JP4718042B2

JP4718042B2 - Method for determining transplantability of cultured cartilage tissue, quality control method, and method for producing cultured cartilage tissue having transplantability

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Publication number: JP4718042B2
Application number: JP2001155279A
Authority: JP
Inventors: 雅一加藤; 剛之山本; 里佳福島; 豊一久留島
Original assignee: 株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング
Priority date: 2001-05-24
Filing date: 2001-05-24
Publication date: 2011-07-06
Anticipated expiration: 2021-05-24
Also published as: JP2002345456A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は培養軟骨組織の移植適性を判定するための移植適性判定方法、培養軟骨組織の品質管理方法、並びに移植適性を有する培養軟骨組織の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体外（インビトロ）での細胞培養によってヒト組織を再構築し、再構築した培養組織を再び生体へ適用することにより治療を行う再生医療や組織工学が注目を集めている。
【０００３】
細胞培養により再構築された培養組織を生体に適用する際には、培養組織が移植用組織として適切であるか否かを検査する必要がある。移植適性は培養組織の細胞数や基質量を基に判断することができる。
【０００４】
移植適性を判定する１つの方法として、培養組織の基質量を基に移植適性の可否を判断することができる。この方法では、培養時に細胞から産生される基質成分を染色剤で染め、その染色状態を観察する染色法を利用する。例えば、軟骨組織の場合、軟骨細胞の産生基質である酸性ムコ多糖類をアルシアンブルーで染色し、その染色の有無や範囲から、移植用の培養軟骨組織として適切な状態であるか否かを判断することができる。
【０００５】
また、移植適性を判定する他の方法として、培養組織の細胞数に基づいて移植適性の可否を判断することができる。例えば生細胞数を基に移植適性を判定する場合には、トリパンブルーで染色した後、生細胞の数を計測して、移植用の培養組織の適性を判断することができる。この際、生細胞は染色剤を排除するので、染色されなかった細胞をカウントすることにより生細胞数を得ることができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらのような染色法による検査では、生細胞数を顕微鏡下で計測したり、染色領域の広さから基質量を判断したりしなければならないため、経験や熟練が必要とされる。さらに、細胞数の計測には作業者の手間が掛かる。また、基質量の判断に関しては、染色時間等の染色条件によっては染色状態が異なるので、データの比較が困難である。
【０００７】
また、培養細胞は同一の培養期間であっても、採取者（ドナー）の年齢によって増殖能が異なったり、播種密度によって細胞増殖の状態が異なったりするので、培養期間のみによる品質管理では、品質の安定した培養組織を供給することが困難な場合がある。このような場合には、所定の培養時間経過ごとに作業者が顕微鏡観察等を行って個々の培養組織の培養状態を把握し、各々の培養状態に対応させて培養を調整することで品質の安定性を得ているが、培養状態の把握には経験や熟練が必要とされ、作業者への負担が大きかった。
【０００８】
本発明は上記従来技術の問題点を鑑み、培養組織の移植適性を客観的に且つ効率よく判定することが可能であり、また客観的な基準により効率よく、安定した品質の培養組織を供給することが可能な、培養組織の移植適性判定方法、品質管理方法及び製造方法を提供することを技術課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、培養軟骨組織を溶解して得られた組織溶解液のｐＨ値を測定して、予め設定された基準ｐＨ値と比較することにより移植適性を判定することを特徴とする培養軟骨組織の移植適性判定方法である。
【００１２】
また本発明は、培養軟骨組織を溶解して得られた組織溶解液のｐＨ値を測定して、予め設定された基準ｐＨ値と比較することにより培養状態を把握することを特徴とする、培養軟骨組織の品質管理方法である。
【００１３】
本発明の他の、培養軟骨組織の品質管理方法は、培養軟骨組織の培養期間における経時的な基準ｐＨ値の変化に基づいた経時変化曲線を予め作成し、前記培養軟骨組織のｐＨ値を培養開始後少なくとも１回測定して、その測定時期と測定結果を前記経時変化曲線と比較することにより培養状態を把握することを特徴とする。
【００１４】
また本発明は、軟骨細胞を含む培養軟骨組織を培養する培養工程と、培養開始から所定時間後に前記培養軟骨組織を溶解して得られた組織溶解液のｐＨ値を測定する工程と、その測定結果に基づいて細胞数及び／又は基質量を予測し、その予測結果に基づいて培養軟骨組織の培養期間及び培養条件の少なくとも一方を調整する工程を含む、培養軟骨組織の製造方法である。
【００１５】
本発明の他の、移植適性を有する培養組織の製造方法は、上記培養組織の製造方法において、前記測定結果に基づいて前記培養軟骨組織の培養期間及び培養条件の少なくとも一方を調整することを特徴としている。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の移植適性判定方法及び培養組織の品質管理方法は、それぞれ、培養組織のｐＨに基づいて移植適性を判定し、又は品質を管理するものであり、また本発明の移植適性を有する培養組織の製造方法は、培養組織のｐＨを所定時に測定することを含むものである。
【００１７】
移植適性を有する培養組織は、充分量の細胞やその細胞が産生する充分量の基質を含んでいる。培養組織中の細胞は基質を産生する能力を有するので、細胞数が増加すると、産生基質量が増加し、この基質量にともなってｐＨ値が変化する。例えば、培養軟骨組織の場合においては、コンドロイチン硫酸などのムコ多糖類やタイプIIコラーゲンの産生によりｐＨ値が変化すると考えられる。
【００１８】
図１は、培養軟骨細胞の培養期間の経過に伴うｐＨ値の変化を示したグラフである。培養軟骨細胞の場合には、培養によってコンドロイチン硫酸などの酸性ムコ多糖を基質として産生するため、種々の播種密度で培養を開始した場合に播種密度によって傾向が異なるものの、いずれの播種密度のものも培養日数の経過に伴ってｐＨ値が変動（図１の場合には酸性側に移動）する。
【００１９】
このため、測定された培養組織のｐＨ値から、測定時の培養組織の培養状態を把握することができるので、客観的に且つ効率よく、移植適性可能な状態であるか否かを判定することができると共にその品質を管理することができる。また、ｐＨ値に基づいて品質を管理しながら培養組織を製造するので、安定した品質の培養組織を確実に提供することができる。
【００２０】
本発明でいう「培養組織のｐＨ」とは、培養組織の状態を反映する液体を測定したときに得られるｐＨ値を示す。例えば、培養組織の状態を反映する液体としては、培養組織の基質の影響を強く受ける培養組織内部の液体、培養組織の基質の影響を受けた培養組織表面に接触している液体、所定の溶解液で培養組織を溶解したときに得られる溶液等が挙げられる。
【００２１】
本発明に適用可能な培養組織は、インビトロでの培養により再構築されたものであって、培養によって増加する細胞数や、産生される基質の量に伴って培養物溶解液のｐＨ値が変化する組織であることが必要である。このような培養組織を再構築する細胞としては、軟骨細胞又はこの前駆細胞を使用する。
【００２２】
培養組織のｐＨ値は、培養時間の経過にともなって変化するが、変化量や変化の方向（酸性側か、アルカリ性側か）は、産生される基質や担体の種類や量に基づいて決定される。
【００２３】
本発明における培養組織は、組織再生用担体と細胞及び／又は基質とを組合わせた培養組織でも、単なる細胞のみの培養組織であってもよい。組織再生用担体と培養組織を構成する細胞には、軟骨細胞又はこの前駆細胞を挙げることができる。これらの細胞を培養するために用いられる培養液（培地）には、細胞種に応じて使用することが既知の如何なる培地をも選択することができる。
【００２４】
ここで適用可能な組織再生用担体は、細胞の増殖の足場として作用することもでき、このような担体としては、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、フィブリン、キチン、キトサン、ラミニン、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、アルギン酸カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ポリグリコール酸、ポリ乳酸及びポリロタキサンなどを挙げることができる。このうち、生体への適合性及び生体吸収性の観点からコラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、フィブリンが好ましい。
【００２５】
培養組織のｐＨの測定には、既存のｐＨ測定手段のいずれも使用することができる。
使用可能なｐＨ測定手段としては、例えば、ｐＨ電極や半導体電極を使用した測定機器が挙げられる。これらの装置を使用することによって、簡便に且つ正確に具体的なｐＨを知ることができる。
【００２６】
また、ｐＨ指示薬の色変化によりｐＨを測定する手段も使用することができる。このような手段には、例えば、培養組織の表面に直接付着させて容易に測定可能なｐＨ試験紙や色変化を定量的に測定する吸光度測定や蛍光度測定等の比色分析を挙げることができる。このような色変化によりｐＨを測定する手段を使用することによって、簡単にｐＨを知ることができる。
【００２７】
培養組織のｐＨの測定は、使用するｐＨ測定手段に応じた方法で行う。なお、ｐＨの測定には、培養細胞の培養に用いられる培地のｐＨが影響しないように、培地を除去してから行うことが好ましい。また、組織再生用担体を使用する場合には、できるだけ測定値への影響が少ない担体を選択することが好ましい。さらに、担体のみのｐＨ値を予め測定しておき、この測定値に基づいて培養開始後に測定された培養組織のｐＨ値を補正してもよい。
【００２８】
液体の試料を測定対象とするｐＨ測定手段によりｐＨ測定するために、培養組織の形態に応じて、培養組織を溶解することが好ましい。
【００２９】
培養組織の溶解は、既知の溶解方法により行うことができる。例えば、コラーゲン担体により三次元形状を保持する培養組織の場合には、コラゲナーゼ等の酵素処理により測定試料を作製することができる。このような酵素処理に使用可能な酵素には、トリプシンやディスパーゼ等を挙げることができる。また、培養骨などの培養組織の場合には、酸を使用して測定試料を作製することができる。培養骨の場合、リン酸カルシウムが基質として産生されるが、酸で処理するため、基質量の増加によってｐＨは、使用された酸のｐＨよりもアルカリ側へ変化する。
【００３０】
次に、移植適性の判定について説明する。
移植適性の判定は、予め基準値となる基準ｐＨ値を設定しておき、測定されたｐＨ値と基準ｐＨ値とを比較することにより行うことができる。基準ｐＨ値は、培養条件や細胞種によって異なるので、細胞種、担体の種類、培地の種類等に基づいて実験を行い、個別に設定することが好ましい。
【００３１】
培養組織は、生細胞数及び／又は基質量が充分に存在することに基づいて移植適性があると判定することができる。このため、細胞が充分に増殖し、基質量が充分量産生されている状態となっているときのｐＨ値を、基準ｐＨ値とすることができる。例えば、酸性ムコ多糖類を産生基質とする軟骨細胞をコラーゲンに包埋して培養した（コラーゲン包埋法）場合には、ｐＨ４．０〜８．０の範囲内、好ましくはｐＨ５．５〜７．５の範囲内のｐＨを基準ｐＨ値とすることができる。
【００３２】
また、ある一定の培養期間におけるｐＨ値の変化量に基づいて移植適性を判定することもできる。これは、ｐＨは細胞数や基質量の増加によって変化するので、変化量が大きいほど、急激に基質量が増加したと考えることができるためである。例えば、充分な細胞数で細胞を播種すると、その充分量の細胞から基質が産生されて、基質も短時間に多く産生され、その結果、急激にｐＨ値が変化する（図１参照）。
【００３３】
次に培養組織の品質管理について説明する。
上記の通り、培養組織のｐＨは細胞数及び／又は産生基質量の増加によって変動するので、ｐＨ値の変動から培養状態を把握することができる。これにより、ｐＨ値という具体的な基準に基づいて効率よく簡便に、移植適性を有する適切な状態で提供できるように培養細胞の品質を管理することができる。
【００３４】
ここで「培養組織の品質」とは、移植後に効率よく生着し、或いは移植された固体における組織再生が効率よく行われるための培養組織の移植適性に関する用語であり、「移植適性を有する」とは、このような能力を有していることを言う。
【００３５】
またここで「培養組織の品質管理」とは、移植適性を有する培養組織を提供可能とするために、提供時期との関係において、培養組織中の細胞数及び／又は基質量を所定範囲内に調整することを言う。この培養組織の品質管理は、一方では培養組織の提供時（出荷時）において、移植適性を有する培養組織のみを選択することを意味し、また一方では、培養過程における培養状態を把握し、培養期間や培養条件を調整することにより、培養組織の状態を制御することを意味する。これにより、提供される培養組織を常に一定の品質のものに維持することができる。以下に詳述するが、このような品質管理には、培養中の培養組織の移植適性の適合状態を把握し、把握された培養組織の状態に応じて、市場に供するのに適しているか否かを判定したり、培養に関する種々の因子（培地組成、培養期間など）を調整して培養組織の状態をコントロールするといった作業が挙げられる。
【００３６】
培養組織の品質の管理は、上記の移植適性の判定方法と略同様にｐＨを測定し、ｐＨを監視することにより行われる。
基準ｐＨ値は、上述したものに加えて、培養期間の経過に応じた経時的なｐＨ値の変化を示す基準ｐＨ値の経時変化曲線を作成し、この基準ｐＨ値経時変化曲線を経時的な基準ｐＨ値としてもよい。この場合には、この基準ｐＨ値変化曲線と所定時期におけるｐＨ値とのずれ量に応じて培養状態を把握し、適切な時期に培養組織を提供するよう、品質を管理することができる。
【００３７】
培養組織の品質管理は、提供直前にｐＨを測定することにより、培養組織の品質を管理することができる。この場合、移植適性を有する培養組織のみを選択できるので、確実に、移植適性を有する培養組織のみを提供することができる。
【００３８】
また、培養開始後のいずれかの時期にｐＨを測定して細胞数及び／又は基質量を予測し、この予測に基づいて培養組織の品質を管理することもできる。即ち、培養開始後の特定時期で測定されたｐＨ値から、培養組織を構成する細胞の増殖率を把握することができ、把握された増殖率に基づいて、細胞数及び／又は基質量のその後の増加量を予測することができる。このため、この予測結果に基づいて、移植適性を有する培養組織を提供できるように培養組織の品質を管理することができる。
【００３９】
培養組織の品質管理は、培養開始後の少なくとも１回ｐＨを測定し、この測定結果に基づいて培養組織の培養期間及び培養条件の少なくとも一方を調整することによって行うことが好ましい。これにより、培養組織の品質を、より効率的に安定させることができる。
【００４０】
品質管理のための培養組織のｐＨ値の測定は、培養開始後であればいつでも行うことができるが、適切に品質管理を行い移植適性を有する培養組織を効率よく提供するためには、測定結果に基づいて培養期間や培養条件を適切に調整することができる時期に行われることが好ましい。また、細胞種類及び播種密度等によって増殖速度が異なるので、個々の細胞に応じて測定時期を設定することが好ましい。
【００４１】
品質管理における培養組織のｐＨ値の測定は、培養開始後の少なくとも１回行えばよい。培養開始後の少なくとも１回測定することによって、得られたｐＨ値から細胞数及び基質量の少なくとも一方を予測することができ、この予測に基づいて培養組織の品質を管理することができる。より正確に且つ適切に培養組織の品質を管理する観点から、経時的に複数回測定することが好ましい。
【００４２】
品質管理のためのｐＨ値の測定の回数及び測定時期のインターバルは、個々の細胞の増殖速度や基質の種類及び産生速度などを考慮して、各細胞種類別に設定することが好ましい。
例えば軟骨細胞の場合には、培養期間が４週間程度であるので、最初の測定を、測定に際して充分な量の基質が産生される時期、例えば１４日目頃に行い、この後の各測定時期のインターバルを細胞の基質産生速度の観点から、３日〜１週間で行うことが好ましい。
一方、表皮細胞や線維芽細胞は、コラーゲンゲル包埋法で培養を行った軟骨細胞に比べて増殖率が高く、短い培養期間となるので、最終出荷時にのみｐＨ測定を行うことができる。なお、より正確な基質量を把握する場合には、短いインターバルで複数回測定してもよい。
【００４３】
培養期間及び培養条件の調整は、培養期間を長短させて出荷時期を調整したり、培地交換時期、培地種類、培養温度等の培養条件等を調整して細胞の増殖を促進、あるいは遅滞させることによって行われる。培養期間の調整と培養条件の調整とは、いずれか一方を行ってもよく、これらを組合わせて行ってもよい。
【００４４】
培養期間の調整は、設定された基準ｐＨ値に到達していなかった場合には、培養期間を延長し、基準ｐＨ値を超えていた場合には培養期間を短縮することによって行うことができる。また、細胞種類によって異なるが、基準ｐＨ値からのずれと培養期間との相関関係と予め設定しておき、基準ｐＨ値からのずれの大きさから培養期間の長短を一律に設定することもできる。基準ｐＨ値からのずれ量に応じた培養期間の調整は、個々の細胞の増殖速度などを考慮して、各細胞種類別に設定することが好ましい。例えば、軟骨細胞のコラーゲンゲル包埋法の場合には、測定ｐＨ値が０．５のずれ量で基準ｐＨ値に満たない場合には、培養期間を１週間だけ延長し、測定ｐＨ値が０．５のずれ量で基準ｐＨ値を超えている場合には、培養期間を１週間だけ短縮することもできる。
【００４５】
培養条件の調整には、例えば、培養を促進したい場合には、成長因子(Growth Factor)等を添加するなど、培地の種類や添加成分を変更することで培養増殖能を活性化させたり、培地交換のタイミングを速くするなどが挙げられる。逆に、培養を遅滞・停滞させたい場合には、種々のメーカーから市販されている保存用培地を利用したり、細胞活性の低くなる低温で保存したり、といった方法が考えられる。
【００４６】
次に本発明の培養組織の製造方法について説明する。
培養組織の製造方法は、培養組織のｐＨ値を培養開始から所定時間後に測定することを含む。培養組織のｐＨ値は基質の産生量の増加によって変化するので、上記と同様に培養組織のｐＨ値を測定することによって、個々の培養組織の増殖率等が異なっていても、効率よく且つ適切な提供時期に確実に、移植適性を有する培養組織を製造することができる。
【００４７】
移植適性を有する培養組織の製造方法における培養組織のｐＨ値の測定は、特記しない限り、上記の培養組織の移植適性判定方法及び品質管理方法とほぼ同様に行うことができる。
【００４８】
培養組織のｐＨ値の測定は、培養開始後に少なくとも１回行えばよく、例えば培養終了時に１回のみ測定してもよい。移植適性を有する培養組織を確実に製造するためには、培養組織のｐＨ値を経時的に複数回測定することが好ましい。
【００４９】
培養組織のｐＨ値の測定は、培養開始後であればいつでも測定することができるが、移植適性を有する培養組織を確実に製造する観点から、培養組織の増殖が安定して行われている時期以降に行うことが好ましく、例えば軟骨細胞の場合には培養開始後１４日目以降に測定することが好ましい。
【００５０】
測定されたｐＨ値から、細胞数及び基質量を予測して、移植適性を有する培養組織を確実に且つ効率よく提供するために、培養組織の培養期間及び培養条件の少なくとも一方を調整することが好ましい。培養期間及び培養条件の調整は、上記で説明したものと同様である。
【００５１】
【実施例】
以下、軟骨細胞を基に再構築した培養軟骨組織を一実施例として挙げ、本発明を説明する。
【００５２】
＜培養軟骨組織の作製＞
日本白色家兎の膝、股、肩、肘関節から関節軟骨を採取し、トリプシンＥＤＴＡ溶液およびコラゲナーゼ溶液で酵素処理を行い、軟骨細胞を分離・回収した。得られた軟骨細胞を洗浄後、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）を加え、細胞密度が１×１０⁵個／ｍｌ〜１×１０⁸個／ｍｌの範囲となるように細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液と３％アテロコラーゲンインプラント（高研社製）が１：４の割合になるように混合する。この混合工程により１×１０⁵個／ｍｌ〜１×１０⁸個／ｍｌだった細胞密度は、２×１０⁴個／ｍｌ〜２×１０⁷個／ｍｌに希釈される。この細胞−コラーゲン混合液１００μｌを培養皿にマウント（設置）した。また、図１に示すコラーゲン担体のみの試料に関しては、細胞を加えない１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭと、３％アテロコラーゲンインプラントとを１：４の割合になるように混合し、細胞−コラーゲン混合液と同様のコラーゲン濃度となるように作製した。
【００５３】
マウントした混合液は、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で０．５〜１時間静置してゲル化させ、培地を加え、培養を開始した。培地には５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸及び１００μｇ／ｍｌヒアルロン酸を含有する１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを使用し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で培養を行った。
【００５４】
＜ｐＨ測定用試料の作製＞
以上のようにコラーゲンゲルに包埋・培養した培養軟骨組織での細胞数・基質産生状態を調べるために、ｐＨ測定を行った。
以下、ｐＨ測定にて使用する測定試料の作製方法を簡単に説明する。まず、コラゲナーゼを２５０ｍｇ、ＣａＣ１₂を３３ｍｇ、それぞれ秤量し、０．２５％トリプシン１００ｍｌに溶解することによりｐＨ８．２のコラゲナーゼ溶液を作製した。次いで、測定対象となる培養軟骨組織（１００μｌ）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で十分にリンス（洗浄）した後、上記コラゲナーゼ溶液１ｍｌ中に浸漬させ、溶解させた。
【００５５】
このようにして作製したコラゲナーゼ溶液のｐＨを測定した。ｐＨ測定は市販のｐＨ計（ISFET pH Meter：新電元工業株式会社）のｐＨセンサ部を溶解液に浸漬させることによって測定した。
【００５６】
＜ｐＨ値と細胞数測定の比較＞
軟骨細胞では、培養によって細胞数が増殖するとコンドロイチン硫酸などのムコ多糖類を産生する。このため、培養組織のｐＨ値は、基質量の増加に伴って酸性に偏ることが考えられる。
図２はトリパンブルー染色法により測定した細胞数（最終細胞密度）とｐＨの相関を示す図である。図から明らかなようにｐＨ値が低い（酸性側）ほど細胞数が多く、ｐＨ値が中性域より高くなる（アルカリ性側）と極端に生細胞数が少なくなることが見て取れる。この図２では様々な播種密度、培養期間でのデータをプロットしたものであり、どのような播種密度で培養を開始しても或いはどの時点でｐＨを測定しても、測定時の細胞数に対してｐＨ値が相関していることが分かった。
【００５７】
本実施例における移植適性の判定に用いられる基準ｐＨ値は、培養軟骨組織表層部がほぼ集密状態となった状態の細胞数に相当する１×１０⁶個／ｍｌに対応するｐＨ値を基準ｐＨ値とした。図２に示されるグラフから、対応するｐＨ値はおよそ６．９なので、ｐＨ６．９を基準ｐＨ値と設定した。従って、測定されたｐＨ値が６．９を下回った場合、移植適性を有すると判定することができる。このため、移植適性を有するとの判断を、熟練者でなくとも容易にすることができる。
【００５８】
＜ｐＨ値と基質量測定の比較＞
ｐＨ値と基質量との相関関係を調べるにあたり、基質量と相関関係を有する硬さを、基質量の指標とした。これは、培養軟骨組織中の細胞数及び基質量が増えると、これに伴って培養軟骨組織の硬さが硬くなることに基づいている。
硬さの測定には、触覚センサを備えたバイオセンサ（ＡＸＩＯＭ社製）を使用した（詳細は、本願出願人による特願２００１−０４３９３５号を参照のこと）。また、軟骨組織に特異的に含有される酸性ムコ多糖の硫黄（Ｓ）成分は、電子プローブマイクロアナライザ（日本電子株式会社製）を使用し、定量測定した（詳細は、本願出願人による特願２００１−０９６５２６号を参照のこと）。
【００５９】
図３は培養軟骨組織の硬さとｐＨ値の相関を示す図である。図中の縦軸Δｆは触覚センサの周波数変動を示しており、数値が高いほど硬いことを示している。また、図４は培養軟骨組織の硬さと硫黄成分との相関を示す図である。図４に示されるように、軟骨細胞の産生基質である硫黄成分の増加に伴って周波数変動Δｆが高くなっており、産生基質量が培養組織の硬さに反映されることがわかる。なお、本実施例におけるコラーゲン包埋法による培養軟骨組織は三次元構造を有しており、培養組織の表層と内部とにおいて産生基質量が異なる（詳細は、本願出願人による特願２０００−３７１６９２号を参照のこと）が、ともに培養組織の硬さとは良好な相関が得られている。
【００６０】
図３では、データのばらつきが大きいものの、その分布は近似曲線を見ても分かるように、ｐＨ値が低い（酸性側）ほど硬く、ｐＨ値が高い（アルカリ性側）ほど軟らかくなっていることが見て取れる。図３のデータに関しても、図２と同様に様々な播種密度、培養期間でのデータをプロットしており、どのような培養条件で行っても、このような培養条件はｐＨ値に影響しない一方で、測定時の基質量がｐＨ値と相関していることが分かった。
【００６１】
移植適性の判定に用いられる基準ｐＨ値は、上記細胞数の場合と同様に、実験条件等により個別に設定される。本実施例では、上述のバイオセンサによる測定で周波数変動値Δｆが−９０のとき組織として充分な基質量と考えられる硫黄成分濃度０．１質量％に相当するため、本実施例では、Δｆ＝−９０に対応するｐＨ値を基準ｐＨ値とした。図３に示されるグラフから、対応するｐＨ値はおよそ６．８であるので、ｐＨ６．８を基準ｐＨ値と設定した。従って、測定されたｐＨ値が６．８を下回った場合、移植適性を有すると判定することができる。このため、移植適性を有するとの判断を、熟練者でなくとも容易にすることができる。
【００６２】
なお、本実施例では細胞数との関係（図２）からはｐＨ６．９を判定基準値とし、産生基質量（硬さ）との関係（図３）からはｐＨ６．８を判定基準値として説明を行ったが、目的に応じて各々の判定基準値を単独で利用して移植判定を行ってもよいし、双方の関係を鑑みて判定基準値を設定し、移植判定を行ってもよい。
【００６３】
＜ｐＨ値の経時変化＞
また、ｐＨ値を測定した際、判定基準として設定した平均的なｐＨ値の経時変化曲線を基準曲線として作成して、所定のある時点において、基準曲線と測定ｐＨ値とを比較することができる（図１参照）。この基準曲線に対して測定ｐＨ値が大きくずれていた場合には、そのズレ量に応じて培養期間を長短させたり、培養条件を変更することによって細胞の増殖を促進、あるいは遅滞させる。これにより、所望の培養軟骨組織を安定して提供することができる。
【００６４】
このように、培養軟骨組織のｐＨ測定を経時的に行うことによって細胞数及び産生基質量等の培養状態を把握することができるので、対象となる移植患者の状態に応じて適切な状態の培養軟骨組織を提供することができ、安定した品質管理を行うことができる。また、培養期間を長短させたり、培養条件を変更することによって細胞の増殖を促進、あるいは遅滞させたりすることで、所望の時期に所定の培養軟骨組織を得ることができる。
【００６５】
なお、本発明では、ｐＨ値を測定することによって培養組織の移植適性を判定し、品質を管理し、移植適性を有する培養組織を製造するが、ｐＨ値を測定することによって、細胞数と基質量との双方を同時に且つ容易に把握することもできる。これにより、細胞数及び基質量をそれぞれ専用の方法によって測定する手間を省くことができる。
【００６６】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、培養組織の移植適性を客観的に且つ効率よく判定することできる。また客観的な基準により効率よく、安定した品質の培養組織を供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞を播種していないコラーゲンゲル担体のみと、コラーゲンゲル担体に種々の播種密度で播種した場合の培養軟骨組織とにおける、培養日数とｐＨ値の相関関係を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例に係る培養軟骨組織の細胞数とｐＨ値との相関を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例に係る培養軟骨組織の硬さ（基質量）とｐＨ値との相関関係を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例に係る培養軟骨組織の硬さと硫黄成分量との相関関係を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention is culturecartilageTransplantability determination method and culture for determining tissue transplantabilitycartilageTissue quality control method and culture with transplantabilitycartilageThe present invention relates to a tissue manufacturing method.
[0002]
[Prior art]
In recent years, regenerative medicine and tissue engineering, in which human tissue is reconstructed by cell culture in vitro (in vitro) and the reconstructed cultured tissue is applied to the living body again, have attracted attention.
[0003]
When a cultured tissue reconstructed by cell culture is applied to a living body, it is necessary to examine whether or not the cultured tissue is appropriate as a tissue for transplantation. Transplantability can be determined based on the number of cells and the basic mass of the cultured tissue.
[0004]
As one method for determining the transplantability, whether or not the transplantability is possible can be determined based on the basic mass of the cultured tissue. In this method, a staining method is used in which a substrate component produced from cells at the time of culture is dyed with a staining agent, and the staining state is observed. For example, in the case of cartilage tissue, acid mucopolysaccharide, which is a chondrocyte production substrate, is stained with Alcian Blue, and whether or not the staining is appropriate as a cultured cartilage tissue for transplantation is determined based on the presence or absence of the staining. Judgment can be made.
[0005]
In addition, as another method for determining the transplant suitability, whether or not the transplant suitability is possible can be determined based on the number of cells in the cultured tissue. For example, in the case of determining the transplantability based on the number of living cells, after staining with trypan blue, the number of living cells can be measured to determine the suitability of the cultured tissue for transplantation. At this time, since the living cells exclude the staining agent, the number of living cells can be obtained by counting the cells that were not stained.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
However, in examinations using these staining methods, the number of viable cells must be measured under a microscope, and the basic mass must be determined from the size of the staining area, so experience and skill are required. Furthermore, the measurement of the number of cells takes time and labor of the operator. In addition, regarding the determination of the basic mass, since the staining state varies depending on the staining conditions such as the staining time, it is difficult to compare the data.
[0007]
In addition, even if the cultured cells have the same culture period, the growth ability differs depending on the age of the harvester (donor), and the state of cell growth differs depending on the seeding density. It may be difficult to supply a stable cultured tissue. In such a case, the operator performs microscopic observation etc. every predetermined culturing time, grasps the culturing state of each culturing tissue, and adjusts the culturing according to each culturing state. Although stability is obtained, experience and skill are required to grasp the culture state, and the burden on the worker is great.
[0008]
In view of the above-described problems of the prior art, the present invention can objectively and efficiently determine the transplantability of a cultured tissue, and efficiently and stably supply a cultured tissue with an objective standard. An object of the present invention is to provide a method for determining the transplantability of a cultured tissue, a quality control method, and a production method.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
  The present inventionMeasure the pH value of the tissue lysate obtained by dissolving cultured cartilage tissue and compare it with a preset reference pH value.It is characterized by determining transplantabilityIt is a method for determining the transplantability of cultured cartilage tissue.
[0012]
  The present invention also providesQuality control of cultured cartilage tissue characterized by measuring the pH value of a tissue lysate obtained by dissolving cultured cartilage tissue and comparing the measured pH value with a preset reference pH value Is the method.
[0013]
  Other cultures of the present inventioncartilageThe organization's quality control methodA time-dependent change curve based on a change in the reference pH value over time during the culture period of the cultured cartilage tissue is prepared in advance, and the pH value of the cultured cartilage tissue is measured at least once after the start of culture. The culture state by comparing with the time course curveIt is characterized by that.
[0014]
  The present invention also providesA culture step of culturing cultured cartilage tissue containing chondrocytes, a step of measuring a pH value of a tissue lysate obtained by dissolving the cultured cartilage tissue after a predetermined time from the start of culture, and a cell based on the measurement result Predicting the number and / or base mass, and adjusting at least one of the culture period and culture conditions of the cultured cartilage tissue based on the prediction result,culturecartilageIt is a manufacturing method of a tissue.
[0015]
Another method for producing a cultured tissue having aptitude for transplantation according to the present invention is characterized in that, in the method for producing a cultured tissue, at least one of a culture period and a culture condition of the cultured cartilage tissue is adjusted based on the measurement result. It is said.
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The transplant aptitude determination method and the cultured tissue quality control method of the present invention each determine the transplant aptitude based on the pH of the cultured tissue or manage the quality, and the cultured tissue having the transplant aptitude of the present invention. This manufacturing method includes measuring the pH of the cultured tissue at a predetermined time.
[0017]
A cultured tissue having transplantability contains a sufficient amount of cells and a sufficient amount of substrate produced by the cells. Since the cells in the cultured tissue have the ability to produce a substrate, when the number of cells increases, the production base mass increases, and the pH value changes with this base mass. For example, in the case of cultured cartilage tissue, it is considered that the pH value changes due to the production of mucopolysaccharides such as chondroitin sulfate and type II collagen.
[0018]
FIG. 1 is a graph showing changes in pH value over the course of the culture period of cultured chondrocytes. In the case of cultured chondrocytes, since acidic mucopolysaccharides such as chondroitin sulfate are produced as a substrate by culture, the tendency varies depending on the seeding density when the culture is started at various seeding densities. The pH value fluctuates with the passage of the culture days (in the case of FIG. 1, it moves to the acidic side).
[0019]
For this reason, since the culture state of the cultured tissue at the time of measurement can be grasped from the measured pH value of the cultured tissue, it is objectively and efficiently determined whether or not it is in a state suitable for transplantation. Can manage quality. In addition, since the cultured tissue is manufactured while managing the quality based on the pH value, it is possible to reliably provide a cultured tissue with stable quality.
[0020]
The “pH of cultured tissue” as used in the present invention indicates a pH value obtained when a liquid reflecting the state of the cultured tissue is measured. For example, the liquid that reflects the state of the cultured tissue includes a liquid inside the cultured tissue that is strongly influenced by the substrate of the cultured tissue, a liquid that is in contact with the surface of the cultured tissue affected by the substrate of the cultured tissue, and a predetermined dissolution. Examples include a solution obtained when a cultured tissue is dissolved with a solution.
[0021]
  The culture tissue applicable to the present invention has been reconstructed by in vitro culture, and the pH value of the culture lysate changes with the number of cells increased by the culture and the amount of substrate produced. It is necessary to be an organization. As a cell for reconstructing such a cultured tissue,CellIsthisUse progenitor cells.
[0022]
The pH value of the cultured tissue changes with the lapse of culture time, but the amount of change and the direction of change (whether acidic or alkaline) are determined based on the type and amount of the substrate and carrier produced. The
[0023]
  The cultured tissue in the present invention may be a cultured tissue in which a tissue regeneration carrier and cells and / or a substrate are combined, or a cultured tissue containing only cells. Configure tissue regeneration carrier and cultured tissueRu fineThe vesicles are cartilage fineCellIsthisMention may be made of progenitor cells. As a culture solution (medium) used for culturing these cells, any medium known to be used can be selected depending on the cell type.
[0024]
The tissue regeneration carrier that can be applied here can also act as a scaffold for cell growth, such as collagen, gelatin, hyaluronic acid, fibronectin, fibrin, chitin, chitosan, laminin, dermatan sulfate, Examples include heparan sulfate, chondroitin sulfate, calcium alginate, calcium phosphate, calcium carbonate, polyglycolic acid, polylactic acid, and polyrotaxane. Among these, collagen, gelatin, hyaluronic acid, and fibrin are preferable from the viewpoint of biocompatibility and bioabsorbability.
[0025]
Any of existing pH measuring means can be used for measuring the pH of the cultured tissue.
Examples of usable pH measurement means include a measuring instrument using a pH electrode or a semiconductor electrode. By using these devices, the specific pH can be known easily and accurately.
[0026]
In addition, a means for measuring the pH by changing the color of the pH indicator can also be used. Examples of such means include pH test paper that can be directly attached to the surface of cultured tissue and colorimetric analysis such as absorbance measurement and fluorescence measurement that quantitatively measure color change. it can. By using a means for measuring the pH based on such a color change, the pH can be easily known.
[0027]
Measurement of the pH of the cultured tissue is performed by a method according to the pH measurement means used. The pH is preferably measured after removing the medium so that the pH of the medium used for culturing the cultured cells is not affected. When using a tissue regeneration carrier, it is preferable to select a carrier that has as little influence on the measured value as possible. Furthermore, the pH value of only the carrier may be measured in advance, and the pH value of the cultured tissue measured after the start of culture may be corrected based on this measured value.
[0028]
In order to measure the pH with a pH measurement means for measuring a liquid sample, it is preferable to dissolve the cultured tissue according to the form of the cultured tissue.
[0029]
The cultured tissue can be dissolved by a known dissolution method. For example, in the case of a cultured tissue that maintains a three-dimensional shape with a collagen carrier, a measurement sample can be prepared by an enzyme treatment such as collagenase. Examples of enzymes that can be used for such enzyme treatment include trypsin and dispase. In the case of a cultured tissue such as cultured bone, an acid can be used to produce a measurement sample. In the case of cultured bone, calcium phosphate is produced as a substrate, but since it is treated with an acid, the pH changes to the alkali side with respect to the pH of the acid used due to an increase in the base mass.
[0030]
Next, the determination of transplantability will be described.
The determination of transplantability can be performed by setting a reference pH value as a reference value in advance and comparing the measured pH value with the reference pH value. Since the reference pH value varies depending on the culture conditions and cell types, it is preferable to conduct experiments based on the cell type, the type of carrier, the type of medium, and the like and set them individually.
[0031]
The cultured tissue can be determined to be suitable for transplantation based on the presence of a sufficient number of viable cells and / or substrate mass. For this reason, the pH value when the cells are sufficiently grown and a sufficient amount of the basic mass is produced can be set as the reference pH value. For example, when chondrocytes using acidic mucopolysaccharide as a production substrate are embedded and cultured in collagen (collagen embedding method), the pH is in the range of 4.0 to 8.0, preferably pH 5.5 to 7 A pH within the range of 0.5 can be used as the reference pH value.
[0032]
In addition, transplantability can be determined based on the amount of change in pH value during a certain culture period. This is because the pH changes with an increase in the number of cells and the base mass, and it can be considered that the base mass rapidly increases as the amount of change increases. For example, when cells are seeded with a sufficient number of cells, a substrate is produced from a sufficient amount of cells, and a large amount of substrate is produced in a short time. As a result, the pH value changes rapidly (see FIG. 1).
[0033]
Next, quality control of the cultured tissue will be described.
As described above, since the pH of the cultured tissue varies depending on the increase in the number of cells and / or the mass of the production base, the culture state can be grasped from the variation in pH value. Thereby, the quality of cultured cells can be managed so that it can be provided efficiently and simply in an appropriate state having transplantability based on a specific standard of pH value.
[0034]
Here, “quality of the cultured tissue” is a term relating to the transplantability of the cultured tissue so that the tissue can be efficiently engrafted after transplantation or tissue regeneration in the transplanted solid is efficiently performed, and “having transplantability”. Means having such ability.
[0035]
In addition, here, “quality control of cultured tissue” means that the number of cells and / or the basic mass in the cultured tissue is within a predetermined range in relation to the provision time in order to be able to provide a cultured tissue having transplantability. Say to adjust. This quality control of the cultured tissue means, on the one hand, that only the cultured tissue having transplantability is selected when the cultured tissue is provided (shipped), and on the other hand, the culture state in the culturing process is grasped and cultured. It means that the state of the cultured tissue is controlled by adjusting the period and culture conditions. Thereby, the culture tissue provided can always be maintained at a constant quality. As will be described in detail below, such quality control is to determine the suitability of transplantation suitability of cultured tissue during culture, and whether it is suitable for being put on the market according to the grasped state of the cultured tissue. Examples of such operations include determining whether or not, and adjusting various factors related to culture (medium composition, culture period, etc.) to control the state of the cultured tissue.
[0036]
The quality of the cultured tissue is controlled by measuring the pH and monitoring the pH in substantially the same manner as in the above-described method for determining the transplantability.
In addition to the above-mentioned reference pH value, a reference pH value aging curve showing a change in pH value over time according to the lapse of the culture period is prepared. It is good also as a standard pH value. In this case, the quality can be managed so that the culture state is grasped according to the amount of deviation between the reference pH value change curve and the pH value at a predetermined time, and the cultured tissue is provided at an appropriate time.
[0037]
In the quality control of the cultured tissue, the quality of the cultured tissue can be controlled by measuring the pH immediately before provision. In this case, since only the cultured tissue having transplantability can be selected, it is possible to reliably provide only the cultured tissue having transplantability.
[0038]
It is also possible to predict the number of cells and / or the basic mass by measuring pH at any time after the start of culture, and to manage the quality of the cultured tissue based on this prediction. That is, from the pH value measured at a specific time after the start of culture, the growth rate of the cells constituting the cultured tissue can be grasped, and based on the grasped growth rate, the number of cells and / or the basic mass can be determined thereafter. The amount of increase can be predicted. For this reason, based on this prediction result, the quality of a culture tissue can be managed so that the culture tissue which has a transplantability can be provided.
[0039]
The quality control of the cultured tissue is preferably performed by measuring the pH at least once after the start of the culture, and adjusting at least one of the culture period and the culture conditions of the cultured tissue based on the measurement result. Thereby, the quality of cultured tissue can be stabilized more efficiently.
[0040]
Measurement of the pH value of the cultured tissue for quality control can be performed at any time after the start of culture, but in order to appropriately provide quality control and efficiently provide a cultured tissue having transplantability, the measurement results Based on the above, it is preferably performed at a time when the culture period and culture conditions can be adjusted appropriately. In addition, since the growth rate varies depending on the cell type, the seeding density, etc., it is preferable to set the measurement time according to individual cells.
[0041]
The measurement of the pH value of the cultured tissue in quality control may be performed at least once after the start of culture. By measuring at least once after the start of the culture, at least one of the number of cells and the basic mass can be predicted from the obtained pH value, and the quality of the cultured tissue can be managed based on this prediction. From the viewpoint of more accurately and appropriately managing the quality of the cultured tissue, it is preferable to measure multiple times over time.
[0042]
It is preferable to set the number of times of measurement of pH value and the measurement time interval for quality control for each cell type in consideration of the growth rate of individual cells, the type of substrate and the production rate.
For example, in the case of chondrocytes, since the culture period is about 4 weeks, the first measurement is performed at a time when a sufficient amount of the substrate is produced, for example, around the 14th day. It is preferable to perform the interval of 3 days to 1 week from the viewpoint of the cell substrate production rate.
On the other hand, epidermal cells and fibroblasts have a higher growth rate than chondrocytes cultured by the collagen gel embedding method and a short culture period, so that pH can be measured only at the time of final shipment. In addition, when grasping | ascertaining more exact base mass, you may measure several times in a short interval.
[0043]
The culture period and culture conditions can be adjusted by shortening the culture period and adjusting the shipping time, or by adjusting the culture conditions such as the medium replacement time, medium type, and culture temperature to promote or delay cell growth. Is done by. Either adjustment of the culture period and adjustment of the culture conditions may be performed, or a combination of these may be performed.
[0044]
The culture period can be adjusted by extending the culture period when the set reference pH value has not been reached or by shortening the culture period when the reference pH value has been exceeded. Further, although depending on the cell type, the correlation between the deviation from the reference pH value and the culture period is set in advance, and the length of the culture period can be set uniformly from the magnitude of the deviation from the reference pH value. . The adjustment of the culture period according to the amount of deviation from the reference pH value is preferably set for each cell type in consideration of the growth rate of individual cells. For example, in the case of the collagen gel embedding method of chondrocytes, when the measured pH value is less than the reference pH value with a deviation of 0.5, the culture period is extended by 1 week and the measured pH value is 0. When the reference pH value is exceeded with a deviation of .5, the culture period can be shortened by one week.
[0045]
For adjusting the culture conditions, for example, when promoting the culture, the growth ability is activated by changing the kind of the medium and the added components, such as adding a growth factor, etc. For example, speed up the exchange. On the other hand, when it is desired to delay or stagnate the culture, methods such as using a storage medium commercially available from various manufacturers or storing at a low temperature at which cell activity is low can be considered.
[0046]
Next, the manufacturing method of the cultured tissue of this invention is demonstrated.
The method for producing a cultured tissue includes measuring the pH value of the cultured tissue after a predetermined time from the start of the culture. Since the pH value of the cultured tissue changes with an increase in the production amount of the substrate, measuring the pH value of the cultured tissue in the same manner as described above enables efficient and appropriate even if the growth rate of each cultured tissue is different. Thus, it is possible to produce a cultured tissue having aptitude for transplantation with certainty.
[0047]
Unless otherwise specified, the measurement of the pH value of the cultured tissue in the method for producing a cultured tissue having transplantability can be performed in substantially the same manner as the above-described method for determining the transplantability of a cultured tissue and the quality control method.
[0048]
The pH value of the cultured tissue may be measured at least once after the start of the culture. For example, it may be measured only once at the end of the culture. In order to reliably produce a cultured tissue having transplantability, it is preferable to measure the pH value of the cultured tissue multiple times over time.
[0049]
The pH value of the cultured tissue can be measured at any time after the start of the culture, but from the viewpoint of reliably producing a cultured tissue having transplantability, the time when the cultured tissue is stably grown. For example, in the case of chondrocytes, the measurement is preferably performed after 14 days from the start of culture.
[0050]
From the measured pH value, it is possible to predict the number of cells and the basic mass and adjust at least one of the culture period and culture conditions of the cultured tissue in order to reliably and efficiently provide a cultured tissue having transplantability. preferable. The adjustment of the culture period and the culture conditions are the same as described above.
[0051]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to an example of cultured cartilage tissue reconstructed based on chondrocytes.
[0052]
<Production of cultured cartilage tissue>
Articular cartilage was collected from the knee, crotch, shoulder, and elbow joints of Japanese white rabbits and subjected to enzyme treatment with trypsin EDTA solution and collagenase solution to separate and collect chondrocytes. After washing the obtained chondrocytes, DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) containing 10 v / v% FBS (fetal bovine serum) was added, and the cell density was 1 × 10.^FivePieces / ml to 1 × 10⁸A cell suspension was prepared so as to be in the range of cells / ml. The cell suspension and 3% atelocollagen implant (Koken) are mixed at a ratio of 1: 4. 1 × 10 by this mixing process^FivePieces / ml to 1 × 10⁸The cell density, which was 1 cell / ml, was 2 × 10^FourPieces / ml to 2 × 10⁷Dilute to pieces / ml. 100 μl of this cell-collagen mixture was mounted on a culture dish. For the sample of collagen carrier alone shown in FIG. 1, 10% v / v FBS-containing DMEM to which no cells are added and 3% atelocollagen implant are mixed at a ratio of 1: 4, and a cell-collagen mixture is obtained. The same collagen concentration was prepared.
[0053]
Mounted mixture is 37 ° C, 5% CO₂The mixture was allowed to stand for 0.5 to 1 hour under the above conditions for gelation, a medium was added, and culture was started. As the medium, DMEM containing 10 v / v% FBS containing 50 μg / ml ascorbic acid and 100 μg / ml hyaluronic acid was used.₂Culture was performed under conditions.
[0054]
<Preparation of pH measurement sample>
In order to examine the number of cells and the substrate production state in cultured cartilage tissue embedded and cultured in collagen gel as described above, pH measurement was performed.
Hereinafter, a method for producing a measurement sample used for pH measurement will be briefly described. First, collagenase 250mg, CaC1₂33 mg each was weighed and dissolved in 100 ml of 0.25% trypsin to prepare a collagenase solution with a pH of 8.2. Next, the cultured cartilage tissue (100 μl) to be measured was sufficiently rinsed (washed) with a phosphate buffer (PBS), and then immersed in 1 ml of the collagenase solution to be dissolved.
[0055]
The pH of the collagenase solution thus prepared was measured. The pH was measured by immersing the pH sensor part of a commercially available pH meter (ISFET pH Meter: Shindengen Electric Industry Co., Ltd.) in the solution.
[0056]
<Comparison of pH value and cell number measurement>
In chondrocytes, mucopolysaccharides such as chondroitin sulfate are produced when the number of cells grows in culture. For this reason, it is conceivable that the pH value of the cultured tissue tends to be acidic as the basic mass increases.
FIG. 2 is a graph showing the correlation between the number of cells (final cell density) measured by trypan blue staining and pH. As is clear from the figure, it can be seen that the lower the pH value (acidic side), the larger the number of cells, and the higher the pH value is higher than the neutral range (alkaline side), the number of viable cells extremely decreases. FIG. 2 is a plot of data at various seeding densities and culture periods. Regardless of the seeding density at which culture is started or at which time the pH is measured, the number of cells at the time of measurement is shown. On the other hand, it was found that the pH value was correlated.
[0057]
The reference pH value used in the determination of transplantability in this example is 1 × 10 corresponding to the number of cells in a state where the cultured cartilage tissue surface layer is almost confluent.⁶The pH value corresponding to pieces / ml was taken as the reference pH value. From the graph shown in FIG. 2, since the corresponding pH value is approximately 6.9, pH 6.9 was set as the reference pH value. Therefore, when the measured pH value is less than 6.9, it can be determined that the sample has aptitude for transplantation. For this reason, even if it is not an expert, it can make easy judgment that it has transplantability.
[0058]
<Comparison of pH value and basic mass measurement>
In examining the correlation between the pH value and the base mass, the hardness having a correlation with the base mass was used as an index of the base mass. This is based on an increase in the hardness of the cultured cartilage tissue as the number of cells and the basic mass in the cultured cartilage tissue increase.
For the measurement of hardness, a biosensor (manufactured by AXIOM) equipped with a tactile sensor was used (for details, see Japanese Patent Application No. 2001-043935 by the applicant of the present application). In addition, the sulfur (S) component of the acidic mucopolysaccharide specifically contained in the cartilage tissue was quantitatively measured using an electronic probe microanalyzer (manufactured by JEOL Ltd.) (for details, the patent application by the applicant of the present application). 2001-096526).
[0059]
FIG. 3 is a diagram showing the correlation between the hardness of the cultured cartilage tissue and the pH value. The vertical axis Δf in the figure indicates the frequency variation of the tactile sensor, and the higher the value, the harder it is. FIG. 4 is a diagram showing the correlation between the hardness of the cultured cartilage tissue and the sulfur component. As shown in FIG. 4, it can be seen that the frequency fluctuation Δf increases with an increase in the sulfur component that is a chondrocyte production substrate, and the mass of the production base is reflected in the hardness of the cultured tissue. Note that the cultured cartilage tissue by the collagen embedding method in this example has a three-dimensional structure, and the mass of the production base differs between the surface layer and the inside of the cultured tissue (for details, see Japanese Patent Application No. 2000-371692 by the applicant of the present application). However, there is a good correlation with the hardness of the cultured tissue.
[0060]
In FIG. 3, although the data variation is large, the distribution is harder as the pH value is lower (acid side) and softer as the pH value is higher (alkaline side), as can be seen from the approximate curve. I can see it. Regarding the data in FIG. 3 as well, the data at various seeding densities and culture periods are plotted in the same manner as in FIG. 2, and no matter what culture conditions are used, such culture conditions do not affect the pH value. Thus, it was found that the base mass at the time of measurement correlated with the pH value.
[0061]
The reference pH value used for the determination of transplantation aptitude is individually set according to the experimental conditions and the like, as in the case of the number of cells. In the present embodiment, when the frequency fluctuation value Δf is −90 in the measurement by the biosensor described above, this corresponds to a sulfur component concentration of 0.1 mass% which is considered to be a sufficient base mass as a tissue. Therefore, in this embodiment, Δf = The pH value corresponding to -90 was taken as the reference pH value. From the graph shown in FIG. 3, since the corresponding pH value is approximately 6.8, pH 6.8 was set as the reference pH value. Therefore, when the measured pH value falls below 6.8, it can be determined that the sample has aptitude for transplantation. For this reason, even if it is not an expert, it can make easy judgment that it has transplantability.
[0062]
In this example, pH 6.9 is used as a criterion value from the relationship with the number of cells (FIG. 2), and pH 6.8 is used as a criterion value from the relationship with the production base mass (hardness) (FIG. 3). Although described, transplant determination may be performed using each determination reference value independently according to the purpose, or determination reference value may be set in consideration of the relationship between the two, and transplant determination may be performed. .
[0063]
<Change in pH value over time>
In addition, when measuring the pH value, a time-dependent change curve of an average pH value set as a criterion can be created as a reference curve, and the reference curve and the measured pH value can be compared at a predetermined point in time. (See FIG. 1). When the measured pH value deviates greatly from this reference curve, the cell growth is promoted or delayed by changing the culture condition according to the amount of deviation. Thereby, a desired cultured cartilage tissue can be stably provided.
[0064]
Thus, by measuring the pH of the cultured cartilage tissue over time, it is possible to grasp the culture state such as the number of cells and the mass of the production base, so that the culture in an appropriate state according to the state of the target transplant patient Cartilage tissue can be provided, and stable quality control can be performed. Moreover, a predetermined cultured cartilage tissue can be obtained at a desired time by promoting or delaying cell growth by lengthening or shortening the culture period or changing the culture conditions.
[0065]
In the present invention, the transplantability of the cultured tissue is determined by measuring the pH value, the quality is controlled, and the cultured tissue having the transplantability is manufactured. Both the mass and the mass can be easily grasped at the same time. Thereby, the trouble of measuring the number of cells and the basic mass by respective dedicated methods can be saved.
[0066]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, it is possible to objectively and efficiently determine the transplantability of a cultured tissue. Moreover, the culture | cultivation structure | tissue of the stable quality can be supplied efficiently by objective criteria.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the correlation between the number of culture days and the pH value of only a collagen gel carrier not seeded with cells and cultured cartilage tissue when seeded on a collagen gel carrier at various seeding densities.
FIG. 2 is a graph showing the correlation between the number of cells and pH value of cultured cartilage tissue according to an example of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the correlation between the hardness (basic mass) of a cultured cartilage tissue and a pH value according to an example of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the correlation between the hardness of cultured cartilage tissue and the amount of sulfur component according to an example of the present invention.

Claims

A method for determining the transplantability of cultured cartilage tissue, wherein the pH value of a tissue lysate obtained by dissolving the cultured cartilage tissue is measured and compared with a preset reference pH value. A method for determining the transplantability of cultured cartilage tissue.

Culture A quality control method for culturing cartilage tissue, by measuring the pH value of tissue lysate obtained by dissolving the cultured cartilage tissue, by comparing the preset reference pH value the measured value A method for quality control of cultured cartilage tissue to grasp the condition .

A time-dependent change curve based on a change in reference pH value over time during the culture period of the cultured cartilage tissue is prepared in advance, and the pH value of the cultured cartilage tissue is measured at least once after the start of culture, and the measurement timing and measurement The quality control method for cultured cartilage tissue according to claim 2 , wherein the culture state is grasped by comparing the result with the time-dependent change curve .

A method for producing cultured cartilage tissue, comprising culturing a cultured cartilage tissue containing chondrocytes, and measuring a pH value of a tissue lysate obtained by dissolving the cultured cartilage tissue after a predetermined time from the start of culture. Manufacturing a cultured cartilage tissue comprising a step and a step of predicting a cell number and / or a basic mass based on the measurement result and adjusting at least one of a culture period and a culture condition of the cultured cartilage tissue based on the prediction result Method.