JP4777702B2 - タウリン高含有酵母の製造法、タウリン含量の調節方法 - Google Patents

Description

本発明は、タウリンを高濃度に含有する酵母及びその製造法に関する。より詳細には、培養条件を適宜設定することにより、任意のタウリン含量を有する酵母を製造する方法、及びそれにより得られる酵母に関する。

近年、人間も含む陸上哺乳類から魚等の水棲動物まで、タウリンの重要性、特に健康面における重要性が明らかにされつつある。タウリンとはアミノ酸の一種で、体内でメチオニンやシステインなどの含硫アミノ酸から作られ、生命維持に必須な心臓、脳、網膜に多く存在する。タウリンには細胞内浸透圧調節因子という、細胞に栄養素や情報を取り入れ、細胞膜を安定させ、細胞の機能を維持する役割がある。

タウリンは、疲労やストレス下に置かれた状態では欠乏しがちになるため、食餌により補給する必要がある。現在最も安価なタウリン源として合成タウリンが候補として考えられるが、合成タウリンは一部の医薬品に使用が認められているのみで、一般の食品や飼料安全法に規定されている配合飼料への使用は認められていない。

上記背景技術に鑑み、本発明では、一般の食品や配合飼料への使用が可能な程に安全なタウリン源、及びその製造方法を提供することである。

発明者による鋭意研究の結果、酵母の処理液中にタウリンを含有させ、その処理液中で一定の条件下で酵母を処理すると、酵母がタウリンを菌体内に効率的に取込むこと、特に、酵母を栄養培地ではなくむしろ任意のタウリン濃度の処理液中で非増殖的に酵母を嫌気的並びに好気的に攪拌することにより、酵母菌体中に効率的にタウリンが取込まれることを見出し、本発明を完成させるに至った。

上記課題を解決するための手段は、以下の通りである。
＜１＞タウリン含量が０.１〜１２％（乾物重量）の範囲であることを特徴とする、タウリン高含有酵母。
＜２＞タウリンを含有する溶液中に酵母を懸濁し、処理することを特徴とする、タウリン高含有酵母の製造法。
＜３＞タウリンが、合成タウリン、畜産物由来タウリン、水産物由来タウリン、畜産物エキス又は海産物エキスのいずれか一つ若しくは二つ以上に由来することを特徴とする、上記＜２＞に記載の製造法。
＜４＞溶液中のタウリン含量が０．１〜９％（w/v）であることを特徴とする、上記＜２＞又は＜３＞のいずれかに記載の製造法。
＜５＞処理時間が３〜６０時間であることを特徴とする、上記＜２＞〜＜４＞のいずれかに記載の製造法。
＜６＞処理温度が２５〜４０℃であることを特徴とする、上記＜２＞〜＜５＞のいずれかに記載の製造法。
＜７＞溶液のpHが３〜７であることを特徴とする、上記＜２＞〜＜６＞のいずれかに記載の製造法。
＜８＞タウリンを含有する溶液が、非栄養的であることを特徴とする、上記＜２＞〜＜７＞に記載の製造法。
＜９＞処理が、非増殖的な攪拌又は振とうであることを特徴とする、上記＜２＞〜＜８＞に記載の製造法。
＜１０＞酵母を懸濁する溶液に含まれるのタウリン濃度を調節することにより、得られるタウリン高含有酵母中のタウリン含量を調節することを特徴とする、上記＜２＞〜＜９＞のいずれかに記載の製造法。
＜１１＞タウリン高含有酵母中のタウリン含量が０.１〜１２％（乾物重量）の範囲であることを特徴とする、上記＜２＞〜＜１０＞のいずれかに記載の製造法。

本発明のタウリン高含有酵母の製造法においては、処理条件を適宜調節することにより任意のタウリン含量を有する酵母を製造することが可能となる。

本発明において、タウリン高含有酵母とは、０．１〜１２％（乾物重量）の範囲でタウリンを含有する酵母のことを指す。本発明におけるタウリン高含有酵母は、タウリンを含有する溶液に酵母を懸濁、攪拌及び／又は振とうし、酵母にタウリンを取り込ませることにより調製される。本発明タウリン含有酵母の基となる酵母としては、特に限定はされないが食用酵母であるのが好ましい。食用酵母としては、特に制限はなく公知のものの中から選択することができ、パン酵母、ビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母及び味噌醤油酵母から選択されるのが好ましく、パン酵母であるのが特に好ましい。食用酵母の菌株としては、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、ミコトルラ（Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属などが挙げられる。

また食用酵母の菌株の具体例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｕｔｉｌｉｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｃａｎｄｉｄａ、Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｌｉｇｅｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ、Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ、などが挙げられる。これらの中でも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓが好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ が特に好ましい。

本発明において使用するタウリンとしては、医薬品グレードの合成タウリン、畜産物由来タウリン、水産物由来タウリンをはじめ、タウリンを高含有する畜産物エキス、海産物エキスでも使用可能である。本発明の用途に使用しうるタウリン原料としては、例えば豚内臓エキス、オキアミエキス、あるいはイカエキス等が挙げられる。

本発明のタウリン高含有酵母の製造を実施するための処理としては、タウリンを添加した栄養培地で酵母を増殖的に培養しても差し支えないが、非栄養的なタウリン溶液中で酵母を懸濁せしめ、非増殖的に攪拌及び／又は振とう処理するのが望ましい。なお、本発明において「非栄養的」とは、培地中に酵母の増殖に必要な栄養成分のいずれかが欠けている状態であることを意味する。また、本発明において「非増殖的」とは、培地中に酵母の増殖に必須な栄養成分のいずれかが欠けている為、酵母が増殖出来ない状態であることを意味する。

また、酵母をタウリン溶液により処理する場合、最初に一定量のタウリン溶液を調製してその中で酵母を処理するバッチ式の処理方法、あるいはタウリン溶液を少量ずつ流下させて処理する流加式の処理方法等、いずれの処理法によっても本発明を実施することが可能であるが、望ましくはバッチ式の処理方法である。

タウリン溶液により酵母を処理する時間としては、３〜６０時間、好ましくは３５〜５５時間、更に望ましくは４５〜５０時間である。なお、３時間未満の余りに短時間ではタウリンが酵母菌体内に十分に取り込まれず、また５０時間以上ではその時間の増加に見合うだけの効果が見られなくなる。

タウリン溶液により酵母を処理する温度としては、２５〜４０℃の範囲が適用可能であるが、望ましくは３０〜３７℃、より望ましくは３５℃である。なお、２５℃未満ではタウリンが菌体内に効率的に取り込まれず、一方４０℃以上では酵母菌体の自己消化が起こり、望ましくない。

タウリン溶液により酵母を処理する際のpHは、３〜８の範囲が適用可能であるが、望ましくは５〜７、より望ましくは５である。なお、pHが３以下あるいは８以上の条件になると酵母菌体にとってストレスとなり、効率的にタウリンを菌体内に取り込まなくなるため、望ましくない。

タウリン溶液により処理する際の酵母濃度としては、開始時菌体量が１０〜３０％の範囲が適用可能である。なお、酵母の細胞当たりのタウリン含量を高くするためには酵母濃度が少ない方が望ましく、開始時菌体量を１０％程度に低くするのが望ましい。一方、溶液中タウリンの利用率を高くするためには、酵母濃度が高い方が望ましく、開始時菌体量を３０％程度に高くするのが望ましい。

酵母を処理する際の、処理液中のタウリン濃度としては、０．１〜９．０％（w/v）の範囲が適用可能であり、また、左記タウリン濃度の範囲内において、酵母菌体中のタウリン含量を任意に調節することが可能である。なお、処理液中のタウリン濃度が９％以上になると、溶解したタウリンが処理中に結晶を形成して析出するため、望ましくない。

以下に本発明の実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
まず、溶液中のタウリンを効率良く酵母菌体に取込むための処理条件の検討を、３Lの小型ジャーファーメンタを用いて行った。
＜試験例１：処理時間の検討＞
酵母菌体に効率的にタウリンを取込ませるのに必要な処理時間の検討を行った。
タウリンが0.5、1.0及び2.0％（ｗ／ｖ）となるように必要量の合成タウリン（潜江永葯業製）を５０〜６０℃の温水に溶解した溶液を調製し、このタウリン溶液にパン酵母菌体（オリエンタル酵母工業（株）製レギュラーイースト）２００ｇ（１ｘ１０^９個／ｍｌ）を懸濁し、更に水を添加して総量を１Lに調整した。この懸濁液を３Lジャーファーメンタにて３０℃で５１時間、１００ｒｐｍで攪拌処理した。途中一定時間経過毎に少量の菌体を回収して遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分）によって集菌し、イオン交換水で２回洗浄した。洗浄後の菌体は超音波処理あるいはガラスビーズによって菌体破砕し、１０％（ｗ／ｖ）になるようにTCA（トリクロロ酢酸）を添加して１０分間熱湯抽出した。左記抽出液の濾過液を検体とし、HPLCによってタウリン含量を測定した。なお、今回の試験ではタウリンの溶解、酵母の懸濁、洗浄には脱イオン水を用いたが、水道水でも代替可能である。測定結果を表１に示す。

いずれの時間においても処理液のタウリン濃度が高い区ほど酵母菌体のタウリン含量も高い値を示した。また、酵母のタウリン含量はいずれの区も経時的に増加しているが、４５時間でほぼ平衡に達している。よって、いずれのタウリン濃度の処理液においても最大のタウリン含量の酵母を得るには４５時間以上処理を行えば良いことが明らかとなった。

＜試験例２：処理温度の検討＞
タウリン溶液の温度が酵母のタウリン取り込みに大きく影響を及ぼすことが考えられるため、酵母にタウリンを効率的に取込ませるための処理温度の検討を行った。
処理液中のタウリン濃度は2.0％（w/v）とし、処理温度は２５、３０および３５℃の３区を設定した。その他の処理条件及びタウリンの分析法は試験例１と同じであるが、24時間の処理で明確な差が認められたので、24時間で処理を終了した。結果を表２に示す。

本試験の結果、２５℃の低温でも酵母によるタウリンの取り込みは起こるが、３０℃と３５℃に比べて少ないことが明らかとなった。また培養温度が高いほど酵母のタウリン取り込みは高く、特に３５℃で高い値を示していることが見られた。なお、パン酵母は４０℃に近くなると自己消化が激しくなることが知られている。ため、今回の試験結果と合わせ考え、培養温度は３５℃付近が望ましいことが明らかとなった。また、実施例１のタウリン２.０％区の２４時間目の値が２３７０ｍｇ／Ｋｇ湿酵母、今回試験の３０℃区２４時間目の値が２６７７ｍｇ／Ｋｇ湿酵母であるため、使用する酵母の活性に大きな違いが無い場合、処理条件を厳密に管理すれば酵母によるタウリンの取り込み量に関し、再現性が高いと考えられる。

＜試験例３：タウリン溶液のpHの検討＞
酵母に効率良くタウリンを取込ませるための、タウリン溶液のpHを検討した。
酵母の処理開始時のpHを硫酸と水酸化ナトリウムを用いて３、５および７に調整し、処理液中のタウリン濃度を2.0％（w/v）、処理温度を３５℃とし、その他の処理条件とタウリンの分析法は試験例１と同様とした。また、２４時間の処理で明確な結果が得られたので、２４時間で処理を終了した。結果を表３に示す。pH5以下で酵母のタウリンの取り込みが若干少なかったが、pH５及び７においては比較的多いことが明らかとなった。

＜試験例４：酵母濃度の検討＞
酵母に効率良くタウリンを取込ませるための、処理開始時の菌体濃度を検討した。処理開始時の酵母湿菌体量は、処理液総量の１０、２０および３０％の３区とし、処理液のタウリン濃度は2.0％（w/v）、pHは５とし、その他の処理条件とタウリンの分析法は試験例１と同じである。結果を表４に示す。

本試験により、開始時菌体量が少ない区ほど高い傾向を示すことが明らかとなった。よって、酵母のタウリン含量を高くするためには開始時菌体量を１０％程度に低くするのが望ましい。
但し、溶液中のタウリンの酵母への取り込み絶対量で比較すると、菌体中に含まれるタウリンの各区間比は、１０％区では１０８８３×１＝１０８８３、２０％区では８２２６×２＝１６４５２、３０％区では７８９５×３＝２３６８５となり、３０％、２０％、１０％の順となる。よって、溶液中タウリンの利用率を高くすることを目的とする場合には、開始時菌体量を３０％程度に高くするのが望ましいということになる。すなわちその時々の目的によって培養開始時の菌体濃度を調整すれば良い。なお、以下の試験例及び実施例では、酵母のタウリン含量を高くすることを第１の目標としたため、開始時菌体量を１０％とした。

＜試験例５：処理液中のタウリン濃度の検討＞
試験例１の結果では処理液のタウリン濃度が０.５〜２.０％（ｗ／ｖ）の範囲ではタウリン濃度が高い区ほど酵母中のタウリン含量が高い傾向が見られたため、酵母のタウリン取り込みに最も効率の良いタウリン濃度の検討を行った。
処理温度は３５℃とし、処理液のタウリン濃度は２、３、６および９％（ｗ／ｖ）の４区とした。その他の処理条件とタウリンの分析法は試験例１と同じであるが、処理時間は４８時間とした。結果を表５及び図１に示す。

処理液のタウリン濃度が２〜６％（ｗ／ｖ）の範囲では、酵母のタウリン含量も直線的に増加するが、６％（ｗ／ｖ）以上になると傾きが小さくなり、取込み効率が悪くなる傾向が見られた。なお、処理液のタウリン濃度が２〜６％（ｗ／ｖ）の範囲で、処理液のタウリン濃度X（％）及び酵母のタウリン含量Y（ｍｇ／Ｋｇ湿酵母）の相関を解析した結果、Y＝１５８０X＋３４０９の直線式が得られ、R^２は０．９９８７であった。なお、試験例１の処理温度が３０℃、処理液中のタウリン濃度が０.５〜２．０％（ｗ／ｖ）の条件においては、Y=1514X＋４２４、R^２が０．９９７８という相関式が得られた。この結果も合わせて図１に示す。以上より、一定の処理条件下であれば酵母のタウリン取り込みは温度と処理液中のタウリン濃度によって規定されることが示唆される。

次に、処理開始後４８時間目の酵母の水分含量を測定し、更に定法に従って菌体を加水分解して酵母乾燥物当りのタウリン含量を求めた。結果を表６及び図２に示す。

両者の間にはY（酵母のタウリン含量：％（乾物重量））＝１．２４７７X（処理液のタウリン濃度：％（ｗ／ｖ））＋２．６３８５の直線式が得られ、R^２＝０．９９８８であった。また、乾物酵母の総タウリン含量Y（％（乾物重量））と湿物酵母の酸抽出可能タウリン含量X（％（湿物重量））の間にはY=７．８９０６X−０．０４８６の直線式が得られた。処理液のタウリン濃度が６〜９％（ｗ／ｖ）の範囲では、Y（酵母のタウリン含量：ｍｇ／Ｋｇ湿酵母）＝５２７X（処理液のタウリン濃度：％（ｗ／ｖ））＋９６９３の直線式が得られる。この式を乾物のタウリン含量の式に直すと、Y（酵母のタウリン含量：％（乾物重量））＝０．４０X（処理液のタウリン濃度：％（ｗ／ｖ））＋７．７となる。この式を用いて、処理温度３５℃、処理液中タウリン濃度０〜９％（ｗ／ｖ）の範囲において試験例１〜５で検討した処理条件下で４８時間酵母を処理した場合に得られる酵母中のタウリン含量を推定すると表７のようになる。

このことは処理液中のタウリン濃度を０〜９％（ｗ／ｖ）の範囲内で変化させ、その他の条件を一定にしておけば、酵母のタウリン含量が０〜１２％（乾物重量）の範囲で任意のタウリン含量を有する酵母を調製することが可能になることを示している。

試験例１〜５より、最適な処理条件として、温度３５℃、pH５、処理時間４５時間以上、処理開始時湿菌体濃度１０％（但し、培養液タウリンの利用率を高くする場合には１０％以上にする）が考えられる。なお、通気の必要性についても検討したが、菌体が沈降しない程度に攪拌（回転羽根を用いて１００ｒｐｍで攪拌）すれば十分であることが明らかとなったため、通気は行わないこととした。この条件下で培養液タウリン濃度０〜９％（ｗ／ｖ）の範囲で酵母を処理すれば、ほぼ任意のタウリン含量の酵母が得られることとなる。

（３KL大型タンクを用いたタウリン富化条件の検討）
上記実施例１において得られた検討結果を基に、３KLの実生産用大型タンクで処理を行った場合の再現性を検討した。
処理液中タウリン濃度を、３５℃での溶解可能限界量である９％（ｗ／ｖ）とし、以下の手順で処理液の調製を行った。
− １６００Lの熱水に合成タウリン２２５Kgを添加、溶解する。
− ３KLタンクに上記のタウリン溶液の全量を入れ、４０℃前後に保温する。
− ２５０Kg湿菌体相当量の濃縮クリーム状酵母を添加する。
− 水で全体量を２５００Lに調整する（以上の処理で酵母濃度は１０％、処理液のタウリン濃度は９％（ｗ／ｖ）となる）。

上記処理液を３５±２℃、pHは５.０±０.５、攪拌速度１００ｒｐｍで４４時間処理し、処理後の酵母はノズルセパレータで２回以上洗浄後濃縮し、菌体濃度を湿菌体で５０％以上とした。更に濃縮菌体の水分含量を定法により算出し、総タウリン含量を試験例５と同じ方法により算出した。その結果、得られた酵母中のタウリン含量は１１．５％（乾物重量）であった。この値は３Lジャーファーメンタで得られた結果（１１．３％（乾物重量））とほぼ一致しており、３KLの大型タンクで培養した場合にも高い再現性が認められた。

３Lジャーファーメンタで得られた結果を基に、３KLの大型タンクでも目的とするタウリン含量の酵母を得ることが可能か否かにつき検討を行った。なお、本実施例においては、酵母のタウリン含量の目標を５％乾物とした。

試験例５で示したように、処理液のタウリン濃度X（％（ｗ／ｖ））と酵母のタウリン含量Y（％（乾物重量））に間にはY=１．２４７７X＋２．６３８５の関係があるので、５．０−２．６３８５＝１．２４７７X、X=１．８９となり、約１．９％（ｗ／ｖ）のタウリン濃度が必要と予想されるため、２５００Lの処理液量であれば４７．５Kgのタウリンが必要となる。なお、処理液の調製にあたり、１６００Lの熱水に合成タウリン４８Kg添加し、その後２５０Kg湿菌体相当量の濃縮クリーム状酵母と水を加えて総量を２５００Lとし、タウリン濃度１．９２％（ｗ／ｖ）の処理液を得た。

実施例２と同様の処理条件、菌体の洗浄濃縮、タウリンの分析を行った結果、酵母のタウリン含量は５．４％（乾物重量）で、当初の目的をほぼ達成することができた。以上の結果から、３Lの小型ジャーファーメンタでの試験によって得られた最適処理条件は、３KLの大型タンクでにおいても適用可能であることが明らかとなった。

処理液のタウリン濃度X（％（ｗ／ｖ））及び酵母のタウリン含量Y（ｍｇ／Ｋｇ湿酵母）の相関を示すグラフ。 処理液のタウリン濃度X（％（ｗ／ｖ））及び酵母のタウリン含量Y（％（乾物重量））の相関を示すグラフ。

Claims (7)

1. タウリン水溶液中に以下の（ａ）群及び（ｂ）群の少なくとも一方に該当する酵母を懸濁し、処理するタウリン高含有酵母の製造法であって、前記タウリン高含有酵母中のタウリン含量が６．４８〜１１．３％（乾物重量）の範囲であることを特徴とする、タウリン高含有酵母の製造法。
   （ａ）群：サッカロミセス（Saccharomyces）属、トルロプシス（Torulopsis）属、ミコトルラ（Mycotorula）属、トルラスポラ（Torulopsis）属、キャンディダ（Candida）属、ロードトルラ（Rhodotorula）属又はピキア（Pichia）属の酵母。
   （ｂ）群：Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces uvarum、Saccharomyces rouxii、Torulopsis utilis、Torulopsis candida、Mycotorula japonica、Mycotorula lipolytica、Torulaspora delbrueckii、Torulopsis fermentati、Candida
   sake、Candida tropicalis、Candida
   utilis、Saccharomycopsis fibligera、Saccharomyces lipolytica、Rhodotorula rubra又はPichia farinosaである酵母。
2. タウリンが、合成タウリン、畜産物由来タウリン、水産物由来タウリン、畜産物エキス又は海産物エキスのいずれか一つ若しくは二つ以上に由来することを特徴とする、請求項１に記載の製造法。
3. タウリン水溶液中のタウリン含量が３〜９％（w/v）であることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の製造法。
4. 処理時間が３〜６０時間であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造法。
5. 処理温度が２５〜４０℃であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造法。
6. タウリン水溶液のpHが３〜７であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の製造法。
7. 請求項１に記載のタウリン高含有酵母の製造法を行うに当たり、下記の（１）〜（５）の内の１以上の条件に従う処理により、酵母のタウリン含量を高め、あるいは酵母によるタウリン利用率を高めることを特徴とするタウリン含量の調節方法。
   （１）処理時間を４５時間以上とする。
   （２）処理温度を３０℃〜３５℃とする。
   （３）タウリン水溶液のpHをpH５〜７とする。
   （４）タウリン水溶液の酵母濃度を、酵母のタウリン含量を高くするためには１０％とし、タウリン利用率を高めるためには３０％とする。
   （５）Ｙを酵母の目標タウリン含量（ｍｇ／Ｋｇ湿酵母）、Ｘをタウリン水溶液のタウリン濃度（％）としたとき、Ｘが０．５〜２．０％（ｗ／ｖ）の範囲ではＹ＝１５１４Ｘ＋４２４の直線式に従い、Ｘが２〜６％（ｗ／ｖ）の範囲ではＹ＝１５８０Ｘ＋３４０９の直線式に従ってＸを設定する。

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