JP4870469B2

JP4870469B2 - ペプチド

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Publication number: JP4870469B2
Application number: JP2006125283A
Authority: JP
Inventors: 由紀子國枝; 聡志日暮; 睦美元賣; 博昭松山; 篤芹澤; 浩川上
Original assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Current assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2012-02-08
Anticipated expiration: 2026-04-28
Also published as: JP2007254448A

Description

本発明は乳タンパク質に由来する抗酸化作用を有するペプチドに関する。また、本発明は、該ペプチドを有効成分とする抗酸化剤および該ペプチドを配合した抗酸化用飲食品または飼料に関する。
さらに、本発明は、乳タンパク質に由来するアディポネクチン産生促進作用を有するペプチドに関する。さらにまた、本発明は、該ペプチドを有効成分とするアディポネクチン産生促進剤および該ペプチドを配合したアディポネクチン産生促進用飲食品または飼料に関する。

不飽和脂肪酸の酸化によって生じる過酸化物やフリーラジカルは、食品の風味や栄養価等を損ない、品質の劣化を引き起こすだけではなく、生体においては、その強い酸化力により細胞内のタンパク質や遺伝子DNAを傷つけるとともに、細胞膜を構成する脂質を攻撃して、毒性の強いハイドロパーオキサイド等の過酸化脂質を作り、細胞損傷や組織障害を惹き起こすといわれている。こうした活性酸素やフリーラジカルによる生体への有害な作用の蓄積が、老化を促進したり、ガンや動脈硬化、心臓病をはじめとする、いわゆる生活習慣病の原因の一つとして関係があることが明らかとなってきた。特に生活習慣病は、食生活と密接な関係にあることから、食事内容の改善による疾病予防の重要性が注目されている。そのため、食品成分による酸化ストレスの防止や抑制の観点から、食品の抗酸化性と食品成分との関係に関する研究や抗酸化性を持つ成分の探索が行われている。

抗酸化性を持つ成分に関しては、植物由来のビタミンやポリフェノール等が以前から知られている。ビタミンに関しては多くの報告があり、特にビタミンＣ、ビタミンＥ及びβ-カロテン等に抗酸化性が認められている。また、ポリフェノールについては、カテキン類やフラボノイド類等が強い抗酸化性をもつことが明らかにされている。さらに、タンパク質のプロテアーゼ加水分解物からも多種多様な抗酸化ペプチドが分離・同定されており、卵白アルブミンの酵素分解物から3種類の抗酸化ペプチドを分離したという報告がある（例えば、非特許文献１参照。）。また、大豆タンパク質のβ-コングリシニンのプロテアーゼ加水分解物から、6種類の抗酸化ペプチドを分離・同定したという報告もある（例えば、非特許文献２参照。）。

一方、乳タンパク質の酵素分解物についてはオピオイド活性作用、カルシウム吸収促進作用、細胞増殖作用、抗菌作用、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害作用等、多くの生理作用が明らかにされている。魚油等のエイコサペンタエン酸含有油脂を水溶性タンパク質溶液により乳化して魚油臭を抑制する方法（例えば、特許文献１参照。）や、高度不飽和脂肪酸含有油脂を乳の部分加水分解物により乳化し、酸化安定性の高い高度不飽和脂肪酸含有油脂の粉末を得る方法（例えば、特許文献２参照。）が開示されている。また、高度不飽和脂肪酸含有油脂、チーズ及び水を乳化させて抗酸化乳化物を調製して、高度不飽和脂肪酸含有油脂の酸化を防止し、高度不飽和脂肪酸含有魚油由来の魚臭や保存中の異臭をマスキングするという方法（例えば、特許文献３参照。）が開示されている。しかし、これらはいずれも高度不飽和脂肪酸含有油脂に、水溶性タンパク質溶液、乳の部分加水分解物、またはチーズを加えてそれぞれ乳化させた高度不飽和脂肪酸含有油脂の乳化物であって、主体となる高度不飽和脂肪酸含有油脂自体の魚臭や保存中の異臭を防止するものである。しかしながら、高度不飽和脂肪酸含有油脂と混合し乳化させることなく、乳タンパク質由来のペプチド単独で抗酸化性を持つという報告は数少ない。本発明者らはチーズの水溶性ペプチド画分が抗酸化作用を持つことを見出し、特許出願を行った（特許文献４参照。）。また、特定のアミノ酸配列を有するペプチドが抗酸化作用を有することも見出した（特許文献５参照。）。しかしながら、これらのペプチドは特にカビ熟成型のチーズに多く含まれるものである。世界的にチーズの生産量を見ると、乳酸菌のみで熟成したチーズは、カビ熟成型のチーズよりもはるかに多く生産・消費されている。乳酸菌のみで熟成したチーズは、プロセスチーズの原料としても多く利用される。このことから、乳酸菌のみで熟成したチーズにおいて高い抗酸化作用を示すペプチド成分の単離が望まれる。

上述のように、活性酸素やフリーラジカルによる生体への有害な作用の蓄積が、いわゆる生活習慣病の原因の一つとして関係があることが明らかとなっているが、高血圧、高脂血症、糖尿病などの生活習慣病発症・進展の危険因子を予防することが重要である。現在、わが国で、心疾患ならびに脳血管疾患による死亡が、年々増加する傾向にある。脂肪組織はこれまで、エネルギーの貯蔵庫としての役割しか考えられていなかったが、生活習慣病を中心とした代謝異常症候群の病態を考えるうえでの脂肪組織の重要性が、近年、注目されるようになってきた。すなわち、脂肪組織は、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、レプチン、アディポネクチンなどの内分泌因子を分泌し、生体のホメオスタシスの維持に寄与しているが、その産生、分泌の過剰あるいは過少と言ったバランスの破綻が、糖・脂質代謝異常、高血圧、動脈硬化の発症・進展に深く関わっていることが明らかになってきた。
脂肪組織に由来する内分泌因子の一つであるアディポネクチン（Adiponectin）は、２４４個のアミノ酸よりなる、３０ｋＤａのホルモンで、動脈硬化抑制作用などのほかに、肝臓や筋肉における脂肪燃焼を促進する効果があると言われている。また、アディポネクチンには血液中のブドウ糖と脂肪酸が細胞内に取り込まれるのを促進する働きを持っていることが明らかにされている。筋肉や肝臓などに脂肪がたまると、糖分の取り込みが悪くなり糖尿病につながる。しかし、通常、アディポネクチンは、一時的に過剰となった脂肪や糖分を分解することで、体内の栄養バランスを保つとみられ、肥満が進むと、アディポネクチンを分泌する脂肪細胞の働きが弱くなり、体内の栄養バランスが崩れてしまうと言われている。
最近では、合成医薬品による治療よりは、食生活を通じて病状の進展を出来るだけ抑制するような機能を持った食品成分に対する研究も注目されるようになってきている。
アディポネクチンに関しては、アディポネクチンによる肝線維化抑制や正常肝細胞増殖促進効果や抗炎症効果（例えば、特許文献６参照。）が知られており、飲食品由来のアディポネクチン産生促進物としては発酵茶抽出物を有効成分とする組成物（例えば、特許文献７参照。）、アムラーというコミカンソウ属に属する落葉の亜高木抽出物からなる血中脂肪組織特異分泌蛋白増強組成物（例えば、特許文献８参照。）が開示されている。
特開昭６０‐１０２１６８号公報特開平２‐３０５８９８号公報特開平７‐２７４８２３号公報特開２００４‐３５２９５８号特願２００５‐２９４３５８号特開２０００−２５６２０８号公報特開２００２−３６３０９４号公報特開２００６−５６８３６号公報柘植信昭ら、日本農芸化学会誌、65号、p.1635、1991年エッチ・エム・チェンら（Chen, H.M. et al.）, ジャーナル・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（J. Agric. Food Chem.）, 43号, p.574, 1995年

本発明は、食品の風味や栄養価等を損ない、品質の劣化を引き起こすだけではなく、生体においては疾病や老化等に悪影響を及ぼす活性酸素やフリーラジカル等による生体の酸化的障害を抑制するのに有効な抗酸化作用を有するペプチドを提供することを課題とする。また、本発明は、生体においてアディポネクチンの産生を促進させることにより、動脈硬化を抑制し、肝臓や筋肉における脂肪の燃焼を促進するペプチドを提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、次の式（１）〜（３）で表されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドに抗酸化効果があり、しかも低用量で効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 式（１）
His-Pro-Ile-Lys 式（２）
His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 式（３）
すなわち、本発明は、上記の式（１）〜（３）のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる抗酸化作用を持つペプチドに関する。
また、本発明は、乳タンパク質に由来する式（１）〜（３）のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる抗酸化作用を持つペプチドに関する。
さらに、本発明は、式（１）〜（３）のいずれかで表される1以上のペプチドを有効成分とする抗酸化剤に関する。
さらにまた、本発明は、式（１）〜（３）のいずれかで表される1以上のペプチドを配合した抗酸化用飲食品または飼料に関する。
加えるに、本発明者らは、上記の式（１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドはアディポネクチンの産生を促進する効果があり、しかも低用量で効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、上記の式（１）で表されるアミノ酸配列からなるアディポネクチン産生促進作用を持つペプチドに関する。
また、本発明は、乳タンパク質に由来する式（１）で表されるアミノ酸配列からなるアディポネクチン産生促進作用を持つペプチドに関する。
さらに、本発明は、式（１）で表されるペプチドを有効成分とするアディポネクチン産生促進剤に関する。
さらにまた、本発明は、式（１）で表されるペプチドを配合したアディポネクチン産生促進用飲食品または飼料に関する。

本発明の式（１）〜（３）のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる抗酸化作用を持つペプチドは、食品の風味や栄養価等を損ない品質の劣化を惹き起こすだけではなく、生体においては疾病や老化等に悪影響を及ぼす、活性酸素やフリーラジカル等による生体の酸化的障害を抑制するのに有効であり、このペプチドを有効成分とする抗酸化剤として、また、このペプチドを配合した抗酸化用飲食品または飼料として有用である。
また、本発明の式（１）で表されるアミノ酸配列からなるアディポネクチン産生促進作用を持つペプチドは、アディポネクチンの産生を促進するのに有効であり、このペプチドを有効成分とするアディポネクチン産生促進剤として、また、このペプチドを配合したアディポネクチン産生促進用飲食品または飼料として有用である。

本発明に用いることのできるHis-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln、His-Pro-Ile-Lys、あるいはHis-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnで表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、例えばチーズを溶媒に懸濁した後、脱脂、遠心分離によって不溶性物質の除去を行って得ることができる。さらにその得られた画分からタンパク質を除去してもよい。本発明においてチーズを溶媒に懸濁するということは、チーズに溶媒を加えて均質化したり、または溶媒中で破砕したりして、水溶性ペプチド画分を得やすい大きさにすることをいう。溶媒としては、水、リン酸緩衝液等の水性溶媒を用いることができる。その後、透析膜やイオン交換樹脂等によって脱塩を行ってもよいし、さらに、凍結乾燥や噴霧乾燥等によって乾燥させることにより粉末化してもよい。

また、式（１）〜（３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを得るためのチーズ原料としては、パルメザンチーズ、グリュイエールチーズ、マリボーチーズ、ゴーダチーズ、チェダーチーズ、エメンタールチーズ、エダムチーズ、カマンベールチーズ、ブリーチーズ、マンステールチーズ、ポン・レヴェックチーズ、スチルトンチーズ、ダナブルーチーズ、ブルーチーズ等のナチュラルチーズ、及びこれらのナチュラルチーズを原料としたプロセスチーズ等を用いることができるが、熟成度の進んだ乳酸菌熟成型ナチュラルチーズを用いることが望ましい。

さらに、チーズを溶媒に懸濁した後、脱脂、不溶性物質の除去及びタンパク質の除去によって得られる式（１）〜（３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む画分は、Ｃ１８カラムを用いた逆相クロマトグラフィーによりさらに精製することも可能である。本ペプチドを含む画分をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）等の酸性条件下あるいは蒸留水等の中性条件下でＣ１８カラムに通した時に、抗酸化活性を有する画分は、カラムに吸着されない透過画分と、カラムに吸着されて80％アセトニトリルで溶出されてくる画分に主として分かれる。
さらに、このペプチドを含む画分を蒸留水で溶解した後、ＹＭＣ-ＰａｃｋＯＤＳ-Ａカラム（4.6mm×150mm；ＹＭＣ社）を用いて逆相ＨＰＬＣに供してペプチドを分画する。クロマトグラフィーは、溶媒（Ａ液：50mM酢酸アンモニウム水溶液；Ｂ液：80％アセトニトリル）、濃度勾配（12％Ｂ→60％Ｂ,60min）、流速0.8ml/min、検出波長215nmの条件で行うことが望ましい。

本発明の式（１）〜（３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び該ペプチドを含む画分は、飲食品に配合して飲食品の品質劣化防止に使用することができる。飲食品に配合する場合は、チーズを水中で摩砕した後、脱脂、遠心分離によって不溶性物質の除去を行って、さらにタンパク質を除去することにより得たチーズの水溶性ペプチドをそのまま配合することができるし、透析膜やイオン交換樹脂等によって脱塩を行ったもの、さらに、凍結乾燥や噴霧乾燥等によって乾燥を行い粉末化したものも配合することができる。また、合成して得られたペプチドについても利用可能である。

本発明の式（１）〜（３）で表されるアミノ酸配列からなる抗酸化作用を持つペプチド及び該ペプチドを含む画分は、経口あるいは非経口的に投与して、生体において活性酸素やフリーラジカル等を消去することにより疾病や老化等の進行を防止することができる。また、本発明の式（１）で表されるアミノ酸配列からなるアディポネクチン産生促進作用を持つペプチド及び該ペプチドを含む画分は、経口あるいは非経口的に投与して、生体においてアディポネクチン産生を促進することにより動脈硬化を抑制し、肝臓や筋肉における脂肪の燃焼を促進することができる。経口あるいは非経口的に投与する場合、本発明の抗酸化作用あるいはアディポネクチン産生促進作用を持つペプチドの剤形としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、丸剤、トローチ、舌下剤または液剤等の経口投与用の製剤、あるいは、注射剤、座剤等の非経口投与用の製剤を例示することができる。

本発明の式（１）〜（３）で表されるアミノ酸配列からなる抗酸化作用を持つペプチド、あるいは本発明の式（１）で表されるアミノ酸配列からなるアディポネクチン産生促進作用を持つペプチドの経口による投与量は、治療や予防の目的、症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定すればよいが、通常、成人1日あたり、式（１）〜（３）で表されるアミノ酸配列からなる抗酸化作用を持つペプチド、あるいは本発明の式（１）で表されるアミノ酸配列からなるアディポネクチン産生促進作用を持つペプチドとして10μg〜500mg投与すれば、疾病や老化等に悪影響を及ぼす活性酸素やフリーラジカル等による生体の酸化的障害を抑制する、あるいは、アディポネクチン産生を促進する効果が得られる。このように本発明は低用量で効果がある。

また、本発明の式（１）〜（３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドは、それらを配合した飲食品または飼料を経口摂取することによって生体内で抗酸化作用あるいはアディポネクチン産生促進作用を発揮するだけでなく、飲食品または飼料に配合した飲食品または飼料自体の酸化による劣化をも防ぐ。本発明の抗酸化用あるいはアディポネクチン産生促進用飲食品としては、チーズ、バター、乳飲料、清涼飲料、ジュース、ヨーグルト、ゼリー、パン、アイスクリーム、麺、ソーセージ、育児用調製乳や離乳食等を挙げることができる。

さらに、本発明の式（１）〜（３）で表されるアミノ酸配列からなる抗酸化作用を持つペプチドは、各ペプチド1種だけを有効成分として抗酸化剤としたり、1種だけを配合して抗酸化用飲食品または飼料とすることもできるが、各ペプチド1種以上を有効成分として抗酸化剤としたり、1種以上を配合して抗酸化用飲食品または飼料とすることもできる。

以下に実施例及び試験例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

（ゴーダチーズのペプチドの調製）
ゴーダチーズ40gに蒸留水160mlを加え、ワーリングブレンダー（日本精機製作所）で15分間摩砕した後、ポリトロンホモジナイザー（キネマチカ社）で30秒間さらに破砕した。破砕時に生じた乳脂肪を取り除き、得られたチーズスラリーから遠心分離（6,000×g、20min、4℃）で不溶物を除き、上清をろ紙（No.113；ワットマン社）によりろ過した。得られたろ過液にエタノールを70％濃度になるように加え、4℃で一晩静置した後、遠心分離（9,000×g、20min、4℃）により不溶物を除去し、エバポレーターでエタノールを除いた後、凍結乾燥してゴーダチーズの水溶性ペプチド画分を得た。
この水溶性ペプチド画分を蒸留水で溶解した後、ＹＭＣ-ＰａｃｋＯＤＳ-Ａカラム（ＹＭＣ社；4.6mm×150mm）を用いて逆相ＨＰＬＣに供し、水溶性ペプチド精製画分に分画した。クロマトグラフィーは、溶媒（Ａ液：50mM酢酸アンモニウム水溶液；Ｂ液：80％アセトニトリル）、濃度勾配（12％Ｂ→60％Ｂ,60 min）、流速0.8ml/min、検出波長215nmの条件で行った。結果を図１に示す。分画した画分の抗酸化活性を以下に示す試験例１の方法で測定したところ、クロマトグラムの矢印の画分に強い抗酸化活性が確認された。
得られたゴーダチーズのペプチドについて、液体クロマトグラフ質量分析計（サーモエレクトロン社）を用いて分子量を推定し、ペプチドシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ社）でアミノ酸配列を解析したところ、図１の矢印で示される6番がHis-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnなる配列であることが確認された。
このようにして得られたペプチドは、そのまま本発明の抗酸化剤あるいはアディポネクチン産生促進剤として利用可能である。

［試験例１］
（ペプチドの抗酸化活性測定）
実施例１で分画したペプチドについて、リノール酸の酸化物がβ-カロテンを退色させる作用を利用する方法で抗酸化活性を測定した。すなわち、β-カロテン溶液（1mg/mlクロロホルム）0.5ml、リノール酸溶液（100mg/mlクロロホルム）0.2ml、ツイーン40溶液（200mg/mlクロロホルム）1.0mlを300 m1の三角フラスコに入れ、窒素ガスでクロロホルムを完全に除去した後、100mlの蒸留水を加えて溶解した。さらに、0.2Mリン酸緩衝液(pH7.0) 9.0 mlを添加して、リノール酸・β-カロテン溶液を調製した。次に、あらかじめペプチド画分0.02 mlを分注した98穴マイクロウェルプレートに、上記のリノール酸・β-カロテン溶液0.18 mlを加え、直ちに490 nmの吸光度（S₀）を測定した。なお、リノール酸・β-カロテン溶液の調製に際しては、S₀が1.2程度(1.1〜1.3)になるようにβ-カロテン溶液の添加量を適宜増減した。S₀測定後、直ちにマイクロウェルプレートを50℃の恒温槽に入れ、30分間インキュベートした。インキュベート終了後、直ちに吸光度(S₃₀)を測定し、30分間における490 nmの吸光度の低下量、ΔS＝S₀−S₃₀を算出した。ブランクには試料の代わりに70％エタノールを用い、同様の操作を行なった。すなわち、リノール酸・β-カロテン溶液を加えた直後の吸光度（B₀）、及び50℃、30分間保持した後の吸光度（B₃₀）を測定し、30分間における490 nmの吸光度の低下量、ΔB＝B₀−B₃₀を求めた。抗酸化活性は次の式に代入し、抗酸化率（％）として表した。

［数１］
抗酸化率（％）＝〔ΔB−ΔS〕/(ΔB)×100

なお、ポジティブコントロールとして、筋肉由来抗酸化活性ペプチドであるカルノシン（β-Ala-L-His；ペプチド研究所）を0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/mlに調製したものを用いた。

精製ペプチド及びポジティブコントロールとしてのカルノシンの抗酸化活性を測定した結果を表１に示す。

［表１］
抗酸化活性（％）
----------------------------------------------------------------------
サンプル濃度 (μg/ml) 0.01 0.1 1
----------------------------------------------------------------------
カルノシン (Ala-His) 32.9 57.8 78.3
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 13.0 41.0 64.6
----------------------------------------------------------------------

表１に見られるように、ペプチドを添加すると、濃度依存的な抗酸化活性を示した。
以上、本試験例の結果によりHis-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnで表されるアミノ酸配列からなるチーズ由来のペプチドには抗酸化活性（ラジカルスカベンジャー活性）が認められ、活性酸素や過酸化脂質による酸化的細胞障害の予防・改善に有用であることがわかった。

（ペプチドの合成）
上記の式（1）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドについて、ペプチドシンセサイザーにて合成を行った。ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（アプライド・バイオシステムズ社）により、パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基としてＣ末端側からペプチド鎖を順次延長することにより0.25mmolスケールで直鎖保護ペプチドを合成した。得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチドをフェノール、１，２−エタンジチオール、チオアニソール存在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりペプチドのＨＭＰ樹脂からの切り離しと保護基の除去を同時に行った。減圧濃縮によりＴＦＡを除去した後、エチルエーテルで粗ペプチドを結晶化させ、これを５％酢酸に溶解し凍結乾燥を行った。
得られた直鎖粗ペプチドを、ＹＭＣ-ＰａｃｋＯＤＳ-Ａカラム（ＹＭＣ社；4.6mm×150mm）を用いたＨＰＬＣに供した。クロマトグラフィーは、溶媒（Ａ液：50 mmol 酢酸アンモニウム水溶液；Ｂ液：80％アセトニトリル）、濃度勾配（12％Ｂ→60％Ｂ,60 min）、流速0.8ml/min、検出波長215nmの条件で行った。得られた直鎖精製ペプチドの純度は、ＨＰＬＣによる分析の結果98％であった。結果を図２に示す。
このようにして得られたペプチドは、そのまま本発明の抗酸化剤あるいはアディポネクチン産生促進剤としてとして利用可能である。

［試験例２］
（合成ペプチドの抗酸化活性測定）
実施例２で得られたペプチドについて試験例１と同様の方法で抗酸化活性を測定した。ポジティブコントロールとして、筋肉由来抗酸化活性ペプチドであるカルノシン（β-Ala-L-His；ペプチド研究所）及びカテキン（和光純薬工業社）を1μm、10μm、100μm、に調製したものを用いた。合成ペプチドの抗酸化活性を評価した結果を表２及び図３に示す。表２及び図３に示されるように、得られた合成ペプチドに強い抗酸化活性が確認された。

［表２］
抗酸化活性（％）
---------------------------------------------------------------------
サンプル濃度 (μm) 1 10 100
---------------------------------------------------------------------
カテキン 52.65 84.45 97.17
カルノシン 7.07 21.2 48.41
合成ペプチド 32.86 61.13 63.6
---------------------------------------------------------------------

（トリプシン消化物の調製）
実施例２で得られたペプチドのトリプシン消化物を調製した。
実施例２で得られたペプチドおよびトリプシン（シグマアルドリッチジャパン社）を、それぞれ1mg/mlになるように酵素反応溶液（50 mM Tris-HCl、20mM CaCl_２、pH8.0）に溶解した。ペプチド溶液500μlに、トリプシン溶液を5μl添加して、37℃で2時間反応させた後、さらにトリプシン溶液を5μlを加えて、37℃で18時間反応させてトリプシン消化物を得た。
このトリプシン消化物を蒸留水で溶解した後、ＹＭＣ-ＰａｃｋＯＤＳ-Ａカラム（ＹＭＣ社；4.6mm×150mm）を用いてＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ分析は実施例２のトリプシン消化前のペプチドと同じ条件で行った。結果を図４に示す。図に示されるように２つのピークに分かれた。
トリプシンで分解された２つのフラグメント(His-Pro-Ile-Lys、ペプチド１)及び（His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln、ペプチド２)に相当する２つのピークを、それぞれ10回分回収し、遠心エバポレーターを用いて乾燥して、トリプシン消化物である２種のペプチドを得た。得られた２種のペプチド及び分画前のトリプシン消化物の抗酸化活性を以下に示す試験例３の方法で測定したところ、図５に示されるように、合成ペプチドに強い抗酸化活性が確認された。
このようにして得られた抗酸化作用を持つペプチドは、そのまま本発明の抗酸化剤として利用可能である。

［試験例３］
（ペプチドの抗酸化活性測定）
実施例３で得られたトリプシン消化物である２種のペプチド及び分画前のトリプシン消化物について試験例２と同様にカロテン退色法を用いて抗酸化活性を測定した。ペプチド濃度はそれぞれのペプチドを500μlの純水に溶解して、Micro BCA Protein assay kit(ピアース社)を用いて測定した。ポジティブコントロールとして、試験例２と同様に、カルノシン（β-Ala-L-His；ペプチド研究所）及びカテキン（和光純薬工業社）を用いた。各フラグメントについて1ng/ml、10ng/ml、100ng/mlの希釈系列を調製し、βカロテン退色法を用いて抗酸化活性を評価した。トリプシン消化ペプチドの抗酸化活性を評価した結果を図５に示す。図５に示されるように、得られたトリプシン消化ペプチドに強い抗酸化活性が確認された。

［試験例４］
（ペプチドの脂肪細胞投与実験）
実施例１で得られたチーズから分離されたペプチドについて、初代培養内蔵脂肪細胞への投与実験を行った。
ラットの初代培養内臓脂肪細胞(VAC01、セルガレージ社)及び内蔵脂肪細胞分化誘導培地(セルガレージ社)を用いて実験を行った。セルガレージ社のプロトコルに従って凍結保存した細胞を融解し、24穴プレートに播種した日をday0とし、day2、day5、day7に合成ペプチドを溶解した培地(ペプチド濃度:100μM、50μM、10μM、0μM)を加え、8日間培養した。day5、day7、day8に培養上清を回収し、アディポネクチン濃度を測定した。また、day8に細胞を回収し、細胞内のグリセロール 3-リン酸脱水素酵素（GPDH）酵素活性及び各ウエルのDNA量、細胞内蓄積脂肪量を測定した。GPDHはグルコースからトリグリセリドを合成する際に働く酵素で、成熟脂肪細胞が発現する。今回の培養系では、脂肪前駆細胞を分化させると同時に本発明のペプチドを投与してその影響を見た。
DNA量は、セルガレージ社のDNA定量キットを用い、定量を行った。
細胞内のグリセロール 3-リン酸脱水素酵素（GPDH）酵素活性は、セルガレージ社のGPDH活性測定キットを用い、セルガレージ社プロトコルに従って測定を行った。測定結果は各ウエルから抽出したDNA量で標準化した。
アディポネクチン濃度の測定は、大塚製薬社のアディポネクチンELISAキットを用い、培養上清中のアディポネクチン濃度を測定した。測定結果は各ウエルから抽出したDNA量で標準化した。
細胞内蓄積脂肪の定量は、セルガレージ社の脂肪染色キットを用い、オイルレッド０による脂肪染色および吸光度測定による蓄積脂肪定量を行った。

（ペプチドの脂肪細胞投与実験結果）
各ウエルの細胞由来DNAを定量した結果、Student`s ｔ-testでは、本発明ペプチド無添加群と添加群の細胞DNA量に有意差は検出されなかった。
GPDH活性(単位DNA量あたり)を測定した結果、各ウエルの細胞DNA量で標準化したGPDH活性において、ペプチド無添加群よりも本発明ペプチド10μMまたは50μM添加群で有意に高い活性が見られた。ペプチド100μM添加群と、無添加群との有意な差は検出されなかった。
培養日数によるアディポネクチン濃度変化の測定結果では、培養7日目でアディポネクチン産生量は最大になるが、8日目では急激に減少することがわかった。培養上清中のアディポネクチン濃度が最も高かったday7で、投与したペプチド濃度の違いによるアディポネクチン産生量の違い(単位DNA量あたり)を図６に示す。
ペプチド無添加で培養した細胞よりもペプチドを添加した細胞のほうが、アディポネクチンを有意に多く産生していた。この傾向は、特にペプチド濃度10μMもしくは50μMで添加したものにおいて顕著に見られた。
培養8日目に、オイルレッド０による脂肪染色および吸光度測定による蓄積脂肪量の定量を行った結果を図７に示す。
脂肪細胞の染色には固定が必要であるため、脂肪定量を行ったウエルの細胞数(細胞DNA量)を定量することはできない。しかし、同じ条件で培養した細胞のDNA定量結果から、ペプチド添加による細胞数への影響が見られなかったことから、各ウエルにはほぼ同数の細胞が存在すると推測される。Student`ｓｔ-testでは、ペプチド無添加で培養したものと、ペプチドを加えて培養したものの脂肪蓄積量に有意な差は見られなかったが、ペプチドを100μM添加した細胞では、図７に示されるように脂肪蓄積量がやや減少する傾向が見られた。

（ペプチドの脂肪細胞投与実験まとめ）
脂肪前駆細胞に本発明のペプチドを10〜50μM添加して培養すると
（1）GPDH活性が上がり、
（2）アディポネクチン産生量も増加するが、
（3）脂肪蓄積量には変化がなかった。
この場合、ペプチド添加によって脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化が促進されているか、もしくは分化した熟成脂肪細胞における脂肪合成活性が促進されていると考えられる。しかしながら、ペプチド無添加の細胞と脂肪蓄積量には差がなかったことから、何らかの別の分子メカニズムにより、合成された脂肪は分解されている可能性がある。アディポネクチンは、成熟脂肪細胞から分泌される善玉サイトカインであり、本発明のペプチド添加によってこのアディポネクチン産生促進効果が確認された。以上のことから、本発明のペプチドには、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への機能的分化を促し、アディポネクチンの産生量を増加させる作用があることが認められ、また、細胞への脂肪蓄積は抑制する効果がある可能性が示唆された。
アディポネクチンには動脈硬化抑制作用などのほかに、肝臓や筋肉における脂肪燃焼を促進する効果があると言われている。本発明のペプチドには、アディポネクチンを産生しやすい脂肪細胞をつくり、メタボリックシンドロームを予防する働きがあることが考えられる。
一方、脂肪前駆細胞に本発明のペプチドを100μM添加して培養すると
（1）GPDH活性には変化がなく、
（2）アディポネクチン産生量は増加し、
（3）脂肪蓄積量には変化がない（有意な差はないが、減少傾向が見られるようである）。
これらの結果から、脂肪細胞に対する本発明のペプチドの効果には濃度によって違いがあり、至適濃度が存在する可能性が示唆された。いずれにしても、本発明のペプチド添加により、アディポネクチン産生量を促進する作用が確認された。また、脂肪蓄積量抑制効果があることには違いなく、本発明ペプチドにメタボリックシンドローム予防効果がある可能性が示された。
なお、このHis-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnで表されるアミノ酸配列からなるペプチドのトリプシン分解物であるHis-Pro-Ile-Lys及びHis-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnで表されるアミノ酸配列からなるペプチドについても、同様のアディポネクチン産生量を促進する作用が確認された。

（錠剤の製造）
実施例1で得られた抗酸化ペプチド（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro -Gln）20重量％、乳糖（ＤＭＶ社）46重量％、結晶セルロース（和光純薬工業社）31重量％、水3重量部を十分混合した後、打錠機（富士薬品機械社製）により打錠し、本発明の抗酸化用錠剤を製造した。

（果汁飲料の製造）
表３に示した組成で各成分を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の実施例２で得られた合成抗酸化ペプチド（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly- Leu-Pro-Gln）を配合した本発明の抗酸化用果汁飲料を製造した。

［表３］
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混合異性化糖 15.4 (重量％)
果汁 10.0
クエン酸 0.5
抗酸化ペプチド
（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln) 0.1
香料 0.2
水 73.8
-----------------------------------------------------------

（清涼飲料水の製造）
表４に示した組成で各成分を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の実施例３で得られたトリプシン消化ペプチド(His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln)を配合した本発明の抗酸化用清涼飲料水を製造した。

［表４］
---------------------------------------------------------
マルチトール 7.5 (重量％)
50％乳酸溶液 0.12
抗酸化ペプチド(His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln) 0.1
香料 0.2
水 92.08
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（清涼飲料水の製造）
表５に示した組成で各成分を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の実施例３で得られたトリプシン消化ペプチド(His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln及びHis-Pro-Ile-Lys)を配合した本発明の抗酸化用清涼飲料水を製造した。

［表５］
--------------------------------------------------------
マルチトール 7.5 (重量％)
50％乳酸溶液 0.12
抗酸化ペプチド(His-Pro-Ile-Lys) 0.05
抗酸化ペプチド(His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln) 0.05
香料 0.2
水 92.08
---------------------------------------------------------

（ビスケットの製造）
表６に示す組成のドウを作成し、成形した後、焙焼して本発明の実施例１で得られたペプチド（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln ）を配合した本発明の抗酸化用ビスケットを製造した。

［表６］
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小麦粉 51.0 (重量％)
砂糖 20.0
食塩 0.5
マーガリン 12.5
卵 12.5
水 2.5
ミネラル混合物 0.8
抗酸化ペプチド(実施例１) 0.2
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（イヌ飼育用飼料の製造）
表７に示す組成で各成分を混合し、本発明の実施例１で得られた抗酸化ペプチド（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln ）を配合した本発明のイヌ飼育用飼料を製造した。

［表７］
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大豆粕 12.0 (重量％)
脱脂粉乳 14.9
大豆油 4.0
コーン油 2.0
パーム油 28.0
とうもろこし澱粉 15.0
小麦粉 8.0
ふすま 2.0
ビタミン混合物 9.0
ミネラル混合物 2.0
セルロース 3.0
抗酸化ペプチド(実施例１) 0.1
----------------------------------------------------

（錠剤の製造）
実施例1で得られた抗酸化ペプチド（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro -Gln）20重量％、乳糖（ＤＭＶ社）46重量％、結晶セルロース（和光純薬工業社）31重量％、水3重量部を十分混合した後、打錠機（富士薬品機械社）により打錠し、本発明のアディポネクチン産生促進用錠剤を製造した。

（果汁飲料の製造）
表８に示した組成で各成分を混合し、容器に充填した後、加熱殺菌して、本発明の実施例２で得られた合成ペプチド（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly- Leu-Pro-Gln）を配合した本発明のアディポネクチン産生促進用果汁飲料を製造した。

［表８］
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混合異性化糖 15.4 (重量％)
果汁 10.0
クエン酸 0.5
ペプチド
（His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln) 0.1
香料 0.2
水 73.8
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ゴーダチーズを原料とする水溶性ペプチド画分の分離クロマトグラムを示す（実施例１）。合成ペプチド画分の分離クロマトグラムを示す（実施例２）。合成ペプチド画分の抗酸化活性評価を示す（実施例２、試験例２）。トリプシン消化後のペプチド画分の分離クロマトグラムを示す（実施例３）。トリプシン消化後のペプチド画分の抗酸化活性評価を示す（実施例３、試験例３）。ペプチド濃度の違いによるアディポネクチン産生量 (単位DNA量あたり)を示す（実施例１、試験例４）。ペプチド濃度の違いによる蓄積脂肪量を示す（実施例１、試験例４）。

符号の説明

［図１］矢印は本発明のHis-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnなるアミノ酸配列を示す。
［図４］図中１は本発明のHis-Pro-Ile-Lysなるアミノ酸配列を、図中２は本発明のHis-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnなるアミノ酸配列を示す。
［図５］ペプチド消化物１は本発明のHis-Pro-Ile-Lysなるアミノ酸配列を、ペプチド消化物２は本発明のHis-Gln-Gly-Leu-Pro-Glnなるアミノ酸配列を示す。

Claims

次の式（１）から（３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの1以上のペプチドを有効成分とする抗酸化剤。
His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 式（１）
His-Pro-Ile-Lys 式（２）
His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln 式（３）