JP4896445B2

JP4896445B2 - ニンニク処理物を含む腺癌を予防及び／又は治療するための組成物

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Publication number: JP4896445B2
Application number: JP2005183990A
Authority: JP
Inventors: 貞次塚本; 裕治唐崎; 孝二岡元
Original assignee: 鳥越製粉株式会社
Priority date: 2004-06-23
Filing date: 2005-06-23
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2025-06-23
Also published as: JP2006206573A

Description

本発明は、ニンニク処理物を含む腺癌を予防及び／又は治療するための組成物、その製造方法ならびに該組成物を含む食品及び飼料に関する。

癌は、生活習慣病の中でも依然として死亡率が最も高く、特効薬がないため、その予防及び治療に関する研究は以前にも増して活発に行われている。現在、癌患者に対して用いられている医薬品には、ナイトロジェンマスタードやシクロホスファミドのようなアルキル化剤、６−メルカプトプリンやアザチオプリンのようなプリン代謝拮抗物質、５−フルオロウラシルやシラビタンのようなピリミジン代謝拮抗物質、メトトレキサートやアミノプテリンのような葉酸代謝拮抗物質、マイトマイシンＣやブレオマイシンのような抗癌性抗生物質などがあるが、いずれも核酸合成系を抑制することから、正常細胞に対して毒性を示し、造血障害などの副作用を引き起こす。また、抗癌活性がある食品として、アガリクス茸やメシマコブのような免疫賦活作用を有する多糖類を多く含有する健康食品が市販されており、世間的にも癌の予防及び治療に対する意識は高く、高い抗癌活性を有する医薬品や健康食品の開発が望まれている。

一方、ニンニクは、古来より調味料や香辛料として利用されているが、近年、その中に種々の生理活性成分が含まれていることが明らかとなり、健康食品及び医薬品として広く使用されている。例えば、特許文献１では、ニンニクから分離精製したアリシンが、前立腺癌及び膀胱癌の治療又は予防に有効であることを報告している。

特許文献２には、ニンニク由来のレクチンとその他の物質を含む混合物が癌細胞増殖抑制効果を有することが報告されている。しかし、特許文献２は、当該混合物のリンパ球系癌細胞Ｕ９３７に対する増殖抑制効果について試験しているに過ぎず、ニンニク由来レクチンが、造血器癌以外の癌に対して抗癌作用を有すること、ならびに癌種に対して選択的な抗癌作用を有することについては知られていなかった。

特開２００１−３０２５３１号公報特開２００４−２３１５６５号公報

本発明は、癌を予防及び／又は治療するための組成物、これを含む食品及び飼料、ならびにその製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ニンニク由来のレクチンが癌種に選択的な抗癌活性を有すること、特に腺癌に対する抗癌活性を有することを見いだし、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ニンニクレクチンを固形成分に対して２質量％以上含有するニンニク処理物を有効成分とする腺癌を予防及び／又は治療するための組成物。
（２）ニンニク処理物がニンニク抽出物である（１）記載の組成物。
（３）腺癌が、消化器癌である（１）又は（２）記載の組成物。
（４）消化器癌が、胃癌又は大腸癌である（３）記載の組成物
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物を含有する、腺癌を予防及び／又は治療するための食品。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物を含有する、腺癌を予防及び／又は治療するための飼料。

本発明により、腺癌を予防及び／又は治療するための組成物、これを含む食品及び飼料、ならびにその製造方法が提供される。

本発明においてニンニクとは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、すなわち、ユリ科(Liliaceae)、アリウム(Allium)属に属するアリウム・サチバム・リンネ(Allium sativum L.)を意味する。

本発明において、ニンニクレクチンとは、ニンニクに由来するレクチンを意味し、ニンニクに含まれるレクチン、ニンニクから得られるレクチン及びニンニクから抽出したレクチンなどを含む。本発明において、ニンニクレクチンは、その分子量が、通常２００００〜２５０００Ｄａ、好ましくは２１０００〜２４０００Ｄａ、より好ましくは約２３０００Ｄａである。また、本発明においてニンニクレクチンは、通常、１１０００〜１２０００Ｄａのサブユニットからなるダイマー構造をとっていると考えられる。本発明においてニンニクレクチンは、好ましくは表２に表されるアミノ酸構成を有する。また、Ｎ−末端付近のアミノ酸配列（１〜３６アミノ酸）は、通常、ＲＮＩＬＭＮＧＥＧＬＹＡＧＥＳＬＤＶＥＰＹＨＦＩＭＱＤＤＣＮＬＶＬＹＸＨ（配列番号１）である。

本発明において、ニンニク処理物とは、ニンニクから製造され、かつニンニクレクチンを含むものであれば特に制限されない。本発明においてニンニク処理物には、乾燥ニンニク粉末、ニンニク抽出物、ニンニク抽出物の乾燥粉末等が含まれる。本発明において、ニンニク処理物は、ニンニクのうち、鱗茎部に由来するものが好ましい。

乾燥ニンニク粉末は、当技術分野において通常用いられる方法、例えば、天日乾燥、加温もしくは加熱室での乾燥、熱風乾燥、凍結乾燥法などにより製造できる。

ニンニク抽出物を得るための処理方法は、当技術分野において通常用いられる方法を使用できる。ニンニクの抽出は、通常０〜７０℃、好ましくは５〜６０℃、より好ましくは１０〜５０℃の温度で、通常１分以上、好ましくは５分〜２４時間行う。短時間で行う場合には、加圧下で抽出を行ってもよい。抽出に用いる溶媒としては、水、３５％以下のアルコール、ｐＨ４．５〜１０の緩衝液等を使用できる。水としては、蒸留水、精製水、イオン交換水、水道水等いずれも使用できる。生のニンニク１質量部に対して、溶媒を０．１〜１０質量部、好ましくは０．５〜５質量部、より好ましくは１質量部を使用する。抽出にあたっては、ニンニクを粉砕することが必要であり、ニンニクの粉砕は加熱前に行うのが好ましい。

得られたニンニク抽出液はそのまま直接に使用することもでき、あるいは、さらに濃縮して流動エキス又は濃縮乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥もしくは凍結乾燥等の慣用の乾燥手段により粉末として使用してもよい。

また、本発明においてニンニク処理物は、以下の方法により調製したものが好ましい。ニンニクに水を加え、ミキサーなどにより粉砕する。このとき水は、好ましくはニンニクの質量と同量加える。これをガーゼ、濾紙や布等で濾過し、濾液を通常３０〜１００℃、好ましくは６０〜１００℃、より好ましくは８０〜１００℃にて、通常５分〜１０時間、好ましくは１０分〜１時間、より好ましくは２０〜４０分加熱する。これを冷却後、遠心分離にかけ上澄みを得る。遠心分離の条件は、通常３０００〜１５０００ｒｐｍで、５分〜１５分程度である。これを塩析し、通常０〜３０℃、好ましくは０〜１０℃で放置する。塩析は、例えば、硫酸アンモニウムを加えることにより実施できる。その後、再び同様の条件で遠心分離し、沈殿を得る。この沈殿を通常、水又はｐＨ４．５〜１０の緩衝液に溶かし、不溶物を遠心分離によって除去する。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液等を使用できる。

好ましくは、得られた処理物をさらに、同緩衝液で平衡化したカラムにかけゲル濾過を行い、２８０ｎｍの吸光度を測定し、二番目のピーク部分を集める。

本発明において、ニンニク処理物は、ニンニクレクチンを固形成分に対して、通常２質量％以上、好ましくは３〜４５質量％、より好ましくは１０〜４０質量％、さらに好ましくは２０〜３０質量％含む。

本発明により、カラムで精製する前のニンニク処理物にも抗腫瘍活性があることが明らかとなった。

本発明においてニンニク処理物には、精製ニンニクレクチンも包含される。精製ニンニクレクチンの純度（固形物換算）は、通常７０〜１００質量％、好ましくは８０〜１００質量％、より好ましくは９０〜１００質量％である。精製物を得るためには、沈殿法、クロマトグラフ法等の当技術分野で通常用いられる方法を使用できる。

例えば、上記でゲル濾過を行って二番目のピーク部分を集めた処理物を濃縮し、リン酸緩衝液で平衡化したカラムに同緩衝液で食塩水の勾配をかけて溶出し、２８０ｎｍのピーク部分を集め、水に対して透析を行うことによって、精製ニンニクレクチンを得ることができる。

ニンニク処理物における、固形成分に対するニンニクレクチンの濃度は、当技術分野において通常用いられる方法で測定することができ、例えば、クロマトグラフィー、ＴＯＦ−ＭＳ等を使用すればよい。具体的には、以下のような手順により測定することができる。

高速液体クロマトグラフィーでは、ＴＳＫゲルＳｕｐｅｒＳＷ２０００（東ソー製）を用い、０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）で溶出することにより測定する。一般のクロマトグラフィーでは、セファデックスＧ-７５カラム（ファルマシア製）を用い、蒸留水で溶出することにより測定することも出来る。

本発明の組成物は、上記のニンニク処理物を有効成分として含む。本発明の上記組成物は、腺癌の予防及び／又は治療の目的で使用できる。本発明において腺癌とは当技術分野において通常用いられる意味を有し、腺の構造に配列した細胞からなる癌をいう。腺癌としては、胃癌、大腸癌、舌癌、食道癌、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、咽頭癌等が挙げられる。本発明の組成物は、消化器における腺癌、好ましくは胃および大腸（特に結腸）における腺癌の予防及び／又は治療に有効である。

本発明の組成物の有効成分であるニンニクは、通常食用に供されており、一般に低毒性である。従って、本発明の組成物は、安全性が高いと考えられる。さらに、原料であるニンニクは安価に入手可能であることから、抗癌活性を有する組成物を安価に製造することが可能になる。

本発明の組成物は、常法により食品又は飼料としたり、薬学的に許容される担体とともに種々の剤型の医薬とすることができる。このうち経口用固形製剤を調製する場合は、本発明の組成物に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ぶどう糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、カルメロースカルシウム、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。

経口用液体製剤を調製する場合は、ニンニク処理物に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。

本発明の組成物の投与量及び投与方法は、年齢、体重、症状等により適宜決定することができるが、通常成人１日当たり、ニンニクレクチンに換算して５〜５０ｍｇを１回又は数回に分けて投与することが好ましい。

（実施例１）ニンニクレクチンの調製
ニンニクに同質量の水を加え、ミキサーに２分間かけ、ガーゼで濾過し、濾液を恒温槽で９０℃、３０分間加熱した。これを冷却後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ上澄みを得た。これに８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、５℃で３０分間放置後再び８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を得た。この沈殿を０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶かし、不溶物を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ除去した。これを同緩衝液で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５（ファルマシア製）カラムにかけゲル濾過を行った。各フラクションの２８０ｎｍの吸光度を測定し、二番目のピーク部分を集め、アミコン限外濾過器で濃縮し、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー製）に同緩衝液で０〜２．５Ｍ食塩水の濃度勾配をかけ溶出した。２８０ｎｍの吸光度のピーク部分を集め、水に対して透析を行った後、凍結乾燥を行った。

（実施例２）凍結乾燥物の組成分析
得られた凍結乾燥物について、糖質含量、タンパク質含量及び水分含量を測定した。糖質含量は、グルコースを標準物質とし、フェノール・硫酸法によって測定した。タンパク質含量は、牛血清アルブミンを標準物質とし、Ｌｏｗｒｙ法によって測定した。水分含量は、常圧加熱乾燥法（１０５℃）によって測定した。結果を以下の表1に示す。

ここで得られた糖質は、共有結合によりタンパク質に結合していると考えられる。また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、シングルバンドを示した。

（実施例３）分子量測定及びアミノ酸分析
実施例１で得られた精製物（タンパク質）について、分子量測定及びアミノ酸分析を行った。分子量の測定は、０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−７５カラム（２．０×４９ｃｍ）を用いたゲル濾過法によって行った。ゲル濾過において、得られたタンパク質の分子量は、２３０００Ｄａであった。

アミノ酸分析は、日立８３５型のアミノ酸分析機を用いて行った。結果を以下の表２に示す。

また、タンパク質の一次構造を、アプライドバイオシステム４７７Ａタンパク質シークエンサーを用いて測定した。その結果、Ｎ−末端付近のアミノ酸配列（１〜３６アミノ酸）、ＲＮＩＬＭＮＧＥＧＬＹＡＧＥＳＬＤＶＥＰＹＨＦＩＭＱＤＤＣＮＬＶＬＹＸＨ（配列番号１）が得られた。

（実施例４）結腸腺癌細胞に対する抗癌活性の試験
癌細胞として、ＷｉＤｒ細胞（ヒト結腸腺癌細胞）を使用し、実施例１で得られたニンニクレクチンの抗癌活性、ならびに抗癌剤として知られるクレスチンについて抗癌活性を試験した。ニンニクレクチンについては、試作日が異なる三つのロットについてそれぞれ試験を行なった。ＷｉＤｒ細胞は、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団ヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手した。

（１）培養液（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓｍｏｄｉｆｉｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ、ナカライテスク株式会社製）に１０％の牛胎児血清ＦＢＳ（ＧｉｂｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と抗生物質ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ株式会社製）５０μｇ／ｍｌを加えたものを細胞培養液とした。細胞数を２×１０^４細胞／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌ（２×１０^３個）を９６穴マイクロプレートの一つずつのウェルに加えた。
（２）一夜経過した後、ニンニクレクチン、ニンニク処理物又はクレスチンなどの試薬を溶かした上記細胞培養液の０．１ｍｌを各ウェルに加えた。
（３）３７℃の炭酸ガスインキュベーターの中で細胞を培養した。
（４）２４時間毎に、細胞数をｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８（株式会社同人化学研究所製）で測定した。すなわち、ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８を各ウェルに１０μｌずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１〜４時間呈色反応を行った。マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

なお、表５において、ニンニク処理物Ａとあるのは、実施例１において、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５（ファルマシア製）カラムにかけゲル濾過を行い、各フラクションの２８０ｎｍの吸光度を測定し、二番目のピーク部分を集めた後、透析し、凍結乾燥して得られる、ニンニクレクチンを含むニンニク処理物である。得られた凍結乾燥物について、実施例２と同様にして組成を分析したところ、ニンニクレクチンが２５質量％含まれていた。

結果を以下の表３〜７に示す。

以上の結果から、ニンニクレクチンが結腸腺癌細胞に対して抗癌活性を有すること、抗癌剤として知られるクレスチンよりも高い抗癌活性を有することが明らかとなった。

（実施例５）胃癌細胞に対する抗癌活性の試験
癌細胞として、ＫＡＴＯIII細胞（ヒト胃腺癌細胞）を使用し、実施例１で得られたニンニクレクチンについて抗癌活性を試験した。ニンニクレクチンについては、試作日が異なる二つのロットについてそれぞれ試験を行なった。ＫＡＴＯIII細胞は、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団ヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手した。

（１）培養液（ＲＰＭＩ１６４０ｍｅｄｉｕｍとＥａｇｌｅＭＥＭを１：１に混合）に１０％のＦＢＳと抗生物質ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ株式会社製）５０μｇ／ｍｌを加えたものを細胞培養液とした。
（２）細胞数を２×１０^４細胞／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌ（２×１０^３個）を９６穴マイクロプレートの一つずつのウェルに加えた。
（３）一夜経過した後、ニンニクレクチンなどの試薬を溶かした上記細胞培養液の０．１ｍｌを各ウェルに加えた。
（４）３７℃の炭酸ガスインキュベーターの中で細胞を培養した。
（５）２４時間毎に、細胞数をｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８（株式会社同人化学研究所製）で測定した。すなわち、ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８を各ウェルに１０μｌずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１〜４時間呈色反応を行った。マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

結果を以下の表８及び９に示す。

以上の結果から、ニンニクレクチンが胃腺癌細胞に対して抗癌活性を有することが明らかとなった。

（実施例６）ニンニク処理物Ｂの調製
ニンニク２１０ｇと蒸留水２１０ｍｌをミキサーにかけたあと、ガーゼで濾過した。濾液を９０℃で３０分間、加熱処理した。冷却して遠心分離（４℃、１００００ｒｐｍ、１０分間）した。上澄み液に、８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、溶解後、５℃で１５分間以上、冷却した。遠心分離（４℃、１００００ｒｐｍ、１０分間）し、沈殿物を蒸留水１００ｍｌに溶かし、再び遠心分離（４℃、１００００ｒｐｍ、１０分間）した。得られた上澄み液を水に対して透析を行い、脱塩後、凍結乾燥し、ニンニク処理物Ｂを得た。得られた凍結乾燥物について、実施例２と同様にして組成を分析したところ、ニンニクレクチンが２３質量％含まれていた。

（実施例７）ニンニク処理物Ｂの抗癌活性
癌細胞として、ＷｉＤｒ細胞（ヒト結腸腺癌細胞）及びＫＡＴＯIII（ヒト胃腺癌細胞）を用い、それぞれ実施例４及び５と同様の実験を行い、細胞数を測定することにより、実施例６で得られたニンニク処理物Ｂについて抗癌活性を試験した。

ＷｉＤｒ細胞（ヒト結腸腺癌細胞）での結果を表１０に、ＫＡＴＯIII（ヒト胃腺癌細胞）での結果を表１１に示す。

以上の結果から、ニンニクレクチンを精製する前の、ニンニクレクチンを含有するニンニク処理物もまた、抗癌活性を有することが明らかになった。

（比較例１）ニンニク処理物の扁平上皮癌に対する活性
癌細胞として、ＨＳＣ−１細胞（ヒト皮膚扁平上皮癌細胞）を使用し、実施例１で得られたニンニクレクチンについて抗癌活性を試験した。ニンニクレクチンについては、試作日が異なる二つのロットについてそれぞれ試験を行なった。ＨＳＣ−１細胞は、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団ヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手した。

（１）培養液（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ、ナカライテスク株式会社製）に１０％のＦＢＳと抗生物質ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ株式会社製）５０μｇ／ｍｌを加えたものを細胞培養液とした。細胞数を５×１０^４細胞／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌ（５×１０^３個）を９６穴マイクロプレートの一つずつのウェルに加えた。
（２）一夜経過した後、ニンニクレクチンなどの試薬を溶かした上記細胞培養液の０．１ｍｌを各ウェルに加えた。
（３）３７℃の炭酸ガスインキュベーターの中で細胞を培養した。
（４）２４時間毎に、細胞数をｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８（株式会社同人化学研究所製）で測定した。すなわち、ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８を各ウェルに１０μｌずつ添加する。炭酸ガスインキュベーター内で１〜４時間呈色反応を行った。マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

上記試験を二度行った。
結果を以下の表１２及び１３に示す。

以上の結果から、本発明のニンニク処理物は、ヒト皮膚扁平上皮癌細胞に対しては、抗癌作用を有しないことが明らかとなった。すなわち、本発明者らは、本発明のニンニク処理物の抗癌作用は癌種によって選択性を有し、腺癌を含む特定の癌種に対してのみ抗癌作用を有することを見いだしたのである。

（実施例８）ニンニク処理物/腺癌細胞懸濁液のマウスへの移植
８−１．癌細胞培養
腺癌細胞としてｃｏｌｏｎ−２６癌細胞を用いた。マウス由来ｃｏｌｏｎ−２６癌細胞は金沢大学がん研究所よりご提供いただいた。この癌細胞について以下の表に示す。

（１）培地の調製
ＲＰＭＩ１６４０培地の粉末を測り、超純水にとかし、ろ過滅菌した。１０％ＮａＨＣＯ_３溶液を１００ｍｌ調製し、オートクレーブにて滅菌した。ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＮａＨＣＯ_３溶液を２ｍｇ／ｍｌになるように、ペニシリン・ストレプトマイシン液を１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌになるように、ＦＢＳ（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ、牛胎児血清）を１０％になるようにそれぞれを添加し、培地を調製した。具体的には、ＲＰＭＩ１６４０８６ｍｌ、１０％ＮａＨＣＯ_３２ｍｌ、およびペニシリン・ストレプトマイシン液２ｍｌを混合し、色の変化を確認後、ＦＢＳ１０ｍｌを添加した。

（２）細胞培養
上記培地およびＨａｎｋｓ溶液を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中で温め、凍結しているｃｏｌｏｎ−２６癌細胞を３７℃の恒温槽で温めた。まだ少し凍っている状態でＨａｎｋｓ溶液の入ったファルコンチューブへ移した。ピペッティングおよび遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清をパスツールで吸引除去した。Ｈａｎｋｓ溶液を１ｍｌ加え、ピペッティングを行った。細胞懸濁液３０μｌおよびトリパンブルー３０μｌをエッペンチューブに採取した。ヘモサイトメーターおよび顕微鏡を用いて細胞数をカウントし、３×１０^５細胞／ディッシュで１００ｍｍディッシュに播種した。１０ｍｌ／ディッシュで培地を加えた。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで細胞を培養した。

（３）細胞継代
細胞がサブコンフルエントまで増殖しているか顕微鏡にて確認し、増殖していたならば以下の操作により細胞の継代を行った。ディッシュからパスツールピペットを用いて培地を除去し、Ｈａｎｋｓ溶液を５ｍｌ加えて洗浄後、パスツールピペットで除去した。トリプシン・ＥＤＴＡ液を３ｍｌ加え、３７℃のインキュベーター内で約４分間放置した。ディッシュの底を指ではじき、顕微鏡ではがれているかを確認した。はがれていたら、直ちに７ｍｌの培地を加えてトリプシン作用をとめ、撹拌後にメスピペットでファルコンチューブに採取した。ディッシュをＨａｎｋｓ溶液２ｍｌで洗浄し、これもメスピペットで採取した。続いて上記細胞培養手順における遠心分離以降の操作を行った。

８−２．ニンニク処理物/癌細胞懸濁液の調製
以下の表に示す要領でニンニク処理物と癌細胞とをマウスに移植すべく、ニンニク処理物/癌細胞懸濁液を調製した。ニンニク処理物としては、実施例６で調製したニンニク処理物Ｂを用いた。

（１）ＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ、リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて、各々の目的のニンニク処理物Ｂ濃度の倍の濃度になるようにニンニク処理物溶液を１ｍｌずつ調製した。
（２）培養したｃｏｌｏｎ−２６癌細胞をトリプシン処理後、ファルコンチューブに移し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行った。
（３）上清を取り除いた後、培地を加え、ピペッティングし、トリパンブルーとヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。
（４）カウント後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を取り除き、細胞濃度が１×１０^７細胞／ｍｌになるようにＰＢＳで細胞懸濁液を作製した。
（５）（１）で作製したニンニク処理物Ｂ溶液、（４）で作製した細胞懸濁液を１：１の割合で（１ｍｌずつ）合計２ｍｌになるように混合した。

８−３．マウスへのニンニク処理物/癌細胞懸濁液の移植
移植には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（オス）を用いた。
移植前に、マウスの体重を計測した。ニンニク処理物Ｂを各濃度で含むニンニク処理物／細胞懸濁液を上記のように調製後、１０分間静置した。７匹のマウスからなるマウス群５群に対し、ニンニク処理物を各濃度で含むニンニク処理物／細胞懸濁液を右側腹部の皮下に０．２ｍｌ（１×１０^６細胞）ずつ移植した（この日を０日目とした）。

腫瘍が顕著に見られるようになった７日後に体重およびノギスを用いた腫瘍の面積[ｍｍ^２］（＝腫瘍の最長直径×腫瘍の最短直径）の計測を開始した。その後、４日毎に移植して１９日目まで同様に計測を行った。１５日目、１９日目には腫瘍の高さの計測も行うことで腫瘍体積も求めた（腫瘍体積［ｍｍ^３］＝（腫瘍の最長直径）×（腫瘍の最短直径）×（腫瘍の高さ））。

統計分析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌを用いてｔ検定を行った。結果を以下の表１６および図１に示す。

以上の結果から、本発明のニンニクレクチンを含むニンニク処理物が、腺癌に対して、in vivoにおいて抗癌活性を有することが実証された。

（実施例９）腺癌細胞移植マウスへのニンニク処理物の経口投与
９−１．癌細胞懸濁液の調製
実施例８で培養したｃｏｌｏｎ−２６癌細胞をトリプシン処理した後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行った。上清を取り除いた後、培地を加え、ピペッティングし、トリパンブルー、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。カウント後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）し、細胞濃度が５×１０^６細胞／ｍｌになるようにＰＢＳで細胞懸濁液を作製した。

９−２．癌細胞懸濁液の移植およびニンニク処理物の投与
マウスとしては、ＢＡＬＢ／ｃマウス（オス）を用いた。癌細胞懸濁液の移植およびニンニク処理物の投与の前に、マウスの体重を計測した。８匹のマウスからなるマウス群４群に対し、上記癌細胞懸濁液を右側腹部の皮下に０．２ｍｌ（１×１０^６細胞）ずつ移植した（この日を０日目とした）。

ニンニク処理物Ｂをそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で含むニンニク処理物Ｂ溶液をＰＢＳを用いて調製し、各マウス群のマウスに、２日毎に０．５ｍｌずつ投与した。コントロール群にはＰＢＳを投与した。腫瘍が顕著に見られるようになった１０日後から体重、ノギスを用いた腫瘍の面積[ｍｍ^２］（＝腫瘍の最長直径×腫瘍の最短直径）の計測を開始し、その後、３日毎に癌細胞を移植して２８日目まで同様に計測を行った。１６日目、２２日目には腫瘍の高さの計測も行うことで腫瘍体積も求めた（腫瘍体積［ｍｍ^３］＝（腫瘍の最長直径）×（腫瘍の最短直径）×（腫瘍の高さ））。

統計分析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌを用いてｔ検定を行った。結果を以下の表１７および図２に示す。

以上の結果から、本発明のニンニクレクチンを含むニンニク処理物を経口摂取することにより、in vivoにおいて腺癌抑制効果が得られることが実証された。

（比較例２）ニンニク処理物/非腺癌細胞懸濁液のマウスへの移植
２−１．細胞培養
非腺癌細胞として、扁平上皮癌ＳＣＣＶＩＩ細胞を使用した。扁平上皮癌ＳＣＣＶＩＩは京都大学原子炉実験所附属粒子線腫瘍学研究センターからご提供いただいた。この癌細胞について以下の表に示す。

（１）培地の調製
ＭＥＭ培地溶液に、ペニシリン・ストレプトマイシン液を１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌになるように、ＦＢＳを１０％になるようにそれぞれを添加した。具体的には、ＭＥＭ８８ｍｌ、ペニシリン・ストレプトマイシン液２ｍｌおよびＦＢＳ１０ｍｌを混合した。

（２）細胞培養
上記培地およびＨａｎｋｓ溶液を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中で温め、凍結しているＳＣＣＶＩＩ細胞を３７℃の恒温槽で温めた。まだ少し凍っている状態でＨａｎｋｓ溶液の入ったファルコンチューブへ移した。ピペッティングおよび遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清をパスツールで吸引除去した。Ｈaｎｋｓ溶液を１ｍｌ加え、ピペッティングを行った。細胞懸濁液３０μｌおよびトリパンブルー３０μｌをエッペンチューブに採取した。ヘモサイトメーターおよび顕微鏡を用いて細胞数をカウントし、３×１０^５細胞／ディッシュで１００ｍｍディッシュに播種した。１０ｍｌ／ディッシュで培地を加えた。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで細胞を培養した。

（３）細胞継代
細胞がサブコンフルエントまで増殖しているか顕微鏡にて確認し、増殖していたならば以下の操作により細胞の継代を行った。ディッシュからパスツールピペットを用いて培地を除去し、Ｈaｎｋｓ溶液を５ｍｌ加えて洗浄後、パスツールピペットでこれを除去した。トリプシン・ＥＤＴＡ液を３ｍｌ加え、３７℃のインキュベーター内で約４分間放置した。ディッシュの底を指ではじき、顕微鏡ではがれているかを確認した。はがれていたら、直ちに７ｍｌの培地を加えてトリプシン作用をとめ、撹拌後にメスピペットでファルコンチューブに採取した。ディッシュをＨaｎｋｓ溶液２ｍｌで洗浄し、これもメスピペットで採取した。続いて上記細胞培養手順における遠心分離以降の操作を行った。

２−２．ニンニク処理物/癌細胞懸濁液の調製
以下の表に示す要領でニンニク処理物と癌細胞とをマウスに移植すべく、ニンニク処理物/癌細胞懸濁液を調製した。ニンニク処理物としては、実施例６で調製したニンニク処理物Ｂを用いた。

（１）ＰＢＳを用いて、各々の目的のニンニク処理物Ｂ濃度の倍の濃度になるようにニンニク処理物溶液を１ｍｌずつ調製した。
（２）培養したＳＣＣＶＩＩ癌細胞をトリプシン処理後、ファルコンチューブに移し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行った。
（３）上清を取り除いた後、培地を加え、ピペッティングし、トリパンブルーとヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。
（４）カウント後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を取り除き、細胞濃度が４×１０^６細胞／ｍｌになるようにＰＢＳで細胞懸濁液を作製した。
（５）（１）で作製したニンニク処理物Ｂ溶液、（４）で作製した細胞懸濁液を１：１の割合で（１ｍｌずつ）合計２ｍｌになるように混合した。

２−３．マウスへのニンニク処理物/癌細胞懸濁液の移植
移植には、Ｃ３Ｈマウス（オス）を用いた。
移植前に、マウスの体重を計測した。ニンニク処理物Ｂを各濃度で含むニンニク処理物／細胞懸濁液を上記のように調製後、１０分間静置した。１０匹のマウスからなるマウス群３群に対し、ニンニク処理物を各濃度で含むニンニク処理物／細胞懸濁液を右側腹部の皮下に０．１ｍｌ（２×１０^５細胞）ずつ移植した（この日を０日目とした）。

腫瘍が顕著に見られるようになった１０日後に体重およびノギスを用いた腫瘍の面積[ｍｍ^２］（＝腫瘍の最長直径×腫瘍の最短直径）の計測を開始した。その後、３日毎に移植して２２日目まで同様に計測を行った。１６日目、１９日目には腫瘍の高さの計測も行うことで腫瘍体積も求めた（腫瘍体積［ｍｍ^３］＝（腫瘍の最長直径）×（腫瘍の最短直径）×（腫瘍の高さ））。

結果を以下の表２０および図３に示す。統計分析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌを用いてｔ検定を行った。統計分析の結果、有意差は見られなかった。

以上の結果から、本発明のニンニクレクチンを含むニンニク処理物が、非腺癌に対してin vivoにおいて抗癌活性を有しないことが示された。すなわち、本発明のニンニクレクチンを含むニンニク処理物は、in vivoにおいても腺癌に対し選択的に抗癌活性を有することが実証された。

（比較例３）非腺癌細胞移植マウスへのニンニク処理物の経口投与
３−１．癌細胞懸濁液の調製
比較例２で培養したＳＣＣＶＩＩ癌細胞をトリプシン処理した後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行った。上清を取り除いた後、培地を加え、ピペッティングし、トリパンブルー、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。カウント後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）し、細胞濃度が２×１０^６細胞／ｍｌになるようにＰＢＳで細胞懸濁液を作製した。

３−２．癌細胞懸濁液の移植およびニンニク処理物の投与
マウスとしては、Ｃ３Ｈマウス（オス）を用いた。癌細胞懸濁液の移植およびニンニク処理物の投与の前に、マウスの体重を計測した。６匹のマウスからなるマウス群４群に対し、上記癌細胞懸濁液を右側腹部の皮下に０．１ｍｌ（２×１０^５細胞）ずつ移植した（この日を０日目とした）。

ニンニク処理物Ｂをそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で含むニンニク処理物Ｂ溶液をＰＢＳを用いて調製し、各マウス群のマウスに、２日毎に０．５ｍｌずつ投与した。コントロール群にはＰＢＳを投与した。腫瘍が顕著に見られるようになった１０日後から体重、ノギスを用いた腫瘍の面積[ｍｍ^２］（＝腫瘍の最長直径×腫瘍の最短直径）の計測を開始し、その後、３日毎に癌細胞を移植して２２日目まで同様に計測を行った。１６日目、２２日目には腫瘍の高さの計測も行うことで腫瘍体積も求めた（腫瘍体積［ｍｍ^３］＝（腫瘍の最長直径）×（腫瘍の最短直径）×（腫瘍の高さ））。

結果を以下の表２１および図４に示す。統計分析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌを用いてｔ検定を行った。統計分析の結果、有意差は見られなかった。

以上の結果から、本発明のニンニクレクチンを含むニンニク処理物を経口摂取した場合、in vivoにおいて非腺癌抑制効果はみられないことが示された。すなわち、本発明のニンニクレクチンを含むニンニク処理物は、in vivoにおいても腺癌に対し選択的に抗癌活性を有することが実証された。

（実施例１０）ニンニク処理物のｃｏｌｏｎ−２６癌細胞に対する抗癌活性試験
（１）培養液（ＲＰＭＩ１６４０：ナカライテスク株式会社製）に１０％のＦＢＳを加えたものを細胞培養液とした。単層培養（付着）細胞なので、０．２５％トリプシン＋１ｍＭのＥＤＴＡでフラスコより細胞をはがして、細胞数を１×１０^５細胞／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌ（１×１０^４個）を９６穴マイクロプレートの一つずつのウェルに加えた。
（２）一夜経過した後、実施例６で調製したニンニク処理物Ｂを各種濃度で溶かした上記細胞培養液の０．１ｍｌを各ウェルに加えた。
（３）３７℃の炭酸ガスインキュベーターの中で細胞を培養した。
（４）２４時間毎に、細胞数をｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８（株式会社同人化学研究所製）で測定した。すなわち、ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８を各ウェルに１０μｌずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１〜４時間呈色反応を行った。マイクロリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度に基づき細胞数を測定した。結果を以下の表２２に示す。

以上から、本発明のニンニクレクチンを含むニンニク処理物が腺癌であるｃｏｌｏｎ−２６癌細胞に対して、in vitroでも抗癌活性を示すことが確認された。また、in vitroにおける抗癌活性が、in vivoにおける抗癌活性と相関関係を有することが実証された。

ニンニク処理物を各種濃度で含むニンニク処理物/腺癌細胞懸濁液をマウスに移植したときの、腫瘍面積の変化を示す。腺癌細胞を移植したマウスにニンニク処理物を各種濃度で含むニンニク処理物溶液を経口摂取させたときの、腫瘍面積の変化を示す。ニンニク処理物を各種濃度で含むニンニク処理物/非腺癌細胞懸濁液をマウスに移植したときの、腫瘍面積の変化を示す。非腺癌細胞を移植したマウスにニンニク処理物を各種濃度で含むニンニク処理物溶液を経口摂取させたときの、腫瘍面積の変化を示す。

Claims

ニンニクレクチンを固形成分に対して２質量％以上含有するニンニク処理物を有効成分とする大腸癌又は胃癌を予防及び／又は治療するための医薬。
ニンニク処理物がニンニク抽出物である請求項１記載の医薬。