JP4824201B2

JP4824201B2 - Method for determining appropriateness of transplantation of cultured tissue and method for producing cultured tissue

Info

Publication number: JP4824201B2
Application number: JP2001167908A
Authority: JP
Inventors: 里佳福島; 雅一加藤; 剛之山本
Original assignee: 株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング
Priority date: 2001-06-04
Filing date: 2001-06-04
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2021-06-04
Also published as: JP2002360242A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養組織の移植適性判定方法及び培養組織の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体外（インビトロ）での細胞培養によってヒト組織を再構築し、再構築した培養組織を再び生体へ適用することにより治療を行う再生医療や組織工学が注目を浴びている。
【０００３】
細胞培養により再構築された培養組織を生体に適用する際には、培養組織が移植用組織として適切であるか否かを検査する必要がある。このような移植適性の判定方法の１つとして、培養時に細胞から産生される基質成分を染色剤で染め、その染色状態を基に検査を行う染色法を利用することが考えられる。例えば、軟骨組織の場合、軟骨細胞の産生基質である酸性ムコ多糖類をアルシアンブルーで染色できるので、その染色状態を基に移植用の培養組織として適切な状態であるか否かの判定に利用することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、染色法による検査では定量的な測定情報が得られず、染色時間等の染色条件によっては染色状態が異なるので、データの比較が困難であり、検査判断には経験や熟練が必要とされる。また、検査に際して複数の検査用組織片が別途必要になるので、移植用培養組織とは別に同一ロットの培養組織を検査用組織として多く準備する必要がある。
【０００５】
また、培養細胞は同一の培養期間であっても、採取者（ドナー）の年齢によって増殖能が異なったり、播種密度によって細胞増殖の状態が異なったりするので、培養期間のみによる品質管理では、品質の安定した培養組織を供給することが困難な場合がある。このような場合には、所定の培養時間経過ごとに作業者が顕微鏡観察等を行って個々の培養組織の培養状態を把握し、各々の培養状態に対応させて培養を調整することで品質の安定性を得ている。しかしながら、これらの方法では一連の作業を必要とするため、作業者への負担が大きかった。
【０００６】
本発明は上記従来技術の問題点を鑑み、培養組織の移植適性を客観的に且つ効率よく判定することが可能であり、また客観的な基準により効率よく、安定した品質の培養組織を供給することが可能な培養組織の移植適性判定方法及び製造方法を提供することを技術課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の培養組織の移植適正判定方法は、コラーゲンゲル包埋法でインビトロ培養された培養軟骨組織の質量を重量測定により測定し、当該測定結果と予め設定された移植適性の基準を比較し、当該比較結果に基づいて培養軟骨組織の移植適性を判定することを特徴としている。
【０００８】
本発明の培養組織の移植適正判定方法は、コラーゲンゲル包埋法でインビトロ培養された培養軟骨組織の質量を複数回測定し、当該測定結果から得られる質量変化率を算出し、当該質量変化率と予め設定された移植適性の基準を比較し、当該比較結果に基づいて培養軟骨組織の移植適性を判定することを特徴としている。
【０００９】
本発明の移植適性を有する培養組織の製造方法は、コラーゲンゲル包埋法で軟骨組織をインビトロ培養する培養工程と、当該培養工程中において培養軟骨組織の質量を少なくとも１回は重量測定により測定する測定工程と、当該測定工程と予め設定された移植適性の基準を比較する比較工程と、当該比較結果に基づいて前記培養工程における培養期間及び培養条件の少なくとも一方を調整する調整工程と、を含むことを特徴としている。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の培養組織の移植適性判定方法及び品質管理方法は、それぞれ、培養組織の質量に基づいて移植適性を判定し、又は品質を管理するものであり、また本発明の移植適性を有する培養組織の製造方法は、培養組織の質量を所定時に測定することを含むものである。
【００１１】
培養組織では、細胞の播種後に適切な培養条件で培養することによって、細胞が増殖し、細胞外マトリクス等の基質を産生する。このような培養組織は、基となる細胞の増殖能、殊にドナーの年齢によって増殖率、増殖速度が異なり、同一培養期間であっても培養組織の状態が異なるが、細胞増殖や基質産生等の状態は質量に反映されるため、質量を測定することで培養状態を知ることができる。このため、測定された質量から、客観的に且つ効率よく、移植適性可能な状態であるか否かを判定することができ、品質を管理することができる。また、質量に基づいて品質を管理しながら培養組織を製造するので、安定した品質の培養組織を確実に提供することができる。
【００１２】
ここで「培養組織の質量」とは、成育培地中で培養された組織自体の質量を主として意味する。即ち、培養組織は、培養された細胞と基質、及び基質に保持される成分（水やイオン）とで主として構成されており、このような培養組織自体の質量の他、質量測定時に培養組織に付着及び／又は浸透された培地など、培養組織自体以外であるが、培養組織自体の質量又は培養組織自体の質量の比較において、影響の少ない他の因子の質量が付加された場合も含む。また、本発明において培養組織の質量は、培養組織そのものを測定して直接的に得ることができるが、後述するような種々の測定方法により培養組織の質量を間接的に得ることもできる。本願発明では、このように直接的或いは間接的な測定のどちらであっても、同様の効果を得ることができる。
【００１３】
本発明における培養組織は、インビトロでの培養により再構築されたものであって、組織再生用担体と細胞及び／又は基質とを組み合わせた培養組織を利用する。また、細胞種は軟骨細胞を利用する。この細胞を培養するために用いられる培養液（培地）は、細胞種に応じた既知の如何なる培地をも選択することができる。なお、組織再生用担体と細胞及び／又は基質とを組み合わせた培養組織においては、軟骨細胞又はこの前駆細胞や、間葉系幹細胞を利用することが好ましい。
【００１４】
ここで適用可能な組織再生用担体としては、生体への適合性及び生体吸収性の観点から、コラーゲンを利用し、これは細胞増殖の足場として作用する。
【００１５】
培養組織の質量測定は、慣用の方法を用いて測定することができる。例えば、培養組織の重さを測定することで、実質的に質量を測定することができる。この場合、微量な値でも正確に測定することができる電子天秤が好ましく、市販されている種々のメーカーのものを使用することができる。
【００１６】
培養組織の質量の測定は、無菌的に測定することが好ましい。また、培養組織を培養容器に入れたままの状態で質量測定することは、非接触で培養状態を知ることができるので好ましい。このような場合には、培養容器の質量を補正して、実質的に培養組織の質量を算出してもよい。このように培養容器に入れた状態で測定することで、培養組織に対する汚染を防止することができる。また、移植に使用する培養組織そのものを検査できるので、別途検査用の培養組織を作製する必要がない。
【００１７】
次に、本発明の移植適性の判定方法について説明する。
移植適性の判定は、基準の質量となる適性基準を予め設定しておき、測定結果と適性基準とを比較することで移植適性の判定を行う。これにより、質量といった客観的な基準に基づいて容易に判定することができ、また対象となる培養組織に対して直接的に判定を行うことができるので、別途検査用の培養組織を作製する必要性がなく、効率よく培養組織の移植適性を判定することができる。
【００１８】
培養組織の移植適性は、細胞が充分に増殖し、基質も充分量産生している状態となったときの質量又は、そのような状態になるまでの質量変化率を設定し、これを適性基準とすることができる。標準化してより効率よく移植適性を判定する観点から、質量変化率を適正基準とすることが好ましい。適性基準は、細胞種や培養条件によって異なるので、細胞の播種条件、担体の種類、担体の設置量、培養容器の質量や培地量等を考慮して設定する必要がある。
【００１９】
この適性基準は、実験的に得られる質量データに基づいて設定することが好ましい。コラーゲン包埋法で培養された軟骨細胞の場合、例えば、２×１０⁶個／ｍｌの播種密度で培養を行うと、適性基準は培養開始時の質量に対して１．０〜１０．０倍であり、好ましくは１．５〜５．０倍である。フィーダーレイヤー（Feeder Layer）培養法で培養された表皮細胞の場合、例えば、培養フラスコの底面積が１５０ｃｍ²、層数が２〜６層程度の場合には、表皮細胞組織の重さは約８５０ｍｇ程度であり、これを適正基準とすることができる。このように設定された適性基準を超えた培養組織を、移植適性あり、と判定することができる。
【００２０】
なお、担体を用いて培養組織の培養を行う場合には、細胞数及び基質産生による質量が増加しても担体の分解による培養組織の質量減少の速度が大きいと培養組織の総質量が減少することも起こり得るため、用語「質量変化率」とは、培養組織の質量が増加する場合と減少する場合との双方を含む。
【００２１】
適性基準との対比は、適性基準の測定方法と同一の条件で測定された結果を利用することが好ましい。例えば、培養容器と共に測定したものを適性基準として適用した場合には、培養容器と共に測定した測定結果と対比する。
【００２２】
次に本発明の培養組織の品質管理方法について説明する。
上記の通り、培養組織の質量は適正な培養によって変化するため、培養組織の質量を測定し、その測定結果を基に測定時の培養状態を把握することができる。これにより、質量という具体的且つ客観的な適性基準により、移植適性を有する培養組織を適切な状態で提供できるように、培養組織の品質を管理することができる。
【００２３】
ここで「培養組織の品質」とは、移植後に効率よく生着し、或いは移植された個体における組織再生が効率よく行われるための要件を備えていることであり、「移植適性を有する」とは、このような能力を有していることを言う。
【００２４】
またここで「培養組織の品質管理」とは、移植適性を有する培養組織を提供可能とするために、提供時期との関係において、培養組織中の細胞数及び／又は基質量を所定範囲内に調整することを言う。この培養組織の品質管理は、一方では培養組織の提供時（出荷時）において、移植適性を有する培養組織のみを選択することを意味し、また一方では、培養過程における培養状態を把握し、培養期間や培養条件を調整することにより、培養組織の状態を制御することを意味する。これにより、提供される培養組織を常に一定の品質のものに維持することができる。以下に詳述するが、このような品質管理には、培養中の培養組織の移植適性の適合状態を把握し、把握された培養組織の状態に応じて、市場に供するのに適しているか否かを判定したり、培養に関する種々の因子（培地組成、培養期間など）を調整して培養組織の状態をコントロールするといった作業が挙げられる。
【００２５】
培養組織の品質管理は、上記の移植適性の判定方法と略同様に培養組織の質量を測定及び監視することにより行われる。
判定基準は、上述したものに加えて、培養期間の経過に応じた経時的な質量の変化を示す基準質量の経時変化曲線を作成し、この基準質量経時変化曲線を経時的な判定基準としてもよい。この場合には、この基準質量変化曲線と所定時期における質量とのずれ量に応じて培養状態を把握し、適切な時期に培養組織を提供するよう、品質を管理することができる。
【００２６】
培養組織の品質管理は、提供直前に質量を測定することにより、培養組織の品質を管理することができる。この場合、移植適性を有する培養組織のみを選択できるので、確実に、移植適性を有する培養組織のみを提供することができる。
【００２７】
また、培養開始後のいずれかの時期に質量を測定して細胞数及び／又は基質量を予測し、この予測に基づいて培養組織の品質を管理することもできる。即ち、培養開始後の特定時期で測定された質量から、培養組織を構成する細胞の増殖率を把握することができ、把握された増殖率に基づいて、細胞数及び／又は基質量のその後の増加量を予測することができる。このため、この予測結果に基づいて、移植適性を有する培養組織を提供できるように培養組織の品質を管理することができる。
【００２８】
培養組織の品質管理は、培養開始後の少なくとも１回質量を測定し、この測定結果に基づいて培養組織の培養期間及び培養条件の少なくとも一方を調整することによって行うことが好ましい。これにより、培養組織の品質を、より効率的に安定させることができる。
【００２９】
品質管理のための培養組織の質量の測定は、培養開始後であればいつでも行うことができるが、適切に品質管理を行い、移植適性を有する培養組織を効率よく提供するためには、測定結果に基づいて培養期間や培養条件を適切に調整することができる時期に行われることが好ましい。このため、細胞種類及び播種密度等によって増殖速度が異なるために、個々の場合に応じて測定時期を設定することが好ましい。
【００３０】
品質管理における培養組織の質量の測定は、培養開始後の少なくとも１回行えばよい。培養開始後に少なくとも１回測定することによって、得られた質量から、その後の質量変化の状態を予測することができ、この予測に基づいて培養組織の品質を管理することができる。より正確に且つ適切に培養組織の品質を管理する観点から、経時的に複数回測定することが好ましい。
【００３１】
品質管理のための質量測定の回数及び測定時期のインターバルは、個々の細胞の増殖速度や基質の種類及び産生速度などを考慮して、各細胞種類別及び／又は培養方法別に設定することが好ましい。
例えば軟骨細胞のコラーゲンゲル包埋法の場合には、培養期間が４週間程度であるので、最初の測定を、測定に際して充分な量の細胞が増殖し、且つ充分な量の基質が産生される時期、例えば１４日目頃に行い、この後の各測定時期のインターバルを細胞の細胞増殖及び基質産生速度の観点から、３日〜１週間で行うことが好ましい。
一方、表皮細胞のフィーダーレイヤー培養法の場合、培養期間が１〜２週間程度であるので、測定時期のインターバルを１〜３日程度で行うと、正確なデータを得ることができる。
【００３２】
培養期間及び培養条件の調整は、培養期間を長短させて出荷時期を調整したり、培地交換時期、培地種類、培養温度等の培養条件等を調整したりすることによって行われる。培養期間の調整と培養条件の調整とは、いずれか一方を行ってもよく、これらを組合わせて行ってもよい。
【００３３】
培養期間の調整は、設定された適性基準を下回っていた場合には培養期間を延長し、適性基準を上回っていた場合には培養期間を短縮することにより行われる。また、細胞種類によって異なるが、適性基準からのずれと培養期間との相関関係を予め設定しておき、適性基準からのずれの大きさから培養期間の長短を一律に決定することもできる。基準質量値からのずれ量に応じた培養期間の調整は、個々の細胞の増殖速度などを考慮して、各細胞種類別及び／又は培養方法別に設定することが好ましい。例えば、軟骨細胞のコラーゲン包埋法による培養の場合、効率よく培養期間の調整ができる時期に測定したとき、適性基準から１０〜５０％下回っていた場合には、培養期間を２０〜７０％延長すると決定することができる。
【００３４】
例えば、培養を促進したい場合などは、成長因子（Growth Factor）等を添加するなど、培地の種類や添加成分を変更することで細胞増殖能を活性化させたり、培地交換のタイミングを早くしたり、等の方法が考えられる。逆に、培養を遅滞・停滞させたい場合には、種々のメーカーから市販されている保存用培地を利用したり、細胞活性の低くなる低温で保存したり、といった方法が考えられる。
【００３５】
次に本発明の培養組織の製造方法について説明する。
培養組織の製造方法は、培養組織の質量を培養開始から所定時間後に測定することを含む。培養組織の質量は細胞の増殖及び基質の産生によって増加するので、上記と同様に培養組織の質量を測定することによって、個々の培養組織の増殖率等が異なっていても、効率よく且つ適切な提供時期に確実に、移植適性を有する培養組織を製造することができる。
【００３６】
移植適性を有する培養組織の製造方法における培養組織の質量の測定は、特記しない限り、上記の培養組織の移植適性判定方法及び品質管理方法とほぼ同様に行うことができる。
【００３７】
培養組織の質量の測定は、培養開始後に少なくとも１回行えばよく、培養終了時に１回のみ測定してもよい。移植適性を有する培養組織を確実に提供するためには、培養組織の質量を経時的に複数回測定することが好ましい。
【００３８】
培養組織の質量の測定は、培養開始後であればいつでも測定することができるが、移植適性を有する培養組織を確実に提供する観点から、細胞増殖及び基質産生が安定して行われている時期以降に行うことが好ましく、例えば軟骨細胞のコラーゲンゲル包埋法の場合には培養開始後１４日以降、表皮細胞のフィーダーレイヤー培養法の場合には培養開始後２日以降に、それぞれ測定することが好ましい。
【００３９】
【実施例】
以下、軟骨細胞を基に再構築した培養軟骨組織を一実施例として挙げ、本発明を説明する。
［実施例１］
＜培養軟骨組織の作製＞
日本白色家兎の膝、股、肩、肘関節から関節軟骨を採取し、トリプシンＥＤＴＡ溶液およびコラゲナーゼ溶液で酵素処理を行い、軟骨細胞を分離・回収した。得られた軟骨細胞を洗浄後、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）を加え、細胞密度が１×１０⁷個／ｍｌとなるように細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液と３％アテロコラーゲンインプラント（高研社製）が１：４の割合になるように混合し、細胞−コラーゲン混合液を調整した。この混合工程により１×１０⁷個／ｍｌだった細胞密度は、２×１０⁶個／ｍｌに希釈される。この細胞−コラーゲン混合液１００μｌを培養皿にマウント（設置）した。但し、後述の図１では１ｍｌをマウントした場合を示している。
【００４０】
マウントした混合液は、３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で０．５〜１時間静置してゲル化させ、培地を加え、培養を開始した。培地には５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸及び１００μｇ／ｍｌヒアルロン酸を含有する１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを使用し、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で５週間培養を行った。
【００４１】
＜移植適性の判定＞
移植適性の検査はディッシュ内の培地をアスピレータで吸引し、ディッシュ内に培養組織が載置された状態のまま、重量測定器（はかり）で測定を行う。本実施例における重量測定器には、微量な値でも正確な測定が可能な電子天秤（メトラー・トレド社製）を使用した。以下に記載される質量値は、測定した重量値を実質的な質量値として説明する。
【００４２】
図１は培養軟骨組織の質量の経時変化を示すグラフである。なお、質量は培養容器（ディッシュ）の質量を含む単位で示してある。図１には２つの試料（Ｎｏ．１及び２）の質量経時変化がプロットされており、これらの平均値に対する近似曲線をＡ．Ｃ．として示した。図２は培養軟骨組織の断面をアルシアンブルーにより染色した染色像を経時的に観察した観察像であり、（ａ）〜（ｅ）は各々培養７，１４，２１，２８，３５日目を示している。
【００４３】
図１から明らかなように、培養開始から時間が経過するにしたがって培養軟骨組織の質量が徐々に増加していることが一見して観察できる。図２からは培養日数の経過に伴って、培養軟骨組織の細胞及び産生基質が増加していることが観察でき、質量の増加を示す図１との関係から、細胞増殖及び基質産生を質量変化として捕えることができることが分かる。
【００４４】
図２において、培養２１日目以降の培養組織（図２（ｃ）〜（ｅ）を参照）には、その表面に十分な細胞層及び基質層が発達しており、移植時において移植先と早期に生着し、脱落する可能性が低く、十分な移植適性を有している。
【００４５】
これに基づいて、例えば、図１の近似曲線Ａ．Ｃ．を基に判定基準を設定すると、移植に十分な状態となる培養２１日目には近似曲線Ａ．Ｃ．は約２５．１ｇ（ディッシュ込）を示しているので、判定基準となる基準質量を２５．０ｇとし、上記手順で作製した培養軟骨組織の測定質量（ディッシュ込）が２５．０ｇを超えた時点で移植適性を有していると判断することができる。
【００４６】
このように、所定の条件で作製したときの培養組織が移植適性を満たしたときの質量を閾値として判定基準とすることにより、熟練者でなくとも容易に移植適性を判定することができる。
【００４７】
＜品質管理＞
近似曲線Ａ．Ｃ．を培養増殖の判定基準とし、ある培養日数での培養組織の質量が曲線Ａ．Ｃ．による質量を満たしていない場合には、例えば、培地に成長増殖因子を添加したり、培地交換間隔を短縮したりすることで、細胞増殖及び基質産生を促進させて、所定培養日数で所望の培養組織を得るように調整することができる。
【００４８】
逆に、培養組織の測定質量が曲線Ａ．Ｃ．の基準を大きく上回っているときには、例えば、保存用培地を利用したり、低温保存したりすることで細胞増殖及び基質産生を遅滞あるいは停滞させることで、所定時期に所望の培養組織を得られるように調整することが可能である。
【００４９】
なお、上記例では曲線Ａ．Ｃ．を境界として判定したが、判定基準に幅を持たせ、例えば、曲線Ａ．Ｃ．±０．１ｇの領域を所定基準とし、この領域を上下する範囲において、上記のような培養条件の調整を行うようにしてもよい。
【００５０】
このように培養組織の質量変化を経時的に測定し、質量曲線等の判定基準と比較することによって、培養条件や培養期間等を調整することで、出荷時の品質を安定させることができる。
【００５１】
さらに、測定質量が判定基準よりも下回っている場合には、その程度に応じて出荷までの培養日数を長く調整することで出荷時での品質を安定させることができる。逆に、測定質量が判定基準よりも大きく越えているような場合には、基準となる培養日数より早期に出荷することが可能となる。
【００５２】
［実施例２］
実施例２は、実施例１と同様の方法で作製された２つの培養軟骨組織を用いた他の実施例である。
図３は細胞を播種しない状態での担体（コラーゲンゲル１００μｌ）の質量の経時変化及び培養組織の質量の経時変化を示すグラフである。但し、図３では図１と異なり、培養容器（ディッシュ）の質量を総質量から減算することで担体及び培養組織のみの質量を示している。コラーゲンゲル担体のみの試料は、コラーゲン濃度を培養組織と同様にするために、培養組織の作製方法に準じて作製した。具体的には、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭと３％アテロコラーゲンインプラントを１：４の割合で混合した混合液を、培養皿にマウントし、ゲル化させた。
【００５３】
図３において、黒塗り丸及び黒塗り三角が培養組織の質量を示し、黒塗り菱形及び黒塗り四角が担体のみの質量変化を示している。図中の点線は培養組織及び担体質量の各々の平均値に対する近似曲線を示す。
【００５４】
培養組織の質量が増加するのに対して、コラーゲンゲル担体のみのものは時間の経過とともに質量が減少しているのが見て取れる。これは、コラーゲンゲルが液体培地中に徐々に溶出していることが原因と考えられる。培養組織においても担体となるコラーゲンゲルは溶出による質量の減少が考えられるが、担体のみの場合と比較すると、培養組織表面が産生基質によって被覆されるため、溶出する割合は少なくなる。培養組織質量は培養１１日目頃までは担体質量の減少に伴って減少するが、その後は徐々に質量が増加する。
【００５５】
図３では、例えば、コラーゲンゲル担体のみの質量に対して、培養組織の質量が所定の倍率になることで移植適性を判定する。例えば、細胞の増殖がプラトー（plateau）な状態になる質量変化率に相当する判定基準を設定する。図３の場合、担体質量に対して培養組織質量が２００％となることを判定基準とすれば、およそ培養２１日目以降の培養組織に対して移植適性が良好であると判定することができる。本実施形態におけるプラトーな状態とは、細胞数がほぼ一定になり、細胞増殖がほとんど行われなくなった状態をいう。
【００５６】
また、図１と同様に閾値となる質量を判定基準として設け、培養組織の質量が閾値を越えたか否かによって判定する。さらに経時変化を測定することによって、培養期間や培養条件を調整する。この場合、細胞増殖によって質量変化が生じる培養１１日目以降に測定することが好ましい。
【００５７】
［実施例３］
実施例３は、実施例２の測定結果を別の形式で処理したものである。
図４は、図３における培養組織質量から担体質量を減算することにより得た質量変化のグラフである。この場合に得られる質量は、細胞、産生基質及び基質に保持される成分（例えば、水やイオン）の質量が示される。図中の黒塗り丸は図３の黒塗り丸から担体質量の平均値（黒塗り菱形と黒塗り四角の平均値）を減算した値であり、黒塗り三角は図３の黒塗り三角から担体質量平均を減算した値を示している。これらの値は、実質的な細胞の増殖及び産生基質による質量増加と想定することができる。図中の点線は黒塗り丸と黒塗り三角の平均値による近似曲線を示している。
【００５８】
図４においても、図１の場合と同様に、予め閾値となる質量を適性基準として設定することにより、容易に移植適性の判定を行う。図４の細胞及び基質質量の変化グラフにおいて、軟骨細胞の増殖がプラトーな状態となる０．１ｇを閾値とした場合、黒塗り丸及び黒塗り三角ともに培養開始２１〜２６日目にかけて、移植用培養軟骨組織として使用しても良い状態になったと判定することができる。また、図中の点線を判定基準として、質量の経時変化を基に培養期間や培養条件の調整を行うことができる。
【００５９】
このように、測定質量を判定基準と照らし合わせて比較することによる移植判定方法では、実施例１（培養容器ごとの質量）、実施例２（培養組織での質量）及び、実施例３（細胞及び基質質量）のいずれでも、容易に移植適性を判定することができ、適切な判定基準を容易に設定することができる。
【００６０】
また、判定基準の設定としては特定の質量を設定しなくとも、培養０日目の質量に対する変化量を判定基準とすることもできる。例えば、測定質量が培養０日目の質量に対して２００％以上となった時点を適性基準する等である。これにより、培養開始時における播種密度等の多少の誤差を気にすることなく、適切な判定基準を設定することができ、適切な適性判定を容易に行うことができる。培養０日目の質量測定は、培養中あるいは培養後の培養組織の測定状態と同様になるように、混合液がゲル化した後、培地を一度加え、その培地を除去した状態で測定することが好ましい。これにより、培養組織に保持される水分等を加味した状態で測定でき、培養中あるいは培養後の培養組織の測定状態と同様な状態で測定することができる。
【００６１】
以上のことから、播種密度、培養条件等に基づいて、移植用組織としての培養軟骨組織の適切な質量値あるいは質量変化値を予め設定しておくことによって、組織断面像を確認することなく、質量あるいは質量変化のみによって移植適性を検査することができ、熟練者でなくとも容易に移植適性を判定することができる。さらに、培養容器ごと質量を測定することによって、非接触で培養組織の質量を測定することができるので、汚染等の心配が軽減される。
【００６２】
また、培養組織の質量を経時的に測定することによって培養組織の細胞増殖及び基質産生の状態を得ることができ、測定質量に応じて、培養期間を調整したり、培地交換時期、培地種類、培養温度等の培養条件を調整したりすることによって、細胞の増殖速度や、基質の産生状態を制御し、所望の状態の培養軟骨組織を安定して得ることができ、また、培養組織の品質を容易に管理することができる。
【００６３】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、培養組織の質量を測定することによって、培養組織の移植適性を客観的に且つ効率よく判定することができる。また、培養組織の質量を測定することによって、客観的な基準により容易に且つ効率よく培養組織の品質を管理でき、さらに、移植適性を有する高い品質の培養組織を安定して提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例に係る培養軟骨組織の質量の経時変化を示すグラフである。
【図２】（ａ）は培養７日目、（ｂ）は培養１４日目、（ｃ）は培養２１日目、（ｄ）は培養２８日目及び（ｅ）は培養３５日目の、本発明の実施例に係る培養軟骨組織の断面の染色像である。
【図３】本発明の実施例に係る担体のみの質量と、培養組織及び担体の質量との双方の経時変化を示すグラフである。
【図４】図３における培養組織の総質量から担体質量を減算することにより得た細胞＆基質の質量変化のグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for determining the transplantability of a cultured tissue. Law And a method for producing a cultured tissue.
[0002]
[Prior art]
In recent years, regenerative medicine and tissue engineering, in which human tissue is reconstructed by cell culture in vitro (in vitro) and the reconstructed cultured tissue is applied to the living body, have attracted attention.
[0003]
When a cultured tissue reconstructed by cell culture is applied to a living body, it is necessary to examine whether or not the cultured tissue is appropriate as a tissue for transplantation. As one method for determining such transplantation aptitude, it is conceivable to use a staining method in which a substrate component produced from cells during culturing is dyed with a staining agent and an inspection is performed based on the staining state. For example, in the case of cartilage tissue, acidic mucopolysaccharide, which is a chondrocyte production substrate, can be stained with Alcian Blue, so that it can be determined whether or not it is an appropriate culture tissue for transplantation based on the stained state. Can be used.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, quantitative measurement information cannot be obtained in the inspection by the staining method, and since the staining state varies depending on the staining conditions such as the staining time, it is difficult to compare the data, and experience and skill are required for the inspection judgment. The In addition, since a plurality of test tissue pieces are separately required for the test, it is necessary to prepare many culture tissues of the same lot as the test tissues separately from the transplanted culture tissues.
[0005]
In addition, even if the cultured cells have the same culture period, the growth ability differs depending on the age of the harvester (donor), and the state of cell growth differs depending on the seeding density. It may be difficult to supply a stable cultured tissue. In such a case, the operator performs microscopic observation etc. every predetermined culturing time, grasps the culturing state of each culturing tissue, and adjusts the culturing according to each culturing state. Has gained stability. However, since these methods require a series of operations, the burden on the workers is great.
[0006]
In view of the above-described problems of the prior art, the present invention can objectively and efficiently determine the transplantability of a cultured tissue, and efficiently and stably supply a cultured tissue with an objective standard. To determine transplantability of cultured tissue Law And providing a manufacturing method.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The method for determining the appropriateness of transplantation of the cultured tissue of the present invention comprises: The mass of cultured cartilage tissue cultured in vitro by the collagen gel embedding method is measured by gravimetry, and the measurement result is compared with a preset standard of transplantability, and the transplantability of cultured cartilage tissue is based on the comparison result. It is characterized by determining.
[0008]
The method for determining the appropriateness of transplantation of the cultured tissue of the present invention is as follows. Measure the mass of cultured cartilage tissue cultured in vitro by collagen gel embedding method multiple times, calculate the mass change rate obtained from the measurement result, and compare the mass change rate with the preset criteria for transplantability Based on the comparison results, the transplantability of cultured cartilage tissue It is characterized by determining.
[0009]
The method for producing a cultured tissue having transplantability according to the present invention comprises: A culture step of culturing cartilage tissue in vitro by a collagen gel embedding method, a measurement step in which the mass of the cultured cartilage tissue is measured at least once by gravimetry during the culture step, and the measurement step and preset transplantability A comparison step for comparing the criteria of the above, and an adjustment step for adjusting at least one of the culture period and the culture conditions in the culture step based on the comparison result, It is characterized by including.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The transplantability determination method and the quality control method of the cultured tissue of the present invention each determine the transplantability based on the mass of the cultured tissue or manage the quality, and the cultured tissue having the transplantability of the present invention This manufacturing method includes measuring the mass of the cultured tissue at a predetermined time.
[0011]
In cultured tissues, cells are grown under appropriate culture conditions after seeding of the cells, whereby the cells proliferate and produce a substrate such as an extracellular matrix. Such cultured tissues have different growth rates and growth rates depending on the growth capacity of the underlying cells, especially the age of the donor, and the state of the cultured tissues varies even during the same culture period. Since the state is reflected in the mass, the culture state can be known by measuring the mass. For this reason, it can be determined from the measured mass whether it is the state which can be transplanted suitable objectively and efficiently, and quality can be managed. In addition, since the cultured tissue is manufactured while managing the quality based on the mass, it is possible to reliably provide a cultured tissue with stable quality.
[0012]
Here, the “mass of the cultured tissue” mainly means the mass of the tissue itself cultured in the growth medium. That is, the cultured tissue is mainly composed of cultured cells, a substrate, and components (water and ions) held by the substrate. In addition to the mass of the cultured tissue itself, In addition to the cultured tissue itself, such as an attached and / or infiltrated medium, the mass of the cultured tissue itself or the mass of the cultured tissue itself is included in the case where the mass of another factor that has less influence is added. In the present invention, the mass of the cultured tissue can be directly obtained by measuring the cultured tissue itself, but the mass of the cultured tissue can also be indirectly obtained by various measurement methods as described later. In the present invention, the same effect can be obtained regardless of the direct or indirect measurement.
[0013]
The cultured tissue in the present invention is reconstructed by in vitro culture, and is a cultured tissue in which a tissue regeneration carrier is combined with cells and / or substrates. Is used. The cell type is chondrocyte Use . As the culture medium (medium) used for culturing the cells, any known medium corresponding to the cell type can be selected. In cultured tissue in which a tissue regeneration carrier is combined with cells and / or substrates, chondrocytes Or this It is preferable to use progenitor cells or mesenchymal stem cells.
[0014]
As a tissue regeneration carrier applicable here, From the viewpoint of biocompatibility and bioabsorbability, collagen Use This acts as a scaffold for cell proliferation.
[0015]
The mass of the cultured tissue can be measured using a conventional method. For example, the mass can be substantially measured by measuring the weight of the cultured tissue. In this case, an electronic balance capable of accurately measuring even a minute amount is preferable, and commercially available products from various manufacturers can be used.
[0016]
The mass of the cultured tissue is preferably measured aseptically. Moreover, it is preferable to measure the mass of the cultured tissue in a state where it is put in the culture vessel because the cultured state can be known without contact. In such a case, the mass of the culture vessel may be substantially calculated by correcting the mass of the culture vessel. Thus, by measuring in the state put in the culture container, the contamination with respect to culture tissue can be prevented. Further, since the cultured tissue itself used for transplantation can be inspected, it is not necessary to separately prepare a cultured tissue for inspection.
[0017]
Next, the method for determining transplantability according to the present invention will be described.
The determination of transplantability is performed by setting an aptitude standard that is a reference mass in advance and comparing the measurement result with the aptitude standard. This makes it possible to easily determine based on an objective standard such as mass, and to directly determine the target cultured tissue, so that it is necessary to prepare a cultured tissue for examination separately. Therefore, it is possible to efficiently determine the transplantability of the cultured tissue.
[0018]
The aptitude for transplantation of the cultured tissue is determined by setting the mass when the cells are sufficiently proliferated and producing a sufficient amount of substrate, or the rate of mass change until such a state is reached. It can be. From the standpoint of standardization and more efficient determination of transplantability, it is preferable to use the mass change rate as an appropriate standard. Since the suitability criteria vary depending on the cell type and culture conditions, it is necessary to set in consideration of the cell seeding conditions, the type of carrier, the amount of carrier installed, the mass of the culture vessel, the amount of medium, and the like.
[0019]
This suitability criterion is preferably set based on experimentally obtained mass data. In the case of chondrocytes cultured by the collagen embedding method, for example, 2 × 10 ⁶ When culture is performed at a seeding density of 1 / ml, the suitability criterion is 1.0 to 10.0 times, preferably 1.5 to 5.0 times the mass at the start of culture. In the case of epidermal cells cultured by the feeder layer culture method, for example, the bottom area of the culture flask is 150 cm. ² When the number of layers is about 2 to 6 layers, the weight of the epidermal cell tissue is about 850 mg, which can be used as an appropriate standard. A cultured tissue that exceeds the aptitude criteria set in this way can be determined to be transplantable.
[0020]
When culturing a cultured tissue using a carrier, even if the number of cells and the mass due to substrate production increase, the total mass of the cultured tissue decreases if the mass reduction rate of the cultured tissue due to the decomposition of the carrier is large. Since this can also occur, the term “mass rate of change” includes both cases where the mass of the cultured tissue increases and decreases.
[0021]
For comparison with the aptitude standard, it is preferable to use a result measured under the same conditions as the aptitude standard measuring method. For example, when what was measured with a culture container is applied as an aptitude standard, it compares with the measurement result measured with the culture container.
[0022]
Next, the quality control method for cultured tissue of the present invention will be described.
As described above, since the mass of the cultured tissue changes due to proper culture, the mass of the cultured tissue can be measured, and the culture state at the time of measurement can be grasped based on the measurement result. Thus, the quality of the cultured tissue can be managed so that the cultured tissue having transplantability can be provided in an appropriate state based on the specific and objective suitability criteria of mass.
[0023]
Here, “quality of cultured tissue” means that it has a requirement for efficient engraftment after transplantation or efficient tissue regeneration in the transplanted individual, and “having transplantability”. Says that it has such ability.
[0024]
In addition, here, “quality control of cultured tissue” means that the number of cells and / or the basic mass in the cultured tissue is within a predetermined range in relation to the provision time in order to be able to provide a cultured tissue having transplantability. Say to adjust. This quality control of the cultured tissue means, on the one hand, that only the cultured tissue having transplantability is selected when the cultured tissue is provided (shipped), and on the other hand, the culture state in the culturing process is grasped and cultured. It means that the state of the cultured tissue is controlled by adjusting the period and culture conditions. Thereby, the culture tissue provided can always be maintained at a constant quality. As will be described in detail below, such quality control is to determine the suitability of transplantation suitability of cultured tissue during culture, and whether it is suitable for being put on the market according to the grasped state of the cultured tissue. Examples of such operations include determining whether or not, and adjusting various factors related to culture (medium composition, culture period, etc.) to control the state of the cultured tissue.
[0025]
The quality control of the cultured tissue is performed by measuring and monitoring the mass of the cultured tissue in substantially the same manner as the above-described transplantability determination method.
In addition to the above-mentioned criteria, a reference mass aging curve showing a change in mass over time according to the lapse of the culture period is prepared, and this reference mass aging curve is used as a temporal judgment criterion. Good. In this case, the quality can be controlled so that the culture state is grasped according to the amount of deviation between the reference mass change curve and the mass at a predetermined time, and the cultured tissue is provided at an appropriate time.
[0026]
In the quality control of the cultured tissue, the quality of the cultured tissue can be controlled by measuring the mass immediately before provision. In this case, since only the cultured tissue having transplantability can be selected, it is possible to reliably provide only the cultured tissue having transplantability.
[0027]
It is also possible to predict the number of cells and / or the basic mass by measuring mass at any time after the start of culture, and to manage the quality of the cultured tissue based on this prediction. That is, from the mass measured at a specific time after the start of culture, the proliferation rate of the cells constituting the cultured tissue can be ascertained, and based on the ascertained proliferation rate, the subsequent number of cells and / or the basic mass The amount of increase can be predicted. For this reason, based on this prediction result, the quality of a culture tissue can be managed so that the culture tissue which has a transplantability can be provided.
[0028]
The quality control of the cultured tissue is preferably performed by measuring the mass at least once after the start of the culture and adjusting at least one of the culture period and culture conditions of the cultured tissue based on the measurement result. Thereby, the quality of cultured tissue can be stabilized more efficiently.
[0029]
Measurement of the mass of cultured tissue for quality control can be performed at any time after the start of culture, but in order to appropriately perform quality control and efficiently provide a cultured tissue having transplantability, the measurement results Based on the above, it is preferably performed at a time when the culture period and culture conditions can be adjusted appropriately. For this reason, since the growth rate varies depending on the cell type, the seeding density, and the like, it is preferable to set the measurement time according to individual cases.
[0030]
The measurement of the mass of the cultured tissue in quality control may be performed at least once after the start of culture. By measuring at least once after the start of culturing, the state of subsequent mass change can be predicted from the obtained mass, and the quality of the cultured tissue can be managed based on this prediction. From the viewpoint of more accurately and appropriately managing the quality of the cultured tissue, it is preferable to measure multiple times over time.
[0031]
The number of mass measurements for quality control and the interval between measurement periods are preferably set for each cell type and / or culture method in consideration of the growth rate of individual cells, the type of substrate and the production rate. .
For example, in the case of the collagen gel embedding method of chondrocytes, since the culture period is about 4 weeks, a sufficient amount of cells proliferate and a sufficient amount of substrate is produced in the first measurement. It is preferable to carry out the measurement, for example, around the 14th day, and to carry out the intervals between the subsequent measurement periods from 3 days to 1 week from the viewpoint of cell growth and substrate production rate.
On the other hand, in the case of the feeder layer culture method of epidermal cells, since the culture period is about 1 to 2 weeks, accurate data can be obtained if the measurement time interval is about 1 to 3 days.
[0032]
The culture period and the culture conditions are adjusted by adjusting the shipping time by shortening the culture period or by adjusting the culture conditions such as the medium replacement time, the medium type, and the culture temperature. Either adjustment of the culture period and adjustment of the culture conditions may be performed, or a combination of these may be performed.
[0033]
The adjustment of the culture period is performed by extending the culture period when it falls below the set aptitude standard and shortening the culture period when it exceeds the aptitude standard. In addition, although depending on the cell type, a correlation between the deviation from the aptitude standard and the culture period can be set in advance, and the length of the culture period can be uniformly determined from the magnitude of the deviation from the aptitude standard. The adjustment of the culture period according to the amount of deviation from the reference mass value is preferably set for each cell type and / or culture method in consideration of the growth rate of individual cells. For example, in the case of culturing by the collagen embedding method of chondrocytes, when measured at a time when the culturing period can be adjusted efficiently, the culturing period is extended by 20 to 70% if it is 10 to 50% less than the aptitude standard. Then you can decide.
[0034]
For example, if you want to promote culture, you can activate cell growth by changing the type and components of the medium, such as adding growth factors, etc. The method of, etc. can be considered. On the other hand, when it is desired to delay or stagnate the culture, methods such as using a storage medium commercially available from various manufacturers or storing at a low temperature at which cell activity is low can be considered.
[0035]
Next, the manufacturing method of the cultured tissue of this invention is demonstrated.
The method for producing a cultured tissue includes measuring the mass of the cultured tissue after a predetermined time from the start of the culture. Since the mass of cultured tissue increases due to cell growth and substrate production, measuring the mass of cultured tissue in the same manner as described above enables efficient and appropriate measurement even if the growth rate of individual cultured tissues is different. A cultured tissue having transplantability can be produced reliably at the time of provision.
[0036]
Unless otherwise specified, the measurement of the mass of the cultured tissue in the method for producing a cultured tissue having transplantability can be performed in substantially the same manner as the above-described transplantability determination method and quality control method for cultured tissue.
[0037]
The mass of the cultured tissue may be measured at least once after the start of culture, or may be measured only once at the end of the culture. In order to reliably provide a cultured tissue having transplantability, it is preferable to measure the mass of the cultured tissue multiple times over time.
[0038]
The mass of the cultured tissue can be measured at any time after the start of the culture, but from the viewpoint of reliably providing a cultured tissue having transplantability, the time when cell growth and substrate production are performed stably For example, in the case of the collagen gel embedding method of chondrocytes, the measurement should be performed after 14 days from the start of the culture, and in the case of the feeder layer culture method of epidermal cells, the measurement should be performed after 2 days after the start of the culture. Is preferred.
[0039]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to an example of cultured cartilage tissue reconstructed based on chondrocytes.
[Example 1]
<Production of cultured cartilage tissue>
Articular cartilage was collected from the knee, crotch, shoulder, and elbow joints of Japanese white rabbits and subjected to enzyme treatment with trypsin EDTA solution and collagenase solution to separate and collect chondrocytes. After washing the obtained chondrocytes, DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) containing 10% FBS (fetal bovine serum) was added, and the cell density was 1 × 10. ⁷ A cell suspension was prepared so that the number of cells / ml was reached. The cell suspension and 3% atelocollagen implant (manufactured by Koken Co., Ltd.) were mixed at a ratio of 1: 4 to prepare a cell-collagen mixture. By this mixing process, 1 × 10 ⁷ The cell density, which was 1 cell / ml, was 2 × 10 ⁶ Dilute to pieces / ml. 100 μl of this cell-collagen mixture was mounted on a culture dish. However, FIG. 1 described later shows a case where 1 ml is mounted.
[0040]
Mounted mixture is 37 ° C, 5% CO ₂ The mixture was allowed to stand for 0.5 to 1 hour under the above conditions for gelation, a medium was added, and culture was started. As the medium, 10% FBS-DMEM containing 50 μg / ml ascorbic acid and 100 μg / ml hyaluronic acid was used. ₂ Cultivation was performed for 5 weeks under the conditions.
[0041]
<Determining transplantability>
In the examination of transplantability, the medium in the dish is sucked with an aspirator, and the measurement is performed with a weight measuring instrument (scale) while the cultured tissue is placed in the dish. An electronic balance (manufactured by METTLER TOLEDO) capable of accurate measurement even with a minute amount was used for the weight measuring instrument in this example. The mass values described below explain the measured weight value as a substantial mass value.
[0042]
FIG. 1 is a graph showing changes with time in the mass of cultured cartilage tissue. The mass is shown in units including the mass of the culture vessel (dish). In FIG. 1, the mass change with time of two samples (No. 1 and No. 2) is plotted. C. As shown. FIG. 2 is an observation image obtained by observing a stained image in which a cross section of cultured cartilage tissue is stained with Alcian blue over time. Show.
[0043]
As is clear from FIG. 1, it can be observed at a glance that the mass of the cultured cartilage tissue gradually increases as time elapses from the start of culture. From FIG. 2, it can be observed that the cells and production matrix of the cultured cartilage tissue increase with the passage of the culture days. From the relationship with FIG. As you can see it can be caught.
[0044]
In FIG. 2, the cultured tissue after the 21st day of culture (see FIGS. 2 (c) to 2 (e)) has a sufficient cell layer and substrate layer developed on its surface. Engrafts early, has a low possibility of falling off, and has sufficient transplantability.
[0045]
Based on this, for example, the approximate curve A. C. If the determination criteria are set based on the approximate curve A. on the 21st day of the culture, which is sufficient for transplantation. C. Indicates approximately 25.1 g (including dish), so that the reference mass serving as a criterion is 25.0 g, and the measured mass (including dish) of the cultured cartilage tissue prepared by the above procedure exceeds 25.0 g Therefore, it can be determined that it has transplantability.
[0046]
Thus, even if it is not an expert, transplantability can be easily determined by setting the mass as a threshold value when the cultured tissue produced under predetermined conditions satisfies transplantability.
[0047]
<Quality control>
Approximate curve A. C. Is the criterion for the growth of the culture, and the mass of the cultured tissue in a certain number of culture days is the curve A. C. If the mass is not satisfied, for example, by adding a growth growth factor to the medium or shortening the medium exchange interval, cell proliferation and substrate production are promoted, and the desired culture is performed in a predetermined number of culture days. Can be adjusted to get the tissue.
[0048]
Conversely, the measured mass of the cultured tissue is the curve A.I. C. If the standard is greatly exceeded, for example, a desired culture tissue can be obtained at a predetermined time by delaying or stagnation of cell growth and substrate production by using a storage medium or storing at a low temperature. It is possible to adjust to.
[0049]
In the above example, the curve A. C. Is determined as a boundary, but the determination criterion has a width, for example, the curve A. C. The culture condition may be adjusted as described above within a range where the region of ± 0.1 g is a predetermined reference and the region is moved up and down.
[0050]
Thus, the quality at the time of shipment can be stabilized by adjusting the culture conditions, the culture period, and the like by measuring the mass change of the cultured tissue over time and comparing it with a criterion such as a mass curve.
[0051]
Furthermore, when the measured mass is lower than the criterion, the quality at the time of shipment can be stabilized by adjusting the number of days of culture until shipment according to the degree. On the contrary, if the measured mass is much larger than the criterion, it can be shipped earlier than the standard number of culture days.
[0052]
[Example 2]
Example 2 is another example using two cultured cartilage tissues produced by the same method as in Example 1.
FIG. 3 is a graph showing the change over time of the mass of the carrier (collagen gel 100 μl) and the change over time of the mass of the cultured tissue in a state where cells are not seeded. However, in FIG. 3, unlike FIG. 1, the mass of only the carrier and the cultured tissue is shown by subtracting the mass of the culture vessel (dish) from the total mass. A sample containing only a collagen gel carrier was prepared according to the method for preparing a cultured tissue in order to make the collagen concentration similar to that of the cultured tissue. Specifically, a mixed solution in which DMEM containing 10% FBS and 3% atelocollagen implant were mixed at a ratio of 1: 4 was mounted on a culture dish and gelled.
[0053]
In FIG. 3, black circles and black triangles indicate the mass of the cultured tissue, and black diamonds and black squares indicate changes in mass of the carrier alone. The dotted lines in the figure indicate approximate curves for the average values of the cultured tissue and the carrier mass.
[0054]
While the mass of the cultured tissue increases, it can be seen that the mass of the collagen gel carrier alone decreases with time. This is probably because the collagen gel is gradually eluted in the liquid medium. Although the mass of the collagen gel as a carrier in the cultured tissue can be reduced by elution, the ratio of elution is reduced compared to the case of the carrier alone because the surface of the cultured tissue is covered with the production substrate. The mass of the cultured tissue decreases with the decrease in the mass of the carrier until around the 11th day of culture, but thereafter the mass gradually increases.
[0055]
In FIG. 3, for example, the suitability for transplantation is determined by the mass of the cultured tissue being a predetermined magnification with respect to the mass of the collagen gel carrier alone. For example, a determination criterion corresponding to a mass change rate at which cell growth reaches a plateau state is set. In the case of FIG. 3, if the criterion is that the mass of the cultured tissue is 200% relative to the mass of the carrier, it can be determined that the transplantability is favorable for the cultured tissue after the 21st day of culture. . The plateau state in the present embodiment refers to a state in which the number of cells is substantially constant and cell growth is hardly performed.
[0056]
Similarly to FIG. 1, a threshold mass is provided as a determination criterion, and the determination is made based on whether the mass of the cultured tissue exceeds the threshold. Further, the culture period and culture conditions are adjusted by measuring the change with time. In this case, it is preferable to measure after the 11th day of culture when mass change occurs due to cell proliferation.
[0057]
[Example 3]
In Example 3, the measurement result of Example 2 is processed in another format.
FIG. 4 is a graph of mass change obtained by subtracting the carrier mass from the cultured tissue mass in FIG. The mass obtained in this case indicates the mass of the cell, the production substrate and the components (for example, water and ions) retained on the substrate. The black circle in the figure is a value obtained by subtracting the average value of the carrier mass (average value of the black diamond and the black square) from the black circle in FIG. 3, and the black triangle is the carrier from the black triangle in FIG. The value obtained by subtracting the mass average is shown. These values can be assumed to be substantial cell growth and mass increase due to production substrate. The dotted line in the figure shows the approximate curve by the average value of the black circle and the black triangle.
[0058]
Also in FIG. 4, as in the case of FIG. 1, the aptitude of transplantation is easily determined by setting a mass serving as a threshold as an aptitude reference in advance. In the graph of change in cell and substrate mass in FIG. 4, when 0.1 g at which the growth of the chondrocytes becomes a plateau is set as a threshold, both the black circle and the black triangle are used for transplantation on the 21st to 26th days from the start of culture. It can be determined that it is ready to be used as cultured cartilage tissue. In addition, with the dotted line in the figure as a criterion, the culture period and culture conditions can be adjusted based on the change in mass over time.
[0059]
Thus, in the transplantation determination method by comparing the measured mass against the determination criteria, Example 1 (mass for each culture vessel), Example 2 (mass in the cultured tissue), and Example 3 (cells) And the mass of the substrate), the suitability for transplantation can be easily determined, and an appropriate determination criterion can be easily set.
[0060]
In addition, as a determination criterion, a change amount with respect to the mass on the 0th day of culture can be used as a determination criterion without setting a specific mass. For example, the suitability criteria may be used when the measured mass reaches 200% or more with respect to the mass on the 0th day of culture. Thereby, an appropriate determination criterion can be set without worrying about some errors such as the seeding density at the start of culture, and an appropriate aptitude determination can be easily performed. Mass measurement on day 0 of culture should be performed with the medium added once and the medium removed, after the mixture has gelled, so that it is the same as the measurement state of the cultured tissue during or after culture. Is preferred. Thereby, it can measure in the state which considered the water | moisture content etc. which are hold | maintained at culture tissue, and can measure in the state similar to the measurement state of the culture tissue during culture | cultivation or after culture | cultivation.
[0061]
From the above, based on the seeding density, culture conditions, etc., by setting an appropriate mass value or mass change value of the cultured cartilage tissue as a transplant tissue, without confirming the tissue cross-sectional image, Transplantability can be inspected only by mass or mass change, and transplantability can be easily determined without being an expert. Furthermore, since the mass of the cultured tissue can be measured in a non-contact manner by measuring the mass of the entire culture container, the concern about contamination and the like is reduced.
[0062]
In addition, by measuring the mass of the cultured tissue over time, the state of cell growth and substrate production of the cultured tissue can be obtained, and according to the measured mass, the culture period can be adjusted, medium replacement time, medium type, By adjusting the culture conditions such as the culture temperature, the growth rate of the cells and the production state of the substrate can be controlled to stably obtain the cultured cartilage tissue in the desired state. Can be managed easily.
[0063]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, the transplantability of the cultured tissue can be objectively and efficiently determined by measuring the mass of the cultured tissue. In addition, by measuring the mass of the cultured tissue, the quality of the cultured tissue can be managed easily and efficiently according to an objective standard, and a high-quality cultured tissue having transplantability can be stably provided. .
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing a change with time of mass of cultured cartilage tissue according to an example of the present invention.
FIG. 2 (a) is 7 days of culture, (b) is 14 days of culture, (c) is 21 days of culture, (d) is 28 days of culture, and (e) is 35 days of culture. It is a dyeing | staining image of the cross section of the cultured cartilage tissue based on the Example of this invention.
FIG. 3 is a graph showing changes over time in both the mass of the carrier alone and the mass of the cultured tissue and the carrier according to an example of the present invention.
4 is a graph showing a change in mass of cells and substrates obtained by subtracting the carrier mass from the total mass of the cultured tissue in FIG. 3. FIG.

Claims

A method of determining the transplant characteristics of cultured cartilage, the mass of the culture cartilage tissue cultured in vitro in collagen gel embedded method was determined gravimetrically, comparing the reference preset implanted suitability with the measurement result and, determining the transplant suitability of culture cartilage based on the comparison result, transplant suitability judgment method for culturing cartilage tissue.

A method for determining the transplantability of cultured cartilage tissue, measuring the mass of cultured cartilage tissue cultured in vitro by a collagen gel embedding method, calculating the mass change rate obtained from the measurement result, and calculating the mass comparing the reference rate of change between preset implanted suitability determines transplant suitability of culture cartilage based on the comparison result, transplant suitability judgment method for culturing cartilage tissue.

A method for producing cultured cartilage tissue, a culture step of in vitro culture of cartilage tissue by a collagen gel embedding method, a measurement step of measuring the mass of the cultured cartilage tissue at least once by gravimetry during the culture step, A comparison step for comparing the measurement step with a preset standard for transplantability , and an adjustment step for adjusting at least one of a culture period and a culture condition in the culture step based on the comparison result. A method for producing cultured cartilage tissue.