JP4839665B2 - シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法、該培養方法によって得られた培養液、並びに地下水及び／又は土壌の浄化方法 - Google Patents

Description

本発明は、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法に関する。特には、塩化ビニルを蓄積することなく、シス−１，２−ジクロロエチレンをエチレンにまで分解することのできる微生物の培養方法に関する。

近年において科学技術が発展し、それに伴い、種々の化学物質が利用されるようになってきており、土壌や地下水が各種の有害難分解物質によって汚染されることが問題となっている。特に、テトラクロロエチレン（以下、「ＰＣＥ」ともいう）、トリクロロエチレン（以下、「ＴＣＥ」ともいう）、シス−１，２−ジクロロエチレン（以下、「ｃＤＣＥ」ともいう）等の塩素化エチレンによる環境汚染は深刻な問題となっている。これらの塩素化エチレンは、土壌中に残留したものが雨水等によって地下水中に溶解して、周辺に広がるものとされている。このような塩素化エチレンは、水に対する溶解性が低く、また化学的に安定な化合物であることから、いったん環境中に放出されると、長期間にわたって土壌や地下水中に蓄積してしまう。

一方で、塩素化エチレンのヒトに対する毒性が指摘されており、ＰＣＥ、ＴＣＥ及びｃＤＣＥについてはｐｐｂレベルでの環境基準値が設定されており、これらの塩素化エチレンによって汚染された土壌、地下水の浄化方法について、様々な研究がなされている。そのような研究の中でも、微生物を用いた浄化方法は、物理・化学的方法に比べて浄化コストが低いこと、また大がかりな掘削をする必要がなく、稼働中の工場等に隣接した場所における浄化が可能であること等の理由から、近年特に注目されている。

塩素化エチレンを無害化することのできる微生物には、好気性微生物と嫌気性微生物との両者が存在する。前者は、メタン、トルエン、フェノール等の誘導物質の存在下に、共酸化的に塩素化エチレンを分解するものであり、現場での適用には通気を必要とするため、コスト高となることから、現場で実施する例は少ない。これに対し、嫌気性微生物を用いる浄化には空気を必要とせず、かつこれらの微生物がエネルギー源として塩素化エチレンを必要とするため、誘導物質を添加する必要がなく、低コストでの実施が可能となる。

嫌気性微生物による塩素化エチレンの分解（脱塩素化反応）は、一般的にテトラクロロエチレン→トリクロロエチレン→シス−１，２−ジクロロエチレン→塩化ビニル（以下、「ＶＣ」ともいう）→エチレンの順に進行する。テトラクロロエチレンをトリクロロエチレンに分解する嫌気性微生物、テトラクロロエチレンをシス−１，２−ジクロロエチレンに分解する嫌気性微生物は数多く知られているが、シス−１，２−ジクロロエチレンを塩化ビニル、エチレンにまで分解することのできる嫌気性微生物として知られているのは、Dehalococcoides属の微生物のみである。このため、Dehalococcoides属微生物が存在しない現場では、ｃＤＣＥが蓄積することが多い（非特許文献１参照）。更に、Dehalococcoides属微生物には多くの種類が存在することが知られているが、シス−１，２−ジクロロエチレンを塩化ビニルにまで分解するが、塩化ビニルをエチレンにまで分解できないもの、又は、分解速度が非常に遅いもの等が知られている（非特許文献２、３及び４参照）。

塩化ビニルについては、現在のところ、環境基準値が設定されていないが、塩素化エチレンの中では、唯一、発癌性が証明されている物質であり、浄化工程においては、当然ながら残存することは好ましくない。
上述した、嫌気性微生物を用いた塩素化エチレンで汚染された土壌、地下水の浄化方法としては、土着のDehalococcoides属微生物に栄養源を供給し、塩素化エチレンを分解させるバイオスティミュレーション法が知られており、既に実用化されている。

Hendrickson et al. Applied and Environmental Microbiology, vol.68, P485-495,2003 He el al. Nature, vol.424, P62-65 Szewzyk et al Nature, vol.408, P580-583 Maymo-Gatell et al. Applied and Environmental Microbiology, vol.65, p3108-3113,1999

しかし、上述したように、Dehalococcoides属微生物の中にも、ＶＣを分解する能力のないもの、又は分解する能力は有するが、分解速度が非常に遅いもの等がある。また、Dehalococcoides属微生物自体が存在しない汚染現場も数多く存在することから、ＶＣを蓄積することなく、ｃＤＣＥを効率よくエチレンにまで分解することのできるDehalococcoides属微生物を培養し、これらを汚染土壌、地下水に人為的に注入するバイオオーギュメンテーション法の確立が望まれている。しかしながら、バイオオーギュメンテーションに用いることのできる、塩素化エチレン分解微生物の効果的な培養方法はいまだ確立されていない。

従って、本発明の目的は、ＶＣを蓄積することなく、ｃＤＣＥを効率よくエチレンにまで分解することができ、バイオオーギュメンテーション法に用いることのできる、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法を提供することにある。
また、本発明の目的は、上記培養方法によって得られた培養液を用いる、地下水及び／又は土壌の浄化方法を提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を含む植種源を特定の条件下で集積培養することにより、上記目的を達成し得るという知見を得た。

本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を含む植種源を、塩化ビニルを含有する液体培地で嫌気的条件下で培養することを特徴とする、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法を提供するものである。
また、本発明は、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を含む植種源を、シス−１，２−ジクロロエチレンを含有する液体培地で、該液体培地内のシス−１，２−ジクロロエチレンが検出されなくなるまで培養し、得られた培養液を、塩化ビニルを含有する液体培地に移植し、嫌気的条件下で培養を行うことを特徴とする、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法を提供する。
また、本発明は、上記培養方法によって得られた、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群を含有する培養液を提供する。
また、本発明は、上記培養液を、塩素化エチレンによって汚染された地下水及び／又は土壌中に注入することを特徴とする、地下水及び／又は土壌の浄化方法を提供する。

本発明のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法によれば、塩化ビニルを蓄積することなく、シス−１，２−ジクロロエチレンを効率良く分解することができ、かつバイオオーギュメンテーション法に用いることのできる、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群を培養することが可能となり、上記シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群のスクリーニングに用いることができる。塩化ビニルは、発癌性を有することが知られており、本発明の培養方法によれば、塩化ビニルを蓄積することなく、シス−１，２−ジクロロエチレンを分解することのできる微生物群が得られ、バイオオーギュメンテーションにも有用である。
また、本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法は、本発明の微生物群の培養方法によって得られた培養液を用いており、シス−１，２−ジクロロエチレンの分解活性が安定化され、地下水及び／又は土壌中のシス−１，２−ジクロロエチレンの分解効率が向上したものとなる。

以下、先ず本発明のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法について説明する。本発明のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法は、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を含む植種源を、塩化ビニルを含有する液体培地で嫌気的条件下で培養する。
本発明のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法においては、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を含む植種源を用いる。本明細書において、「塩素化エチレン」とは、エチレンの水素原子のうち少なくとも１個が塩素原子に置換されている化合物を意味するものとし、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルを含む。

本発明のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法においては、植種源として、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を、シス−１，２−ジクロロエチレンを含有する液体培地で培養した培養液を用いてもよい。すなわち、本発明は、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を含む植種源を、シス−１，２−ジクロロエチレンを含有する液体培地で培養し、得られた培養液を、塩化ビニルを含有する液体培地に移植し、嫌気的条件下で培養を行う方法であってもよい。

本発明において用いられる植種源は、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌であり、このような地下水及び／又は土壌としては、稼働中の工場に隣接したエリアにおける土壌、地下水等が挙げられる。用いられる地下水及び／又は土壌としては、バイオスティミュレーションによる汚染の浄化が進行しており、かつ浄化の過程においてDehalococcoides属細菌が顕著に増殖している汚染現場より採取した地下水及び／又は土壌を用いることが好ましい。また、Dehalococcoides属細菌は偏性嫌気性微生物であるため、酸素の存在下では速やかに死滅することが懸念される。従って、現場における土壌、地下水の採取、それらの移送及び培養容器への添加等の一連の操作においては、可能な限り嫌気性条件下で操作を行うことが好ましい。

本発明のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法について、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を含む植種源を、シス−１，２−ジクロロエチレンを含有する液体培地で培養し、得られた培養液を植種源として用いる場合について、図面を参照しつつ説明する。図１は、本発明のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法の手順を示す図であり、本発明の培養方法は、図１の手順に従って集積培養を行う。

本発明のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法においては、まず、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を培養容器１０に投入して培養を行う。図１において、培養容器１０としては、容量が１５０ｍｌの容器を用いており、植種源としては、塩素化エチレンにより汚染された地下水を用いている。用いられる地下水は、培養容器の容量が１５０ｍｌの場合、１００ｍｌ程度でよいが、通常は、５０〜１２０ｍｌ程度の地下水が用いられる。植種源として地下水を用いる場合、そのまま培養容器１０に投入してもよいが、水等で希釈した後に用いてもよい。また、植種源として土壌を用いる場合も、そのまま培養容器１０に投入して液体培地中に懸濁してもよいが、適当な溶媒（水等）に懸濁した後に、培養容器１０に投入してもよい。また、用いられる培養容器１０としては、培地中にシス−１，２，−ジクロロエチレン又は、塩化ビニルが含まれるので、これらの塩素化エチレンの溶剤としての特性から、ガラス製のものを用いることが好ましい。また、培養容器１０の蓋としては、ポリテトラフルオロエチレンでコーティングされたブチルゴム栓を用いることが好ましい。

培養容器１０内に含まれる培地としては、液体培地が用いられ、この培地には、有機栄養源として、１００〜１０００ｍｇ／Ｌのクエン酸、及び１０〜１００ｍｇ／Ｌの酵母エキスを含む培地が好ましく用いられる。また、培地成分としては、クエン酸に代え、乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、メタノール、ショ糖等の有機酸、有機酸塩、アルコール又は糖類等を用いてもよい。また、培養容器１０には、シス−１，２−ジクロロエチレンが含有されており、その濃度は、好ましくは１〜１００ｍｇ／Ｌ（１０μＭ〜１ｍＭ）であり、更に好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｌ（１０〜１００μＭ）である。上記有機栄養源等は、通常の嫌気培養において用いられる方法によって培養容器１０に添加することができるが、培養容器１０内を嫌気条件とするために、培地中に硫化ナトリウム及び塩化第一鉄を添加することが好ましい。培地中に加える硫化ナトリウム及び塩化第一鉄の濃度は、好ましくは５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌである。また、培地内には、嫌気度を調べるための指示薬であるレサズリンを添加してもよい。培地のｐＨは、６〜８．５程度の中性域であることが好ましい。
なお、上述した培地成分の濃度は、培養を行う際の濃度であり、植種源である地下水を加えた際には、希釈されて濃度が低下するので、それを考慮し、地下水を加える前の培地としては、最終濃度が適正な濃度となるように、高濃度のものを作製して用いることが好ましい。

培養容器１０内は、脱気することによって容器内を嫌気状態としてもよく、また、窒素ガス、又は窒素ガスと二酸化炭素との混合ガスをパージすることによって、培養容器１０内を嫌気状態とすることもできる。なお、培養温度は好ましくは１０〜３０℃であり、３０℃が最適である。
培養時間には特に制限はないが、培地内に含まれるシス−１，２−ジクロロエチレンが、全てエチレンにまで分解されるまで、すなわちシス−１，２−ジクロロエチレンが検出されなくなるまで培養を行うことが好ましい。シス−１，２，−ジクロロエチレンの分解は、例えば、培養容器１０中の培養液を少量サンプリングし、ガスクロマトグラフィーにより、シス−１，２，−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの分析を行うことによって調べることができる。すなわち、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルが検出されなくなるまで培養を行うことが好ましい。

培養容器１０内のシス−１，２−ジクロロエチレンが完全にエチレンにまで分解されたことを確認した後、培養容器１０内の培養液を、培養容器１２に移植する。培養容器１２内には、培養容器１０内に含有される液体培地と同様の液体培地が含まれている。培養容器１０内の培養液には、シス−１，２−ジクロロエチレンが含有されているが、培養容器１２においては、液体培地中に、シス−１，２−ジクロロエチレンの代わりに塩化ビニルが含有されている。液体培地中の塩化ビニルの濃度は、好ましくは１〜１００ｍｇ／Ｌ（１６μＭ〜１．６ｍＭ）であり、更に好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｌ（１６〜１６０μＭ）である。なお、培養容器１２の素材は、培養容器１０のものと同じものが用いられる。

培養容器１２内における培養は、嫌気的条件下で行う。嫌気的条件下で培養を行なう方法としては、上述した、培養容器１０における培養と同様の方法が挙げられる。なお、培養温度は、好ましくは１０〜３０℃であり、３０℃が最適である。
培養容器１２における培養は、培養容器１０と同様に、液体培地内に含まれる塩化ビニルが、全てエチレンにまで分解されるまで培養を行うことが好ましい。塩化ビニルの分解は、例えば、培養容器１２中の培養液を少量サンプリングし、ガスクロマトグラフィーにより、塩化ビニル及びエチレンの分析を行うことによって調べることができる。すなわち、塩化ビニルが検出されなくなるまで培養を行うことが好ましい。このように、培地中の塩化ビニルが検出されなくなるまで培養を行うことにより、本発明の培養液が得られる。該培養液には、塩化ビニルを蓄積することなく、シス−１，２−ジクロロエチレンをエチレンにまで分解する能力を有する微生物群が含まれている。すなわち本発明は、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群をスクリーニングするための方法として用いることができる。

本発明は、上述の培養液をも含むものであり、得られた培養液は、地下水及び／又は土壌の浄化方法に用いられる。この点については後述する。

本発明のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法においては、上述のようにして、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を含む植種源（塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を、シス−１，２−ジクロロエチレンを含有する液体培地で培養した培養液）を、塩化ビニルを含有する液体培地で嫌気的条件下で培養することにより、培養液を得、この培養液を、地下水及び／又は土壌の浄化方法に用いることができる。本発明のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法においては、上述のようにして得られた培養液を、更に、塩化ビニルを含有する液体培地で嫌気的条件下で培養を行ってもよい。

上述のようにして得られた培養液を、更に、塩化ビニルを含有する液体培地で嫌気的条件下で培養を行うことにより、シス−１，２−ジクロロエチレンを分解させる際に、多量の塩化ビニルを生成することなく、エチレンにまで速やかに分解することのできる微生物群を得ることが可能となる。図１に示す、培養方法の手順においては、培養容器１２で得られた培養液を、培養容器１４に移植して培養を行い、培養容器１４で得られた培養液を、培養容器１６に移植して培養を行い、培養容器１６で得られた培養液を培養容器１８に移植して培養を行い、培養容器１８で得られた培養液を培養容器２０に移植して培養を行い、培養液を得る。図１に示す方法においては、図示したように、培養液の培地への植え継ぎを５回行っている。本発明の培養方法における、培養液の植え継ぎの回数は、３〜１０回程度が好ましい。すなわち、本発明の培養方法は、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を含む植種源を、塩化ビニルを含有する液体培地で嫌気的条件下で培養して得られた培養液の、塩化ビニルを含有する液体培地への植え継ぎを３〜１０回程度行なうことが好ましい。植え継ぎ回数が、これよりも少ないと、得られる培養液中の微生物群を用いてシス−１，２−ジクロロエチレンを分解させる際に、多量の塩化ビニルが生成され、エチレンにまで分解する速度が低下する場合があり、一方、これ以上多く植え継ぎを実施しても、効果はそれ以上に向上しないと考えられる。なお、培養容器１４、１６、１８及び２０の素材については、上記培養容器１０と同じものが用いられ、それぞれの培養容器内に含まれる培地は、培養容器１２に含まれるものと同一であり、培養方法についても同様である。

本発明の培養液は、上述したように、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌を含む植種源を、塩化ビニルを含有する液体培地で嫌気的条件下で培養することにより得られる。該培養液は、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群を含んでおり、塩素化エチレンにより汚染された地下水及び／又は土壌のバイオオーギュメンテーションに用いることができる。
バイオオーギュメンテーションとは、有害物質（例えば、塩素化エチレン）の分解活性を有する微生物を大量培養し、この微生物を、有害物質に汚染された地下水及び／又は土壌に注入して、有害物質の分解を行わせる方法のことである。本発明の培養液は、原位置バイオオーギュメンテーションに用いることができるのみならず、汚染現場から揚水された地下水、掘削された土壌を浄化するためにも用いることができる。
地下水又は土壌に注入される培養液の量、注入速度等については、汚染された地下水及び／又は土壌の汚染状況によって異なり、適宜選択することが可能である。

次に、本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法について説明する。
本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法は、上記培養液を、塩素化エチレンによって汚染された地下水及び／又は土壌中に注入することを特徴とする。
具体的には、本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法は、地下水及び／又は土壌のバイオオーギュメンテーションによって行なうことができる。バイオオーギュメンテーションについては上述した通りであり、本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法は、上記培養液を、塩素化エチレンによって汚染された地下水及び又は土壌中に注入することを特徴とし、すなわち原位置バイオオーギュメンテーションで行なうことができる。しかし、本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法は、原位置バイオオーギュメンテーションのみならず、汚染現場から揚水された地下水、掘削された土壌を浄化するためにも用いることができる。なお、地下水及び／又は土壌に注入する培養液の量、注入速度等については、汚染された地下水の汚染状況によって異なり、適宜選択することができる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
参考例１
バイオスティミュレーションによる塩素化エチレン汚染土壌・地下水の浄化処理を行っている現場より、地下水を採取し、図２に示すような手順に従い、培養を行った。なお、３カ所の現場より３個の地下水を採取し、それぞれの現場を、現場Ａ、現場Ｂ及び現場Ｃとした。採取した地下水１００ｍＬを、１５５ｍＬ容のガラス製バイアル（培養容器）１０に入れ、下記成分を、下記濃度になるように加えた。
Ｃ_３Ｈ_４（ＯＨ）（ＣＯＯＨ）_３ ５００ｍｇ／Ｌ
（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４ ６ｍｇ／Ｌ
酵母エキス １００ｍｇ／Ｌ
Ｎａ_２Ｓ・９Ｈ_２Ｏ ５０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ５０ｍｇ／Ｌ

次いで、培養容器１０内の気相を、窒素／二酸化炭素混合ガス（混合比＝８：２）で置換した後、ポリテトラフルオロエチレンでコートされたブチルゴム栓により培養容器を密栓した。次いで、ガラス製シリンジを用いて、シス−１，２−ジクロロエチレンを、濃度が約６０μＭとなるように添加し、培養容器１０を３０℃の恒温槽中にいれ、静置培養を開始した。培養容器１０の気相２００μＬを定期的に引き抜き、ガスクロマトグラフィーにより、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した。
なお、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルについてはガスクロマトグラフィー（ＧＣ１７Ａ）により、エチレンについてはガスクロマトグラフィー（ＧＣ９Ａ）により測定を行った。以下の実施例においても同様である。

ガスクロマトグラフィーの測定により、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルが全てエチレンに分解されたのを確認し、すなわち、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルが検出されなくなったのを確認した後、培養液（水相）を１ｍＬ採取した。この培養液には、シス−１，２−ジクロロエチレンを分解する能力を有する微生物が含有されており、この微生物群の植え継ぎを以下のように行った。
下記成分からなる培地を、培養容器１２に入れ、またシス−１，２−ジクロロエチレンを約６０μＭの濃度となるように添加した。上述のように、培養容器１０から採取した培養液１ｍＬを、培養容器１２に移植した。

Ｃ_３Ｈ_４（ＯＨ）（ＣＯＯＮａ）_３ ５００ｍｇ／Ｌ
酵母エキス １００ｍｇ／Ｌ
ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ １５ｍｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ_３ ２５２０ｍｇ／Ｌ
Ｔｒｉｓ ２２９０ｍｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ５００ｍｇ／Ｌ
ＮａＣｌ ５００ｍｇ／Ｌ
ＫＨ_２ＰＯ_４ ２００ｍｇ／Ｌ
ＮＨ_４Ｃｌ ３００ｍｇ／Ｌ
ＫＣｌ ３００ｍｇ／Ｌ
Ｎａ_２Ｓ・９Ｈ_２Ｏ ４８０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ２００ｍｇ／Ｌ
ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ １ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ １．９ｍｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ_２ ０．７ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．０４ｍｇ／Ｌ
Ｈ_３ＢＯ_３ ０．０６ｍｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．２５ｍｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．４４ｍｇ／Ｌ
濃塩酸 １μＬ／Ｌ
レサズリン １ｍｇ／Ｌ

次いで、培養容器１２内の気相を、培養容器１０と同様に、窒素／二酸化炭素混合ガス（混合比＝８／２）で置換した後、ポリテトラフルオロエチレンでコートされたブチルゴム栓により密栓し、３０℃の恒温槽中に置き、静置培養を開始した。培養容器１２内の気相２００μＬを定期的に引き抜き、ガスクロマトグラフィーを用いて、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した。ガスクロマトグラフィーの測定により、培養容器１２内のシス−１，２−ジクロロエチレンが全てエチレンに分解されたのを確認し、すなわち、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルが検出されなくなったのを確認した後、培養液を１ｍＬ採取した。

次に、培養容器１４及び培養容器１５を準備し、培養容器１２に入れた培地成分と同一の成分を、それぞれの培養容器に入れ、培養容器１４にはシス−１，２−ジクロロエチレンを、培養容器１５には塩化ビニルを、濃度が約６０μＭとなるように添加した、次いで、培養容器１２から採取した培養液１ｍＬを、それぞれの培養容器に移植し、培養容器１２と同様にして培養を行った。培養容器１４及び培養容器１５内の気相２００μＬを定期的に引き抜き、ガスクロマトグラフィーを用いて、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した。ガスクロマトグラフィーの測定により、培養容器１４内の塩化ビニルが全てエチレンに分解されたのを確認し、すなわち、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルが検出されなくなったのを確認した後、培養液を１ｍＬ採取した。
培養容器１５については、ガスクロマトグラフィーによる測定の結果、培養容器１２から得られた培養液中に含まれる微生物が塩化ビニルの分解能を有していることが確認された。測定後、培養容器１５内の培地は廃棄した。

次いで、培養容器１６、１８、２０、１７、１９、２１を準備し、それぞれに、培養容器１２に入れた培地と同一の培地を入れ、培養容器１６、１８、２０には、シス−１，２−ジクロロエチレン、培養容器１７、１９、２１には塩化ビニルを、濃度が約６０μＭとなるように添加し、図２に示すように微生物の植え継ぎを行った。すなわち、培養容器１４から得られた培養液１ｍＬを培養容器１６及び１７に移植し、培養容器１６から得られた培養液１ｍＬを培養容器１８及び１９に移植し、培養容器１８から得られた培養液１ｍＬを培養容器２０及び２１に移植した。それぞれの培養容器における培養条件は、培養容器１２における条件と同一である。すなわち、培養容器１６、１８及び２０においては、ガスクロマトグラフィーの測定により、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルが検出されなくなるまで培養を行い、培養容器１７、１９及び２１においては、ガスクロマトグラフィーの測定により、塩化ビニルが検出されなくなるまで培養を行った。

培養容器２０における、気相のガスクロマトグラフィーの測定は、現場Ａ、Ｂ及びＣの３カ所の地下水を植種源として用いた場合、いずれにおいても、培地中のシス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルが検出されなくなるまで培養を行うことができ、シス−１，２−ジクロロエチレンが全てエチレンにまで分解されるまで培養を行うことが可能であることを示す。また、培養容器２１においても、塩化ビニルは検出されず、塩化ビニルが全てエチレンにまで分解されるまで培養を行うことが可能であった。この結果は、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の、シス−１，２−ジクロロエチレンを含有する液体培地を用いた集積培養が可能であることを示す。

参考例１における培養容器２０の培養開始から定期的に気相をサンプリングし、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの測定を行った。その結果を図３（現場Ａから採取した地下水を植種源として用いた場合）、図４（現場Ｂから採取した地下水を植種源として用いた場合）、及び図５（現場Ｃから採取した地下水を植種源として用いた場合）に示す。図３〜図５は、培養容器２０内の気相のシス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した結果を表すグラフであり、横軸は培養開始後の経過日数を表し、縦軸は、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を表す。図３、図４及び図５のいずれにおいても、培養開始後、シス−１，２−ジクロロエチレンが分解されるに従い、塩化ビニルの濃度が上昇し、塩化ビニルの濃度は約６０μＭまで上昇し、その後、徐々に塩化ビニルの濃度が低下し、エチレンの濃度が上昇することがわかる。このことは、上述した培養方法により得られた培養液を用いてシス−１，２−ジクロロエチレンの分解を行った場合、先ず、シス−１，２−ジクロロエチレンが塩化ビニルに分解され、その後、エチレンへの分解が始まることがわかる。

実施例１
参考例１における、培養容器１２、１４、１６、１８及び２０に塩化ビニルを、培養容器１５、１７、１９及び２１にシス−１，２−ジクロロエチレンを、それぞれ濃度が６０μＭになるように添加した以外は、参考例１と同様に微生物群の集積培養を行った。いずれの培養容器においても、塩化ビニル又はシス−１，２−ジクロロエチレンが全てエチレンに分解されるまで培養を行った。すなわち、培養容器１２、１４、１６、１８及び２０においては、塩化ビニルが検出されなくなるまで、培養容器１５、１７、１９及び２１においては、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルが検出されなくなるまで培養を行った。

培養容器２０における、気相のガスクロマトグラフィーの測定は、現場Ａ、Ｂ及びＣの３カ所の地下水を植種源として用いた場合、いずれにおいても、培地中の塩化ビニルが検出されず、塩化ビニルが全てエチレンにまで分解されるまで培養を行うことが可能であることを示す。また、培養容器２１においても、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルは検出されず、シス−１，２−ジクロロエチレンが全てエチレンにまで分解されるまで培養を行うことが可能であった。この結果は、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の、塩化ビニルを含有する液体培地を用いた集積培養が可能であることを示す。

実施例１における培養容器２０の培養開始から定期的に気相をサンプリングし、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの測定を行った。その結果を図６（現場Ａから採取した地下水を植種源として用いた場合）、図７（現場Ｂから採取した地下水を植種源として用いた場合）、及び図８（現場Ｃから採取した地下水を植種源として用いた場合）に示す。図６〜図８は、培養容器２１内の気相の塩素化エチレン又はエチレンの濃度を測定した結果を表すグラフであり、横軸は培養開始後の経過日数を表し、縦軸は、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を表す。図６、図７及び図８のいずれにおいても、培養開始後、シス−１，２−ジクロロエチレンが分解されるに従い、塩化ビニルの濃度の上昇はあまり認められなかった。塩化ビニルの濃度は、２０〜３０μＭ程度にまで上昇するのみであった。このことは、上述した培養方法により得られた微生物群は、シス−１，２−ジクロロエチレンを分解する能力を有しており、シス−１，２−ジクロロエチレンを塩化ビニルにまで分解した後に、エチレンに分解するのではなく、シス−１，２−ジクロロエチレンを塩化ビニルに分解しながら、同時に塩化ビニルをエチレンに分解していることがわかる。

参考例２
参考例１における培養容器２０の培養液１ｍＬを、参考例１と同様に植え継ぎを行った。すなわち、参考例１の培養容器２０の培養液（現場Ｃから得られら地下水を受け継いだもの）１ｍＬを、シス−１，２−ジクロロエチレンを約６０μＭの濃度で含有する培地に植え継ぎ、この操作を更に３回繰り返し、合計８回の植え継ぎを行った。

８回目の植え継ぎを行った培養容器（液体培地中にシス−１，２−ジクロロエチレンを含有する培養容器）について、参考例１と同様にして、ガスクロマトグラフィーにより、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの測定を行った。その結果を図９に示す。図９は、培養容器内の気相のシス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した結果を表すグラフであり、横軸は培養開始後の経過日数を表し、縦軸は、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を表す。

図９から明らかなように、培養開始後、シス−１，２−ジクロロエチレンの濃度は低下するに従い、塩化ビニルの濃度が上昇し、培養を継続しても、この塩化ビニルの濃度は低下せず、エチレンの濃度はわずかに上昇したのみであった。この結果は、植え継ぎを更に繰り返すことにより、微生物群がシス−１，２−ジクロロエチレンを含有する液体培地で集積培養されることで、シス−１，２−ジクロロエチレンから塩化ビニルへの分解を担う微生物群が優占的に増殖し、塩化ビニルをエチレンにまで分解することのできる微生物が淘汰され、消滅してしまったものと考えられる。

実施例２
実施例１における培養容器２０の培養液１ｍＬを、参考例１と同様に植え継ぎを行った。すなわち、実施例１の培養容器２０の培養液（現場Ｃから得られら地下水を受け継いだもの）１ｍＬを、塩化ビニルを約６０μＭの濃度で含有する培地に植え継ぎ、この操作を更に３回繰り返し、合計８回の植え継ぎを行った。

８回目の植え継ぎを行った培養容器（液体培地中にシス−１，２−ジクロロエチレンを含有する培養容器）について、実施例１と同様にして、ガスクロマトグラフィーにより、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの測定を行った。結果は図示しないが、実施例１の図８と同様な結果が得られた。このことは、塩化ビニルを含有する液体培地を用いて植え継ぎを行うことにより、高濃度の塩化ビニルを中間生成物として生ずることなく、かつ植え継ぎを繰り返しても安定にシス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルの分解能を維持できることがわかった。

上述した培養方法によれば、塩化ビニルを蓄積することなく、シス−１，２−ジクロロエチレンを効率良く分解することができる、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群を培養することができ、この培養方法により、塩化ビニルを蓄積することなく、シス−１，２−ジクロロエチレンを効率よく分解することのできる、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群のスクリーニングを行うことができる。

本発明のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法の手順を示す図である。 実施例で行った培養方法の手順を示す図である。 培養容器内の気相のシス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した結果を表すグラフである。 培養容器内の気相のシス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した結果を表すグラフである。 培養容器内の気相のシス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した結果を表すグラフである。 培養容器内の気相のシス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した結果を表すグラフである。 培養容器内の気相のシス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した結果を表すグラフである。 培養容器内の気相のシス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した結果を表すグラフである。 培養容器内の気相のシス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの濃度を測定した結果を表すグラフである。

符号の説明

１０ 培養容器 １２ 培養容器
１４ 培養容器 １５ 培養容器
１６ 培養容器 １７ 培養容器
１８ 培養容器 １９ 培養容器
２０ 培養容器 ２１ 培養容器

Claims (3)

1. 塩素化エチレンにより汚染された、デハロコッコイデス（Dehalococcoides）属細菌が増殖している汚染現場より採取した地下水及び／又は土壌を含む植種源を、シス−１，２−ジクロロエチレンを含有する液体培地で、該液体培地内のシス−１，２−ジクロロエチレンが検出されなくなるまで培養した培養液を、塩化ビニルを含有する液体培地を用いて植え継ぎを行なうことにより、高濃度の塩化ビニルを中間生成物として生ずることなく、かつ植え継ぎを繰り返しても安定にシス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルの分解能が維持できることを特徴とする、シス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法。
2. 塩化ビニルを含有する液体培地における培養を、塩化ビニルが検出されなくなるまで行う、請求項１に記載のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法。
3. 塩化ビニルを含有する液体培地中の塩化ビニルの濃度が１〜１００ｍｇ／Ｌである、請求項１又は２に記載のシス−１，２−ジクロロエチレン分解微生物群の培養方法。
   

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