JP4927825B2

JP4927825B2 - 初期段階の心機能異常を診断または予測するための装置および方法

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Publication number: JP4927825B2
Application number: JP2008510547A
Authority: JP
Inventors: トロイト，ベルンハルト; アマン−ザラン，イルディコ; オテロ，ホセミゲルリヴェラ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2006-05-03
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2026-05-03
Also published as: DE602006017058D1; EP1880221B1; CN101171517B; ES2352351T3; CA2605247A1; ATE482398T1; EP1722232A1; JP2008541078A; US20110104813A1; WO2006120152A1; EP1880221A1; CN101171517A; CN103091497A; HK1119771A1

Description

本発明は、尿サンプル中の脳性ナトリウム利尿ペプチド (BNP)の量に基づいて被験体の軽度または中程度の心不全を診断するための方法および装置に関する。さらに、本発明は、被験体が心不全を伴う心血管系疾患発症の危険にあるか否かを、尿サンプル中のBNP量に基づいて予測するための方法および装置を包含する。

現代医療における目標の１つは、個人または個別対応の治療法を提供することである。これらは、患者の個々の必要性またはリスクを考慮する治療法である。特に重要なのは、心血管合併症、とりわけ認識されない心血管合併症の存在である。心血管合併症、特に心疾患は、西半球における罹患および死亡の主因である。心血管合併症は、長期間、無症状を維持することがある。したがって、心血管合併症に関しては、信頼性のある診断が一般に考えられているより困難でありかつ誤りやすいものである(非特許文献１)。

ナトリウム利尿ペプチドは、心疾患の進行に関する分子マーカーとして知られている。血中の脳性ナトリウム利尿ペプチド (BNP)およびその変異体が、既に心不全に罹患している患者の差し迫る死および病的状態を予測するために使用できることが、特許文献１に開示されている。心疾患、特に心筋虚血を診断するために、特許文献２はまた、一旦診断された疾患および障害の予後指標として使用することができる、様々な血液生体マーカーを開示している。とりわけ、好適な生体マーカーとして、BNPが言及されている。さらに、Hutflessらは、心臓手術後の患者の血中のBNP濃度に基づいて、術後３０日以内の病的状態または死を予測することが可能であることを示した (非特許文献２)。しかし、上記著者らによるこの研究結果は、あまり重要視されなかった。しかし、診断マーカーとしてのナトリウム利尿ペプチドの使用については、これまで危ういものであった。それは、これらペプチドのレベルが様々な体液（適切な腎機能に由来する尿を含む）中のものに依存するものであったことによる(非特許文献３)。

先行技術の方法の欠点は、たいていは心臓専門医による検査結果の診断を要すること、または外科手術などの心イベントが生じた後になって初めて適用することが可能になることである。さらに、診断、特に重症度の低い心不全を診断するための開示されている手段および方法は、前述の不確実性のために信頼性に問題があった。
WO 02/083913 WO 02/089657 Svendstrup Nielsen, L.ら、(2003). N-terminal pro- brain natriuretic peptide for discriminating between cardiac and non-cardiac dyspnoea. The European Jounal of Heart Failure. Hutfless 2004, Utility of B-type natriuretic peptide in predicting postoperative complications and outcomes in patients undergoing heart surgery. J Am Coll Cardiol 43: 1873-9. McCullough 2003. B-Type Nariuretic Peptides: A Diagnostic Breakthrough for Clinicians. Reviews in Cardiovascular Medicine 4: 72-80.

従って、心疾患の罹患がまだ同定されていない患者または心臓手術を受けていない患者の心不全を診断するための手段および方法が長らく望まれている。さらに、それらの手段および方法は、信頼できかつ迅速な診断を可能とするものでなければならない。特に、それらの手段および方法は、専門の臨床医または心臓専門医だけではなく、一般開業医も心不全を診断することができるものでなければならない。

従って、本発明の根底にある技術的課題は、前述の要求を満たす手段および方法を提供することである。これらの手段および方法は、同時に、上記先行技術の欠点を回避するものでなければならない。上記の技術的課題は、特許請求の範囲および本明細書中にて特徴付けられた実施形態によって解決される。

従って、本発明は、被験体の心不全を診断するための方法であって、
ａ）被験体の尿サンプル中の脳性ナトリウム利尿ペプチド (BNP)の量を測定すること;および
ｂ）ステップa)にて測定されたBNP量に基づいて、被験体が心不全に罹患しているか否か診断すること
を含む、上記方法に関する。

本発明の診断方法は、in vitroにおける方法が好ましい。上記ステップb)は、ステップa)にて測定された量と、以下に詳細に記載されるような１つの標準的基準または複数の標準的基準とを相関させることを含む。さらに、相関関係の診断生データを、臨床医によるさらなる判断を必要としない診断結果へと処理することを含んでも良い。ステップa)および／またはb)は全てまたは一部を、オートメーションによって、例えば、データを相関させる、および／もしくは処理するのに好適なコンピュータープログラム、またはステップa)において量を測定するためのロボットおよび感知装置によって補助されることが好ましい。

本明細書中で用いられる場合、「診断する」という用語は、被験体が心不全に罹患しているか、罹患する可能性を評価することをいう。当業者には理解されるように、このような評価は大抵、診断される100%の被験体で正確であることを意図していない。しかし、この用語は統計学的に有意な一部の被験体が、心不全に罹患していることまたは、将来的に心不全に罹患するリスクを有することを診断し得えることを要する。一部が統計学的に有意であるか否かは、当業者によるさらなる作業を必要とすることなく、様々な周知の統計学的評価ツール（例えば、信頼区間の測定、p-値測定、スチューデント t-検定、Mann-Whitney検定など）を使用して測定することができる。Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に詳細が記載されている。信頼区間は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99 %が好ましい。p-値は、0.1、0.05、0.01、0.005または0.0001が好ましい。

本発明において診断とは、関連する疾患、症状またはリスクの、監視、確認、細分類、および予測が含まれる。監視は、例えば、疾患の進行または疾患もしくは合併症の進行に対する特定の治療の効果を分析するために、既に診断された疾患または合併症の動向を把握することに関する。確認は、既に行われた診断を、他の指標またはマーカーを用いて強化または実証することに関する。細分類は、診断された疾患の種々のサブクラスに従って、診断をさらに詳しく特定すること、例えば軽度のおよび重篤な疾患を以下に詳細に議論するように特定することに関する。予測は、他の症状もしくはマーカーが自明になるか、または有意に変化する前に、疾患または合併症を予測することに関する。本明細書中で用いられる場合、予測とはまた、心不全の罹患率を診断することを含むのが好ましい。

本発明において「尿」という用語は、全尿またはその画分を含む。この画分は、尿のペプチド-またはポリペプチド含有画分である。尿サンプルは、当該分野にて既知であるいずれかの方法によって採取することができる。サンプルは、本発明方法に用いられる前に、既知の様々な前処理に付しても良い(すなわち、処理済尿サンプル)。

本明細書中で用いられる場合「心不全」という用語は、心臓の機能障害を指す。心不全は、ニューヨーク心臓協会（New York Heart Association：NYHA）による機能的分類システムで分類されている。クラスＩの患者は、心血管疾患のいかなる明白な症状も示さない。身体的活動が制限されず、通常の身体的活動によって過度の疲労、動悸、または呼吸困難（呼吸の短縮）が生じない。しかし、心エコー検査によって、活動時の患者において異常が検出されるかもしれない。クラスＩＩの患者は、身体的活動にわずかな制限を受ける。患者は安静時には快適であるが、通常の身体的活動によって疲労、動悸、または呼吸困難がある。クラスＩＩＩの患者は、身体的活動に著しい制限を受ける。患者は安静時には快適であるが、通常の活動より軽い身体的活動によって疲労、動悸、または呼吸困難が起こる。クラスＩＶの患者は、不快感なしにはいかなる身体的活動も実行できない。患者は安静時にも心不全の症状を示し、いかなる身体的活動が実行された場合にも、不快感が増強する。従って、患者は、何ら臨床症状を示さない個体と症状(例えば、呼吸困難)を示す個体に分けることができる。心不全が慢性心不全であることが好ましい。さらに、本明細書中に記載されるように心不全は、軽度または中程度の心不全に関するのが好ましい。本明細書中に示されるような軽度または中程度の心不全を伴う症状は、あまり重篤ではない。すなわち、患者らは、明白な症状を示さない(例えば、クラスI)か、またはNYHAクラスIIまたはIIIに示される症状を示す。この用語は、様々な基礎疾患または障害によって生じ得るうっ血性心不全に関するのが好ましい。前述のように、軽度または中程度の心不全は、NYHAクラスI, IIまたはIIIに示される心不全に関する。

症状の検査および監視によって、心不全を罹患している患者、特に軽度または中程度の心不全を罹患している患者を、弱いまたは不明瞭な症状に照らして分類することは困難である。BNPの尿中の濃度が少なくとも0.8 pg/mlであることは、心不全の指標となることが、本発明によって見出された。NYHAクラスIに属する被験体は、Advia Carteenerアッセイ (Bayer) においてBNP量が0.8 pg/ml〜2.4 pg/ml相当であることが好ましく、1.7 pg/mlであることが最も好ましい。また、NYHAクラスIIに属する被験体は、Advia CarteenerアッセイにおいてBNP量が2.5 pg/ml〜3.9 pg/ml相当であることが好ましく、2.8 pg/mlであることが最も好ましい。NYHAクラスIIIに属する被験体は、Advia CarteenerアッセイにおいてBNP量が4.0〜12.0 pg/ml相当であることが好ましく、5.4 pg/mlであることが最も好ましい。それよりも高い量(すなわち、12.0 pg/ml以上)は、NYHAクラスIVの指標となる。本明細書中で用いられる場合「ml」という略語は、ミリリットル量の尿サンプルを指す。前述の範囲および量の限界は、統計学的に変化し得る (以下の実施例および図面を参照)。さらに、範囲は、検出に用いられる特定のアッセイによってさらに変化し得る。しかし、本発明の方法または装置は、以下の実施例に記載されるアッセイ(Advia Carteneenrアッセイ)と本質的に同程度の感度および／または特異性をもって、尿中のBNP量を測定できるものでなければならない。

BNP量の測定は、試料中のポリペプチドまたはペプチド量を測定するための既知の全ての手段によって達成し得る。この手段は、様々なサンドイッチアッセイ、競合アッセイまたはその他のアッセイ形式にて標識化分子を利用し得る免疫アッセイ装置および方法を含む。これらのアッセイは、BNPの有無を示すシグナルを生じる。さらに、このシグナル強度は、試料中に存在するポリペプチドの量に直接的にまたは間接的に相関（例えば、逆比例）することが好ましい。さらに、装置および方法は、バイオセンサー、免疫アッセイに連結した光学装置、バイオチップ、分析装置（例えば、質量分光計、NMR分析器、またはクロマトグラフィー装置など）を含む。さらに、方法は、マイクロプレートELISAベースの方法、完全自動化またはロボット免疫アッセイ(例えば、Elecsys^TM分析器にて利用可能)、CBA (例えば、Roche-Hitachi^TM分析器にて利用可能な酵素によるコバルト結合アッセイ：Cobalt Binding Assay)およびラテックス凝集反応アッセイ(例えば、Roche-Hitachi^TM分析器にて利用可能)を含む。本発明において量の測定は、量または濃度を、好ましくは半定量的または定量的に測定することに関する。測定は、直接的または間接的に行うことができる。間接的な測定には、細胞応答、結合リガンド、標識、または酵素による反応産物を測定することを含む。本発明との関連において、量とはまた濃度に関する。既知容量の試料中にある目的物質の総量から、その物質の濃度を算出できることは明らかであり、その逆もまた可能である。試料中のBNPの量または濃度の測定は、様々な技術によって達成することができる。

好ましい実施形態において、BNP量を測定するための方法は、(a)ポリペプチドに対して細胞応答可能な細胞と当該ポリペプチドを適当な期間接触させるステップ、(b)その細胞応答を測定するステップを含む。細胞応答を測定するために、尿サンプルまたは処理済尿サンプルを、培養細胞に添加し、そして細胞内または細胞外の細胞応答を測定する。細胞応答としては、レポーター遺伝子の発現、物質（例えば、ペプチド、ポリペプチドもしくは小分子）の分泌を含み得る。

別の好ましい実施形態において、BNP量を測定するための方法は、(a)ポリペプチドと好適な基質を適当な期間接触させるステップ、(b) 生成物の量を測定するステップ、を含む。

別の好ましい実施形態において、BNP量を測定するための方法は、 (a)ポリペプチドと特異的に結合するリガンドとを接触させるステップ、(b) (必要に応じて)未結合のリガンドを除去するステップ、(c)結合リガンドの量を測定するステップ、を含む。

他の好ましい測定方法は、目的のペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合するリガンドまたは薬剤の量を測定することを含み得る。本発明において結合とは、共有結合および非共有結合を含む。本発明においてリガンドとは、本明細書中に記載されるBNPに結合するペプチド、ポリペプチド、核酸、または小分子のいずれかであり得る。リガンドまたは薬剤は、BNPに特異的に結合することが好ましい。本発明において「特異的に結合する」とは、リガンドまたは薬剤が、分析される試料中に存在する別のペプチド、ポリペプチドまたは物質に実質的に結合（「交差反応」）しないことを意味する。特異的に結合したタンパク質は、他の関連ペプチドまたはポリペプチドよりも、少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも10倍、さらにより好ましくは少なくとも50倍高い親和性によって結合することが好ましい。試験対象のペプチドまたはポリペプチドが、例えばウェスタンブロット上の大きさによって、またはそれが試料中で比較的豊富にあることによって、識別可能であり、かつ明確に測定できる場合、非特異的結合も許容されることがある。リガンドの結合は、当技術分野で公知のいかなる方法でも測定することができる。この方法は、半定量的であるか、または定量的であることが好ましい。適切な方法を以下に記載する。第１に、リガンドの結合は、例えば、ＮＭＲまたは表面プラズモン共鳴法で直接測定することができる。第２に、リガンドが目的のペプチドまたはポリペプチドのもつ酵素活性の基質として機能する場合には、酵素反応産物を測定することができる（例えば、プロテアーゼの量は、切断された基質の量を、例えば、ウェスタンブロットで測定することによって、測定することができる）。酵素反応産物を測定するためには、基質の量が飽和状態に近いことが好ましい。基質は、反応前に検出可能な標識で標識されてもよい。試料は適当な時間、基質に接触させることが好ましい。適当な時間とは、検出可能であり、かつ好ましくは測定可能な量の産物が生成されるのに必要な時間を指す。産物の量を測定する代わりに、所定（例えば、検出可能な）量の産物が生じるのに必要な時間を測定することもできる。第３に、リガンドは、リガンドの検出および測定を可能にする標識と、共有結合または非共有結合によって結合させることができる。標識は、直接的方法で行っても、間接的方法で行ってもよい。直接標識は、標識をリガンドに直接（共有結合または非共有結合によって）結合させるものである。間接標識は、二次リガンドを一次リガンドに結合させる（共有結合または非共有結合によって）ものである。二次リガンドは、一次リガンドに特異的に結合すべきものである。上記二次リガンドは、適当な標識と結合してもよく、および／または二次リガンドに結合する三次リガンドの標的（受容体）であってもよい。シグナルを増強するために、二次、三次、またはさらに高次のリガンドがしばしば用いられる。適当な二次リガンド、およびより高次のリガンドには、抗体、二次抗体、および周知のストレプトアビジンビオチン系（Vector Laboratories社）を含むことができる。リガンドまたは基質は、当技術分野で公知の、１つまたは複数のタグで「タグ標識」してもよい。そのようなタグは、その後、より高次のリガンドの標的となりうる。適当なタグには、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｈｉｓタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ｍｙｃタグ、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、マルトース結合タンパク質などが含まれる。ペプチドまたはポリペプチドの場合、タグは、Ｎ末端および／またはＣ末端にあることが好ましい。適切な検出方法で検出可能ないかなる標識も、適当な標識である。典型的な標識には、金粒子、ラテックスビーズ、アクリダンエステル、ルミノール、ルテニウム、酵素的に活性な標識、放射性標識、磁性標識（例えば、常磁性および超常磁性標識を含めた「磁性ビーズ」）、および蛍光標識が含まれる。酵素的に活性な標識には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびこれらの誘導体が含まれる。検出用に適当な基質には、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ（４−ニトロブルーテトラゾリウム塩化物および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸、Roche Diagnostics社から既成の原液として購入可能）、CDP-Star^TM(Amersham Biosciences社)、およびECF^TM（Amersham Biosciences社）が含まれる。適当な酵素と基質との組合せは、有色の反応生成物、蛍光、または化学発光をもたらすことがあり、それらは、当技術分野で公知の方法で測定することができる（例えば、感光性フィルムまたは適当なカメラシステムを用いて）。酵素反応を測定することに関しては、上記の規準が同様に適用される。典型的な蛍光標識には、蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびその誘導体など）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、フルオレセイン、およびアレクシア色素（例えばアレクシア５６８）が含まれる。この他の蛍光標識は、例えば、Molcular Probes社（Oregon）から購入可能である。また、蛍光標識としての量子ドットの使用も考慮される。典型的な放射性標識には、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、および同様のものが含まれる。放射性標識は、例えば感光性フィルムまたは蛍光造影装置（phosphor imager）など、公知であり、かつ適切ないかなる方法でも検出できる。本発明において適切な測定方法には、沈殿（特に免疫沈降反応）、電気化学発光法（電気的に発生する化学発光）、ＲＩＡ（ラジオ免疫アッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、サンドイッチ酵素免疫試験、電気化学発光サンドイッチ免疫アッセイ（ＥＣＬＩＡ）、解離増強ランタニド蛍光免疫アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）、比濁分析、比ろう分析、ラテックス強化比濁分析もしくは比ろう分析、または固相免疫試験も含まれる。当技術分野で公知の他の方法（ゲル電気泳動、２次元ゲル電気泳動、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウエスタンブロッティング、質量分析など）は、単独で使用することも、上述の標識化法または他の検出方法と組み合わせて使用することもできる。好ましいリガンドには、抗体、核酸、ペプチドまたはポリペプチド、およびアプタマー、例えば核酸アプタマーもしくはペプチドアプタマーが含まれる。そのようなリガンドに関する方法は、当技術分野で周知である。例えば、適当な抗体またはアプタマーの同定および製造は、供給業者によって提供される。当業者は、そのようなリガンドの、より高い親和性および特異性を有する誘導体を開発する方法に精通している。例えば、核酸、ペプチド、またはポリペプチドにランダム変異を導入することができる。これらの誘導体は、その後、当技術分野で公知のスクリーニング方法、例えばファージディスプレイによって、結合について試験することができる。本明細書において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方と、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ）_２フラグメントなど、抗原またはハプテンに結合可能なそれらのフラグメントとが含まれる。本発明には、「ヒト化された」ハイブリッド抗体も含まれるが、そのような抗体では、所望の抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列がヒトアクセプター抗体の配列に結合される。ドナー配列は、通常、少なくともドナーの抗原結合性アミノ酸残基を含むが、さらに、構造上および／または機能上適切な、ドナー抗体の他のアミノ酸残基も含むことができる。そのようなハイブリッドは、当技術分野で周知のいくつかの方法で調製することができる。

別の好ましい実施形態では、リガンドが、好ましくは、核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、およびアプタマーからなる群から選択され、固相支持体、好ましくはアレイ上に存在する。BNPに対するリガンドまたは結合薬剤を含む上記固相支持体またはアレイは、当該分野において周知であり、とりわけ、市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンチップ、ならびに表面、ニトロセルロースストリップ、膜、シート、硬膜細胞（duracyte）、ウェル、反応トレイの壁、プラスチックチューブなどを含む。リガンドまたは薬剤は、多くの様々な担体に結合しても良い。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾したセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、発明に合わせて可溶性または非可溶性のいずれかであり得る。好適なリガンドまたは薬剤の固着/固定方法は周知であり、これらに限定されないが、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用などを含む。本発明において、アレイとして、「懸濁液アレイ」を用いることも意図される（Nolan JP, Sklar LA、 (2002)、Suspension array technology:evolution of the flat-array paradigm、Trends Biotechnol、20(1):9〜12）。そのような懸濁液アレイでは、担体（例えば、ミクロビーズまたはミクロスフェア）が懸濁液中に存在する。このアレイは、様々なリガンドを保持し、場合によっては標識された様々なミクロビーズまたはミクロスフェアからなる。上記に定義したようなアレイを生成する方法、例えば固相化学および感光性保護基に基づく方法は一般に公知である（米国特許第５，７４４，３０５号）。そのようなアレイは、物質または物質ライブラリーと接触させて、相互作用、例えば、結合またはコンフォメーション変化の有無を試験することができる。したがって、上記に定義したようなペプチドまたはポリペプチドを含むアレイは、上記のペプチドまたはポリペプチドに特異的に結合するリガンドを特定するために使用してもよい。

「BNP」という用語は、成熟BNPおよびその変異体を含み、これらは同一の診断および予測値を有する。これらの変異体は、前駆体ポリペプチド、当該ポリペプチドの断片または分解産物が好ましい。さらに、「変異体」という用語はまた、ヒトまたは他の動物種のいずれかにおける相同遺伝子によってコードされる対立遺伝子変異体も含む。このような相同遺伝子は、前述のポリペプチドをコードするパラロガス遺伝子またはオーソロガス遺伝子が好ましい。本発明において用いられる好ましいBNPおよびその変異体は、以下に詳細に記載される。「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書中において互換的に用いることができる。

被験体が軽度または中程度の心不全を罹患しているか否かをBNP量に基づいて診断する方法は、測定したBNP量と基準量とを相関することを含む。基準量は、同時に測定しても、別々に測定しても良い。後者の場合には、基準量を適当な方法で保存または記録し、相関用に提供される。基準量は、心不全の指標となる。一実施形態において、基準量は、心不全に罹患していないことがわかっている（すなわち、健全な)被験体または被験体群より測定した量 (すなわち、当該群の平均値)である。健全な被験体は、エコー・ドップラー研究において正常に見え、正常な心電図 (ECG)を示し、ならびに標準的な生化学および血液パラメーターについて正常な値を示すことを特徴とする。さらに、健全な被験体はNYHA分類によるところの症状を示さない。診断は、測定された量と基準量とを相関し、そして基準量と比較して増大している量が心不全を示す。

別の実施形態において、測定した量を、心不全への罹患が知られている基準となる被験体または被験体群に由来する基準量と比較する。診断は、測定された量と基準量とを相関し、そして心不全を示す基準量と比較して同程度であるか、または増大している量に基づいて行われる。

さらなる実施形態において、基準値のパネルを提供する。これらはそれぞれ、心不全と関連する様々な強度の症状と相関し、すなわち、NYHAクラスI, II, III およびIVによるところのそれぞれの心不全について、個々の基準値が規定される。基準値は、上記のものが好ましい。NYHA基準による症状については、本明細書中どこかに詳細に記載されている。本実施形態においては、被験体が心不全に罹患しているか否かを診断するだけではなく、所定の被験体が発症する症状の強度を診断することも可能である。したがって、心不全に罹患している被験体を、確実に同定し、それぞれのNYHAクラスに分類することもできる。

本発明により、操作が容易であり、かつ非常に専門的な臨床医による診断に依存することのない試験装置を使用して、心不全、特に軽度もしくは中程度の心不全を、またはそれらによるリスクを確実に診断することが可能である。したがって、本方法により、臨床医はもはや診断を行うのに必要ではなくなるかもしれない。一般開業医は、心臓の診察を行うために、高価な診断用器具を必要としない。試料として尿を用いることによって、被験体におけるいずれの侵襲的ステップを行うことも回避できるために都合が良い。驚くべくことに、本発明の基礎をなす研究において、尿中のBNP量が血中のBNP量と少なくとも同じくらい、診断について有益でありかつ確実であることが見出された。大抵は、単にマイナーなレベルのBNPが尿中に存在すると期待するであろうが、それはBNPポリペプチドの大部分のクリアランスが腎臓における糸球体ろ過が行われることによる。従って、(i) 十分量のBNPが常に、尿中に存在するということ、および(ii)信頼できる診断または予測はそれらの量に基づくものであり得るとは期待しないであろう。それは尿中のBNP量も、適切な糸球体ろ過に依存しているためである。さらに、本発明の基礎をなす研究において、尿サンプル中に存在するBNP量が、心不全発症の指標となるだけではなく、心不全のNYHA分類システムに従った信頼できる分類をも可能とすることが見出された。さらに、これよって、疾患の進行を効率的に監視することを可能とする。本明細書中に記載される方法は、薬理効果に関する研究に用いることができる。特に、ある薬物または薬物候補が、心不全、それに伴う疾患または本明細書中に記載された症状を改善するか否かを、確実に判断することができる。したがって、本発明の方法はまた、臨床試験または研究を容易にする。

上になされた用語の定義および説明は、必要な変更を加えて、以下に記載される実施形態にも適用される。下記の全ての定義および説明も同様である。

さらに、本発明は、
a)被験体の尿サンプル中のBNP量を測定するための手段;および
b)BNP量に基づいて被験体が心不全に罹患しているか否か診断するための手段、
を備える、被験体の心不全を診断するための装置を含む。

本明細書中にて用いられる場合「装置」という用語は、心不全の診断が可能となるように互いに作用可能に連結された少なくとも前述の手段を含む手段の系に関する。BNP量を測定するための手段および心不全を診断するための手段は、本発明方法との関連において、上に開示されたものが好ましい。どのようにそれらの手段を操作手段に連結するかは、装置に含められる手段の型による。例えば、BNP量を自動的に測定するための手段が用いられる場合、その自動操作手段によって得られたデータは、心不全を診断するために、例えば、コンピュータープログラムによって処理することができる。このような場合には、当該手段は単一の装置に含められることが好ましい。したがって、当該装置は、用いられた試料中のBNP量を測定するための分析ユニットおよび診断用に得られたデータを処理するためのコンピューターユニットを含んでも良い。あるいは、BNP量を測定するために試験紙法などの手段を用いる場合、診断手段は、対照試験紙または、測定された量を上記のような心不全を伴うことが知られている量または健全な被験体の指標となることが知られている量に分類する表を含む。試験紙は、BNPに特異的に結合するリガンドまたは薬剤と結合していることが好ましい。そのリガンドまたは薬剤に結合するプレプロBNP由来のペプチドを検出するための手段を、ストリップまたは装置は含むのが好ましい。検出手段としては、上記発明方法に関連する実施形態との関連において開示されたものが好ましい。このような場合、これらの手段は、取扱説明書に与えられた指示および解説に従って、系の使用者が量の測定結果およびその診断値をもたらす手段に作用可能に連結される。このような実施形態において、手段は別々の装置であってもよいが、キットとして共にパッケージングされるのが好ましい。当業者は困難無く、どのようにこれらの手段を連結するのかわかるであろう。装置としては、専門臨床医の特殊な知識を要することなく用いることができるもの、例えば、試験紙または単に試料をロードすることだけを要する電子装置が好ましい。結果は、臨床医による解釈を必要とする診断用生データのアウトプットとして与えられ得る。しかし、装置のアウトプットは、その解釈に臨床医を必要としない処理された診断用生データであることが好ましく、すなわち、被験体が心不全に罹患しているか否かが、アウトプットから必然的に明確であるものにすべきである。さらに好ましい装置は、本発明方法との関連において上に言及された分析ユニット／装置(例えば、バイオセンサー、アレイ、BNPを特異的に認識するリガンドもしくは薬剤に結合している固相支持体、表面プラスモン共鳴装置、NMR分光計、質量分光計など)または評価ユニット／装置を含む。

上記の観点から、本発明の方法または装置の好ましい実施形態において、BNP量に基づく診断は、被験体の尿サンプル中のBNP量と、心不全に罹患していないことがわかっているまたは心不全に罹患していることがわかっている被験体の尿サンプル中のBNP量とを比較することを含む。

本発明はまた、被験体が心不全後に心血管系疾患を発症する危険にあるか否かを予測するための方法であって、
a)被験体の尿サンプル中のBNP量を測定すること;および
b)ステップa)にて測定されたBNPの量に基づいて、被験体が心不全を伴う心血管系疾患発症の危険にあるか否かを予測すること、
を含む、上記方法に関する。

「心血管系疾患」という用語は、心血管系疾患−心不全、急性冠症状群、脳血管障害／一過性脳虚血発作、末梢血管疾患、不整脈または失神についての、心血管系による死亡および入院に関する。さらに、大量の医薬を必要とする非代償性心不全の新たな外来患者の発作も、本明細書中に示される心血管系疾患下にまとめることができる。心血管系疾患の症状および診断上の特徴は、臨床医にとって周知である(例えば、Troughton 2000. Treatment of heart failure guided by plasma aminoterminal brain natriuretic peptide (N-BNP) concentrations. The Lancet, Vol. 355.を参照)。詳細はまた、標準的なテキスト（例えば、PschyrembelまたはStedman）にも記載されている。これらの症状および特徴は、例えば、被験体の年齢、体重、身長、およびさらなる疾患または障害、治療および／または病歴などのさらなるパラメーターを考慮して臨床医によって判定および診断され得る。このような心血管系疾患とは、被験体の入院を必要とし、および／または被験体の死亡もしくは増大した病的状態が付随して生じることが好ましい。

本発明により、尿中のBNP量が好ましくは、少なくとも2.5 pg/ml、さらに好ましくは少なくとも2.67 pg/mlである場合、心血管系疾患の発症および／または将来的な死亡 (心臓死)の高いリスクの指標となることが見出された。前述の値は、統計学的境界値内で変化し得ることが理解される。

従って、本発明方法は、患者のリスクの分類に用いることができる。したがって、治療または他の必要な医療処置もしくは手段を、被験体に用いることができる。さらに、心不全発症のリスクを、将来的な治療または医療手段のために考慮することができる。

さらに、本発明は、被験体が心不全後に心血管系疾患を発症する危険にあるか否かを予測するための装置であって、
a)被験体の尿サンプル中のBNP量を測定するための手段;および
b)BNP量に基づいて被験体が心不全を伴う心血管系疾患発症の危険にあるか否かを予測するための手段、
を備える上記装置を含む。

したがって、上記より、本発明の方法または装置の好ましい実施形態において、BNP量に基づく予測は、被験体の尿サンプル中のBNP量と、心不全を発症していないことがわかっている被験体または心不全を発症していることがわかっている被験体の尿サンプル中のBNP量とを比較することを含む。

本発明の方法または装置のさらに好ましい実施形態において、心不全を伴う心血管系疾患を発症する危険は、予後期間の少なくとも１２ヶ月に関するものである。

本発明の基礎をなす研究において、BNP量に基づく心血管系疾患の予測は、予後期間の12ヶ月内が最も信頼でき、意義深いということが見出された。本発明によって想定されるさらなる予後期間は、少なくとも１年の期間である。

本発明の方法または装置の他の好ましい実施形態において、心不全は、ニューヨーク心臓協会（New York Heart Association、NYHA）クラスI, II, IIIまたはIVに分類することができる。上記のように、軽度または中程度の心不全のNYHAクラスへの分類は、BNP量に基づいて行うことができ、すなわち、被験体が発症する症状の強度は、BNP量に基づいて測定することができる。本発明の基礎をなす研究において、驚くべきことに、NYHAクラスIおよびIIに属する患者でさえも、それぞれのクラスに確実に分類することができることが見出された。したがって、被験体に発症し得る症状は、軽度または中程度の心不全に関してはより確実に予測することが可能である。さらに、被験体が発症し得る症状の知見に基づいて、被験体の生活はより快適なものとなり得る。

本発明の方法または装置の好ましい実施形態において、被験体はヒトである。

本発明の方法または装置において言及されるBNPとしては、
a)ヒトBNP;
b)ヒトBNPと少なくとも60％同一であるポリペプチド;ならびに
c)ヒトBNPと比較して、アミノ酸の欠失、置換、および／または付加を有し、BNP特性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるものが好ましい。

本発明において言及されるヒトBNPは、成熟分子であるpreproBNPの77位〜108位アミノ酸に相当する32アミノ酸長を含むポリペプチドであることが好ましい。このポリペプチドの構造は、既に先行文献（例えば、WO 02/089657、WO 02/083913、Bonow 1996, New Insights into the cardiac natriuretic peptides. Circulation 93: 1946-1950）に詳細に記載されている。上記先行文献は、それらに開示されている特定のBNP配列およびその変異体に関して、参照として本明細書中に援用される。本発明において言及されるBNPはさらに、同程度の生物学的および／または免疫学的特性を有するヒトポリペプチドの特定配列に対する対立遺伝子および他の変異体を含む。特に、ヒトBNPとアミノ酸レベルで少なくとも60 %、より好ましくは少なくとも70 %、少なくとも80 %、少なくとも90 %、少なくとも95 %、少なくとも98%または少なくとも99 %同一である変異ポリペプチドが想定される。また、ヒトBNPと比較してアミノ酸の欠失、置換、および／または付加を有し、ヒトBNPの生物学的または免疫学的特性を有する変異ポリペプチドも含まれる。これらの変異ポリペプチドは、本明細書中に示した特定のBNPと、心不全に関する同等の予測値および診断値を有する。好ましくはWO 02/089657または以下の実施例に記載されるように、BNPを分析することができる。

BNPは、上に特定したようなヒトBNPであることが最も好ましい。

最後に、本発明はまた、被験体の心不全を診断するため、または被験体が心不全発症の危険にあるか否かを予測するために、本明細書中上記した装置または上に特定したような尿サンプル中のBNPの使用を含む。

本明細書中に引用された全ての参考文献は、その開示内容の全体および本明細書中にて具体的に言及した開示内容について、参照として本明細書中に援用される。

以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

尿中のBNPの診断値および予後値
今回の調査は、ヒト尿中のBNPの存在を分析するため、対象および疾患群にて見出されたBNPレベルを比較するため、ならびに尿中BNPの診断値および予後値を調べるためのものであった。尿中のBNPレベルは、15人の健全なボランティアと91人の心不全 (HF) 患者にて測定した。HF群中、8人はNYHAクラスIの状態にあり、63人はNYHAクラスIIの状態にあり、20人はNYHAクラスIIIの状態であった。

尿中のBNPレベルは、HF 患者のレベルが対照のレベルに対して統計学的に有意に高かった(3.28 ± 4.24 vs. 0.54 ± 0.94 pg/ml; p < 0.0001)。機能が悪化しているクラスにおいては、尿中のBNPの平均レベルは重篤度が高くなるにつれて、顕著に増加した（図３を参照）。HFを検出するためのBNPのROC曲線は、対角線と比べて、0.81; p < 0.0001の曲線(AUC)下に領域を生じた。このROC曲線から、この特定のアッセイにおける任意のカット−ポイントが、特異性80 %かつ感度78 %である0.83 pg/mlとなった。さらに、尿中のBNPが、心臓死 (１２ヶ月)についての予後となったか否かを調べるために、対角線と比べて、AUC = 0.76 p = 0.013を生じるROC曲線を実施した。心臓死を予測するのに最適なカット−ポイントは、この特定のアッセイにおいては2.67 pg/mlと算出された。

したがって、本調査は、BNPがヒト尿サンプル中にて測定できること、尿中のBNPレベルを心不全患者の診断および予後ならびにこれら患者の機能状態の特徴付けに用いることができることを示す。

図１は、心不全を罹患している患者(HF患者)および健全な対照の尿中にて見出されたBNP量の比較を示す。p-値がp < 0.001である場合、BNP量について見いだされた差異は非常に有意であることを示す。図２は、健全な対照個体群またはニューヨーク心臓協会（New York Heart Association）クラスI, IIもしくはIII (NYHA I, IIもしくはIII)によるところのいずれかの心不全を罹患している個体群にて見出された尿中のBNP量の差異を示す。図より明らかなように、個体群の尿中に見出されるBNP量を用いて、心不全の重篤度を区別することができる。群間の差異は、統計学的に有意であった。図３は、心不全を診断するための尿中のBNP量についての受動者動作曲線（Receiver operating curve ：ROC)を示す。図４は、試料測定の後１２ヶ月以内の心臓死の予後についての尿中のBNP量のROC曲線を示す。図５は、本発明の基礎をなす研究において見出された死亡に関するROC曲線の最も好ましいカットオフを伴う表を示す。

Claims

ニューヨーク心臓協会（New York Heart Association、NYHA）クラスI, II, IIIまたはIVに被験体の心不全を分類するための方法であって、
a)被験体の尿サンプル中の32個のアミノ酸からなる成熟脳性ナトリウム利尿ペプチド (BNP)の量を測定すること;および
b)ステップa)にて測定された該32個のアミノ酸からなる成熟BNP量に基いて被験体がNYHAクラスI, II, IIIまたはIVによるところのいずれの心不全に罹患しているかを分類すること、
を含み、BNP量が0.8 pg/ml〜2.4 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIに属し、BNP量が2.5 pg/ml〜3.9 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIIに属し、BNP量が4.0 pg/ml〜12.0 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIIIに属し、BNP量が12.0 pg/mlよりも高い量である場合、被験体はNYHAクラスIVに属すると分類する、上記方法。
被験体が心不全を伴う心血管系疾患発症の危険にあるか否かを予測するための方法であって、
a)被験体の尿サンプル中の３２個のアミノ酸からなる成熟BNP量を測定すること;および
b)ステップa)にて測定された該３２個のアミノ酸からなる成熟BNP量に基づいて被験体が心不全を伴う心血管系疾患発症の危険にあるか否か予測すること、
を含み、BNP量が少なくとも2.5 pg/mlである場合、被験体は心血管系疾患の発症および／または将来的な死亡の高いリスクを有すると予測する、上記方法。
３２個のアミノ酸からなる成熟BNP量に基づく予測が、被験体の尿サンプル中の該３２個のアミノ酸からなる成熟BNP量と心不全を発症していないこと、または心不全を発症していることが知られている被験体の尿サンプル中の該32個のアミノ酸からなる成熟BNP量とを比較することを含む、請求項２に記載の方法。
心不全を伴う心血管系疾患を発症する危険が１２ヶ月の予後期間に関する、請求項２または３に記載の方法。
心不全が、ニューヨーク心臓協会（New York Heart Association、NYHA）クラスI, IIまたはIIIによるところの心不全である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
心不全が慢性心不全である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
被験体がヒトである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
被験体の心不全をニューヨーク心臓協会（New York Heart Association、NYHA）クラスI, II, IIIまたはIVに分類するための装置であって、
a)被験体の尿サンプル中の32個のアミノ酸からなる成熟BNPの量を測定する手段;および
b)該成熟BNP量に基いて被験体の心不全をニューヨーク心臓協会（New York Heart Association、NYHA）クラスI, II, IIIまたはIVに分類する手段、
を備え、BNP量が0.8 pg/ml〜2.4 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIに属し、BNP量が2.5 pg/ml〜3.9 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIIに属し、BNP量が4.0 pg/ml〜12.0 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIIIに属し、BNP量が12.0 pg/mlよりも高い量である場合、被験体はNYHAクラスIVに属すると分類する、上記装置。
被験体が心不全を伴う心血管系疾患発症の危険にあるか否かを予測するための装置であって、
a)被験体の尿サンプル中の32個のアミノ酸からなる成熟BNP量を測定する手段;および
b)該32個のアミノ酸からなる成熟BNPの量に基いて被験体が心不全を伴う心血管系疾患発症の危険にあるか否かを予測する手段、
を備え、BNP量が少なくとも2.5 pg/mlである場合、被験体は心血管系疾患の発症および／または将来的な死亡の高いリスクを有すると予測する、上記装置。
心不全をNYHAクラス I, II, III または IVに分類するための、被験体の尿サンプル中の32個のアミノ酸からなる成熟BNPの使用であって、BNP量が0.8 pg/ml〜2.4 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIに属し、BNP量が2.5 pg/ml〜3.9 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIIに属し、BNP量が4.0 pg/ml〜12.0 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIIIに属し、BNP量が12.0 pg/mlよりも高い量である場合、被験体はNYHAクラスIVに属すると分類する、上記使用。
被験体の心不全をNYHAクラスI, II, IIIまたはIVに分類するための、被験体の尿サンプル中の32個のアミノ酸からなる成熟BNP量を測定する手段および心不全をNYHAクラスI, II, IIIまたはIVに分類するための診断手段を備える装置の使用であって、BNP量が0.8 pg/ml〜2.4 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIに属し、BNP量が2.5 pg/ml〜3.9 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIIに属し、BNP量が4.0 pg/ml〜12.0 pg/mlである場合、被験体はNYHAクラスIIIに属し、BNP量が12.0 pg/mlよりも高い量である場合、被験体はNYHAクラスIVに属すると分類する、上記使用。
被験体が心不全発症の危険にあるか否かを予測するための、被験体の尿サンプル中の32個のアミノ酸からなる成熟BNPの使用であって、BNP量が少なくとも2.5 pg/mlである場合、被験体は心血管系疾患の発症および／または将来的な死亡の高いリスクを有すると予測する、上記使用。
被験体が心不全発症の危険にあるか否かを予測するための、被験体の尿サンプル中の32個のアミノ酸からなる成熟BNPの量を測定する手段および被験体が心不全発症の危険にあるか否かを予測する手段を備える装置の使用であって、BNP量が少なくとも2.5 pg/mlである場合、被験体は心血管系疾患の発症および／または将来的な死亡の高いリスクを有すると予測する、上記使用。