JP4931012B2 - 全反射照明蛍光顕微鏡用カバーガラス - Google Patents

Description

本発明は、アメーバ運動を全反射照明蛍光顕微鏡で観察するのに用いる特殊なカバーガラスに係る。詳しくは、アメーバ運動の牽引力とそれを生じさせる細胞内の分子の運動状況とを同時に視認するための全反射照明蛍光顕微鏡用カバーガラスに関する。

アメーバは、一つの細胞でありながら自由に動き回ることができ、その動きはアメーバ運動として知られている。

かかるアメーバ運動は、白血球や神経細胞の動き或いは傷口の治癒時における上皮細胞の動きなどと同じであり、医学への応用等も期待されることから、多くの研究者によって研究がおこなわれ、その動く力の大きさや、動かすための原動力となる細胞内分子の働きなどが解明されつつある。

従来、アメーバ運動の牽引力の測定方法としては、透明なラップ状フィルムの上にアメーバを乗せ、その動きに従って生ずるシワの状況を測る方法（非特許文献１）や、剣山様の多数の軟らかい突起上にアメーバをのせ、その動きによる突起の撓み状況から、アメーバの牽引力を測定する方法（非特許文献２）或いは、弾性体製の基質に粒径数１００ｎｍのビーズを多数分散・固着させ、その上にアメーバを乗せ、アメーバの動きにより弾性体が歪む状況を前記ビーズの動きから観察する方法（非特許文献３）が採られている。

また、牽引力の源となる物質は、アクチンとミオシンというたん白質であることも知られている。そして、これらのたん白質（「モーターたん白質」ともいう。）の細胞内での挙動は全反射照明蛍光顕微鏡（「ＴＩＲＦＭ」という。）により観察することができる。

しかしながら、アメーバ運動における動きと、細胞内でのアクチンやミオシンの動き、特に細胞内のどの部分にアクチンやミオシンが、どのように存在するのか動的状態で同時に視認することは不可能であった。

すなわち、アメーバが移動するとき、細胞のどの部分がどのように変化し、その時アクチンやミオシンがどのように作用しているかを同時に知りたいという願望はあったにもかかわらず、未だ達成されていなかったのである。
Ｂｕｒｔｏｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌaｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ１０，３７４５−３７６９ Ｂａｌａｂａｎ ＮＱ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ３，４６６−４７２ Ｄｅｍｂｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ７０，２００８−２０２２

本発明は、アメーバが基板上を移動するため牽引力を生じている時、その大きさと細胞内のたん白質分子の動きとを同時に視認する方法の開発を目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の第１の態様は、ガラス基板の片面上に、ヤング率０．５〜２ＫＰａ好ましくは０．８〜１．２ＫＰａで、屈折率１．４〜１．５の実質的に透明な薄膜が存在し、該薄膜は、ガラス基板と接していない表面に粒径１０〜５０ｎｍ、好ましくは２０〜３０ｎｍのビーズが多数分散、固定されていることを特徴とするアメーバ運動の牽引力とそれを生ぜさせる分子（たん白質）運動を同時に視認するための全反射照明蛍光顕微鏡用カバーガラスである。

更に、本発明の態様は第１の態様において、薄膜が実質的に透明なシリコンゴムよりなるものである。

更に、本発明の別の態様においては、上記薄膜はガラス基板の上に１０〜２０μｍの厚さで存在していることを特徴とする。

また、本発明の別の態様にあっては、官能基、好ましくはカルボキシル基を有するビーズを用い、該官能基と化学結合する接着剤、例えばシラン系接着剤、例えばアミノ基を有するカプリグ剤により、ビーズとの間に化学結合を形成し、薄膜の表面にビーズを固定したことを特徴とする前記ＴＩＲＦＭ用カバーガラスである。

本発明の特殊なカバーガラスを用いてＴＩＲＦＭにより蛍光物質、例えばグリーンフルオレッセントプロテイン（「ＧＦＰ」ともいう。）で形質転換したアクチンを細胞内に有するアメーバを観察することにより、一方で薄膜上のビーズの動きから薄膜に加わる力、すなわちアメーバ運動の牽引力を観察することができると同時に、他方でＴＩＲＦＭ本来の機能により、アメーバ細胞内のモーターたん白質の動きを観察することができるのである。

延いては、アメーバ運動に由来する白血球マクロファージの動きや、神経細胞の継がり方、傷口の再生機構等を究明する手がかりになるのである。

アメーバ等の細胞は耐えず動いており、そのための牽引力が働いている。この力は、細胞の前進する側でのアクチンの重合と細胞後部でのミオシンＩＩの増加が重要な役割を演じている。従って、移動する力と細胞内のこれらたん白質の分子の動きとの関係を知ることは、細胞の動きを解明する上で重要である。

すでに述べたようにアメーバの牽引力は、例えばヤング率が０．５〜２ＫＰａ、好適には０．８〜１．２ＫＰａ程度の低いヤング率を有する柔軟な基板の歪から計算できる。

また、細胞内のたん白質分子の動きは、ＴＩＲＦＭを用いて、蛍光染色されたたん白質分子の動きを観察することができる。

しかしながら、牽引力の測定は、基板の動き（歪）の大きさを測定するものであり、歪の状態を表面から観察しなければならず、他方全反射照明蛍光顕微鏡は、カバーガラスを用いて精々数百ｎｍ以内を観察するものであるから、両者を併せ観察することは不可能であった。

本発明は、これら２つの測定を同時に行うことを可能にするものである。

すなわち、ＴＩＲＦＭにあっては被検体をカバーガラスの上に置いて（又は被検体の上にカバーガラスを覆い、上から光を当てて観察する方法もあるが、本明細書では下から光を当てる場合の例について説明する）、斜に光（一般にレーザー光）を当て、カバーガラスの表面又はカバーガラスと被検体との界面で光を全反射させる。そのとき、わずかに裏面に濡れ出る光（エバネッセント光ともいう）を利用する。

この光は、一般に数十ｎｍ乃至数百ｎｍ程度までしか届かないため、その範囲内に存在する物だけを照らし出し、それより遠方は暗闇となり、背景が黒くなるため、カバーガラスに極めて近い部分だけが浮き上がってはっきりと見ることができる。このため、例えば細胞中の分子一つ一つの状態を観察することができるのである。勿論、このＴＩＲＦＭの原理及びその装置自体は公知である。

本発明にあっては、ガラス基板の片面、特に被検体と接する側の表面に実質的に透明で、基板ガラスと同等又はそれ以下で、アメーバ等の細胞を対象とするため、それに含まれる又はその周囲に介在する水よりも大きい屈折率、好ましくは１．４〜１．５で、且つアメーバ運動によって歪が生ずる程度の柔軟性、例えばヤング率０．５〜２ＫＰａ、好ましくは０．８〜１．２ＫＰａ程度の薄膜を存在させる。

この薄膜は、あまりに薄いと、アメーバの牽引力により、薄膜表面近傍が引っ張られて歪を生ずる場合に下にあるガラス基板の影響を受けて正確な測定ができなくなり、また厚すぎると光の透過性が低下する場合もあるので、好ましくは１０〜２０μｍ程度とするのがよい。

本発明の場合、光はガラス基板と薄膜の界面では、実質的に反射せず、基板ガラスを透過した光は、そのまま或いは多少の屈折をして、薄膜中を透過し、薄膜の表面と被検体（一般に水が介在する）との界面で全反射させることが重要である。

図１は、上記を図示した説明図であり、屈折率１．５２のガラス基板上に、屈折率１．４１の透明シリコンゴムの薄膜を施した場合の図である。光は対物レンズを通り、ガラス基板に入るとき、一旦屈折し、更に低い屈折率のシリコンゴムに入射する時屈折し、シリコンゴムと水との界面で全反射することを示した例である。

光が全反射した場合、エバネッセント光が生じ、これが検体に当たり、細胞中の蛍光性分子を励起することになる。かくしてその蛍光を発している分子を、対物レンズを通して受光し、観察することができるのである。

薄膜を構成する材質は、上記条件を満足するものであれば、特に限定されない。例えば、シリコンゴム、シュウ素化ポリスチレン、ポリ塩化ビニリデン、ポリブタジエンなどであり、特にシリコンゴムが好ましい。例えば、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社製ＣＹ５２−２７６Ａ及び同Ｂ（いずれも商品名）を適宜混合して固化させることにより、所望の屈折率を有する、透明で低ヤング率のシリコンゴム薄膜を得ることができる。これらは、ガラス基板上で重合させるなどにより、薄膜を形成させるか、或いはあらかじめ薄膜を成形して、ガラス基板上に載置することができる。

本発明にあっては、更に薄膜の歪を観察するため、薄膜の被検体側表面にのみ、ビーズを多数分散固定する。一般にビーズの分散密度は、５０粒／３μｍ^２以上、好ましくは１００粒／３μｍ^２以上で、一般に２００粒／３μｍ^２もあれば十分である。ビーズの分散量があまりに少ないと薄膜の歪が正確に測定し得ない。また多い場合は一般に問題とはならないが、あまりに多すぎるとビーズが重なったり、薄膜の歪によるビーズの動きが測定し難くなるので好ましくは３００粒／３μｍ^２程度までが適当である。

また、粒子は薄膜表面にのみ存在することが好ましく、薄膜中に均一に存在する場合は、歪によるビーズの動きが異なり、動きによる牽引力の計算が不正確になる。

また、ビーズの粒子径が、例えば１００μｍ以上の如くあまり大きい場合は、牽引力を正確に測定することができない。すなわち、ビーズの分散密度を高くすると、薄膜が歪んだ時、ビーズ同士の接触が生じやすいし、また分散密度を下げると歪の測定点の数が限定されるため、いずれにしても歪の測定が不正確になる。よって、ビーズの粒径は、１０〜５０ｎｍ、好ましくは２０〜４０ｎｍ程度である。

また、ビーズの材質は特に限定されず、有機又は無機の微粒子が用いられる。例えば、コロイド状のポリスチレン粒子などの有機重合体及びその表面に反応性官能基、例えばカルボキシル基、アミノ基、水酸基等を有するものや、ヒュームドシリカ及びその表面にカルボキシアルキル基等が存在するもの等が好ましい。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社が市販している「Ｆ−８７８６」（商品名）が、表面にカルボキシ基の官能基を有するので、好適である。

ビーズの薄膜上への固定方法は特に限定されない。例えば薄膜上にビーズを散布し分散させた後、ロール等を用いて加熱押圧して、薄膜中に押し込む方法や、ビーズを分散させた溶液にシランカップリング剤等、例えばビーズの有する官能基と容易に反応することができる官能基を有する接着剤物質を加えて、薄膜上に塗布し、乾燥させる方法等が採用される。かかる接着剤成分として、ビーズがカルボキシル基等の酸性基を有している場合、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社から市販されている３−アミノプロピルトリエトキシシラン等が好適に使用される。勿論、ビーズがアミノ基を有する場合は、酸性基を持つカップリング剤を用いる。

かくして得られた本発明のカバーガラスを用いた場合のアメーバ細胞の牽引力は、前記細胞内の分子の運動と同時にビーズの動きとして観察することができる。一般には、ビーズに前記細胞内分子を蛍光発光させるための励起波長とは異なる波長のレーザー光等を用い、必要により、ビーズを該波長で励起される蛍光染料で染色されたビーズを用いて測定すればよい。

この場合、ＴＩＲＦＭに用いる光源としては、白色光を用いるものもあるが、一般にはレーザー光を用いるので、２種類のレーザーを用意し、切り換えによりいずれのレーザー光も即時に出せるようにしておくのもよい方法である。

以下に実施例を示す。

細胞の培養
Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｕｉｄｕｍ（粘菌）の細胞はＨＬ５培地（１．３％（ｗ／ｖ）バクテリオロジカルペプトン，０．７５％（ｗ／ｖ）イーストエクストラクト，８５．５ｍＭ Ｄ−グルコース，３．５ｍＭ リン酸水素二ナトリウム（１２水和物），３．５ｍＭ リン酸二水素カリウム，ｐＨ６．４）で培養し、観察の前にＢＳＳ溶液（１０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＫＣｌ，３ｍＭ ＣａＣｌ_２）で発生を進めた。野
生型細胞株ＡＸ２にＧＦＰ−ＡＢＤ１２０ｋを発現させたもの、及び、ミオシンＩＩノックアウト細胞株（ＨＳ１）にＧＦＰ−ミオシンＩＩを発現させたものを観察に用いた。ＡＢＤ１２０ｋはアクチンフィラメントに特異的に結合するため、ＧＦＰ−ＡＢＤ１２０ｋを観察することでアクチンフィラメントの分布を知ることができる。

弾性基質（シリコンゴム薄膜）の準備
ダウコーニング社の、白金触媒でゲル化するビニル基を持つシリコンポリマーゾルＣＹ５２−２７６Ａ及び同Ｂを弾性基質の材料とした。固化したゲルは無色透明で屈折率は１．４である。すなわち３００ｍｇのＣＹ５２−２７６Ａと２５０ｍｇのＣＹ５２−２７６Ｂを混合し、これを２２ｍｍ×２２ｍｍのカバーガラス（Ｎｏ．１，マツナミ社製）に１０−２０μｍの厚みで塗布した。固化のため室温（２３℃）２日間静置した。固化させた基質は１００μｌの液体シラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎ，シグマアルドリッチ社 ＪＡＰＡＮ）と共に密閉容器に入れ、７０℃で１時間静置し、シランを蒸着させた。基質の上に内径１６ｍｍ高さ２ｍｍの土手円筒形の枠をはめ、そこへ４００μｌの蛍光ビーズ液（２０ｎｍ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ，励起波長５８０ｎｍ、蛍光波長６０５ｎｍ，Ｆ−８７８６（商品名；モレキュラープローブ−インビトロジェン社）を蒸留水で４万倍に薄めたもの）を注ぎ、１分後、これを吸引除去した。この作業により基質表面に蛍光ビーズが適切な密度で結合する。

シリコンゴム薄膜のヤング率は以下の方法で計測した。すなわち、鉄球（直径０．５ｍｍ，７．８ｋｇ／ｍ^３）をシリコンゴム薄膜上に置き、くぼみの深さからヤング率を計算した。ヤング率は Ｙ＝３（１−ｐ^２）^２ｆ^２／４ｄ^３／２ｒ^１／２の式で与えられる。ｆは鉄球の重さ、ｄはくぼみの深さ、ｒは鉄球の半径、ｐはポアソン比（０．５）である。計測したヤング率は１．０ｋＰａであった。

顕微鏡観察
ＧＦＰ融合遺伝子を導入された粘菌アメーバをシリコンゴム薄膜上に置きＴＩＲＦＭ光学系で観察した。模式図を図２に示す。顕微鏡はオリンパス社製ＩＸ７１を用い、６０倍の対物レンズ（ＰＬＡＰＯＮ ６０ｘ ＯＴＩＲＦＭ，ＮＡ １．４５）で観察した。ＧＦＰの励起光光源として出力波長４７３ｎｍのレーザーダイオード ＤＰＢＬ−９０１０Ｆ（商品名；Ｐｈｏｔｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、赤色蛍光ビーズ用の励起光光源として出力波長５４３ｎｍのヘリウムネオンレーザー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｏｐｔｉｃｓ社）をそれぞれ用いた（レーザーの光路は図１のとおりである）。

それぞれのレーザーからの励起光は電磁シャッターで交互に照射し、ＧＦＰの蛍光と赤色ビーズの蛍光はデュアルバンドパスフィルタＸＦ３０５６（商品名；クロマテクノロジー社）で分け。冷却ＣＣＤカメラ ＯＲＣＡ ＥＲ（浜松フォトニクス社）で取得した。励起光ははじめ、屈折率１．５２の対物レンズ、油浸オイル、基板ガラスの領域を通過し、基板ガラスと屈折率１．４０のシリコンの境界で屈折する 屈折率１．３３のＢＳＳ溶液との界面で全反射が起きる。入射角は７２度（ｓｉｎ φ≧１．３３／１．４０）以上であればよい。

全反射照明がきちんとできているか確かめるためにＧＦＰ−ＡＢＤ１２０ｋを観察した（図３Ａ）。アクチンフィラメントの網目が綺麗に観察できるので、全反射照明がシリコンゴム薄膜上で達成できていることが分かる。同時に観察したシリコン表層に結合させた赤色ビーズの像を図３Ｂに示す。ビーズ１つ１つがきちんと識別できることが分かる。

アメーバ運動の牽引力の計算
牽引力は粘菌細胞の力そのものではなく、粘菌細胞が出した力の結果生じた、シリコンゴム薄膜の応力として求めた。応力の計算は、赤色ビーズの変位を元に、三角形要素の２次元弾性有限要素法を用いた。典型的なビーズの像を図３Ｂに示す。

５１２×５１２ピクセルのビーズの画像を約８０００の三角形の要素（図３Ｃ）に分割する。各要素の三角形の１辺の長さはおよそ４００ｎｍである。ビーズの変位から各要素の接点（三角形の頂点）の変位を計算し、それぞれの要素の歪みを各々の要素を構成する３つの接点の変位から計算した。各々の要素の応力は平面応力近似下で計算した。応力の大きさを疑似カラー化させた。それぞれの計算にはＲｅａｌ ＢＡＳＩＣ Ｖｅｒ．３．５（アスキー社）、画像処理にはＩｍａｇｅＪ Ｖｅｒ．１．３３（ＮＩＨ フリーウエア）、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ（アドビ社）を用いた。
結果と考察
糸状突起はアクチンフィラメントの束からなる突起で、粒状のアクチンが重合することで伸びることが知られる、アメーバ運動で重要な構造である。しかし、この糸状突起の力を計測した例はない。糸状突起はアクチンに満ちているためＴＩＲＦＭで明瞭に観察できる（図４矢印）。そこで、今回我々が開発した方法で糸状突起の力を測ってみることにした。図４の矢印で示した糸状突起の動きと牽引力を図５〜図７に示す。図５を見ると、糸状突起はその伸長中には力を発揮せず、収縮を始めるときその先端で力を基質に及ぼすことが分かる。糸状突起のアクチンフィラメントの長さと基質の力を図６に示す。アクチンフィラメントが縮み始めるとき基質に力が生じていることが分かる。図７は図５の２６秒時のアクチンの蛍光強度と力の糸状突起の長さ方向の分布である。力が糸状突起先端で最大であることが分かる。

粘菌細胞ではアメーバ運動中の細胞後部の基質からの脱着がミオシンＩＩによる力によって生じると言われる。しかし、ミオシンＩＩと力を同時に観察した例はない。そこで、ＧＦＰ−ミオシンＩＩを導入した細胞で、我々が今回開発した方法で同時に観察してみると、予想したとおり、牽引力はミオシンＩＩの分布と一致し細胞後部で顕著だということが分かった。

本発明のカバーガラスを用いた全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）における光路を示す模式図である。 本発明のカバーガラス上にアメーバを置いたときの模式図である。 Ａは、ＴＩＲＦＭによりアメーバ細胞内が明確に観察できていることを示す図である。 Ｂは、シリコンゴム薄膜上に存在するビーズをＴＩＲＦＭで撮影した写真である。 Ｃは、ビーズの画像を約８０００の三角形の要素に分割して示した図である。 アメーバの糸状突起をＴＩＲＦＭで観察した写真である。 糸状突起の伸長及び収縮と基質（薄膜）に及ぼす力の関係を示すための連続写真である。上の数字は経過時間（秒）を示す。 アクチンフィラメントの束の長さと基質への力を示すグラフである。 図５に示す２６秒時のアクチンの蛍光強度と力の糸状突起の長さ方向の分布図である。 牽引力が、ミオシンＩＩの分布と一致し、細胞後部で顕著であることを示す図である。

Claims (4)

1. ガラス基板の片面上に、ヤング率０．５〜２ＫＰａで、屈折率１．４〜１．５の、実質的に透明な薄膜が存在し、該薄膜はガラス基板と接していない表面に、粒径１０〜５０ｎｍのビーズが多数分散固定されていることを特徴とするアメーバ運動の牽引力とそれを生じさせる分子運動を同時に視認するための全反射照明蛍光顕微鏡用カバーガラス。
2. 薄膜がシリコンゴムよりなる請求項１記載の全反射照明蛍光顕微鏡用カバーガラス。
3. 薄膜が１０〜２０μｍの厚さである請求項２記載の全反射照明蛍光顕微鏡用カバーガラス。
4. 官能基を有するシラン系接着剤により、ビーズを化学結合して薄膜表面に固定されていることを特徴とする請求項２又は３記載の全反射照明蛍光顕微鏡用カバーガラス。

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