JP4742882B2

JP4742882B2 - 細胞電気生理センサおよびその製造方法

Info

Publication number: JP4742882B2
Application number: JP2006017118A
Authority: JP
Inventors: 将也中谷; 浩司牛尾; 聡一郎平岡
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2006-01-26
Filing date: 2006-01-26
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2026-01-26
Also published as: JP2007198876A

Description

本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサに関するものである。

従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネル機能を測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。

このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。

例えば、２つの領域を分離するキャリアに穴を有し、このキャリアの上下に設置した電極によって電界を発生させることで細胞を穴に効率よく保持し、上下の電極間で電気的測定を行うことで細胞の電気生理的測定を可能にしたり（特許文献１参照）、平板のデバイスに複数の貫通孔を設け、ここに接着した細胞の連続層を含み、電極で電位依存性のイオンチャンネル活性を測定する技術などが開示されている（特許文献２参照）。

また、基板に複数設けたキャビティの内部にそれぞれ設けたマイクロエレメントと、このマイクロエレメントにつながる流路を減圧することにより細胞をマイクロエレメントに引きつけて、細胞の電気生理現象を測定する技術（特許文献３参照）、基板の平面部に穴を設け、基板に基準電極および測定電極が一体化されていることにより、細胞の電気生理現象を測定する技術（特許文献４参照）、一つのチャンネルが貫通している表面に、細胞の下面から吸引して位置決めした後、圧力差を増大させて細胞の下面一部を破裂させることにより、液体中に含まれる細胞の測定を行う方法（特許文献５参照）について開示している。

さらに、使用時に物体がオリフィスをシールし、これによって電気的に絶縁された第一および第二の空洞部が形成されるように構成し、第一および第二の空洞部にそれぞれ設置された電極間のインピーダンスの変化によって、媒体中の物体の電気的測定を行う装置（特許文献６参照）について開示している。

また、基板の上に設けられた細胞保持手段を備えたウエルと、このウエルの電気信号を検出する測定用電極と、基準電極とを備えた細胞外電位測定用デバイスによって細胞外電位を測定する技術（特許文献７参照）を開示している。

ＳｉＯ₂のメンブレンの内部に設けた２．５μｍの穴に、ヒト培養細胞株の一種であるＨＥＫ２９３細胞を保持させて高い密着性を確保して高精度に細胞外電位を測定する技術（非特許文献１参照）を開示しており、これは平板に作成された貫通孔はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、平板の裏面側からの吸引などの方法により細胞が自動的に引きつけられ、細胞を容易に保持できるという利点を有している。

また、オリフィスに物体をシールさせて、これによって電気的に絶縁された空洞間の電極インピーダンスを測定することによって、物体の状態変化を検出する装置について開示されており、物体が置かれている液体環境を迅速に除去・交換するために液体供給毛細管と液体吸引毛細管を備えた液体供給手段についても開示している（特許文献８参照）。
特表２００２−５０８５１６号公報特表２００２−５１８６７８号公報米国特許第６３１５９４０号明細書特表２００３−５１１６６８号公報特表２００３−５１１６９９号公報特表２００３−５２７５８１号公報国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット特表２００３−５２７５８１号公報Ｔ．Ｓｏｒｄｅｌｅｔａｌ，ＭｉｃｒｏＴｏｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍｓ２００４，Ｐ５２１〜５２２（２００４）

しかしながら、前記従来の構成では、細胞を高い密着性によって保持することで、細胞内外で発生する電位差を高精度に測定する細胞電気生理センサの細胞保持部に関する技術について開示されたものはあるものの、この細胞電気生理センサの効率的な生産を実現するための構成についてほとんど開示されていない。

本発明は、生産性に優れた細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現することを目的とするものである。

前記従来の課題を解決するために、本発明は、第一の貫通孔を設けた薄板と、この薄板の周囲に設けた支持体と、第二の貫通孔と電極パターンを設けた枠体基板とからなる細胞電気生理センサであって、第二の貫通孔の内部に支持体を設置する際、支持体の外形の大きさが収縮する機能を設けて、前記支持体の外形より小さな第二の貫通孔の内部に嵌合して設置した構成とするものである。

本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、枠体基板への薄板および支持体によって構成される微少な形状を有するセンサチップのマウントが容易で、且つ確実な設置を実現できることから、特に効率よく生産することができる細胞電気生理センサおよびその製造方法を提供することができる。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサについて、図面を参照しながら説明する。

図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの上面図であり、図２はその断面図であり、図３は分解断面図である。また、図４はセンサチップの上面図であり、図５はその断面図であり、図６は別の例のセンサチップの上面図である。

図１〜図３において、１はシリコンなどの加工性に優れた基板からなる薄板であり、内部に少なくとも一つの第一の貫通孔２を形成しており、この薄板１の周囲にはシリコンなどの加工性に優れた材料からなる支持体４が接合手段によって一体化している。そして、５は樹脂などの成型性に優れた枠体基板であり、この枠体基板５の内部には第二の貫通孔６を形成しており、この第二の貫通孔６の内部へ薄板１および支持体４からなるセンサチップをマウントしている。

また、前記枠体基板５には第一の電極７および第二の電極８をセンサチップを中心として対向配置するように設けており、これらの電極７，８によって薄板１で仕切られた領域間の電位や電流を測定することができる構成となっている。

なお、第一の電極７は第一の電極パターン１２に接続しており、第二の電極８は枠体基板５のスルホール電極１１を介して枠体基板５の上面に設けた第二の電極パターン１３に接続している。また、薄板１の上下の空間に培養液あるいは薬液などを貯留するために、それぞれ第一の容器９および第二の容器１０を接合して設けている。

以上のような構成を有する細胞電気生理センサにおいて、図３に示す組み立て前において、第二の貫通孔６の内径は薄板１および支持体４の外形よりわずかに小さく設計している。そして、図４に示すように支持体４の一端には薄板１を設けた支持体４の他端に向かってスリット３を複数形成している。このような複数のスリット３を設けた支持体４の構造によって、図２および図３に示すように支持体４および薄板１を第二の貫通孔６の内部へ嵌合したとき、支持体４は複数のスリット３が第二の貫通孔６の形状に沿って収縮することができるので、支持体４の外形より小さな第二の貫通孔６の内部へ確実に嵌合することによって固定している。

このような細胞電気生理センサは一般的に細胞の大きさは数μｍ〜数十ミクロンと微少な形状を有していることから、これに用いるセンサチップの形状もμｍレベルの寸法形状を有していることが多く、そのために寸法精度を高く維持したまま、容易に作製することができる細胞電気生理センサが非常に望まれており、本実施の形態１のような構成とすることによってその要望に応えることができる細胞電気生理センサおよびその製造方法を提供することができる。

また、図４に示したようにスリット３の形状を支持体４の中心に向かって放射状に形成している。これによって、スリット３の加工形成を容易に行うことができるとともに、支持体４は適度な強度を持ちながらスリット３を収縮することができる。

また、図５に示すように、センサチップに形成するスリット３の深さは支持体４の厚みより小さくすることが好ましい。これによって、機械的強度を維持したままバネ性を高めることができる。例えば、支持体４の厚みが５００μｍ程度の場合、スリット３の深さは２００〜４００μｍとすることが生産性の観点から好ましい。さらに、スリット３の幅は支持体４の内径に比べて十分小さくすることが好ましい。これによって、生産性の利点を高めることができる。例えば、支持体４の内径が約５００μｍの場合、スリット３の幅は５０μｍ以下とすることがセンサチップの保持強度の観点から好ましい。このような構造とすることによって、支持体４は適度なバネ性強度を持ちながらスリット３を変形収縮することができるとともに、後に述べる製造方法においても効率の良い生産性をもたらすことができる。

また、図６に示したように、スリット３の形状を支持体４の中心に向かって、渦巻き状に形成することによって、センサチップを渦巻き方向に回転させながら第二の貫通孔６の内部へ挿入嵌合するとき、容易にスリット３を収縮させながら支持体４を嵌合することができる。

次に、図７は別の例の細胞電気生理センサの分解断面図であり、図８はその断面図である。

図７および図８に示すように、第二の貫通孔６の内径を支持体４のスリット３側に行くに従ってテーパ状に小さくなるような形状とし、この第二の貫通孔６の内部へ薄板１および支持体４をマウントすることである。これによって、支持体４は確実に第二の貫通孔６の内部へ保持、密着されやすいことに加えて、支持体４を自動投入しやすいという製造上の利点を有する。

次に、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの製造方法について図面を用いて説明する。図９〜図１５は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの製造方法を説明するための断面図である。

まず、図９に示すように、シリコン基板１４の表面にレジストマスク１５を通常のフォトリソ工程によって形成する。

次に、図１０に示すようにエッチングによって第一の貫通孔２を形成する。なお、第一の貫通孔２の形状はエッチングの種類によって代えることができ、例えばＳＦ₆、ＣＦ₄などのエッチングを促進するガスとＣ₄Ｆ₈、ＣＨＦ₃などのエッチングを抑制するガスを混合したドライエッチングを行うことによって垂直にエッチング加工する。

なお、例えば図１１に示したようにＳＦ₆やＸｅＦ₂などのエッチングを促進するガスのみを用いてテーパ形状あるいは丸み形状としたり、あるいは図１２に示したようにこれらの組み合わせにすることもできる。このような形状の第一の貫通孔２を形成することによって細胞のサイズ、形状および細胞の表面の特性に合わせて、細胞の保持性およびシール性の高いセンサチップを作製することができる。

次に、図１３に示すようにシリコン基板１４の裏面にレジストマスク１８を形成した後、図１４に示すようにエッチングによってキャビティ１７およびスリット３を形成する。ここでは、薄板１と支持体４を一つのシリコン基板から加工して作製しているが、薄板１と支持体４を別々の工程で作製した後、それらを接合することによって作製することも可能である。このどちらの製造方法を採用するかについてはセンサ構造と生産性の観点から適宜、選択することによって最適な製造方法を選択することができる。

このとき、図１５に示すように上面から見たレジストマスク１８にはキャビティ１７を形成する開口部とスリット１９を形成する開口部が形成されているが、スリット１９の幅はキャビティ１７の開口部より十分に小さい形状としている。このことによって、シリコン基板１４をエッチングする際、スリット１９とキャビティ１７にはエッチングレートの差が生じ、キャビティ１７を所定の深さまでエッチングしてもスリット１９の深さは同じ深さとはならず、結果としてスリット１９は薄板１まで到達することはないので簡単にスリット１９をエッチングによって加工することができる。そして、このスリット１９は支持体４を収縮させる機能を有するとともに支持体４の強度も保つことができる。

なお、この時のエッチング方法としてはエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを混合して行うドライエッチングが好ましい。これによって、スリット１９とキャビティ１７のエッチングレートの差を大きくすることができ、効率の高い条件で生産を行うことができるという製造上の利点を有している。

次に、支持体４を枠体基板５の第二の貫通孔６の内部へ挿入して嵌合させた後、成型性に優れた高分子材料からなる第一の容器９および第二の容器１０を接合させることによって細胞電気生理センサを作製することができる。

なお、支持体４の外形は第二の貫通孔６の内径より大きいが、支持体４にはスリット１９が設けられているため、適度に収縮することができ、破壊されることなく、十分な強度を保ちながら固定設置することができる。

以上のように、本発明にかかる細胞電気生理センサおよびその製造方法は、細胞が発する物理化学的変化を電気的に検出することができる生産性に優れたセンサ構造およびその製造方法を実現することができることにより、例えばイオンチャンネルの薬剤に対する反応を高速に測定するための薬剤スクリーニング装置に用いるデバイスとして有用である。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの上面図同断面図同分解断面図同要部拡大上面図同断面図同別の例の要部拡大上面図同別の例の細胞電気生理センサの分解断面図同断面図同細胞電気生理センサの製造方法を説明するための断面図同断面図同断面図同断面図同断面図同断面図同上面図

符号の説明

１薄板
２第一の貫通孔
３スリット
４支持体
５枠体基板
６第二の貫通孔
７第一の電極
８第二の電極
９第一の容器
１０第二の容器
１１スルホール電極
１２第一の電極パターン
１３第二の電極パターン
１４シリコン基板
１５レジストマスク
１７キャビティ
１８レジストマスク
１９スリット

Claims

第一の貫通孔を設けた薄板と、この薄板の周囲に設けた支持体と、第二の貫通孔を設けた枠体基板とからなり、前記第一の貫通孔に細胞を保持してこの細胞の電気生理現象を電極により測定するための細胞電気生理センサであって、前記第二の貫通孔の内部に前記支持体を設置する際、前記支持体の外形の大きさが収縮する機能を設けて、前記支持体の外形の大きさが収縮する機能として、前記支持体に複数のスリットを設け、前記支持体の外形より小さな第二の貫通孔の内部に嵌合して設置した細胞電気生理センサ。
スリットの深さを支持体の厚みより小さくした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
スリットの形状を支持体の中心に向かって放射状とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
スリットの形状を支持体の中心に向かって渦巻き状とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
スリットの幅を支持体の内径より小さくした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
第二の貫通孔の内径をテーパ状とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
前記枠体基板に電極パターンを設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
第一の貫通孔を設けた薄板と、この薄板の周囲に設けた支持体と、第二の貫通孔を設けた枠体基板とからなり、前記第一の貫通孔に細胞を保持してこの細胞の電気生理現象を電極により測定するための細胞電気生理センサであって、前記第二の貫通孔の内部に前記支持体を設置する際、前記支持体の外形の大きさが収縮する機能を設けて、前記支持体の外形より小さな第二の貫通孔の内部に嵌合して設置した細胞電気生理センサの製造方法であって、前記支持体にその深さが前記支持体の厚みより小さく、その幅が前記支持体の内径より十分に小さいスリットを設けるステップを有しており、このステップがエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いたドライエッチングを用いて行う工程を含む細胞電気生理センサの製造方法。