JP4902077B2

JP4902077B2 - Cell active substance, method for producing the same, and pharmaceutical and cosmetics containing the cell active substance

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Publication number: JP4902077B2
Application number: JP2001304002A
Authority: JP
Inventors: 来健賀; 作一朗矢
Original assignee: Pigeon Corp; Kochi Prefectural PUC
Current assignee: Pigeon Corp; Kochi Prefectural PUC
Priority date: 2000-12-27
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2021-09-28
Also published as: JP2002255987A

Description

【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、海洋水中に含有される細胞活性物質、その製造方法、この細胞活性物質を含有する医薬品および化粧料に関する。さらに詳しくは、本発明は、海洋水中に含有される、皮膚細胞活性物質（例：繊維芽細胞活性物質）、免疫細胞活性物質（例：好酸球活性物質）などの細胞活性物質、このような細胞活性物質を製造する方法、このような細胞活性物質を含有する医薬品および化粧料に関する。
【０００２】
【発明の技術的背景】
人皮には、加齢などの内的要因によりあるいは紫外線などの外的要因などにより、しわ、しみ、たるみの発生といった老化症状が発現する。こうした人皮の老化症状は、皮膚真皮繊維芽細胞の機能低下、さらにこうした細胞の機能低下に伴うマトリックス繊維およびコラーゲンの分泌不足が主要な発生要因となっていると考えられている。従って、人皮の老化防止あるいは老化した皮膚の機能改善には、皮膚真皮繊維芽細胞を活性化させ、さらにこうした細胞の増殖を図ることが有効な手段であると考えられている。
【０００３】
このような人皮の老化症状、すなわち皮膚真皮繊維芽細胞の活性の低下に対しては、海藻などからの抽出物が有効であるとされている。例えば特開平10-330281号公報には、ヤハズグサ類、ホンダワラ類、フクリンアミジ類、フクロノリ類、コンブ類、カイメンソウ類、カギケノリ類、イトグサ類、ヤナギノリ類、ソゾ類、ガラガラ類からの抽出液が真皮繊維芽細胞の代謝を活性化させることが記載されている。また、特開平11-116431号公報には、キートセロスグラシリスの培養上清を含有してなる皮膚外用剤の発明が開示されている。ここで使用されているキートセロスグラシリス(Chaetoceros gracilis)は、近海の海中に単独で生息する藻類の一種である。このキートセロスグラシリスの培養上清は、真皮の繊維芽細胞の代謝活性を向上させる効果があると記載されている。
【０００４】
また、こうした海藻由来の成分のほかにも、例えば特開2000-169320号公報には、海藻抽出液、カミツレ抽出液、ムクロジ抽出液、タマサキツズラフジ抽出液のいずれかと、ユッカ抽出液とを組み合わせることにより細胞賦活剤として効果があると記載されている。
しかしながら、こうした藻類あるいは植物からの抽出物は、藻類あるいは植物の生息状況によって抽出される成分の組成に変動が生ずる虞があり、また、こうした藻類あるいは植物からの抽出操作も複雑であるとの問題がある。
【０００５】
また、特開2000-159654号公報には、海洋深層水を限外濾過、逆浸透膜濾過法、電気透析法、イオン交換膜法および蒸留法の処理法から選ばれる少なくとも1種の処理法により処理することにより得られる濃縮水を含有することを特徴とする化粧料の発明が開示されている。そして、この公報には、この濃縮水の導電率が５mS/cm〜１S/cm、好ましくは１０mS/cm〜５００mS/cmであると記載されており、海水が上記のような導電率を有するためには、相当量のイオン性物質を含有していると考えられる。また、この公報では、濃縮水中の水蒸発固形分あたりの塩素イオン、ナトリウムイオンおよびカリウムイオンの合計存在量比率は３５％以下であり、現に実施例２および比較例２で使用している濃縮水B1の塩素イオン、ナトリウムイオン及びカリウムイオンの合計存在比率は３１.５％、実施例２および比較例２で使用している濃縮水B2の塩素イオン、ナトリウムイオン及びカリウムイオンの合計存在比率も３２.５％と非常に高い値を示している。そして、該公報には、これらの値を有し、かつこの公報に記載されている方法により得られる濃縮水であって、海洋深層水中に含有される成分のうち、皮膚に対して刺激性を有する塩素イオン、ナトリウムイオン及びカリウムイオンを除いたミネラル分を高い濃度で含有する海洋深層水を用いた化粧料の発明が開示されていると解される。海洋深層水に含まれる無機物質から、皮膚に対して刺激性を有する塩素イオン、ナトリウムイオン及びカリウムイオンを除去すると、一般に栄養塩といわれるイオンであるリン酸イオン、ケイ酸イオン、硝酸イオンなどの含有比率が高くなり、これらの天然ミネラルが皮膚のくすみ、しわなどの改善効果および痩身効果を奏するものと考えられる。
【０００６】
上記のように特開2000-159654号公報には、海洋深層水を濃縮して、海洋深層水中に含有される天然ミネラルを主として含有する海洋深層水の濃縮水を使用した化粧料が開示されているのであり、この公報に開示されている化粧料によって奏される効果は海洋深層水中に含まれる天然ミネラル成分、すなわち無機塩であると解される。
【０００７】
このような加齢などの内的要因による皮膚の老化とは別に、皮膚疾患として、近年、住環境および食生活等の変化、ストレスなどから、アトピー性皮膚炎などの種々のアレルギー症状を起こす患者が増えており、問題となっている。
アトピー性皮膚炎などのアレルギー症状は、遺伝による体質が大きな役割を果たしている過敏症の一種である。このようなアレルギー症状を引き起こす抗原は、血液中にあると考えられており、この抗原と抗体との複合体が、組織からヒスタミンあるいはヒスタミン様物質を遊離させる結果、特異的な症状が引き起こされるものと考えられている。例えば、アトピー性皮膚炎では、末梢血好酸球が増大し、組織所見においても好酸球の浸潤がみられることが多い。このことからも、好酸球がアトピー性皮膚炎においては中心的な役割を担う細胞の一つであると考えられる。
【０００８】
こうした背景のもとに、好酸球活性物質について種々の研究がなされており、海洋深層水によって好酸球の活性が高くなることが既に知られているが、このような海洋水の好酸球活性に関するメカニズムについては、いまだ正確には解明されていない。目下のところ、好酸球活性は、海洋深層水中に含まれるミネラル分に由来するものとの考え方が大勢を占めており、海洋深層水を濃縮、脱塩、分離して得られるミネラル分を多く含む分離物がアレルギー性の薬剤等に用いられていた。
【０００９】
上記のような海洋深層水を濃縮、脱塩、分離して得られる物質では、そのほとんどを硫酸カルシウム等の無機塩が占めている。しかしながら、硫酸カルシウムには、アレルギーに関与した薬効が実質的にはないことが知られている。
【００１０】
【発明の目的】
本発明は、海洋水中から無機塩をできるだけ除去し、一方この海洋水中に含有される有機物質を濃縮した高濃縮脱塩海洋水からなる細胞活性物質である皮膚細胞活性物質（たとえば、繊維芽細胞活性物質）および免疫細胞活性物質（たとえば、好酸球活性物質）を提供することを目的としている。
【００１１】
さらに本発明は、上記のような細胞活性物質である皮膚繊維芽細胞活性物質および好酸球活性物質を製造する方法を提供することを目的としている。
また、本発明は、上記のような皮膚細胞活性物質（たとえば、繊維芽細胞活性物質）および免疫細胞活性物質（たとえば、好酸球活性物質）などの細胞活性物質を用いた医薬品および化粧料を提供することを目的としている。
【００１２】
【発明の概要】
本発明の細胞活性物質は、溶存する無機塩の少なくとも一部を分離した脱塩海洋水から、さらに析出物あるいは無機塩を分離する操作及び該析出物あるいは無機塩を分離する操作を経た脱塩海洋水をさらに濃縮する操作を少なくとも１回行うことにより得られ得るものである。
【００１３】
本発明において、濃縮操作（工程）とは、海洋水中に溶存する溶在塩の除去操作をいい、本工程においては、海洋水が濃縮され真水が除去されてもよい。
前記脱塩海洋水は、必要に応じて、減圧蒸留等により濃縮された濃縮脱塩海洋水であってもよい。
さらに詳しくは本発明の細胞活性物質は、海洋水中に溶存される無機塩の少なくとも一部を分離する操作を経た（濃縮）脱塩海洋水を、さらに濃縮する操作を少なくとも１回行うことにより得られ得るものである。
【００１４】
本発明の細胞活性物質には、細胞エネルギー代謝活性物質が含まれる。
また、本発明の細胞活性物質には、繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質などの皮膚細胞活性物質および好酸球活性物質などの免疫細胞活性物質が包含される。
また、本発明の細胞活性物質の製造方法は、必要に応じて、海洋水を減圧下に蒸留濃縮することにより、該海洋水に溶存する無機塩の少なくとも一部をたとえば析出させるなどして分離して濃縮脱塩海洋水を得た後、
該（濃縮）脱塩海洋水からさらに析出物あるいは無機塩を分離する工程、及び、該析出物などを分離する工程を経た（濃縮）脱塩海洋水をさらに減圧下に濃縮する工程及び分離する工程を少なくとも１回行うことを特徴としている。
【００１５】
さらに詳しくは本発明の細胞活性物質の製造方法は、海洋水から溶存する無機塩の少なくとも一部を分離して（濃縮）脱塩海洋水を得る工程、および、該（濃縮）脱塩海洋水をさらに濃縮して析出物あるいは無機塩を分離する工程を少なくとも一回行う工程を経て細胞活性物質を高い濃度で含有する高濃縮脱塩海洋水を得ることを特徴としている。
【００１６】
さらに、本発明の医薬品は、海洋水中に溶存される無機塩の少なくとも一部を分離する操作を経た（濃縮）脱塩海洋水を、さらに濃縮する操作を少なくとも１回行うことにより得られ得る細胞活性物質を含有することを特徴としている。
上記医薬品は、外用薬であっても、内服薬であってもよい。
医薬品が外用薬である場合、本発明の皮膚外用薬は、たとえば、海洋水を減圧下に蒸留濃縮することにより得られる濃縮海洋水から析出物あるいは無機塩を分離する操作並びに該析出物等を分離する操作を経た（濃縮）脱塩海洋水をさらに減圧下に濃縮する操作及び分離する操作を少なくとも１回行うことにより得られ得る細胞活性物質を含有するものであってもよい。
【００１７】
また、本発明の化粧料は、海洋水中に溶存される無機塩の少なくとも一部を分離する操作を経た（濃縮）脱塩海洋水を、さらに濃縮する操作を少なくとも１回行うことにより得られ得る細胞活性物質を含有することを特徴としている。
海洋水中には、無機塩と有機物質とが含有されており、海洋水中に溶存している無機塩の濃度は、通常は３．４重量％程度である。そして、この無機塩のうち２．２重量％以上は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウムであり、こうした無機塩は、細胞エネルギー代謝活性物質としての作用は少なく、また、特に無機塩中に多く含まれる硫酸カルシウムには、アレルギーに関与した薬効も実質的にないことが知られている。
【００１８】
一方、海洋水に溶存している無機塩を除去しながら濃縮して得られる濃縮液を分析すると、この濃縮液中には一定分子量以上の有機物質が含有されていることがわかった。このような有機物質の由来およびその構成などについての詳細は明らかではなく、極めて多種多様な成分を含有しているものと推定される。しかしながら、こうした有機物質について、展開溶媒を選択してゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分析すると、波長２８０nmにおける紫外線検出分析においては分子量１００万以上の第１画分、分子量５万〜１００万の第２画分、分子量５０００〜５万の第３画分、および、分子量５０００以下の第４画分よりなる画分の少なくとも１の画分にピークを有する有機物質が含有されていることがわかった。
【００１９】
そして、本発明はこのような海洋水中に含有される有機物質を選択的に収集して繊維芽細胞に対する挙動および好酸球活性などの細胞活性を調査した結果、これらの有機物質に繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性および好酸球活性などの細胞活性があるとの知見を得て本発明を完成したものである。
すなわち、従来は海洋水、例えば海洋深層水中に含有される塩化物系以外の無機物である天然ミネラルが注目されており、こうした天然ミネラルを例えば化粧品などの皮膚外用薬に配合することにより、希少天然ミネラルが繊維芽細胞活性物質および好酸球活性を有する活性物質として作用すると考えられ検討されていたが、こうした海洋水に微量に含有される有機物質に関しては、細胞活性などに関する詳細な検討はされていない。これは海洋水中における無機塩の含有率が高く、通常の分離方法では、無機塩により阻害されて極微量に含有される有機物質を無機塩から分離することさえも極めて困難であると共に、こうした無機塩の影に隠れて極微量の有機物質の作用効果を特定すること自体に著しい困難性があったためである。
【００２０】
しかしながら、本発明者は、海洋水を繰り返し濃縮しながら無機塩をでき得る限り分離除去して有機物質の濃度を高めて、この有機物質を比較的高い濃度で含有する濃縮液を、例えば繊維芽細胞や好酸球に作用させてみたところ、繊維芽細胞のエネルギー代謝・増殖活性物質として優れた効果を奏し、また、好酸球活性物質としても優れた効果を奏したのである。
【００２１】
【発明の具体的な説明】
以下に、皮膚細胞活性物質として繊維芽細胞活性物質を例に採り、また、免疫細胞活性物質として好酸球活性物質を例に採って、本発明の細胞活性物質である皮膚細胞活性物質および免疫細胞活性物質、それらの製造方法、ならびにこの細胞活性物質を含む医薬品および化粧料について具体的に説明する。
【００２２】
本発明において、皮膚細胞活性物質とは、繊維芽細胞等を活性化し得る物質をいう。
また、免疫細胞活性物質とは、白血球、すなわち、マクロファージなどの単球、NK細胞、T細胞、K細胞、B細胞などのリンパ球、好酸球、好中球、好塩基球などの顆粒球等を活性化し得る物質をいう。
【００２３】
図１は、本発明の細胞活性物質を得るための代表的な操作の例を示すものである。なお、本発明の細胞活性物質は、それぞれ上記操作によって得られ得るものであるが、この操作のみによって得られる物質に限定的に解釈されるべきではない。
まず本発明の細胞活性物質について、図１に例示した製造フローに沿って具体的に説明する。
【００２４】
図１に示すように、本発明の細胞活性物質は海洋水を原料として用いて製造される。本発明において、細胞活性物質には、細胞エネルギー代謝活性物質が含まれる。また、本発明の細胞活性物質には、皮膚細胞活性物質（繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質などの繊維芽細胞活性物質を含む）および／または免疫細胞活性物質（好酸球活性物質を含む）が含まれる。すなわち、本発明の細胞活性物質は、皮膚細胞活性を有すると同時に免疫細胞活性を有するものであってもよく、また、皮膚細胞活性または免疫細胞活性のみを有するものであってもよい。
【００２５】
勿論、本発明で使用される海洋水は、河川の水の流れ込む陸地付近を離れたある程度外海で収集されたものを用いることが好ましい。これは、河川から流れ込む淡水によって海水が希釈されるのを防止するためであることは勿論、河川から流れ込む淡水は、生活汚水、産業排水、長年にわたって蓄積された土壌汚染物などの溶出物が混入している虞を完全に否定することはできないからである。したがって、こうした物質の比較的少ない外海などで採取した海洋水を用いることが好ましい。
【００２６】
このように採取された海洋水は、採取の際に混入することもある浮遊物を除去するため、メンブランフィルターのように比較的目開きの小さいフィルターを用いて濾過する。本発明では通常は０．０１〜２μm、好ましくは０．1〜１μmの目開きのフィルター、特にメンブランフィルターを用いて濾過することが好ましい。このようなフィルターを用いることにより、肉眼では確認することができない微細成分まで濾別することができる。なお、この段階で析出してくる析出物あるいは無機塩がある場合には、この段階でこのような析出物等が分離されてもよい。
【００２７】
本発明では上記のようにして濾過した濾液を用いるので、フィルターを透過できなかった物質（残渣）は廃棄される。
本発明では、上記のようにして得られた濾液を減圧下に蒸留して、この濾液中に含有される水分の少なくとも一部をこの減圧蒸留操作により除去する。最初に採取した海洋水を１００容量部としたときに、この減圧下における蒸留操作によって、最初の海洋水採取量に対して通常は１〜３０容量部、好ましくは２〜２５容量部、特に好ましくは５〜２０容量部になるように、減圧蒸留を行う。具体的には、１〜４０torr、好ましくは５〜３０Torrの減圧下に、５０℃以下の温度、好ましくは４０℃以下の温度で、１０分〜３．０時間、好ましくは３０分〜１．０時間かけて減圧蒸留する。なお、この減圧蒸留の際の蒸留温度は、海洋水に溶存している溶存物質の分解を防止等するため、できるだけ低いことが好ましく、従って、ここで使用する減圧蒸留時の圧力を低くすることにより、より低い温度でこの減圧蒸留操作を行うことができる。この減圧蒸留操作によって海洋水中の水の一部が分離され、この分離された水は廃棄される。また、無機塩を分離する設備の処理能力が充分であれば、上記濃縮操作は削除できる。
【００２８】
また、上記のようにして減圧蒸留により海洋水を濃縮して無機塩を分離する代わりに、荷電モザイク膜を用いて海洋水中の電解質（無機塩）を分離することもできる。荷電モザイク膜を用いることにより海洋水中の無機塩を選択的に除去することができ、しかもこの無機塩の選択的な除去に際して海洋水を加熱する必要がないので、この方法を採用することにより溶存する有機物などに対する熱影響を低減することができる。
【００２９】
一方、上記のように減圧蒸留によって水を分離することにより濃縮された海洋水（以下、濃縮海洋水という）中には、無機塩などが析出する。この析出物は、塩化ナトリウム、硫酸カルシウム、塩化マグネシウムなどの無機塩を主成分とするものであり、蒸留残渣を充分に冷却（通常は室温（25℃）以下）した後、好ましくは２〜１０℃に冷却することにより析出した析出物を分離する。この析出物の分離には、濾過、遠心分離、デカンテーションなどの一般的な分離方法を利用することができる。また、これらの分離操作を組み合わせることもできる。上記のようにして減圧下に濃縮することにより析出する析出物の量（主として無機塩化物）は比較的多く、またこの析出物はほとんどが結晶化した無機塩であることから、濾過による分離が効率的である。
【００３０】
ここで無機塩などの析出物の分離に使用される濾過装置に特に限定はないが、目開きが通常０．０１〜２μｍ、好ましくは０．１〜１．０μｍのフィルターを使用する。上記のようなフィルターを用いて減圧濾過することにより、効率よく析出物と濾液とを分離することができる。上述のようにここで分離される析出物は主として無機塩化物であり、この分離操作によって最初に使用した海洋水中に溶存している無機塩化物などの無機塩（主として、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムの他、硫酸カルシウムなど）の７０重量％以上、好ましくは９０重量％以上が除去される。上記のようにして分離された析出物（主として無機塩化物）は、本発明では使用せず廃棄される。
【００３１】
本発明では、上記のようにして析出物が分離された分離液、即ち、上記例で示すと濾過により分離した場合には上記脱塩濾液を次の工程で使用する（以下、（濃縮）脱塩海洋水という）。
即ち、本発明の細胞活性物質は、上記の工程で得られた脱塩濾液（（濃縮）脱塩海洋水）を濃縮し、この濃縮により析出した析出物を分離する工程を少なくとも1回行うことにより得られ得る高濃縮脱塩海洋水中に高い濃度で含有される。
【００３２】
本発明において、濃縮操作（工程）とは、海洋水中に溶存する溶在塩の除去操作をいい、本工程においては、海洋水が濃縮され真水が除去されてもよい。
ここで濾液は、通常は減圧蒸留により濃縮される。このときの圧力は、通常は１〜４０Torr、好ましくは５〜３０Torrの範囲内に設定することができ、蒸留温度は、通常は５〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃である。上記のような条件で一回の操作で、もとの濾液の量100容量部に対して好ましくは５〜３０容量部、さらに好ましくは５〜２０容量部の範囲内になるように蒸留する。このように蒸留することにより、この濾液中に溶存した成分（主として無機塩）が析出する。次いで、本発明では、このようにして析出した析出物（主として無機塩）を分離する。
【００３３】
この析出物あるいは無機塩の分離、すなわち、溶存塩の除去工程においては、半透過膜を用いた分離操作、残留イオン性物質を電気的に分離する操作、遠沈操作、ゲル濾過操作、荷電モザイク膜を用いた分離操作および、限外濾過操作のいずれかの方法を採用することが好ましい。即ち、この工程における析出物は、前の工程における析出物よりも粒子径が小さくなる傾向があり、一部はコロイド状あるいはゲル状になることさえあるため、通常の濾過などの操作では析出物を分離しにくい。
【００３４】
そこで、この工程における析出物あるいは無機塩と液との分離には、半透過膜の浸透圧の差を利用して分散媒から分離する方法、電圧を印加して残留するイオン性物質の電気的特性を利用して収集し分散媒から分離する方法、遠心力のような外部応力を用いて析出物を収集し分散媒から分離する方法、限外濾過膜など所望の透過性を有する濾過膜を用いて加圧下に濾過する方法、ゲル濾過を用いて低分子量の粒子を分散媒から分離する方法などを利用することにより、析出物と分散媒とを分離することができる。
【００３５】
本発明の細胞活性物質は、上記のような濃縮操作と分離操作を少なくとも１回、好ましくは2回以上行うことにより得られる分散媒（高濃縮脱塩海洋水）である。なお、上記の工程を繰り返し行う場合、前の操作で行った濃縮操作および分離操作と、次に行う濃縮操作および分離操作とは、同一の操作である必要はなく、その析出物の状態などに対応させて適宜操作を組み合わせることができる。こうして分離された析出物は、主として残存していた無機塩、溶存金属化合物などであると考えられ、本発明ではこの析出物は廃棄される。
【００３６】
上記のような濃縮および分離を繰り返すことによって得られる分散媒（高濃縮脱塩海洋水）は、細胞活性物質を高濃度で含有する液体であり、この細胞活性物質（すなわち、繊維芽細胞活性物質などの皮膚細胞活性物質および好酸球活性物質などの免疫細胞活性物質）を高濃度で含有する液体の量は、最初に使用した海洋水１００容量部に対して通常は０．０００１〜３０．０容量部、好ましくは０．００１〜５．０容量部、さらに好ましくは０．０１〜０．５容量部の量になる。
【００３７】
上記のようにして得られた高濃縮脱塩海洋水中には、種々の有機物質が含有されており、逆に無機物質の含有率は、非常に低く、通常は０．９重量％以下、好ましくは０．０１重量％以下であり、この細胞活性物質の強熱残分は通常は０．１重量％以下、好ましくは０．０１重量％以下である。特に、この高濃縮脱塩海洋水中における無機塩化物の含有率は著しく低く通常は１００ppm以下、好ましくは１０ppm以下である。また、この高濃縮脱塩海洋水中に含有される有機物質の総合量は、通常は０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％の範囲内にある。
【００３８】
上記のようにして得られた高濃縮脱塩海洋水中には、たとえば、人皮の繊維芽細胞を活性化する物質などの皮膚細胞活性物質および好酸球の活性を高める物質などの免疫細胞活性物質が含有されている。この高濃縮脱塩海洋水中に含有される細胞活性物質、具体的には、繊維芽細胞活性物質などの皮膚細胞活性物質および好酸球活性物質などの免疫細胞活性物質についての詳細は不明であるが、少なくとも上記のようにして海洋水を処理することにより得られる高濃縮脱塩海洋水は繊維芽細胞にエネルギー代謝活性を賦与する成分、増殖活性を示す成分および好酸球活性を有する成分を含有している。そして、本発明者の検討によると、この物質は、高濃縮脱塩海洋水に含有される有機物質のいずれかであろうと推定される。
【００３９】
そこで、この高濃縮脱塩海洋水を展開溶媒としてリン酸バッファー生理食塩水（PBS-）を用い、カラムとして商品名セファクリルS-300（ファルマシヤ社製）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーにより波長２８０nmにおける紫外線検出で分析し、この分析結果を、分子量１００万以上の第１画分、分子量５万〜１００万の第２画分、分子量５万〜５０００の第３画分、および、分子量５０００以下の第４画分に分割して各画分におけるピークの有無を調べてみると、上記のようにして得られた高濃縮脱塩海洋水は、少なくとも上記第１〜第４画分のいずれかの画分に少なくとも１個のピークが観察される。上記のような分子量で区画した画分にピークが表れることは、この高濃縮脱塩海洋水が上記画分に該当する分子量の有機化合物を含有していることを意味する。因みに、標識物質として数平均分子量１３７００のRibonuclease Aを添加した場合、このRibonuclease Aに対応する部分は第３画分に表れ、また、標識物質として数平均分子量４４００００のFerritinを添加した場合には、このFerritinに対応する部分は、第２画分に表れる。
【００４０】
上記のようにして得られた高濃縮脱塩海洋水について測定したゲル濾過クロマトグラフィーのチャートの例を図２に示す。図２において、破線で示したのは標識物質として使用した数平均分子量１３７００のRibonuclease Aおよび数平均分子量４４００００のFerritinのピークである。
図２に示すチャートでは、第３画分（分子量５０００〜５万）にピークが表れ、また、第１画分（分子量１００万以上）にも小さいながらピークが表れる。これらのピークとなって表れる物質の構造などについては、これらのピークが単一の物質を表すものではなく、複数の化合物に起因するピークであることから、その詳細は解明するに至っていない。しかしながら、標識物質のピークとの対比からすると、重合体化した生体関連物質である可能性が高い。
【００４１】
上記のような高濃縮脱塩海洋水は、細胞活性、すなわち、より具体的には、繊維芽細胞に対する細胞エネルギー代謝・増殖促進活性などの皮膚細胞活性、および、好酸球活性などの免疫細胞活性を有している。
以下に、上記皮膚細胞活性および免疫細胞活性について、繊維芽細胞に対する細胞エネルギー代謝・増殖促進活性および好酸球活性を例にとって、説明する。
【００４２】
まず上記高濃縮脱塩海洋水中に高濃度で含まれる細胞活性物質の有する、繊維芽細胞に対する細胞エネルギー代謝・増殖促進活性について説明する。
例えば、上記高濃縮脱塩海洋水をヒト真皮由来繊維芽細胞の三次元細胞組織モデルを用いてMTT法により細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝活性を評価すると、上記高濃縮脱塩海洋水は、固体分濃度０．１重量％の添加で、繊維芽細胞に対する明らかな代謝活性の改善効果が認められる。
【００４３】
さらに、画分別に成分を分離して繊維芽細胞のエネルギー代謝活性を調べると、第３画分の成分が最も高いエネルギー代謝・増殖活性を示す傾向があり、これに続いて第４画分の成分が高いエネルギー代謝・増殖活性を示す傾向がある。
上記のように本発明の細胞エネルギー代謝・増殖活性物質（繊維芽細胞活性物質）は海洋水から得られ、特に繊維芽細胞に対してエネルギー代謝・増殖活性を示すことから、この細胞エネルギー代謝・増殖活性物質（繊維芽細胞活性物質）は、医薬品・化粧料、特に皮膚外用剤として使用することができる。なお、本発明の効果を達成し得る限り、医薬品・化粧料の剤型、投与方法は、制限されないことはいうまでもなく、本発明においては、当該細胞活性物質（繊維芽細胞活性物質）は、内服薬であってもよく、経口投与も可能である。
【００４４】
本発明の皮膚外用薬は、海洋水を減圧下に蒸留濃縮することにより得られる濃縮海洋水から、析出物あるいは無機物質を分離する操作並びに該析出物等を分離する操作を経た（濃縮）脱塩海洋水をさらに減圧下に濃縮する操作及び分離する操作を少なくとも１回行うことにより得られ得る細胞活性物質、具体的には、繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質を含有している。
【００４５】
この細胞エネルギー代謝・増殖活性を有する物質（繊維芽細胞活性物質）は、例えば水性媒体に配合して化粧水のようにして使用することもできるし、軟膏基材に配合してクリームとして使用することもできる。さらに、エマルジョンに配合することにより乳液のように使用することができ、さらにこの細胞エネルギー代謝・増殖活性物質を水性媒体に配合し、この水性媒体に増粘剤を配合することにより、ジェルのようにして使用することができる。
【００４６】
本発明の皮膚外用剤に配合することができる細胞活性物質以外の成分としては、鉱油、植物油、ワックス、脂肪酸、脂肪族アルコール、エステル油、界面活性剤、湿潤剤、ポリマー、動植物抽出油、アミノ酸類、ビタミン剤、ステロイド剤、消炎剤、防腐剤、紫外線吸収剤、金属キレート剤、酸化防止剤、ｐH調整剤、色剤、香料など、皮膚の外用剤に通常使用される成分を配合することができる。
【００４７】
本発明の皮膚外用剤は、その用途に対応させて繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質（繊維芽細胞活性物質）の含有量を調整することができる。即ち、本発明の皮膚外用剤は、人の皮膚の細胞の代謝活性を改善することにより、ヒト皮膚のしわ、しみ、たるみの発生といった老化症状を予防あるいは治療するものであり、その使用方法などに対応させて、配合する繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質（繊維芽細胞活性物質）を調整することができる。この繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質（繊維芽細胞活性物質）は、上述のように通常は水に溶解もしくは分散した状態で得られるが、ヒト皮膚のしわ、しみ、たるみの発生といった老化症状の予防あるいは治療には、この水溶液あるいは分散液中の溶存あるいは分散成分が作用することから、本発明では固形分換算重量として繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質の使用量を特定することが好ましい。そして、本発明の皮膚外用薬（剤）１００重量部中における繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質（繊維芽細胞活性物質）の量は、固形分換算で、通常は０．０００１〜３０．０重量部、好ましくは０．００１〜５．０重量部、特に好ましくは、０．０１〜１．０重量部である。本発明の繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質（繊維芽細胞活性物質を含む）は、分子量による上記画分に含有される成分の構造などの詳細が必ずしも明らかではなく、従ってこれらの画分に含有される成分の作用効果を明確にすることは非常に困難であると共に、それぞれの画分に含有される成分の相互作用による作用効果の向上もあると考えられる。上記の理由から、本発明では各画分に含有される成分の複合体である上記のようにして得られた繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質を含有する水溶液あるいは分散液をそのまま使用することが好ましく、そして、その際に使用量は、水溶液あるいは分散液中に溶存もしくは分散している固形分として表記する。
【００４８】
上記のような量で繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質（繊維芽細胞活性物質）を含有する本発明の皮膚外用剤を使用することにより、この繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性物質（繊維芽細胞活性物質）がヒトの皮膚細胞、特に繊維芽細胞を活性化して、例えばコラーゲンなどの皮膚老化防止性の成分の分泌を促進すると共に、色素の沈着、ヒアロルン酸生成の低下などを有効に防止することができる。
【００４９】
そして、これらが総合して、ヒト皮膚のしわ、しみ、たるみの発生といった老化症状を予防することができ、あるいはこうして老化症状に陥った皮膚を治療することができる。
次に、上記高濃縮脱塩海洋水中に高濃度で含まれる細胞活性物質（好酸球活性物質を含む）の有する好酸球活性を例に採り説明する。
【００５０】
上記高濃縮脱塩海洋水を用いて、後述するような方法により、好酸球活性を調べると、コントロールとして用いたリン酸バッファー生理食塩水（PBS）よりも高い好酸球活性を示す。
また、上記のように分割した各画分について好酸球活性を調べた場合においても、いずれの画分においても、コントロールよりも高い好酸球活性が見られる。
【００５１】
アトピーに代表されるアレルギーと好酸球活性の関係について簡単に説明する。
アトピー性皮膚炎のようなアレルギー反応においては、局所に遊走した好酸球がヒスタミラーゼ、アリルスルファターゼB、ホスホリパーゼＤ₂を放出する。放出されたこれらの物質は炎症をメディエート(mediate)するヒスタミン、異種蛋白等の異物に対する異常過敏反応のエオジン好性細胞走化性因子（eosinophil chemotactic factor of anaphylaxis）および血小板活性化因子（platelet activating factor(PAF)）を代謝してアレルギー反応の修復に働くことが知られている。さらに、最近では、好酸球は上記のような組織の修復作用以上に組織の障害性に働くと考えるようになってきてもいる。好酸球が組織障害に関与する上で役割を果たすのが好酸球の特殊顆粒内に存在する４種類の塩基性タンパク質（major basic protein(MBP), eosinophil peroxidase(EPO), eosinophil cationic protein(ECP), eosinophil-derived neurotoxin(EDN)）と好酸球が産生するスーパーオキサイド（Ｏ₂ ^-）由来の各種活性酵素分子種である。これらの４種類の塩基性タンパク質は、活性化された好酸球から脱顆粒によって組織に放出され、組織障害に関与すると考えられている。特にＭＢＰは好塩基性球を、ＥＰＯは肥満細胞を活性化しヒスタミンを遊離させアレルギー反応を増長させていると考えられている。
【００５２】
また、スーパーオキサイド（Ｏ₂ ^-）は、好酸球がIgE複合体、PAF、オプソニン化ザイモザン（OZ）、phorbol myristate acetate などの種々の刺激によってNADPHオキシダーゼと呼ばれる細胞膜結合性酵素系が活性化することによって産生する。このNADPHオキシターゼは、急激なhexose monophosphate shunt 活性の増大で生成されるNADPHを酸化し、それによって酸素が１電子還元されたＯ₂ ^-を生成する。このＯ₂ ^-からは酵素的あるいは非酵素的反応により、H₂O₂、HO^-、¹O₂などの反応性の高い各種活性酸素分子種が生ずる。これらの活性酸素分子種は、殺菌などの重要な生体防御を担っている。したがって、好酸球は、好酸球の有するスーパーオキサイド（Ｏ₂ ^-）産生を促進させる能力によって、アトピー性皮膚炎などのアレルギー反応の原因要素の抑制に非常に有効に作用する。
【００５３】
本発明において、好酸球の活性化度は例えば以下に記載する方法により測定することができる。
まず、活性化度を測定するのに用いられる好酸球を調製する。具体的には、例えば、好酸球に選択的な増殖分化因子であるIL-５を恒常的に産生するトランスジェニックマウス(C3H/HeN-TgN(IL-5)Imeg)の１５〜２０週令の個体から、脾臓好酸球および脊髄好酸球を調製する。すなわち、脾臓および脊髄をCa²⁺フリーのKrebs-Ringer-phosphate buffer solution(KRP)(pH値7.4)中でホモジナイズし、細胞懸濁液をPercoll不連続密度勾配遠心法等の方法で分離することにより、好酸球を得ることができる。脾臓は通常は７５％、脊髄は通常は８０％をそれぞれ好酸球画分として使用することができる。なお、ここで使用されるマウスは、メタロチオネインプロモーター支配下にIL-５産生量を高める目的で実験の５日前に硫酸カドミウム２０μｇの腹腔内投与を行ったものであることが望ましい。
【００５４】
また、上記の他、例えば、好酸球に選択的な増殖分化因子であるIL-５を恒常的に産生するトランスジェニックマウス(C3H/HeN-TgN(IL-5)Imeg)の末梢血から分離した好酸球も好ましく用いられる。
海洋水中に含有されている本発明の細胞活性物質（好酸球活性物質）による好酸球のスーパーオキサイド（Ｏ₂ ^-）産生向上力は、好酸球により産生される過酸化水素により還元されたシトクロムｃ（Cyt. c）の量を測定することにより算定できる。
【００５５】
この測定は、Nakagawa. A., Shibata. K., Takeshige. K., et al: Exp.Cell.Res.101:224-234(1976)に記載の方法で行うことができる。すなわち、例えば、２０μモルのシトクロムｃ（Cyt. c）、１０ｍモルのグルコース、１ｍMのCaCl₂を含み、３７℃に保持されたKRPに上記由来の好酸球（5×10⁵cells/ml）を懸濁し、Cyt. cの還元に伴う５５０nmの吸光度の増大（A_550-540）を経時的に測定する。なお、Ｏ₂ ^-の生成量は、Cyt. cの分子吸光度２１．０ｍM^-1・cm^-1から求めることができる。また、この測定には、反応液を攪拌しながら吸光度を測定できる装置（例えば、（株）島津製作所製、二波長分光光度計（UV-300））を使用することが望ましい。
【００５６】
また、好酸球の活性化度は更に以下に記載する方法により測定することができる。
すなわち、例えば、好酸球が産生するスーパーオキサイド（Ｏ₂ ^-）から派生した過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）の量を測定することにより算定できる。この過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）の量は好酸球の過酸化水素産生能を示すものであり、活性化指標として好酸球の活性化度を表すことができる。この測定は、Irene, A.M.Vint, John, C. Foreman, et al: Eur. J. Immunol. 24:1961-1965,1994に記載の方法で行うことができる。
【００５７】
すなわち、好酸球が海洋水の好酸球活性物質により活性化され産生するスーパーオキサイド（Ｏ₂ ^-）から派生した過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）の量の測定は、2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)による蛍光を、フローサイトメーターを用いて解析することにより測定することができる。具体的には、５×１０⁵cells／ｍｌの好酸球を2.5μモルDCFH-DAを含むPhosphate-buffer saline glucose(5mモルglucose)(PBSｇ)０．５ｍｌ中で３７℃、１５分間インキュベートし、その後、刺激物を添加して３７℃で、３０分間インキュベートを行い、最後にPBSｇで数度細胞を洗浄した後、フローサイトメーターで解析測定することができる。
【００５８】
なお、上記の測定方法は、好酸球の活性化度を測定する方法の例であり、本発明の好酸球活性物質の活性化度の測定方法は上記の方法に限定されるものではない。
本発明の細胞活性物質（好酸球活性物質）は、優れた好酸球活性を有するため、医薬品・化粧料に使用することができる。
【００５９】
また、本発明の細胞活性物質（好酸球活性物質）を含有する医薬品は、アレルギー疾患、特にアトピー性皮膚炎に使用される医薬品の成分として有用性が高い。
すなわち、本発明の細胞活性物質（ここでは、好酸球活性物質）は、局所に遊走した好酸球を活性化してアレルギー反応におけるヒスタミン、異種蛋白等の異物に対する異常過敏反応のエオジン好性細胞走化性因子（eosinophil chemotactic factor of anaphylaxis）および血小板活性化因子（platelet activating factor(PAF)）を代謝させるヒスタミラーゼ、アリルスルファターゼB、ホスポリパーゼD₂を放出する。さらに、好酸球が細胞膜結合性酵素系を活性化することによるスーパーオキサイド（Ｏ₂ ^-）の生成により生体防御反応を向上させることができる。
【００６０】
ただし、上記に述べたように、本発明の細胞活性物質（好酸球活性物質を含む）は、分子量による上記画分に含有される成分の構造などの詳細が必ずしも明らかではなく、従ってこれらの画分に含有される成分の作用効果を明確にすることは非常に困難であると共に、それぞれの画分に含有される成分の相互作用による作用効果の向上もあると考えられる。
【００６１】
したがって、本発明の医薬品・化粧料では、各画分に含有される成分の複合体である上記のようにして得られた細胞活性物質を含有する水溶液あるいは分散液をそのまま使用することが好ましい。
本発明の好酸球活性物質は、基材に溶解もしくは分散させた外用薬として使用することもできる。このように外用薬として使用する場合、外用薬中における好酸球活性物質の量は、通常は０．００００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００１〜０．１重量％である。この場合の外用薬の基材としては、ワセリン、セレシン、パラフィン、スクワラン、ワックス類、オゾケライド等通常の外用薬の基材として使用されているものを用いることができる。また、剤形としては、エマルジョン状、油状、ワックス状、ローション状などに応用されることができる。
【００６２】
また、本発明の好酸球活性物質を水溶液とすることにより注射液として使用することもできる。この場合における好酸球活性物質の濃度は、通常は０．０００００１〜１０．０重量％、好ましくは０．０００１〜０．１重量％の範囲内に設定する。注射液として使用する場合、ｐH調整剤、酸化防止剤など注射液の安定性等を確保するために配合する成分を配合することができる。
【００６３】
さらに、本発明の好酸球活性物質は、粉剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップなどの内服薬として使用することもできる。
本発明の好酸球活性物質を使用する内服薬、注射薬として使用する場合、使用量は症状、使用者の状態などを考慮して適宜設定することができるが、体重１kgあたりの使用量は、一般には、０．０００１〜１００００mg、好ましくは０．１〜１００mgの範囲内に設定することができる。
【００６４】
なお、上記に、本発明の細胞活性物質を医薬品・化粧料に用いる場合の好ましい態様の例を挙げたが、本発明の効果が得られる限り、本発明の医薬品・化粧料の剤型、投与方法、使用方法等は制限されることはない。
【００６５】
【発明の効果】
本発明の細胞活性物質（繊維芽活性細胞物質などの皮膚細胞活性物質および好酸球活性物質などの免疫細胞活性物質を含む）は、海洋水に特定の処理をすることにより得られる溶液中に含有される物質であり、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの適切な手段で水から分離して得られる一定の分子量を有する高分子化合物であろうと推定される。
【００６６】
従来より、海水からの分離物を皮膚治療あるいはアレルギー治療に使用することは知られているが、これらは、海水中に含有される無機成分を用いたものである。即ち、海水中には塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムのような塩化物のほかに、種々多様なミネラルが含まれており、これらのミネラルを皮膚治療またはアレルギー治療に利用することが知られていた。従って、皮膚治療およびアレルギー治療に海水を使用する場合には、海水を濃縮して析出した析出物（ミネラル分）を海水から分離して使用していた。さらに、海水中には皮膚治療またはアレルギー治療に有効な有機成分は含有されているとは考えられていなかったことから、海水中に含有される有機物質を分離して使用することは試みられていなかった。
【００６７】
これに対して本発明者は、海洋水中には上記のような無機塩とは別に有機物質が含有されており、この有機物質は、海水中に含有されるミネラルとは全く異なる機能を有しており、この機能を利用することにより、皮膚を形成する繊維芽細胞活性および好酸球活性を向上させることができることを見出したのである。
本発明の細胞活性物質は、海洋水に特定の処理を施すことにより得られ得る有機物質を含有しており、この有機物質は繊維芽細胞のエネルギー代謝・増殖活性および好酸球活性を向上させることができる。
【００６８】
こうした細胞活性物質は、種々の有機物質の複合体であり、個々の成分を特定することが極めて困難であるが、海洋水に本発明で規定する処理をすることにより繰り返し得ることができる。
そして、この細胞活性物質は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分子量により、複数の画分にピークを有する有機物質の複合体であることがわかった。これらの各画分に分離された成分は、単独では、例えば繊維芽細胞に対するエネルギー代謝・増殖活性あるいは好酸球活性が異なるが、これらの複合体をそのまま使用することにより、特に繊維芽細胞に対して優れたエネルギー代謝活性・増殖および好酸球に対する活性の向上効果を示すことが確認された。
【００６９】
しかも、このような本発明の細胞活性物質（繊維芽細胞活性物質などの皮膚細胞活性物質および好酸球活性物質などの免疫細胞活性物質を含む）は、通常の細胞活性物質と比較して、副作用が著しく少なく、極めて安全性が高く、特に繊維芽細胞に対しては、副作用なしに優れた細胞エネルギー代謝・増殖活性（細胞活性）を示すとの特異的な効果が認められるため、特に皮膚外用剤として有用性が高い。また、同様な理由から、特にアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の治療薬として非常に有用性が高い。
【００７０】
また、本発明の細胞活性物質（繊維芽細胞活性物質などの皮膚細胞活性物質および好酸球活性物質などの免疫細胞活性物質を含む）は、水に対する親和性がよいので、外用薬、内服薬、注射液など種々の形態で利用することができる。
さらに具体的には、本発明の繊維芽細胞活性物質によれば、上述のように、顕著に繊維芽細胞を活性化し得るので、人の皮膚の細胞の代謝活性を改善することができ、ヒト皮膚のしわ、しみ、たるみの発生といった老化現象を予防あるいは治療することができる。
【００７１】
また、本発明の好酸球活性物質は、上述のように、好酸球を活性化させることができるため、好酸球が活性化して産生したスーパーオキサイドなどの作用により非常に優れた生体防御機能を有する。また、この物質は、炎症をメディエートするヒスタミンなどを代謝させてアレルギー反応の修復に働くヒスタミラーゼなどを放出する。さらに、この好酸球活性物質を好酸球に作用させることにより、好酸球からスーパーオキサイド（Ｏ₂ ^-）が生成し、このスーパーオキサイド（Ｏ₂ ^-）から酵素的反応あるいは非酵素的反応により反応性の高い各種活性酸素種を生成させることができる。そして、これらの活性酸素種に殺菌作用などの重要な生体防御を発現させることができる。
【００７２】
そして、本発明の好酸球活性物質の有する上記のような機能が複合的に作用すると考えられるので、本発明の好酸球活性物質は、喘息や花粉症、皮膚炎などのアレルギー疾患の治療成分として、特にアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患の治療成分として有用性が高い。また、上記以外にも、本発明の効果を達成し得る限り、本発明の医薬品および化粧料には、医薬品および化粧料の成分として通常使用される成分を配合することができる。
【００７３】
【実施例】
次に、本発明について実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００７４】
【実施例１】
［細胞エネルギー代謝・増殖活性物質の調製］
駿河湾沖１０Kmの位置で、深度１００mから海洋水（温暖層を形成する海水であって、いわゆる表層水）１０リットルを採取した。
この海洋水１０リットルを目開き０．４５μmのメンブランフィルターを用いて濾過し、この海洋水中の浮遊物を除去した。
【００７５】
こうして濾過された海洋水を減圧蒸留装置に入れ、減圧度２０Torr の圧力条件で、蒸留温度を４０℃以下の温度に設定して、海洋水の量が約1リットル（元の海洋水の1／10の量）になるまで減圧蒸留した。
こうして減圧蒸留することにより、海洋水に溶存していた塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムなどの無機塩が析出した。この析出した無機塩を目開き０．４５μmのメンブランフィルターで濾過した。なお、濾別された無機塩は、本発明では使用しないので廃棄した。
【００７６】
次いで、上記工程で得られた濾液をモザイク荷電膜（商品名：ＭＣ−５５Ｂモザイク荷電膜、東ソー（株）製）を用いて低温１０℃の条件で脱塩操作を行い、さらにこの脱塩された液を減圧蒸留装置に入れて、２０Torrの減圧下に、４０℃の温度を超えないように温度を管理して、液の容量が１００mlになるまで減圧下に水分を蒸留除去した。
【００７７】
上記のモザイク荷電膜を用いた脱塩および減圧蒸留を繰り返して、５mlの濃縮物を得た。
この濃縮物中には、１．１重量％の有機物質が含有されており、さらにこの濃縮物中における無機塩の含有率は１００ppm以下、無機塩化物の含有率は２５０ppm以下であった。
【００７８】
この濃縮物をファルマシヤ社製のカラム（セファクリルＳ-300）を有するゲル濾過クロマトグラフィーを用い、展開溶媒としてリン酸バッファー生理食塩水（PBS-）を用いて含有成分を分析した。
この分析結果を、分子量に従って、
分子量１００万以上の第１画分、
分子量５万〜１００万の第２画分、
分子量５０００〜５万の第３画分、および、
分子量５０００以下の第４画分に分けてそれぞれの画分における波長２８０nmでの吸収ピークの有無を調べた。
【００７９】
結果を図２に示す。
この実施例で使用した海洋水を上記のようにして脱塩、濃縮した結果、第３画分に最も大きなピークが表れ、さらに、第１画分には小さいながら明確にピークが表れた。なお、第２画分には、第３画分および第４画分の成分のテーリングした部分のピークが存在し、第４画分には、第２画分に主ピークを有する成分のテーリングしたピークが存在している。
【００８０】
なお、これらの画分に表れたピークの成分の解析の参考にするために、平均分子量13700のRibonuclease Ａおよび平均分子量44万のFerritinを含有する液を調整し、上記と同様にして分析して、その結果を図２に破線で併せて記載する。
［繊維芽細胞エネルギー代謝・増殖活性の測定］
上記のような構成を有する細胞エネルギー代謝・増殖活性物質（繊維芽細胞活性物質を含む）を、固形分換算で０．１重量％となるように標準液であるリン酸バッファー生理食塩水（PBS−）に加えて本発明の試料を調整した。なお、各試料の最終塩分は標準液であるＰＢＳ−の塩分にあわせた。
【００８１】
ヒト真皮由来繊維芽細胞の3次元細胞組織モデル（東洋紡(株)製、MATREX-LDM）を用いて、MTT法により細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝・増殖活性を評価した。
ここでMTT法は、3-(4,5-Dimethyl-2-thiazoly)-2,5-diphenyltertrazolium Bromideを用いた細胞のエネルギー代謝・増殖活性を測定する方法である。即ち、MTTは、細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝過程で生成したNADH(reduced nicotinamide adenine dinucleotide)あるいはNADPH(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)によって還元され、青色のホルマザンを生成する。
【００８２】
青色のホルマザンを波長５７０nmにおいて吸光測定し比色測定し、比色定量することによって細胞の代謝活性及び細胞の増殖活性を評価する方法である。この場合、青色が濃くなればなるほど活性が高いことを示している。
また、本発明では、コントロールとして、上記細胞エネルギー代謝・増殖活性物質を用いずに標準液（PBS−）のみを使用して、同様にしてMTT法により細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝活性を調べた。
【００８３】
さらに、ネガティブコントロールとして、典型的な細胞毒性のあるドデシル硫酸ナトリウム（SDS=Sodium dodecyl sulfate）を、０．１重量％配合してMTT法によりエネルギー代謝活性を調べた。このネガティブコントロールは、エネルギー代謝活性を全く示さない場合におけるMTT法の最低基準を示すものである。
上記コントロールにより得られたMTT法の値を１００とすると、ネガティブコントロールの値は２７．７となる。
【００８４】
そして、同様の試験で測定した本発明の細胞活性物質を０．１重量部で含有する試料のMTT法における値は１９０．６であり、この細胞エネルギー代謝・増殖活性物質は、細胞エネルギー代謝・増殖活性を示すことが明らかである。
また、この試験においてMTT試薬は、細胞のミトコンドリアの代謝過程で生成したNADHあるいはNADPHによって還元され青色になるのではなく、本発明の細胞エネルギー代謝・増殖活性物質自体に還元され青色になる可能性も考えられるため、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS＝Sodium dodecyl sulfate）を、０．１重量％に、本発明の細胞エネルギー代謝・増殖活性物質を固形分換算で０．１重量％加え、同様な試験で調べた。その結果、同様な試験における値は２９．７であり、ドデシル硫酸ナトリウムが単独の場合の値２７．７とほぼ同様であるため、本発明の細胞エネルギー代謝・増殖活性物質自体がMTT試薬を還元し青色に変色させることはなく、細胞のミトコンドリアが本発明の細胞エネルギー代謝・増殖活性物質を添加することによって代謝活性が活発になり、生成されたNADHあるいはNADPHがMTT試薬を還元して青色に変色させることがわかった。即ち、本発明の細胞エネルギー代謝・増殖活性物質により代謝活性及び増殖活性が向上したことは明らかである。また、MTT試薬に上記の深層水細胞活性物質を添加しても、MTT試薬はまったく変色しないことから、上記の結論が更に明らかにされた。
【００８５】
また、参考のために各画分の成分を固形分換算で０．１重量％となるように標準液であるリン酸バッファ生理食塩水（PBS-）に加えた試料を調整し最終塩分は標準液であるPBS-の塩分にあわせ、MTT法における細胞エネルギー代謝・増殖活性を調べた。
その結果、
分子量１００万以上の第１画分の成分の活性は、１０３．２、
分子量５万〜１００万の第２画分の成分の活性は、１０５．１、
分子量５万〜５０００の第３画分の成分の活性は、１６５．２、
分子量５０００以下の第４画分の成分の活性は、１１８．６であった。
【００８６】
なお、上記各画分の成分を用いた活性の評価値は、参考的な値であり、さらに詳細に実験を重ねることにより、また、実験の精度を上げることにより上記値がさらに明確な細胞エネルギー活性を示す可能性が充分にある。
【００８７】
【実施例２】
好酸球活性物質を、実施例１の細胞活性物質の調製と同様の方法にて調製し、得られた好酸球活性物質について、下記の方法により、活性化度を測定した。
［好酸球活性物質の活性化度測定］
本発明の細胞活性物質（好酸球活性物質を含む）の好酸球を活性化する能力（活性化度）は、好酸球が産生するスーパーオキサイド（Ｏ₂ ^-）から派生した過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）の量を指標にして測定した。前記好酸球活性物質により好酸球が活性化されて産生するスーパーオキサイド（Ｏ₂ ^-）から派生した過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）の量の測定は、具体的には、2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)による蛍光をフローサイトメーターを用いて解析することにより行った。
【００８８】
５×１０⁵cells／ｍｌの好酸球を、2.5μモルDCFH-DAを含むPhosphate-buffer saline glucose(5mモルglucose)(PBSｇ)０．５ｍｌ中で、３７℃で、１５分間インキュベートし、その後、刺激物（ＰＭＡ50ng／ml）を添加し、３７℃で、３０分間インキュベートを行った。PBSｇで２度細胞を洗浄した後、フローサイトメーターで解析・測定した。
【００８９】
本実験において使用した好酸球は、好酸球に選択的な増殖分化因子であるIL-５を恒常的に産生するトランスジェニックマウス(C3H/HeN-TgN(IL-5)Imeg)の末梢血から分離した好酸球を用いた。末梢血を終濃度０．２２％のクエン酸を含むＣａ⁺⁺フリーのKrebs Ringerリン酸緩衝液（ＫＲＰ）（０．９％ＮａＣｌ、６ｍモルＫＣｌ、１ｍモルＭｇＣｌ₂、１０ｍモルＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４））中に採取し、赤血球、単球を除去する目的で、Percoll不連続密度勾配遠心法を行った。Percoll原液に対して、１０倍濃度のＫＲＰを１／１０量添加したものを１００％Percoll定義細胞混濁の下に６０、７０、８０％Percollを重層し、３５０ｇ、室温、２０分間遠心した後、７０、８０％層を回収した。回収した細胞集団を分離用緩衝液（５ｍモルＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、１０ｍモルモルＮａ−Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２））に更に懸濁（１×１０⁷cells／５０μｌ）し、抗Ｔｈｙ１．２抗体結合磁気ビーズ（１×１０⁷beads／２５μｌ）と抗Ｂ２２０抗体結合磁気ビーズ（１×１０⁷beads／２５μｌ）に添加し、４℃で２０分間反応させた後、永久磁石を用いネガティブセレクションで採取された細胞集団を好酸球集団として実験に供した。なお、分離後の細胞集団の純度はフローサイトメーター（ＢＥＣＴＯＮＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製のＦＡＣＳcan）で解析した。
【００９０】
測定物質は、サンプル／１．８％ＮａＣｌと精製水で調整し、等張に調整したものを終濃度１００μｇ／ｍｌで添加した。
なお、コントロールとしてリン酸バッファー生理食塩水（PBS）を用いて同様の実験を行った。
上記のように測定した各被験物質の好酸球活性化度の値（過酸化水素量生産相当）は、コントロール（PBS）の好酸球活性化度は３．３５であるのに対し、上記好酸球活性物質の好酸球活性過度は４．２５であった。
【００９１】
上記のようにして得られた好酸球活性物質は、コントロール（PBS）より高い好酸球活性を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の細胞活性物質を得るための工程の例を示す工程図である。
【図２】図２は、本発明の細胞活性物質を、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて各画分に分けて、各画分に表れるピークの例を示した図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a cellular active substance contained in marine water, a production method thereof, a pharmaceutical and a cosmetic containing the cellular active substance. More specifically, the present invention relates to cell active substances such as skin cell active substances (eg, fibroblast active substances) and immune cell active substances (eg, eosinophil active substances) contained in marine water, such as The present invention relates to a method for producing a cell-active substance, a pharmaceutical and a cosmetic containing such a cell-active substance.
[0002]
TECHNICAL BACKGROUND OF THE INVENTION
In the human skin, aging symptoms such as wrinkles, blemishes and sagging appear due to internal factors such as aging or external factors such as ultraviolet rays. Such aging symptoms of the human skin are considered to be caused mainly by a decrease in the function of the cutaneous dermal fibroblasts, and the insufficient secretion of matrix fibers and collagen accompanying the decrease in the function of these cells. Therefore, it is considered that an effective means for preventing the aging of human skin or improving the function of aging skin is to activate skin dermal fibroblasts and further proliferate these cells.
[0003]
Extracts from seaweed and the like are said to be effective for such aging symptoms of human skin, that is, a decrease in the activity of skin dermal fibroblasts. For example, in JP-A-10-330281, extracts from Yakuzusa, Hondara, Fukurinamiji, Fukuronori, Kombu, Kamensou, Kaigankenori, Otosa, Yanagiri, Sozo, Rattle are extracted from dermal fibers. It is described to activate blast cell metabolism. Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-116431 discloses an invention for a topical skin preparation containing a culture supernatant of ketoceros gracilis. As used herein, Chaetoceros gracilis is a kind of algae that lives alone in the waters near the sea. It is described that the culture supernatant of this ketoceros gracilis has an effect of improving the metabolic activity of dermal fibroblasts.
[0004]
In addition to these seaweed-derived components, for example, JP-A-2000-169320 discloses any one of a seaweed extract, a chamomile extract, a mugwort extract, a Tamatsuki-suzuraji extract, It is described that the combination is effective as a cell activator.
However, such an algae or plant extract may cause fluctuations in the composition of the components extracted depending on the algae or plant habitat, and the extraction operation from such algae or plants is also complicated. There is.
[0005]
JP-A-2000-159654 discloses at least one treatment method selected from ultrafiltration, reverse osmosis membrane filtration methods, electrodialysis methods, ion exchange membrane methods and distillation methods. An invention of cosmetics characterized by containing concentrated water obtained by treatment is disclosed. This publication describes that the conductivity of this concentrated water is 5 mS / cm to 1 S / cm, preferably 10 mS / cm to 500 mS / cm, and seawater has the above conductivity. Is considered to contain a considerable amount of ionic substances. In this publication, the total abundance ratio of chlorine ions, sodium ions and potassium ions per water-evaporated solid in the concentrated water is 35% or less, and the concentrated water actually used in Example 2 and Comparative Example 2 is used. The total abundance of chlorine ions, sodium ions and potassium ions in B1 is 31.5%, and the total abundance of chlorine ions, sodium ions and potassium ions in concentrated water B2 used in Example 2 and Comparative Example 2 is also 32. It shows a very high value of 0.5%. And in this gazette, it is the concentrated water which has these values and is obtained by the method described in this gazette, Comprising: It is irritating with respect to skin among the components contained in deep sea water. It is understood that the invention of cosmetics using deep ocean water containing a high concentration of minerals excluding chlorine ions, sodium ions and potassium ions is disclosed. When chlorine ions, sodium ions, and potassium ions that are irritating to the skin are removed from inorganic substances contained in deep sea water, phosphate ions, silicate ions, nitrate ions, etc., which are generally called nutrient salts The content ratio is increased, and it is considered that these natural minerals have an effect of improving skin dullness, wrinkles and the like and a slimming effect.
[0006]
As described above, JP-A-2000-159654 discloses a cosmetic using concentrated water from deep sea water mainly containing natural minerals contained in deep sea water by concentrating deep sea water. Therefore, it is understood that the effect exerted by the cosmetic disclosed in this publication is a natural mineral component contained in deep ocean water, that is, an inorganic salt.
[0007]
Apart from skin aging due to internal factors such as aging, patients who have various allergic symptoms such as atopic dermatitis due to changes in the living environment and eating habits, stress, etc. in recent years as skin diseases Is increasing and is a problem.
Allergic symptoms such as atopic dermatitis are a type of hypersensitivity in which the inherited constitution plays a major role. Antigens that cause allergic symptoms are thought to be in the blood, and the complex of this antigen and antibody releases histamine or histamine-like substances from tissues, resulting in specific symptoms It is believed that. For example, in atopic dermatitis, peripheral blood eosinophils increase, and infiltration of eosinophils is often seen in histological findings. This also suggests that eosinophils are one of the cells that play a central role in atopic dermatitis.
[0008]
Against this background, various studies have been made on eosinophil active substances, and it is already known that the activity of eosinophils is increased by deep ocean water. The mechanism for sphere activity has not been elucidated yet. At present, the idea that eosinophil activity is derived from minerals contained in the deep ocean water is the majority, and the mineral content obtained by concentrating, desalting and separating deep ocean water is large. The isolates contained were used for allergic drugs and the like.
[0009]
Most of the substances obtained by concentrating, desalting and separating the deep ocean water as described above are occupied by inorganic salts such as calcium sulfate. However, it is known that calcium sulfate has substantially no medicinal effects related to allergy.
[0010]
OBJECT OF THE INVENTION
The present invention removes inorganic salts from marine water as much as possible, while skin cell active substances (for example, fibroblasts) that are cell active substances composed of highly concentrated desalted marine water enriched with organic substances contained in the marine water. Active substances) and immune cell active substances (eg eosinophil active substances).
[0011]
It is another object of the present invention to provide a method for producing a dermal fibroblast active substance and an eosinophil active substance, which are the above-mentioned cell active substances.
The present invention also provides a pharmaceutical and a cosmetic using a cell active substance such as a skin cell active substance (for example, a fibroblast active substance) and an immune cell active substance (for example, an eosinophil active substance) as described above. It is intended to provide.
[0012]
SUMMARY OF THE INVENTION
The cellular active substance of the present invention is further desalted through the operation of separating the precipitate or the inorganic salt from the desalted marine water from which at least a part of the dissolved inorganic salt has been separated, and the operation of separating the precipitate or the inorganic salt. It can be obtained by performing the operation of further concentrating the ocean water at least once.
[0013]
In the present invention, the concentration operation (process) refers to an operation for removing dissolved salts dissolved in ocean water. In this step, ocean water may be concentrated and fresh water may be removed.
The desalted marine water may be concentrated desalted marine water concentrated by vacuum distillation or the like, if necessary.
More specifically, the cellular active substance of the present invention is obtained by performing at least one operation of further concentrating (concentrated) demineralized marine water that has undergone an operation of separating at least a part of the inorganic salt dissolved in the marine water. It can be done.
[0014]
Cell active substances of the present invention include cellular energy metabolic active substances.
The cell active substances of the present invention include skin cell active substances such as fibroblast energy metabolism / proliferation active substances and immune cell active substances such as eosinophil active substances.
Further, the method for producing a cellular active substance of the present invention can be separated by, for example, precipitating at least a part of the inorganic salt dissolved in the marine water by distilling and concentrating the marine water under reduced pressure. To obtain concentrated desalted ocean water,
The step of further separating precipitates or inorganic salts from the (concentrated) desalted marine water, and the step of further concentrating the desalted marine water that has undergone the step of separating the precipitates, etc. under reduced pressure The process is performed at least once.
[0015]
More specifically, the method for producing a cellular active substance of the present invention comprises a step of separating at least part of an inorganic salt dissolved from marine water to obtain (concentrated) demineralized marine water, and the (concentrated) demineralized marine water. It is characterized in that highly concentrated demineralized ocean water containing a high concentration of cellular active substances is obtained through a step of further concentrating and separating the precipitate or inorganic salt at least once.
[0016]
Furthermore, the pharmaceutical product of the present invention is a cell that can be obtained by performing at least one operation of further concentrating (concentrated) demineralized marine water that has undergone an operation of separating at least a part of the inorganic salt dissolved in the marine water. It is characterized by containing an active substance.
The medicine may be an external medicine or an internal medicine.
When the pharmaceutical is an external medicine, the skin external medicine of the present invention includes, for example, an operation for separating precipitates or inorganic salts from concentrated marine water obtained by distilling and concentrating marine water under reduced pressure, and the precipitates. It may contain a cell active substance that can be obtained by performing the operation of further concentrating the desalted marine water subjected to the separation operation (concentration) under reduced pressure and the operation of separation at least once.
[0017]
In addition, the cosmetic of the present invention can be obtained by performing at least one operation of further concentrating (concentrated) demineralized marine water that has undergone an operation of separating at least a part of the inorganic salt dissolved in the marine water. It is characterized by containing a cell active substance.
Marine water contains inorganic salts and organic substances, and the concentration of inorganic salts dissolved in the marine water is usually about 3.4% by weight. Of these inorganic salts, 2.2% by weight or more is sodium chloride, magnesium chloride, or calcium sulfate, and these inorganic salts have little action as a cell energy metabolic active substance, and particularly in inorganic salts. It is known that calcium sulfate contained has substantially no medicinal effects related to allergy.
[0018]
On the other hand, when the concentrated solution obtained by concentration while removing inorganic salts dissolved in ocean water was analyzed, it was found that the concentrated solution contained an organic substance having a certain molecular weight or more. The details of the origin and structure of such organic substances are not clear, and it is estimated that they contain a very wide variety of components. However, when such an organic substance is analyzed by selecting a developing solvent and using gel filtration chromatography, in the ultraviolet detection analysis at a wavelength of 280 nm, the first fraction having a molecular weight of 1 million or more and the second fraction having a molecular weight of 50,000 to 1,000,000 are used. It was found that an organic substance having a peak was contained in at least one fraction of the fraction, the third fraction having a molecular weight of 5,000 to 50,000, and the fourth fraction having a molecular weight of 5000 or less.
[0019]
Then, the present invention selectively collects organic substances contained in such marine water and investigates cell activity such as behavior and eosinophil activity on fibroblasts. As a result, fibroblasts are added to these organic substances. The present invention has been completed with the knowledge that there are cell activities such as energy metabolism / proliferation activity and eosinophil activity.
That is, conventionally, natural minerals that are inorganic substances other than chlorides contained in marine water, for example, deep sea water, have attracted attention. By blending these natural minerals with skin external medicines such as cosmetics, rare natural Minerals were considered to have been considered to act as fibroblast active substances and active substances having eosinophil activity. However, organic substances contained in trace amounts in these marine waters have not been studied in detail. Not. This is because the content of inorganic salts in marine water is high, and it is extremely difficult to separate organic substances contained in trace amounts from inorganic salts, which are inhibited by inorganic salts, with ordinary separation methods. This is because it was extremely difficult to identify the action effect of a very small amount of organic substance behind the salt shadow.
[0020]
However, the present inventor has separated and removed inorganic salts as much as possible while repeatedly concentrating ocean water to increase the concentration of the organic substance, and a concentrated solution containing this organic substance at a relatively high concentration, for example, fiber buds. When it was allowed to act on cells and eosinophils, it exhibited an excellent effect as a fibroblast energy metabolism / proliferation active substance, and also an excellent effect as an eosinophil active substance.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, a fibroblast active substance is taken as an example of a skin cell active substance, and an eosinophil active substance is taken as an example of an immune cell active substance. Cell active substances, methods for producing them, and pharmaceuticals and cosmetics containing the cell active substances will be specifically described.
[0022]
In the present invention, the skin cell active substance refers to a substance that can activate fibroblasts and the like.
In addition, immune cell active substances include leukocytes, ie, monocytes such as macrophages, lymphocytes such as NK cells, T cells, K cells, and B cells, granulocytes such as eosinophils, neutrophils, and basophils. A substance that can activate the like.
[0023]
FIG. 1 shows an example of a typical operation for obtaining the cell active substance of the present invention. In addition, although the cell active substance of this invention can be obtained by the said operation, respectively, it should not be limitedly interpreted to the substance obtained only by this operation.
First, the cell active substance of the present invention will be specifically described along the production flow illustrated in FIG.
[0024]
As shown in FIG. 1, the cellular active substance of the present invention is produced using marine water as a raw material. In the present invention, the cell active substance includes a cell energy metabolic active substance. Further, the cell active substance of the present invention includes skin cell active substances (including fibroblast active substances such as fibroblast energy metabolism / proliferation active substances) and / or immune cell active substances (including eosinophil active substances). ) Is included. That is, the cell active substance of the present invention may have a skin cell activity and an immune cell activity at the same time, or may have only a skin cell activity or an immune cell activity.
[0025]
Of course, as the ocean water used in the present invention, it is preferable to use the ocean water collected in the open sea to some extent away from the vicinity of land where river water flows. This is to prevent the seawater from being diluted by the fresh water flowing from the river. Of course, the fresh water flowing from the river is mixed with effluents such as domestic sewage, industrial wastewater, and soil pollutants accumulated over many years. This is because it is impossible to completely deny the fear of doing it. Therefore, it is preferable to use marine water collected in the open sea where such substances are relatively small.
[0026]
The marine water collected in this way is filtered using a filter having a relatively small opening, such as a membrane filter, in order to remove suspended matters that may be mixed during the collection. In the present invention, it is usually filtered using a filter having an opening of 0.01 to 2 μm, preferably 0.1 to 1 μm, particularly a membrane filter. By using such a filter, fine components that cannot be confirmed with the naked eye can be filtered out. If there are precipitates or inorganic salts that precipitate at this stage, such precipitates may be separated at this stage.
[0027]
In the present invention, since the filtrate filtered as described above is used, the substance (residue) that could not pass through the filter is discarded.
In the present invention, the filtrate obtained as described above is distilled under reduced pressure, and at least a part of the water contained in the filtrate is removed by this reduced-pressure distillation operation. When the first collected marine water is 100 parts by volume, the distillation operation under reduced pressure usually results in 1 to 30 parts by volume, preferably 2 to 25 parts by volume, particularly preferably to the first marine water collected. Is distilled under reduced pressure so as to be 5 to 20 parts by volume. Specifically, under a reduced pressure of 1 to 40 torr, preferably 5 to 30 Torr, at a temperature of 50 ° C. or lower, preferably 40 ° C. or lower, 10 minutes to 3.0 hours, preferably 30 minutes to 1.0. Distill under reduced pressure over time. The distillation temperature during the vacuum distillation is preferably as low as possible in order to prevent decomposition of dissolved substances dissolved in the ocean water. Therefore, the pressure during the vacuum distillation used here should be lowered. Thus, this vacuum distillation operation can be performed at a lower temperature. A part of the water in the ocean water is separated by this vacuum distillation operation, and the separated water is discarded. Further, the above concentration operation can be eliminated if the processing capacity of the facility for separating the inorganic salt is sufficient.
[0028]
Moreover, instead of concentrating marine water by vacuum distillation and separating inorganic salts as described above, an electrolyte (inorganic salt) in marine water can be separated using a charged mosaic membrane. By using a charged mosaic membrane, it is possible to selectively remove inorganic salts in ocean water, and it is not necessary to heat ocean water for selective removal of these inorganic salts. It is possible to reduce the heat effect on the organic matter.
[0029]
On the other hand, inorganic salts and the like are deposited in the ocean water concentrated by separating water by vacuum distillation as described above (hereinafter referred to as concentrated ocean water). This precipitate is mainly composed of an inorganic salt such as sodium chloride, calcium sulfate or magnesium chloride, and preferably 2 to 10 after the distillation residue is sufficiently cooled (usually at room temperature (25 ° C.) or lower). The deposited precipitate is separated by cooling to ° C. A general separation method such as filtration, centrifugation, or decantation can be used to separate the precipitate. Moreover, these separation operations can be combined. The amount of precipitates (mainly inorganic chlorides) deposited by concentration under reduced pressure as described above is relatively large, and most of these precipitates are crystallized inorganic salts. Efficient.
[0030]
Although there is no limitation in particular in the filtration apparatus used for isolation | separation of deposits, such as inorganic salt here, a filter with an opening of 0.01-2 micrometers normally, Preferably it is 0.1-1.0 micrometer is used. By filtering under reduced pressure using the above filter, the precipitate and the filtrate can be separated efficiently. As described above, the precipitates separated here are mainly inorganic chlorides, and inorganic salts such as inorganic chlorides (mainly sodium chloride and magnesium chloride) dissolved in the marine water originally used by this separation operation. In addition, 70% by weight or more, preferably 90% by weight or more, of calcium sulfate or the like is removed. The precipitate (mainly inorganic chloride) separated as described above is discarded without being used in the present invention.
[0031]
In the present invention, when the precipitate is separated as described above, that is, when separated by filtration as shown in the above example, the above desalted filtrate is used in the next step (hereinafter referred to as (concentration) desalting. Called salt ocean water).
That is, the cellular active substance of the present invention is a method in which the desalted filtrate ((concentrated) desalted marine water) obtained in the above step is concentrated, and the precipitate separated by this concentration is separated at least once. Is contained in high concentration demineralized marine water that can be obtained by
[0032]
In the present invention, the concentration operation (process) refers to an operation for removing dissolved salts dissolved in ocean water. In this step, ocean water may be concentrated and fresh water may be removed.
Here, the filtrate is usually concentrated by distillation under reduced pressure. The pressure at this time can be normally set within the range of 1 to 40 Torr, preferably 5 to 30 Torr, and the distillation temperature is usually 5 to 50 ° C., preferably 10 to 40 ° C. In one operation under the above conditions, distillation is performed so that the amount of the original filtrate is preferably within the range of 5 to 30 parts by volume, more preferably 5 to 20 parts by volume with respect to 100 parts by volume of the original filtrate. By distillation in this way, components (mainly inorganic salts) dissolved in the filtrate are deposited. Next, in the present invention, the precipitate (mainly inorganic salt) thus precipitated is separated.
[0033]
In the separation of precipitates or inorganic salts, that is, in the process of removing dissolved salts, the separation operation using a semipermeable membrane, the operation of electrically separating residual ionic substances, the centrifuge operation, the gel filtration operation, the charged mosaic It is preferable to employ either a separation operation using a membrane or an ultrafiltration operation. That is, the precipitate in this process tends to have a smaller particle size than the precipitate in the previous process, and some of the precipitate may be colloidal or even gelled. Difficult to separate.
[0034]
Therefore, the separation of precipitates or inorganic salts and liquid in this step is a method of separating from the dispersion medium using the difference in osmotic pressure of the semi-permeable membrane, and the electrical properties of the remaining ionic substances by applying voltage. A method of collecting and separating from a dispersion medium using characteristics, a method of collecting a precipitate using an external stress such as centrifugal force and separating it from the dispersion medium, and a filtration membrane having a desired permeability such as an ultrafiltration membrane. The precipitate and the dispersion medium can be separated by using a method of filtering under pressure using a method, a method of separating low molecular weight particles from a dispersion medium using gel filtration, or the like.
[0035]
The cell active substance of the present invention is a dispersion medium (highly concentrated desalinated marine water) obtained by performing the above-described concentration operation and separation operation at least once, preferably twice or more. When the above steps are repeated, the concentration operation and separation operation performed in the previous operation and the subsequent concentration operation and separation operation do not need to be the same operation, and the state of the precipitates, etc. Corresponding operations can be combined as appropriate. The precipitate thus separated is considered to be mainly the remaining inorganic salt, dissolved metal compound, etc., and in the present invention, this precipitate is discarded.
[0036]
The dispersion medium (highly concentrated desalted marine water) obtained by repeating the concentration and separation as described above is a liquid containing a high concentration of a cell active substance, and this cell active substance (ie, fibroblast active substance) The amount of the liquid containing a high concentration of skin cell active substance such as skin cell active substance and eosinophil active substance) is usually 0.0001-30. The amount is 0 volume part, preferably 0.001 to 5.0 volume part, more preferably 0.01 to 0.5 volume part.
[0037]
The highly concentrated desalted marine water obtained as described above contains various organic substances. Conversely, the content of inorganic substances is very low, usually 0.9% by weight or less, preferably Is 0.01% by weight or less, and the ignition residue of this cellular active substance is usually 0.1% by weight or less, preferably 0.01% by weight or less. In particular, the content of inorganic chloride in this highly concentrated demineralized marine water is extremely low and is usually 100 ppm or less, preferably 10 ppm or less. Further, the total amount of organic substances contained in this highly concentrated desalted marine water is usually 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight.
[0038]
The highly concentrated desalted marine water obtained as described above contains, for example, immune cell activities such as skin cell active substances such as substances that activate human skin fibroblasts and substances that enhance eosinophil activity. Contains substances. Details of cellular active substances contained in this highly concentrated desalted marine water, specifically, skin cell active substances such as fibroblast active substances and immune cell active substances such as eosinophil active substances are unknown. However, highly concentrated desalted marine water obtained by treating marine water at least as described above comprises a component that imparts energy metabolism activity to fibroblasts, a component that exhibits proliferative activity, and a component that has eosinophil activity. Contains. According to the study by the present inventor, it is presumed that this substance is one of the organic substances contained in highly concentrated desalted ocean water.
[0039]
Therefore, using this highly concentrated desalted marine water as a developing solvent, phosphate buffered saline (PBS-) is used, and the product name Sephacryl S-300 (manufactured by Pharmacia) is used as a column. The results of the analysis are shown in Table 1. The first fraction having a molecular weight of 1 million or more, the second fraction having a molecular weight of 50,000 to 1,000,000, the third fraction having a molecular weight of 50,000 to 5000, and a molecular weight of 5000 or less. When the presence or absence of a peak in each fraction was examined by dividing into the fourth fraction, the highly concentrated desalted marine water obtained as described above was at least one of the first to fourth fractions. At least one peak is observed in this fraction. The appearance of a peak in the fraction partitioned by molecular weight as described above means that this highly concentrated desalted marine water contains an organic compound having a molecular weight corresponding to the fraction. Incidentally, when Ribonuclease A having a number average molecular weight of 13700 is added as a labeling substance, the portion corresponding to Ribonuclease A appears in the third fraction, and when adding Ferritin having a number average molecular weight of 440000 as the labeling substance, The part corresponding to Ferritin appears in the second fraction.
[0040]
An example of a gel filtration chromatography chart measured for the highly concentrated desalted marine water obtained as described above is shown in FIG. In FIG. 2, the dashed lines indicate Ribonuclease A having a number average molecular weight of 13700 and Ferritin peaks having a number average molecular weight of 440000 used as the labeling substances.
In the chart shown in FIG. 2, a peak appears in the third fraction (molecular weight 5000 to 50,000), and a peak appears even in the first fraction (molecular weight 1 million or more). The details of the structures of the substances appearing as these peaks have not yet been elucidated because these peaks do not represent a single substance but are peaks caused by a plurality of compounds. However, in comparison with the peak of the labeling substance, there is a high possibility that it is a polymerized biologically relevant substance.
[0041]
Highly concentrated desalted ocean water as described above is a cell activity, more specifically, skin cell activity such as cell energy metabolism / proliferation promoting activity against fibroblasts, and immune cells such as eosinophil activity. Has activity.
Hereinafter, the skin cell activity and immune cell activity will be described by taking cell energy metabolism / proliferation promoting activity and eosinophil activity for fibroblasts as examples.
[0042]
First, the cell energy metabolism / proliferation promoting activity for fibroblasts possessed by the cell active substance contained in the highly concentrated desalted marine water at a high concentration will be described.
For example, when the energy metabolism activity of the mitochondrial cell is evaluated by the MTT method using the three-dimensional tissue model of human dermis-derived fibroblasts, the highly concentrated desalted ocean water has a solid content. When the concentration is 0.1% by weight, a clear improvement effect of metabolic activity on fibroblasts is observed.
[0043]
Furthermore, when the components were separated into fractions and the energy metabolism activity of fibroblasts was examined, the components of the third fraction tended to show the highest energy metabolism / proliferation activity, followed by the fourth fraction. Components tend to exhibit high energy metabolism / proliferation activity.
As described above, the cellular energy metabolism / proliferation active substance (fibroblast active substance) of the present invention is obtained from marine water, and particularly exhibits energy metabolism / proliferation activity against fibroblasts. The proliferative active substance (fibroblast active substance) can be used as a pharmaceutical / cosmetic, particularly as a skin external preparation. In addition, as long as the effect of the present invention can be achieved, the dosage form and administration method of pharmaceuticals / cosmetics are not limited, and in the present invention, the cell active substance (fibroblast active substance) is Oral medicine may be used and oral administration is also possible.
[0044]
The topical skin preparation of the present invention undergoes an operation of separating precipitates or inorganic substances from the concentrated marine water obtained by distilling and concentrating marine water under reduced pressure, and an operation of separating the precipitates (concentration). It contains a cell active substance, specifically, a fibroblast energy metabolism / proliferation active substance, which can be obtained by performing the operation of further concentrating and separating the salt marine water under reduced pressure.
[0045]
This substance having a cellular energy metabolism / proliferation activity (fibroblast active substance) can be used, for example, as a lotion in an aqueous medium, or used as a cream by adding it to an ointment base. You can also. Furthermore, it can be used like an emulsion by blending into an emulsion, and further by blending this cell energy metabolism / proliferation active substance in an aqueous medium and blending a thickener in this aqueous medium, Can be used.
[0046]
Ingredients other than cellular active substances that can be incorporated into the skin external preparation of the present invention include mineral oil, vegetable oil, wax, fatty acid, fatty alcohol, ester oil, surfactant, wetting agent, polymer, animal and plant extract oil, amino acid Ingredients commonly used in external preparations for skin, such as vitamins, vitamins, steroids, anti-inflammatory agents, antiseptics, UV absorbers, metal chelators, antioxidants, pH adjusters, colorants, and fragrances Can do.
[0047]
The external preparation for skin of the present invention can adjust the content of a fibroblast energy metabolism / proliferation active substance (fibroblast active substance) in accordance with its use. That is, the external preparation for skin of the present invention prevents or treats aging symptoms such as wrinkles, blemishes and sagging in human skin by improving the metabolic activity of human skin cells. The fibroblast energy metabolism / proliferation active substance (fibroblast active substance) to be blended can be adjusted in accordance with the above. This fibroblast energy metabolism / proliferation active substance (fibroblast active substance) is usually obtained in a state of being dissolved or dispersed in water as described above, but aging symptoms such as generation of wrinkles, blemishes and sagging in human skin. Since the dissolved or dispersed components in this aqueous solution or dispersion act on the prevention or treatment of the disease, in the present invention, it is preferable to specify the use amount of the fibroblast energy metabolism / proliferation active substance as the weight in terms of solid content . The amount of fibroblast energy metabolism / proliferation active substance (fibroblast active substance) in 100 parts by weight of the external preparation for skin (agent) of the present invention is usually 0.0001 to 30.0 in terms of solid content. Parts by weight, preferably 0.001 to 5.0 parts by weight, particularly preferably 0.01 to 1.0 parts by weight. The fibroblast energy metabolism / proliferation active substance (including the fibroblast active substance) of the present invention is not necessarily clear in details such as the structure of the components contained in the above-mentioned fractions by molecular weight. It is very difficult to clarify the action and effect of the contained components, and it is considered that the action and effect are improved by the interaction of the components contained in the respective fractions. For the above reasons, in the present invention, an aqueous solution or dispersion containing the fibroblast energy metabolism / proliferation active substance obtained as described above, which is a complex of components contained in each fraction, is used as it is. In this case, the amount used is expressed as a solid content dissolved or dispersed in an aqueous solution or dispersion.
[0048]
By using the external preparation for skin of the present invention containing the fibroblast energy metabolism / proliferation active substance (fibroblast active substance) in the amount as described above, this fibroblast energy metabolism / proliferation active substance (fibroblast) Cell active substance) activates human skin cells, especially fibroblasts, and promotes secretion of anti-aging components such as collagen, and effectively prevents pigment deposition and hyaluronic acid production. can do.
[0049]
Together, these can prevent aging symptoms such as wrinkles, blemishes and sagging in human skin, or treat skin that has fallen into aging symptoms.
Next, the eosinophil activity of the cell active substance (including eosinophil active substance) contained in the highly concentrated desalted ocean water at a high concentration will be described as an example.
[0050]
When the eosinophil activity is examined by the above-described method using the highly concentrated desalted marine water, the eosinophil activity is higher than that of phosphate buffered saline (PBS) used as a control.
Further, even when eosinophil activity was examined for each of the fractions divided as described above, eosinophil activity higher than that of the control was observed in any fraction.
[0051]
The relationship between allergy typified by atopy and eosinophil activity will be briefly explained.
In an allergic reaction such as atopic dermatitis, locally migrated eosinophils are Histamylase, allylsulfatase B, phospholipase D.₂Release. These released substances are histamine, which mediates inflammation, eosinophil chemotactic factor of anaphylaxis and platelet activating factor of abnormal hypersensitivity reaction to foreign substances such as foreign proteins (PAF)) is known to work to repair allergic reactions. Furthermore, recently, eosinophils have come to be considered to act on tissue damage more than the above-mentioned tissue repair action. Four types of basic proteins (major basic protein (MBP), eosinophil peroxidase (EPO), eosinophil reactive protein ()) exist in special granules of eosinophils that play a role in the involvement of eosinophils in tissue damage. ECP), eosinophil-derived neurotoxin (EDN)) and superoxide (O₂ ^-) -Derived various active enzyme molecular species. These four basic proteins are released from activated eosinophils into tissues by degranulation and are thought to be involved in tissue damage. In particular, MBP is thought to activate basophils and EPO activates mast cells to release histamine and increase allergic reactions.
[0052]
Superoxide (O₂ ^-) Is produced by activation of a cell membrane-bound enzyme system called NADPH oxidase by various stimuli such as IgE complex, PAF, opsonized zymosan (OZ), and phorbol myristate acetate. This NADPH oxidase oxidizes NADPH produced by a sudden increase in hexose monophosphate shunt activity, and thereby oxygen is reduced by one electron.₂ ^-Is generated. This O₂ ^-From H, due to enzymatic or non-enzymatic reactions₂O₂, HO^-,¹O₂Various reactive oxygen molecular species having high reactivity are generated. These active oxygen molecular species are responsible for important biological defenses such as sterilization. Therefore, eosinophils are superoxide (O₂ ^-) The ability to promote production is very effective in controlling the causative factors of allergic reactions such as atopic dermatitis.
[0053]
In the present invention, the degree of activation of eosinophils can be measured, for example, by the method described below.
First, eosinophils used for measuring the degree of activation are prepared. Specifically, for example, 15 to 20 weeks old of a transgenic mouse (C3H / HeN-TgN (IL-5) Imeg) that constantly produces IL-5 which is a growth and differentiation factor selective for eosinophils. Spleen eosinophils and spinal eosinophils are prepared from these individuals. That is, the spleen and spinal cord²⁺Eosinophils can be obtained by homogenizing in free Krebs-Ringer-phosphate buffer solution (KRP) (pH value 7.4) and separating the cell suspension by a method such as Percoll discontinuous density gradient centrifugation. it can. The spleen is usually 75% and the spinal cord is usually 80% as the eosinophil fraction. The mice used here are preferably those in which 20 μg of cadmium sulfate was intraperitoneally administered 5 days before the experiment for the purpose of increasing IL-5 production under the control of the metallothionein promoter.
[0054]
In addition to the above, for example, isolated from peripheral blood of a transgenic mouse (C3H / HeN-TgN (IL-5) Imeg) that constantly produces IL-5, which is a growth and differentiation factor selective for eosinophils. Eosinophils are also preferably used.
Eosinophil superoxide (O) by the cell active substance (eosinophil active substance) of the present invention contained in marine water.₂ ^-) Production improving ability can be calculated by measuring the amount of cytochrome c (Cyt. C) reduced by hydrogen peroxide produced by eosinophils.
[0055]
This measurement can be performed by the method described in Nakagawa. A., Shibata. K., Takeshige. K., et al: Exp. Cell. Res. 101: 224-234 (1976). Thus, for example, 20 μmol cytochrome c (Cyt. C), 10 mmol glucose, 1 mM CaCl₂And eosinophils derived from the above in KRP maintained at 37 ° C. (5 × 10 5^Fivecells / ml) is suspended, and the absorbance at 550 nm increases with the reduction of Cyt. c (A_550-540) Is measured over time. O₂ ^-The amount of produced is 21.0 mM of Cyt. C molecular absorbance.^-1·cm^-1Can be obtained from For this measurement, it is desirable to use an apparatus (for example, a dual wavelength spectrophotometer (UV-300) manufactured by Shimadzu Corporation) that can measure the absorbance while stirring the reaction solution.
[0056]
Further, the degree of activation of eosinophils can be further measured by the method described below.
That is, for example, superoxide (O₂ ^-Hydrogen peroxide (H) derived from₂O₂) To measure. This hydrogen peroxide (H₂O₂) Indicates the ability of eosinophils to produce hydrogen peroxide, and the degree of activation of eosinophils can be expressed as an activation index. This measurement can be performed by the method described in Irene, A.M.Vint, John, C. Foreman, et al: Eur. J. Immunol. 24: 1961-1965,1994.
[0057]
That is, superoxide (O) produced by eosinophils activated by an eosinophil active substance in ocean water.₂ ^-Hydrogen peroxide (H) derived from₂O₂) Can be measured by analyzing fluorescence by 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) using a flow cytometer. Specifically, 5 × 10^FiveCells / ml eosinophils were incubated in 0.5 ml of Phosphate-buffer saline glucose (5 mM glucose) (PBSg) containing 2.5 μM DCFH-DA at 37 ° C. for 15 minutes, after which stimuli were added. After incubating at 37 ° C. for 30 minutes, and finally washing the cells several times with PBSg, it can be analyzed and measured with a flow cytometer.
[0058]
In addition, said measuring method is an example of the method of measuring the activation degree of an eosinophil, and the measuring method of the activation degree of the eosinophil active substance of this invention is not limited to said method. .
Since the cell active substance (eosinophil active substance) of the present invention has excellent eosinophil activity, it can be used in pharmaceuticals and cosmetics.
[0059]
Moreover, the pharmaceutical containing the cellular active substance (eosinophil active substance) of the present invention is highly useful as a component of a pharmaceutical used for allergic diseases, particularly atopic dermatitis.
That is, the cell active substance of the present invention (here, eosinophil active substance) activates eosinophils that have migrated locally, and eosinophils that are abnormally sensitive to foreign substances such as histamine and heterologous proteins in allergic reactions. Histamylase, allylsulfatase B, phospolypase D, which metabolizes eosinophil chemotactic factor of anaphylaxis and platelet activating factor (PAF)₂Release. Furthermore, superoxide (O) by eosinophils activating the cell membrane-bound enzyme system.₂ ^-) Can improve the biological defense reaction.
[0060]
However, as described above, the cellular active substances (including eosinophil active substances) of the present invention are not necessarily clear in details such as the structure of the components contained in the fraction by molecular weight. It is very difficult to clarify the action and effect of the components contained in the fractions, and it is considered that the action and effect are improved by the interaction of the components contained in each fraction.
[0061]
Therefore, in the pharmaceutical / cosmetics of the present invention, it is preferable to directly use an aqueous solution or dispersion containing the cell-active substance obtained as described above, which is a complex of components contained in each fraction.
The eosinophil active substance of the present invention can also be used as an external medicine dissolved or dispersed in a base material. Thus, when using as an external medicine, the quantity of an eosinophil active substance in an external medicine is 0.00001-10.0 weight% normally, Preferably it is 0.001-0.1 weight%. In this case, as a base material for the external medicine, those used as a base material for ordinary external medicines such as petrolatum, ceresin, paraffin, squalane, waxes, ozokelide can be used. The dosage form can be applied to emulsion, oil, wax, lotion and the like.
[0062]
Further, the eosinophil active substance of the present invention can be used as an injection solution by making it into an aqueous solution. In this case, the concentration of the eosinophil active substance is usually set within the range of 0.000001 to 10.0% by weight, preferably 0.0001 to 0.1% by weight. When used as an injection solution, components to be added to ensure the stability of the injection solution such as a pH adjusting agent and an antioxidant can be added.
[0063]
Furthermore, the eosinophil active substance of the present invention can also be used as an internal medicine for powders, tablets, granules, capsules, syrups and the like.
When used as an internal medicine or an injection using the eosinophil active substance of the present invention, the amount used can be appropriately set in consideration of symptoms, the condition of the user, etc., but the amount used per kg body weight is: Generally, it can be set within the range of 0.0001 to 10000 mg, preferably 0.1 to 100 mg.
[0064]
In addition, although the example of the preferable aspect in the case of using the cell active substance of this invention for a pharmaceutical and cosmetics was mentioned above, as long as the effect of this invention was acquired, the dosage form of the pharmaceutical and cosmetics of this invention, administration The method, usage, etc. are not limited.
[0065]
【The invention's effect】
The cell active substance of the present invention (including skin cell active substances such as fibroblast active cell substances and immune cell active substances such as eosinophil active substances) is contained in a solution obtained by subjecting marine water to a specific treatment. It is presumed that it is a high molecular compound having a certain molecular weight obtained by separating it from water by an appropriate means such as gel filtration chromatography.
[0066]
Conventionally, it is known to use a separated product from seawater for skin treatment or allergy treatment, but these use inorganic components contained in seawater. That is, seawater contains various minerals in addition to chlorides such as sodium chloride, calcium chloride, and magnesium chloride, and these minerals are known to be used for skin treatment or allergy treatment. It was. Therefore, when seawater is used for skin treatment and allergy treatment, the precipitate (mineral content) deposited by concentrating the seawater is separated from the seawater and used. Furthermore, since it was not considered that organic components effective for skin treatment or allergy treatment were contained in seawater, attempts have been made to separate and use organic substances contained in seawater. There wasn't.
[0067]
On the other hand, the present inventor has an organic substance contained in the ocean water in addition to the inorganic salt as described above, and this organic substance has a function completely different from the mineral contained in the sea water. It has been found that by utilizing this function, the fibroblast activity and eosinophil activity that form the skin can be improved.
The cellular active substance of the present invention contains an organic substance that can be obtained by subjecting marine water to a specific treatment, and this organic substance improves the energy metabolism / proliferation activity and eosinophil activity of fibroblasts. be able to.
[0068]
Such a cell active substance is a complex of various organic substances, and it is extremely difficult to specify individual components, but it can be obtained repeatedly by subjecting marine water to the treatment specified in the present invention.
This cell-active substance was found to be a complex of organic substances having peaks in a plurality of fractions according to molecular weight using gel filtration chromatography. The components separated into these fractions alone differ in, for example, energy metabolism / proliferation activity or eosinophil activity for fibroblasts. However, by using these complexes as they are, fibroblasts are particularly useful. On the other hand, it was confirmed that it showed excellent energy metabolism activity / proliferation and activity improvement effect on eosinophils.
[0069]
Moreover, such cell active substances of the present invention (including skin cell active substances such as fibroblast active substances and immune cell active substances such as eosinophil active substances) are compared with normal cell active substances, It has extremely low side effects and is extremely safe. Especially for fibroblasts, it has a specific effect that it shows excellent cell energy metabolism / proliferation activity (cell activity) without side effects. It is highly useful as an external preparation. For the same reason, it is very useful as a therapeutic agent for allergic diseases such as atopic dermatitis.
[0070]
In addition, since the cell active substances of the present invention (including skin cell active substances such as fibroblast active substances and immune cell active substances such as eosinophil active substances) have good affinity for water, It can be used in various forms such as an injection solution.
More specifically, according to the fibroblast active substance of the present invention, as described above, fibroblasts can be remarkably activated, so that the metabolic activity of human skin cells can be improved, and human It is possible to prevent or treat aging phenomena such as skin wrinkles, spots and sagging.
[0071]
In addition, since the eosinophil active substance of the present invention can activate eosinophils as described above, it has an excellent biological defense due to the action of superoxide produced by the activation of eosinophils. It has a function. In addition, this substance metabolizes histamine that mediates inflammation and releases histamylase that works to repair allergic reactions. Furthermore, by making this eosinophil active substance act on eosinophils, superoxide (O₂ ^-) And this superoxide (O₂ ^-) Can generate various reactive oxygen species with high reactivity by enzymatic reaction or non-enzymatic reaction. These active oxygen species can express important biological defenses such as bactericidal action.
[0072]
Since the above-described functions of the eosinophil active substance of the present invention are considered to act in a complex manner, the eosinophil active substance of the present invention is used to treat allergic diseases such as asthma, hay fever and dermatitis. As a component, it is particularly useful as a therapeutic component for allergic diseases such as atopic dermatitis. In addition to the above, as long as the effects of the present invention can be achieved, the pharmaceuticals and cosmetics of the present invention can be mixed with components that are usually used as components of pharmaceuticals and cosmetics.
[0073]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example is shown about this invention and this invention is demonstrated still in detail, this invention is not limited by these.
[0074]
[Example 1]
[Preparation of active substance for cell energy metabolism / proliferation]
Ten liters of marine water (seawater that forms a warm layer, so-called surface water) was collected from a depth of 100 m at a position 10 km off Suruga Bay.
Ten liters of this ocean water was filtered using a membrane filter having an opening of 0.45 μm to remove suspended matters in this ocean water.
[0075]
The filtered ocean water is put into a vacuum distillation apparatus, the distillation temperature is set to a temperature of 40 ° C. or less under a pressure condition of 20 Torr, and the amount of the ocean water is about 1 liter (1/1 of the original ocean water). Distilled under reduced pressure until 10).
By distillation under reduced pressure in this way, inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride and magnesium chloride which had been dissolved in the ocean water were precipitated. The precipitated inorganic salt was filtered through a membrane filter having an aperture of 0.45 μm. The filtered inorganic salt was discarded because it is not used in the present invention.
[0076]
Next, the filtrate obtained in the above step is subjected to a desalting operation at a low temperature of 10 ° C. using a mosaic charged membrane (trade name: MC-55B mosaic charged membrane, manufactured by Tosoh Corporation). The liquid was put into a vacuum distillation apparatus, and the temperature was controlled so as not to exceed a temperature of 40 ° C. under a reduced pressure of 20 Torr, and water was distilled off under reduced pressure until the volume of the liquid reached 100 ml.
[0077]
The desalting and vacuum distillation using the above mosaic charged membrane was repeated to obtain 5 ml of concentrate.
The concentrate contained 1.1% by weight of an organic substance, and the content of inorganic salt in the concentrate was 100 ppm or less, and the content of inorganic chloride was 250 ppm or less.
[0078]
This concentrate was analyzed by gel filtration chromatography having a column (Sephacryl S-300) manufactured by Pharmacia, and the contained components were analyzed using phosphate buffer saline (PBS-) as a developing solvent.
The result of this analysis, according to molecular weight,
The first fraction with a molecular weight of over 1 million,
A second fraction having a molecular weight of 50,000 to 1,000,000,
A third fraction having a molecular weight of 5,000 to 50,000, and
The presence or absence of an absorption peak at a wavelength of 280 nm in each fraction was examined by dividing into fourth fractions having a molecular weight of 5000 or less.
[0079]
The results are shown in FIG.
As a result of desalting and concentrating the ocean water used in this Example as described above, the largest peak appeared in the third fraction, and further, a small peak clearly appeared in the first fraction. In the second fraction, there is a peak of the tailed portion of the components of the third and fourth fractions, and in the fourth fraction, the component having the main peak in the second fraction is tailed. There is a peak.
[0080]
In addition, in order to refer to the analysis of the peak components appearing in these fractions, a solution containing Ribonuclease A with an average molecular weight of 13700 and Ferritin with an average molecular weight of 440,000 was prepared and analyzed in the same manner as described above. The results are also shown in FIG.
[Measurement of fibroblast energy metabolism and proliferation activity]
Cellular energy metabolism / proliferation active substances (including fibroblast active substances) having the above-described configuration are phosphate buffered saline (PBS) which is a standard solution so as to be 0.1% by weight in terms of solid content. In addition to-), the sample of the present invention was prepared. The final salt content of each sample was adjusted to the salt content of PBS- which is a standard solution.
[0081]
Using the three-dimensional tissue model of human dermis-derived fibroblasts (MATREX-LDM, manufactured by Toyobo Co., Ltd.), the mitochondrial energy metabolism / proliferation activity of the cells was evaluated by the MTT method.
Here, the MTT method is a method for measuring energy metabolism / proliferation activity of cells using 3- (4,5-Dimethyl-2-thiazoly) -2,5-diphenyltertrazolium bromide. That is, MTT is reduced by NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) or NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) generated in the process of mitochondrial energy metabolism in cells to produce blue formazan.
[0082]
In this method, blue formazan is absorbed at a wavelength of 570 nm, colorimetrically measured, and colorimetrically quantified to evaluate cell metabolic activity and cell growth activity. In this case, the darker the blue, the higher the activity.
Further, in the present invention, as a control, only the standard solution (PBS-) was used without using the cell energy metabolism / proliferation active substance, and the energy metabolism activity of mitochondrial cells was examined by the MTT method in the same manner.
[0083]
Further, as a negative control, 0.1% by weight of typical cytotoxic sodium dodecyl sulfate (SDS = Sodium dodecyl sulfate) was mixed and the energy metabolism activity was examined by the MTT method. This negative control shows the minimum standard of the MTT method when no energy metabolic activity is shown.
When the value of the MTT method obtained by the above control is 100, the value of the negative control is 27.7.
[0084]
And the value in the MTT method of the sample containing 0.1 parts by weight of the cellular active substance of the present invention measured in the same test is 190.6. This cellular energy metabolism / proliferation active substance is It is clear that it exhibits proliferative activity.
In this test, the MTT reagent may not be reduced to blue by NADH or NADPH generated during the mitochondrial metabolic process of the cell, but may be reduced to blue by being reduced to the cell energy metabolism / proliferation active substance of the present invention itself. Therefore, sodium dodecyl sulfate (SDS = Sodium dodecyl sulfate) was added to 0.1% by weight and 0.1% by weight of the cell energy metabolism / proliferation active substance of the present invention in terms of solid content. Examined. As a result, the value in the same test is 29.7, which is almost the same as the value 27.7 when sodium dodecyl sulfate is used alone, so that the cell energy metabolism / proliferation active substance of the present invention itself reduces the MTT reagent. However, the mitochondria of the cells become active by adding the cell energy metabolism / proliferation active substance of the present invention, and the generated NADH or NADPH reduces the MTT reagent to blue. I found it to change color. That is, it is clear that metabolic activity and proliferation activity were improved by the cell energy metabolism / proliferation active substance of the present invention. Further, the above conclusion was further clarified because the MTT reagent was not discolored at all even when the above-mentioned deep water cell active substance was added to the MTT reagent.
[0085]
For reference, the final salt content is adjusted by adjusting the sample added to the phosphate buffered saline (PBS-), which is the standard solution, so that the components of each fraction are 0.1% by weight in terms of solid content. The cell energy metabolism / proliferation activity in the MTT method was examined according to the salt content of PBS- as a solution.
as a result,
The activity of the component of the first fraction having a molecular weight of 1 million or more is 103.2,
The activity of the component of the second fraction having a molecular weight of 50,000 to 1,000,000 is 105.1,
The activity of the component of the third fraction having a molecular weight of 50,000 to 5000 is 165.2,
The activity of the component of the fourth fraction having a molecular weight of 5000 or less was 118.6.
[0086]
Note that the activity evaluation values using the components of each of the above-mentioned fractions are reference values. By repeating experiments in more detail and increasing the accuracy of the experiments, the above values are more clearly defined. There is plenty of potential for activity.
[0087]
[Example 2]
The eosinophil active substance was prepared by the same method as the preparation of the cell active substance of Example 1, and the degree of activation of the obtained eosinophil active substance was measured by the following method.
[Measurement of activation degree of eosinophil active substance]
The ability (activation degree) of activating eosinophils of the cell active substances (including eosinophil active substances) of the present invention is the superoxide (O₂ ^-Hydrogen peroxide (H) derived from₂O₂) Was used as an index. Superoxide (O) produced by activation of eosinophils by the eosinophil active substance₂ ^-Hydrogen peroxide (H) derived from₂O₂Specifically, the amount of) was measured by analyzing fluorescence by 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) using a flow cytometer.
[0088]
5 × 10^FiveCells / ml eosinophils were incubated for 15 minutes at 37 ° C. in 0.5 ml of Phosphate-buffer saline glucose (5 mM glucose) (PBSg) containing 2.5 μM DCFH-DA, after which stimuli ( PMA (50 ng / ml) was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The cells were washed twice with PBSg, and then analyzed and measured with a flow cytometer.
[0089]
The eosinophils used in this experiment were peripheral blood of transgenic mice (C3H / HeN-TgN (IL-5) Imeg) that constantly produce IL-5, which is a growth and differentiation factor selective for eosinophils. The eosinophils separated from were used. Peripheral blood is Ca containing 0.22% final concentration of citric acid⁺⁺Free Krebs Ringer phosphate buffer (KRP) (0.9% NaCl, 6 mmol KCl, 1 mmol MgCl₂Percoll discontinuous density gradient centrifugation was performed for the purpose of removing erythrocytes and monocytes after collection in 10 mM Na-phosphate buffer (pH 7.4)). 60%, 70, 80% Percoll overlaid with 100% Percoll-defined cell turbidity with 10% concentrated KRP added to Percoll stock solution, centrifuged at 350 g, room temperature, 20 minutes, 70 and 80% layers were collected. The collected cell population was further suspended in a separation buffer (5 mmol EDTA, 0.5% BSA, 10 mmol Na-K-phosphate buffer (pH 7.2)) (1 × 10⁷cells / 50 μl) and anti-Thy1.2 antibody-bound magnetic beads (1 × 10⁷beads / 25 μl) and anti-B220 antibody-coupled magnetic beads (1 × 10⁷bead / 25 μl) and allowed to react at 4 ° C. for 20 minutes, and a cell population collected by negative selection using a permanent magnet was subjected to an experiment as an eosinophil population. The purity of the cell population after separation was analyzed with a flow cytometer (FACScan manufactured by BECTON DICKINSON).
[0090]
The substance to be measured was adjusted with sample / 1.8% NaCl and purified water and adjusted to be isotonic at a final concentration of 100 μg / ml.
A similar experiment was performed using phosphate buffered saline (PBS) as a control.
The value of the degree of eosinophil activation of each test substance measured as described above (equivalent to production of hydrogen peroxide) was 3.35 while the degree of eosinophil activation of the control (PBS) was 3.35. The eosinophil activity excess of the eosinophil active substance was 4.25.
[0091]
The eosinophil active substance obtained as described above showed higher eosinophil activity than the control (PBS).
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a process diagram showing an example of a process for obtaining a cell active substance of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing an example of peaks appearing in each fraction by dividing the cell-active substance of the present invention into each fraction using gel filtration chromatography.

Claims

High concentration in the high concentration desalting ocean water is obtained found by going through the through the operation of separating (concentration) desalting ocean water, operating two or more times to further concentrate at least part of the inorganic salts dissolved in the ocean water Is a cellular active substance contained in
The content of inorganic chloride in the highly concentrated desalted marine water is 10 ppm or less,
The cell-active substance is a first fraction having a molecular weight of 1 million or more by UV detection at a wavelength of 280 nm by gel filtration chromatography analysis using phosphate buffered saline (PBS-) as a developing solvent, and a molecular weight of 50,000 to 1,000,000. A cellular active substance characterized by having a peak in at least one fraction of the second fraction, the third fraction having a molecular weight of 5000 to 50,000, and the fourth fraction having a molecular weight of 5000 or less .

2. The cell active substance according to claim 1, wherein the cell active substance is a skin cell active substance and / or an immune cell active substance.

The above (concentration) operation for further concentrating the desalted marine water is a separation operation using a semi-permeable membrane, an operation for electrically separating residual ionic substances, a centrifuge operation, a gel filtration operation, and a charged mosaic membrane. The cell active substance according to any one of claims 1 to 2 , wherein the cell active substance is an operation for removing at least one kind of dissolved salt selected from the group consisting of a separation operation and an ultrafiltration operation.

After the above (concentrated) desalted marine water purifies the marine water, the filtered and purified marine water is within the range of 1 to 30 parts by volume with respect to 100 parts by volume of the marine water used first. The cell active substance according to any one of claims 1 to 3 , wherein the cell active substance is obtained by separating the inorganic salt by concentration.

The (concentrated) desalinated ocean water is first of claim paragraphs 1 through 4, wherein, characterized in that the marine water is obtained by filtering off the 70% or more by weight of the inorganic salt are dissolved using The cell active substance according to any one of the items.

The above-mentioned cellular active substance is contained in highly concentrated desalted marine water concentrated in the range of 0.0001 to 30.0 parts by volume when the volume of the first used ocean water is 100 parts by volume. The cell active substance according to any one of claims 1 to 5 , wherein the cell active substance is any one of the following.

Separating at least a part of the dissolved inorganic salt from the marine water to obtain (concentrated) demineralized marine water, and further concentrating the (concentrated) demineralized marine water to separate precipitates or inorganic salts the a highly concentrated production method of desalting to obtain Ru fine胞活material ocean water containing a higher concentration of cellular active substance through a step of repeated two or more times,
The inorganic chloride content in the highly concentrated desalted ocean water is 10 ppm or less,
A first fraction with a molecular weight of 1 million or more by a UV detection at a wavelength of 280 nm by gel filtration chromatography analysis using phosphate buffered saline (PBS-) as a developing solvent, a second fraction with a molecular weight of 50,000 to 1,000,000, Production of a cellular active substance having a peak in at least one fraction of a third fraction having a molecular weight of 5,000 to 50,000 and a fourth fraction having a molecular weight of 5,000 or less Method.

The cell active substance, a manufacturing method of the cell active material of claim 7 wherein wherein the a skin cell active substance and / or immune cell activity agent.

The operation of further concentrating the above (concentrated) desalted marine water is a separation step using a semi-permeable membrane, a step of electrically separating dissolved inorganic salts, a centrifuge step, a gel filtration step, a separation using a charged mosaic membrane The method for producing a cell active substance according to any one of claims 7 to 8, which is a step of removing at least one kind of dissolved salt selected from the group consisting of a step and a ultrafiltration step. .

Highly concentrated demineralized ocean water obtained by subjecting (concentrated) demineralized marine water that has undergone an operation of separating at least a part of the inorganic salt dissolved in the marine water to a further concentration operation twice or more. A cosmetic containing a cellular active substance,
The content of inorganic chloride in the highly concentrated desalted marine water is 10 ppm or less,
The cell-active substance is a first fraction having a molecular weight of 1 million or more by UV detection at a wavelength of 280 nm by gel filtration chromatography analysis using phosphate buffered saline (PBS-) as a developing solvent, and a molecular weight of 50,000 to 1,000,000. A cellular active substance having a peak in at least one fraction of the second fraction, the third fraction having a molecular weight of 5000 to 50,000, and the fourth fraction having a molecular weight of 5000 or less. And cosmetics.

11. The cosmetic according to claim 10 , wherein the cell active substance is a skin cell active substance and / or an immune cell active substance.