用いて、レーザ光を強度変調するための変調信号をレーザ光源部２２に供給する。

レーザ光によって励起される蛍光色素は測定しようとする生体物質やマイクロビーズ等の試料１２に付着されており、試料１２が測定対象物としてレーザ光の集束位置である測定点を通過する数μ〜数１０μ秒の間に、測定点でレーザ光の照射を受けて蛍光を発する。

（受光部）
レーザ光源部２２と管路３０との間には、ビームスプリッター２３が設けられている。レーザ光源部２２から出射したレーザ光の一部はビームスプリッター２３を透過し、測定点を通過する試料１２に照射される。また、レーザ光源部２２から出射したレーザ光の一部は反射し、受光部２５に照射される。

受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されている。ビームスプリッター２３を透過したレーザ光が、測定点を通過する試料１２によって前方散乱することにより、試料１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備えている。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８において試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。

受光部２５は、ビームスプリッター２３で反射されたレーザ光の一部が入射するように配置されている。受光部２５は、ビームスプリッター２３で反射されたレーザ光を受光し、受光した信号を出力する光電変換器を備えている。この受光部２５から出力される信号は、レーザ光の変調に対応する信号であり、制御・処理部２８に供給される。制御・処理部２８において、この供給された信号は、蛍光信号との位相差を求めるための参照信号として用いられる。

受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されている。ビームスプリッター２３を透過したレーザ光が測定点を通過する試料１２を照射する。受光部２６は、試料１２が発する蛍光を受光する光電変換器を備えている。

光電変換器は、光電面で受光した光を電気信号（受光信号）に変換する。この受光信号は、制御・処理部２８に供給される。例えば、受光部２６が受光する蛍光が非常に弱く、がフォトン１つずつに相当するようなパルス状の信号を取得するような場合、出力される受光信号は、非常に小さいパルス状の蛍光信号を複数有する。

（制御・処理部）
図２は、制御・処理部２８の一例を示す概略構成図である。制御・処理部２８は、光源制御部４０と、Ａ／Ｄ変換器４６と、を有して構成される。

光源制御部４０は、発振器４２とアンプ４４を備えている。光源制御部４０は、レーザ光の強度を変調させる変調信号を生成し、レーザ光源部２２に供給する。

発振器４２は、所定の周波数の正弦波信号を出力する。正弦波信号の周波数は、例えば、１〜５０ＭＨｚの範囲で設定される。発振器４２から出力された所定の周波数の正弦波信号は、アンプ４４で増幅され、レーザ光源部２２に供給される。

Ａ／Ｄ変換器４６は、受光部２６から出力される受光信号及び受光部２５から供給された参照信号をＡ／Ｄ変換する。Ａ／Ｄ変換は、受光部２４から供給されるトリガ信号に基づいて開始される。Ａ／Ｄ変換器４６は、数ＧＨｚのサンプリングをするものを用いる。これは、後述するように、弱い蛍光の受光信号において、パルス状の離散した蛍光信号を得るためである。Ａ／Ｄ変換された受光信号は、分析装置５０に供給される。

（分析装置）
図３は、分析装置５０の一例を示す概略構成図である。分析装置５０は、コンピュータ上で所定のプログラムを起動させることにより構成される装置であり、ＣＰＵ５２、メモリ５４、入出力ポート７０の他に、ソフトウェアを起動することによって形成される基準タイミング設定ユニット５６、パルス発生時間取得ユニット５８、累積蛍光信号生成ユニット６０、相関値算出ユニット６２、最大相関時間取得ユニット６４、位相差算出ユニット６６、蛍光緩和時間算出ユニット６８を有している。また、分析装置５０には、ディスプレイ８０が接続されている。

ＣＰＵ５２は、コンピュータに設けられた演算プロセッサであり、基準タイミング設定ユニット５６、パルス発生時間取得ユニット５８、累積蛍光信号生成ユニット６０、相関値算出ユニット６２、最大相関時間取得ユニット６４、位相差算出ユニット６６、蛍光緩和時間算出ユニット６８の各種計算を実質的に実行する。

メモリ５４は、コンピュータ上で実行することにより、基準タイミング設定ユニット５６、パルス発生時間取得ユニット５８、累積蛍光信号生成ユニット６０、相関値算出ユニット６２、最大相関時間取得ユニット６４、位相差算出ユニット６６、蛍光緩和時間算出ユニット６８を形成するプログラムを格納したハードディスクやＲＯＭと、これらのユニットにより算出された処理結果や入出力ポート７０から供給された信号を記憶するＲＡＭと、を備えている。メモリ５４には、Ａ／Ｄ変換器４６から供給された受光信号と参照信号が連続的に記憶される。

入出力ポート７０は、Ａ／Ｄ変換器４６から供給される参照信号や受光信号を受け入れるとともに、各ユニットで作成された処理結果の情報をディスプレイ８０に出力するために用いられる。ディスプレイ８０は、各ユニットで求められた、パルス発生時間、累積蛍光信号、相関値、最大相関時間、位相差、蛍光緩和時間などの処理結果の値を表示する。

図４は、分析装置のメモリ５４に記憶された信号の一例を示す図である。図４（ａ）は、受光部２５からＡ／Ｄ変換器４６に供給され、メモリ５４に記憶された参照信号の一例を示す図である。図４（ｂ）は、受光部２６からＡ／Ｄ変換器４６に供給され、メモリ５４に記憶された受光信号の一例を示す図である。受光部２６が受光する蛍光がフォトン１つ受けるたびにパルス状の蛍光信号が得られるような強度の弱い光である場合、図４（ｂ）のように、個々の蛍光信号はパルス状の電気信号として計測される。

基準タイミング設定ユニット５６は、メモリ５４に記憶された受光信号及び参照信号に対して、一定の時間間隔離間した基準タイミング（ｔ_ｉ：ｉは整数）を設定する。この時間間隔は、レーザ光を変調する周波数に対応する周期とする。例えば、レーザ光を変調する周波数が１０ＭＨｚである場合、１０ＭＨｚに対応する周期である１００ｎ秒とする。図４は、レーザ光を変調する周波数に対応する周期（１周期）毎に、基準タイミングを設定した例であるが、２周期、３周期などの単位毎に基準タイミングを設定してもよい。

パルス発生時間取得ユニット５８は、基準タイミングｔ_ｉに基づいて、パルス状の蛍光信号の各々が出力されるまでの時間であるパルス発生時間を取得する。図４（ｂ）の例では、基準タイミングｔ_０からｔ_１までの間に３つのパルス状の蛍光信号が計測され、基準タイミングｔ_０からこの３つのパルス状の蛍光信号の各々が発生するまでの時間（発生時間）を取得する。基準タイミングｔ_１からｔ_２までの間では１つのパルス状の蛍光信号が計測され、基準タイミングｔ_１からこの蛍光信号が発生するまでの時間（発生時間）を取得する。以下、同様にして基準タイミングｔ_ｉからパルス状の蛍光信号の各々が出力されるまでの時間（発生時間）を取得する。

パルス状の蛍光信号が発生するまでの時間（発生時間）は、パルス状の電気信号が予め定めた閾値を超える時間とその閾値を下回る時間の中心の時間とする。閾値を設定するのは、ノイズ成分を誤ってパルス状蛍光信号として取得するのを避けるためである。

累積蛍光信号生成ユニット６０は、パルス発生時間取得ユニット５８が求めたパルス発生時間と、そのパルス発生時間にパルス状の蛍光信号が出力される頻度との関係を示す累積蛍光信号を求める。図５（ｂ）は、分析装置５０の累積蛍光信号生成ユニット６０で取得される累積蛍光信号の一例を示す図である。累積蛍光信号生成ユニット６０は、パルス発生時間取得ユニット５８が求めたパルス発生時間を複数の時間帯域に分け、各時間帯域毎に発生するパルスの発生頻度を計数する。

さらに、基準タイミングの時刻を時刻０とし、時間帯域の中心値を時間とし、この時間におけるパルス状の蛍光信号の発生頻度を信号値として表した累積蛍光信号を生成する。累積蛍光信号は、例えば、図５（ｂ）に表されるヒストグラム状の信号である。もちろん、時間帯域を細かく設定することで、段差の少ない累積蛍光信号を生成することができる。しかし、この場合、累積する蛍光信号の母数が少ないため、ノイズが発生しやすくなる。したがって、連続性を有する滑らかな累積蛍光信号が生成されるように、予め時間帯域の幅の設定を探索して定めておくことが好ましい。

相関値算出ユニット６２は、累積蛍光信号生成ユニット６０が求めた累積蛍光信号と、参照信号との相関値を求める。相関値の算出に用いる参照信号は、基準タイミングを用いて区分けされた１周期の信号であり、記憶されている参照信号を平均化したものを用いてもよいし、１周期の参照信号を１つ選択し、代表として用いてもよい。図５（ａ）は、１周期の参照信号の一例を示す図である。相関値算出ユニット６２は、参照信号を時間方向にずらしながら、参照信号と累積蛍光信号との相関値を取得する。図５（ｃ）は、分析装置の相関値算出ユニット６２で取得される相関値の信号の一例を示す図である。横軸は参照信号を時間方向にずらした時間を、縦軸は相関値を示す。
最大相関時間取得ユニット６４は、相関値算出ユニット６２が求めた相関値が最大となる時間Δｔ（最大相関時間）を求める。

位相差算出ユニット６６は、最大相関時間取得ユニット６４が求めた最大相関時間Δｔを用いて、参照信号と累積蛍光信号との位相差を求める。位相差θは、レーザ光の変調信号の周波数をｆとすると、θ＝２πｆΔｔより求まる。

蛍光緩和時間算出ユニット６８は、位相差算出ユニット６６が求めた位相差θを用いて、測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間τを求める。蛍光緩和時間τは、τ＝ｔａｎθ／（２πｆ）より求まる。

図６は、本実施形態の蛍光検出方法を示すフローチャートである。本実施形態の蛍光検出方法では、まず、所定の周波数で変調したレーザ光を測定対象物に照射する（Ｓ１０１）。次に、測定対象物が発する蛍光を受光して、複数のパルス状の蛍光信号を含む受光信号を出力する（Ｓ１０２）。次に、周波数に対応する周期単位の基準タイミングを設定する（Ｓ１０３）。次に、基準タイミングに基づいて、パルス状の蛍光信号の各々が出力されるまでの発生時間を取得する（Ｓ１０４）。次に、パルス状の蛍光信号の発生頻度と発生時間との関係を示す累積蛍光信号を生成する（Ｓ１０５）。次に、累積蛍光信号と参照信号との相関値を求める（Ｓ１０６）。求めた相関値が最大となる最大相関時間を取得する（Ｓ１０７）。次に、レーザ光の変調に対応する信号を参照信号とし、参照信号と累積蛍光信号との位相差を求める（Ｓ１０８）。この位相差を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める（Ｓ１０９）。

また、本実施形態のプログラムは、所定の周波数で変調したレーザ光を測定対象物に照射したときに測定対象物の蛍光の受光信号として得られる複数のパルス状の蛍光信号の信号処理をコンピュータに実行させるためのプログラムである。このプログラムは、周波数に対応する周期単位の基準タイミングを設定する手順と、基準タイミングに基づいて、パルス状の蛍光信号の各々が出力されるまでの発生時間を取得する手順と、パルス状の蛍光信号の発生頻度と発生時間との関係を示す累積蛍光信号を生成する手順と、レーザ光の変調に対応する信号を参照信号とし、参照信号と累積蛍光信号との位相差を求める手順と、位相差を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める手順と、をコンピュータに実行させる。このプログラムは、分析装置５０のメモリ５４に記憶されている。

本実施形態によれば、微弱な蛍光であり、受光信号が複数のパルス状の蛍光信号で構成されているとき、累積蛍光信号を用いることにより、高い精度で蛍光緩和時間を測定することが可能となる。

＜第２の実施形態＞
第１の実施形態では、レーザ光源部２２から出射したレーザ光の一部をビームスプリッター２３で反射し、受光部２５で受光した信号を参照信号とした。本実施形態では、ビームスプリッター２３と受光部２５を設けず、光源制御部４０から出力される変調信号をレーザ光源部２２とＡ／Ｄ変換器４６の両方に供給し、光源制御部４０からＡ／Ｄ変換器４６に供給された変調信号を参照信号として用いる点が第１の実施形態と異なる。この場合、光源制御部４０で変調信号を分割するため、パワースプリッタを用いる。他の構成については、第１の実施形態と同様である。

本実施形態によれば、より簡易な構成で、蛍光が弱いときでも、高い精度で蛍光緩和時間を測定することが可能となる。

＜第３の実施形態＞
第１の実施形態では、Ａ／Ｄ変換器４６から入出力ポート７０に供給される参照信号や蛍光信号をメモリ５４に記憶する。本実施形態では、Ａ／Ｄ変換器４６から入出力ポート７０に供給される参照信号や蛍光信号をメモリ５４に記憶せず、直接、その後の信号処理を行う点が第１の実施形態と異なる。

光源制御部４０が出力する正弦波信号の周波数ｆは予め定まっている。そのため、基準タイミング設定ユニット５６は、周波数ｆに対応する周期単位の基準タイミングで、入出力ポート７０に供給される参照信号や蛍光信号に対して、基準タイミングを設定する。

パルス発生時間取得ユニット５８は、基準タイミングに基づいて、パルス状の蛍光信号の各々が発生するまでの時間（発生時間）を取得する。発生時間の情報はメモリ５４に記憶される。
その後、第１の実施形態と同様に、発生時間の情報を用いて累積蛍光信号を求め、以後、第１の実施形態と同様の処理を行う。

本実施形態によれば、より少ないメモリ容量で、蛍光が弱いときでも、高い精度で蛍光緩和時間を測定することが可能となる。

＜第４の実施形態＞
第１の実施形態では、累積蛍光信号生成ユニット６０が求めた累積蛍光信号を用いて、相関値算出ユニット６２が、累積蛍光信号と参照信号との相関値を求める。本実施形態では、累積蛍光信号と参照信号との相関値を求めることなく、参照信号と累積蛍光信号との位相差を求める点が第１の実施形態と異なる。図７は、本実施形態の分析装置５０の一例を示す概略構成図である。第１の実施形態における相関値算出ユニット６２と最大相関時間取得ユニット６４とが存在しない以外は、第１の実施形態と同様である。

累積蛍光信号生成ユニット６０は、パルス発生時間取得ユニット５８が求めたパルス発生時間を複数の時間帯域に区分し、各時間帯域毎に発生するパルスの頻度を計数し、累積蛍光信号を求める。さらに、本実施形態の累積蛍光信号生成ユニット６０は、レーザ光を変調する変調信号と同じ形の信号（正弦波信号）でこの累積蛍光信号をフィッティングすることにより、変調信号に対する累積蛍光信号の遅延時間を求める。フィッティングには、最小二乗法などの方法を用いる。図５（ｂ）の点線は、累積蛍光信号をフィッティングした信号を示すものである。

位相差算出ユニット６６は、累積蛍光信号生成ユニット６０が求めた累積蛍光信号を用いて、変調信号に対する累積蛍光信号の遅延時間Δｔを求め、この遅延時間Δｔから位相差を求める。

図８は、本実施形態の蛍光検出方法を示すフローチャートである。本実施形態の蛍光検出方法では、まず、所定の周波数で変調したレーザ光を測定対象物に照射する（Ｓ２０１）。次に、測定対象物が発する蛍光を受光して、複数のパルス状の蛍光信号を含む受光信号を出力する（Ｓ２０２）。次に、周波数に対応する周期単位の基準タイミングを設定する（Ｓ２０３）。次に、基準タイミングに基づいて、パルス状の蛍光信号の各々が出力されるまでの発生時間を取得する（Ｓ２０４）。次に、パルス状の蛍光信号の発生頻度と発生時間との関係を示す累積蛍光信号を生成する（Ｓ２０５）。次に、レーザ光の変調に対応する信号を参照信号とし、参照信号と累積蛍光信号との位相差を求める（Ｓ２０６）。この位相差を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める（Ｓ２０７）。

１０フローサイトメータ
１２試料
２０信号処理装置
２２レーザ光源部
２３ビームスプリッター
２４，２５，２６受光部
２８制御・処理部
３０管路
３２回収容器
４０光源制御部
４２発振器
４４アンプ
４６Ａ／Ｄ変換器
５０分析装置
５２ＣＰＵ
５４メモリ
５６基準タイミング設定ユニット
５８パルス発生時間取得ユニット
６０累積蛍光信号生成ユニット
６２相関値算出ユニット
６４最大相関時間取得ユニット
６６位相差算出ユニット
６８蛍光緩和時間算出ユニット
７０入出力ポート
８０ディスプレイ

Claims

移動する測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行うフローサイトメータにおける蛍光検出方法であって、
所定の周波数で変調したレーザ光を測定対象物に照射する工程と、
前記測定対象物が発する蛍光を受光して、パルス状の蛍光信号を複数出力する工程と、
前記レーザ光の一部を受光して得られる信号を参照信号とするとき、前記参照信号と前記蛍光信号とに対して、前記周波数に対応する周期単位の基準タイミングを設定する工程と、
前記基準タイミングに基づいて、前記パルス状の蛍光信号の各々が出力されるまでの発生時間を取得する工程と、
前記パルス状の蛍光信号の発生頻度と前記発生時間との関係を示す累積蛍光信号を生成する工程と、
前記累積蛍光信号に対して前記参照信号を時間軸に沿ってずらしながら、前記累積蛍光信号と前記参照信号との相関値を求め、前記相関値が最大となる時間に基づいて、前記参照信号と前記累積蛍光信号との位相差を求める工程と、
前記位相差を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める工程と、
を有することを特徴とする蛍光検出方法。
前記レーザ光の変調に対応する信号は、前記レーザ光を変調する変調信号である、請求項１に記載の蛍光検出方法。
移動する測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行うフローサイトメータを用いた蛍光検出装置であって、
所定の周波数で変調したレーザ光を測定対象物に照射するレーザ光源部と、
前記測定対象物が発する蛍光を受光して、パルス状の蛍光信号を複数出力する受光部と、
前記レーザ光を測定対象物に照射することにより前記受光部で出力された蛍光信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める処理部と、を有し、
前記処理部は、
前記レーザ光の一部を受光して得られる信号を参照信号とするとき、前記参照信号と前記蛍光信号とに対して、前記周波数に対応する周期単位の基準タイミングを設定する基準タイミング設定部と、
前記基準タイミングに基づいて、前記パルス状の蛍光信号の各々が出力されるまでの発生時間を取得するパルス発生時間取得部と、
前記パルス状の蛍光信号の発生頻度と前記パルス発生時間との関係を示す累積蛍光信号を生成する累積蛍光信号生成部と、
前記累積蛍光信号に対して前記参照信号を時間軸に沿ってずらしながら、前記累積蛍光信号と前記参照信号との相関値を求め、前記相関値が最大となる時間に基づいて、前記参照信号と前記累積蛍光信号との位相差を求める位相差取得部と、
前記位相差取得部で求めた位相差を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める蛍光緩和時間取得部と、
を有することを特徴とする蛍光検出装置。
フローサイトメータにおいて所定の周波数で変調したレーザ光を移動する測定対象物に照射したときに測定対象物の蛍光の受光信号として得られる複数のパルス状の蛍光信号の信号処理をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、
前記レーザ光の一部を受光して得られる信号を参照信号とするとき、前記参照信号と前記蛍光信号とに対して、前記周波数に対応する周期単位の基準タイミングを設定する手順と、
前記基準タイミングに基づいて、前記パルス状の蛍光信号の各々が出力されるまでの発生時間を取得する手順と、
前記パルス状の蛍光信号の発生頻度と前記発生時間との関係を示す累積蛍光信号を生成する手順と、
前記累積蛍光信号に対して前記参照信号を時間軸に沿ってずらしながら、前記累積蛍光信号と前記参照信号との相関値を求め、前記相関値が最大となる時間に基づいて、前記参照信号と前記累積蛍光信号との位相差を求める手順と、
前記位相差を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を求める手順と、
をコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。