JP5011961B2 - 細胞電気生理センサおよびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を観測するために用いられ、細胞内電位あるいは細胞外電位あるいは細胞膜通過電流等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサおよび製造方法に関する。

電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するタンパク質の機能の一つであるイオンチャネル機能を測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

このパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要である。これは、１個の細胞にマイクロピペットを挿入するために、顕微鏡による観測下で一つの細胞に狙いを定め、マイクロマニュピレータ等の手段により高精度にマイクロピペットの先端を細胞の膜表面に接触させる必要がある。従って、このパッチクランプ法は高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない（例えば、非特許文献１参照）。
新パッチクランプ実験技術法 岡田泰伸編 吉岡書店発行

しかしながら、前記従来の構成では、顕微鏡下において一つの細胞に高精度にマイクロピペットを挿入することに困難が伴うことにある。特に、パッチクランプ法で測定する細胞は、基本的には細胞が顕微鏡下で固定されたガラスプレートなどの基板に接着されている必要があり、浮遊性細胞の場合は何らかの手段により細胞を固定した状態にしてからでないと、細胞の表面にマイクロピペットを移動させて高精度に配置することが困難である。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、顕微鏡下でマイクロピペットの位置制御をする必要が無く、浮遊性の細胞であっても高い確率で細胞を保持することができ、パッチクランプ法と同等の高精度な信号を検出することができる細胞電気生理センサおよびその製造方法を提供することを目的とするものである。

本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、内部に空洞を有した筒部品と、この筒部品の空洞部内の一端または中間部に、薄板とこの薄板の周辺に前記薄板を保持する枠体からなるセンサチップとを備え、前記薄板の内部には少なくとも一つ以上の貫通孔が薄板の垂直方向に形成した構成とするものである。

本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、貫通孔が形成された薄板を持つセンサチップが、筒部品の内部に設置されているため、細胞を含む溶液および測定の際に要する溶液を、それぞれ、センサチップによって仕切られている筒部品の中空部に投入し、センサチップを挟み圧力差を発生させることで容易に細胞を薄板の貫通孔に密着させることができる。これによって、顕微鏡などを必要とすることなく、また高精度なマニュピレータ制御なども行う必要もなく、浮遊性の細胞であっても簡便な取り扱いのできる細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現することができる。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。

図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図、図２は上面図、図３は拡大断面図である。

図１〜図３において、１はガラスよりなる筒部品であり、この筒部品１の外径は図２に示したように円柱状で内部は中空構造をしている。この筒部品１の先端にはシリコンを主成分とする材料よりなるセンサチップ２が設置されており、このセンサチップ２は図３に示したように、シリコンを主成分とする材料よりなる薄板３とシリコンを主成分とする材料よりなる枠体４とから構成されており、薄板３には貫通孔５が少なくとも一つ設けられている。なお、このセンサチップ２は筒部品１の内壁部に隙間無く強固に固着している。これによって、センサチップ２は筒部品１の上部と下部を仕切るとともに、貫通孔５を通してのみ、上部と下部の空間が連通している。

また、センサチップ２が固着される場所は筒部品１の端部のみでなく、図４に示したように中間部であってもよい。この場合は、後に使用方法でも説明するが、センサチップ２の上下に溶液を入れることが容易になるという利点を有している。

次に、別の細胞電気生理センサの例について図５〜図７を用いて説明する。図５は本実施の形態１における別の例の細胞電気生理センサの構成を説明するための断面図、図６は下面図、および図７は拡大断面図である。

図５および図７に示したように、筒部品１の内壁に断面と平行方向に凸形状の段差部７を設けておくことによって、筒部品１の空洞内にセンサチップ２を挿入する際に所定の位置に容易に設置できるので生産性が向上する。また、図６に示したように段差部７を筒部品１の内壁面の溶液の流れ方向に沿って連続して形成しておくことによって、気泡の発生を抑制することができるとともに気泡の除去を効率良く行うことができる。そして、この凸形状の段差部７を設ける手段としては筒部品１がガラス管などの場合には内壁面に同材料のガラスからなる棒材８をあらかじめ溶着したり、筒部品１が樹脂の場合には金型で段差部７を成型する等の方法などを用いることが可能である。

次に、本実施の形態１における細胞電気生理センサの製造方法について図面を用いて説明する。

まず始めに、図８に示したようにガラス管として供給される筒部品１と、シリコンを主成分としてなるセンサチップ２を所定の位置に挿入する。なお、筒部品１は所定の寸法を有するガラス管を加工することによって作製することが可能であり、センサチップ２はシリコン基板などを用いて半導体製造プロセスによる微細加工技術を用いることによって微細な形状のセンサチップ２を高精度に一括して大量に作製することができる。

次に、筒部品１の内部にセンサチップ２を挿入した後、接着剤で固着させることでセンサチップ２は所定の位置に固着することができる。

ここで、図９に示したようにより好ましくはセンサチップ２を挿入した後、筒部品１を外周部から熱源６によって加熱する方法を用いることが好ましい。特に、筒部品１を構成する材料がガラス管などの場合、筒部品１が６００−７００℃以上に加熱されると、ガラスは溶融を起こし、センサチップ２の主材料であるシリコンと強固に固着する。これによって、筒部品１とセンサチップ２は接着剤等の異種材料を使うことなく、強固に隙間なく直接接着することができることから、接着剤による汚れ等の発生を心配する必要のない封止性の高い細胞電気生理センサを作製することができる。

なお、熱源６の種類としてはヒータ、赤外線、ガスバーナ等があるが特に限定するものでない。

また、本実施の形態１では筒部品１の材料はガラスとしたが、特にアクリル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、環状ポリオレフィンポリマー、および環状ポリオレフィンコポリマーのうち少なくともいずれか一つを主成分として含む熱可塑性樹脂を用いることも可能である。この材料を用いた場合において、ガラスの軟化温度より低い温度で熱可塑性樹脂を溶融させることができることから、製造工程において高温を使うことが好ましくない場合に有効である。

例えば、実験ではＴｇが１３０℃の環状ポリオレフィンコポリマーを用いて、１５０−２００℃で周囲を熱することでセンサチップ２と筒部品１を直接固着することができた。

なお、前記加熱工程によって、図９に示したように筒部品１の外形と内形は角部が丸められた形状としている。この外形の周辺部は丸くなることで、外観欠けが起こりにくくなり、また内形の角部を丸めた形状とすることによって、筒部品１の内形がセンサチップ２に近づいていくに従って小さくなることから、後で説明するようにセンサチップ２の下部に培養液あるいは薬液などの溶液を充填する際に気泡が残留することなく確実に充填できるという利点を有している。このセンサチップ２の下部の溶液に気泡が残留していると正確な測定ができないという課題を有しており、これを解決することができる。

次に、センサチップ２を筒部品１の内部へ効率よく挿入するための製造方法について詳細に説明する。図１０はセンサチップ２を筒部品１へ挿入する際に溶液２３（例えば水）とともに挿入した様子を示している。このように溶液２３は筒部品１内へ表面張力によって引き込まれ、同時にセンサチップ２を保持する。

その後、外部から加熱することによって筒部品１の溶融が起こり、図１１に示したようにセンサチップ２が固着されるのである。このとき、溶液２３としてはアルコール類などの親水性を有する液体を用いることによって同様の効果を発揮することができる。

次に、本実施の形態１における細胞電気生理センサを用いて、細胞の電気生理現象を測定する方法について図面を用いて説明する。図１２〜図１７は本実施の形態１における細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理現象を測定する測定方法を説明するための断面図である。また、図１８〜図２０は別の例による使用方法を説明するための断面図である。

まず始めに、図１２に示したように筒部品１の下部に細胞の電気生理現象を測定するために用いる溶液の１種である細胞内液９を投入する。ここで細胞内液９とは被検体細胞１９の内部を満たす溶液とほぼ同じ成分に調整された溶液であり、細胞の種類によって成分は変更されるがここでは詳細な説明は省略する。

なお、本実施の形態１のように筒部品１の内部が中空であり、センサチップ２の下部より垂直方向に細胞内液９が貯留される領域を有することで、細胞内液９を投入する際に内部に気泡が残留してしまうことが少なくなる。さらに、筒部品１の内形は角部が丸められて結果として筒部品１の内壁がセンサチップ２の方向に向かって狭くなっていることから、より細胞内液９を投入する際に内部に気泡の残留を抑制することができる。ここで、図７に示したように筒部品１の内壁に、断面と垂直方向な面に段差部７を形成した構成とすることで、細胞内液９の投入時において、段差部７の周辺部で気泡の抜け道ができることから、気泡の流れをスムーズにし、気泡の残留を抑制することができる。

次に、図１３に示したように筒部品１の上部に細胞の電気生理現象の測定に用いる溶液の１種である細胞外液１０を投入する。この細胞外液１０は細胞内液９と同様に被検体細胞１９の種類によって成分調整されるものであり、通常は被検体細胞１９が生体内で活動するときの細胞外の溶液とほぼ同じ成分に調整される。その後、筒部品１の空洞部の上部、下部それぞれに測定電極１１ａ，１１ｂを挿入する。

次に、図１４に示したように、測定電極１１ａ，１１ｂ間に計測器１７を接続すると、センサチップ２によって仕切られた細胞外液１０と細胞内液９の間の電気的性質が測定される。これは貫通孔５を細胞内液９および細胞外液１０によって満たされることで構成される電気的回路であり、その特性として例えば、電気抵抗、Ｉ−Ｖ特性等として観測され、通常、１ＭΩ程度の電気抵抗値を持つ。

なお、本実施の形態１のように筒部品１は円柱形状をしているので、図１５に示したように市販のパッチクランプ用電極ホルダー１２に挿入することが可能である。パッチクランプ用電極ホルダー１２は筒部品１の挿入口１３と吸引口１４を備え、測定電極１１ｂが電極端子１５につながっており、筒部品１を挿入するとリングシール１６によって筒部品１の下部が密閉され、吸引口１４を通して下部の圧力を容易に変更することができる。

このようにパッチクランプ用のセットを大きく変えることなく、ガラスマイクロピペットに代えて本実施の形態１における細胞電気生理センサを用いることで、顕微鏡やマニュピレータ等で頻雑な作業を行うことなく細胞の電気生理測定を行うことができるようになる。

なお、市販のパッチクランプ用電極ホルダー１２を使わなくとも、図１８に示したように筒部品１へのチューブ２１を挿入することで、チューブ２１の一方の端は容易に吸引手段・加圧手段に接続でき、測定電極１１ｂも外部に取り出しができる。

なお、図１９に示したように本実施の形態１の別の方法として、センサチップ２が筒部品１の中間にあることで、センサチップ２の上部に細胞外液１０をより投入しやすくなる。すなわち、細胞内液９の投入と同様、気泡が残留することなく容易に細胞外液１０を充填することができる。

さらに、図２０に示したように本実施の形態１のさらに別の方法として、シリコン樹脂などからなるリング部品１８を筒部品１の上部先端に挿入しておくことによって細胞外液１０が蓄積される量を増量させることが可能であり、これによって測定電極１１ａをよりセットしやすくなると言う利点を有している。

次に、図１６に示したように細胞外液１０側に被検体細胞１９を投入する。このとき、被検体細胞１９は細胞外液１０と同成分の溶液に所定の濃度で分散させたものとして供給することができる。これによって、浮遊性細胞であっても容易に測定部へ細胞を供給することができる。

その後、細胞内液９側から吸引すると、被検体細胞１９は貫通孔５へ引きつけられて密着するようになる。このとき、被検体細胞１９が貫通孔５に密着したかどうかは、計測器１７によって電気抵抗を測定することで判別できる。

通常、被検体細胞１９が貫通孔５に到達したときには数ＭΩとなり、十分密着した場合には数十ＭΩから数ＧΩになる。このときの抵抗値はシール抵抗と呼ばれ、この抵抗値が高いほどノイズが少なくなるので、測定したい対象によって必要なシール抵抗値が得られるように吸引圧力を最適化すべきであるが、この工程はギガシール形成工程と呼ばれ、パッチクランプ法と全く同じである。

次に、図１７に示したように、さらに吸引圧力を高めることで、貫通孔５の被検体細胞１９の微小な細胞膜部分に細胞膜穴２０を形成する。

これによって、一つの被検体細胞１９の全細胞膜の領域に埋め込まれたイオンチャネルを流れる電流を測定できるようになり、各種のイオンチャネルの電気的特性（例えば、Ｉ−Ｖ特性）、薬剤に対する反応特性、その他外的刺激に対する反応等を測定することができる。

なお、細胞膜に微小な細胞膜穴２０を形成する工程はホールセルと呼ばれ、パッチクランプ法で行うのと全く同じである。

以上、述べてきたように本実施の形態１における細胞電気生理センサでは、貫通孔５が形成された薄板３を持つセンサチップ２が、筒部品１の内部に設置されているため、被検体細胞１９を含む溶液および測定の際に要する溶液を、それぞれ、センサチップ２によって仕切られている筒部品１の中空部に投入し、センサチップ２を介して圧力差を発生させることで、容易に被検体細胞１９を薄板３の貫通孔５に容易に密着させることができるようになる。

これによって、たとえ浮遊性の細胞であっても顕微鏡などを必要とすることなく、また高精度なマニュピレータ制御なども行う必要のない、簡便な取り扱いのできる細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現することができる。

以上のように本発明にかかる細胞電気生理センサおよびその製造方法は、細胞の電気生理現象の効率的な測定を可能にするので、高速で薬理判定を行う、薬品スクリーニング等の測定器に有用である。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図 同上面図 同拡大断面図 同断面図 本実施の形態１の別の細胞電気生理センサの例を示す断面図 同下面図 同拡大断面図 同細胞電気生理センサの製造方法を説明するための断面図 同断面図 別の製造方法を説明するための断面図 同断面図 同使用方法を説明するための断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同別の例による使用方法を説明するための断面図 同別の例による使用方法を説明するための断面図 同別の例による使用方法を説明するための断面図

符号の説明

１ 筒部品
２ センサチップ
３ 薄板
４ 枠体
５ 貫通孔
６ 熱源
７ 段差部
８ 棒材
９ 細胞内液
１０ 細胞外液
１１ 測定電極
１２ パッチクランプ用電極ホルダー
１３ 挿入口
１４ 吸引口
１５ 電極端子
１６ リングシール
１７ 計測器
１８ リング部品
１９ 被検体細胞
２０ 細胞膜穴
２１ チューブ
２３ 溶液

Claims (6)

1. 内部に空洞を有した筒部品と、この筒部品の空洞の一端または中間部に備えられたセンサチップからなり、
   前記センサチップは、少なくとも一つ以上の貫通孔が形成された薄板とこの薄板を保持する枠体とからなり、
   前記筒部品の内形の角部を丸めた形状とし、
   前記筒部品の内形はセンサチップに近付くに従い小さくなり、
   前記筒部品が溶融することによって
   前記センサチップと熱溶着し、
   前記筒部品と前記センサチップとが直接接合している細胞電気生理センサ。
2. 筒部品をガラスとし、センサチップをシリコンとした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
3. 筒部品を樹脂とし、センサチップをシリコンとした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
4. 樹脂を熱可塑性樹脂とした請求項３に記載の細胞電気生理センサ。
5. 熱可塑性樹脂はアクリル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、環状ポリオレフィンポリマーおよび環状ポリオレフィンコポリマーのいずれか一つを含む請求項４に記載の細胞電気生理センサ。
6. 内部に空洞を有した筒部品と、この筒部品の空洞の一端または中間部に備えられたセンサチップからなり、前記センサチップは、少なくとも一つ以上の貫通孔が形成された薄板とこの薄板を保持する枠体とからなり、前記筒部品の内形の角部を丸めた形状とし、前記筒部品の内形はセンサチップに近付くに従い小さくなる細胞電気生理センサの製造方法であって、筒部品とセンサチップを作製する工程と、前記センサチップを親水性の液体中に浸し、この液体中に前記筒部品を浸漬することで、前記液体と筒部品の内壁面の表面張力によって液体とセンサチップを筒部品の内部へ挿入する工程と、その後前記筒部品を加熱することによって前記筒部品の内部に前記センサチップを熱溶着し、前記筒部品と前記センサチップとを直接接合させる工程を少なくとも含む細胞電気生理センサの製造方法。

Images