JP5058403B2

JP5058403B2 - CK-MB activity measuring method and CK-MB activity measuring reagent

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Publication number: JP5058403B2
Application number: JP2000193500A
Authority: JP
Inventors: 泰史白波瀬; 忠宏梶田
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2000-06-27
Filing date: 2000-06-27
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2020-06-27
Also published as: JP2002000270A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はミトコンドリアクレアチンキナーゼ（ｍＣＫ）の活性を特異的に阻害するモノクローナル抗体を用いたクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の測定法および測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）は遺伝子を異にする３つの蛋白が存在する。細胞質に由来する２種類の蛋白（局在により筋肉型（Ｍ型）と脳型（Ｂ型））ともう一つはミトコンドリアに由来する蛋白である。細胞質由来のＣＫアイソザイムはＭ型とＢ型との組み合わせによりなる２量体で構成され、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの３種類に分類される。ミトコンドリアＣＫ（ｍＣＫ）は、偏在型のユビキタス（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）Ｍｉａ−ＣＫとサルコメリック（ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ）Ｍｉｂ−ＣＫのアイソフォームが組織特異的に合成される。
【０００３】
また、ｍＣＫは８量体で極めて安定的に存在するが、クレアチン、ＭｇＡＤＰおよび硝酸塩の遷移状態類似物質複合体の存在下では、数分のうちに２量体に加速的に解離する。また、血液中では時間と共に徐々に２量体になると言われている（ＫａｒｉｎＦｒｉｔｚ−Ｗｏｌｆｅｔａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３８１，３４１−３４５，１９９６）。
【０００４】
これらアイソザイムの電気泳動の移動度は陰極側からｍＣＫ（８量体）、ｍＣＫ（２量体）＝ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの順になる。ｍＣＫ（２量体）はＣＫ−ＭＭと同じ移動度を示すため保存血液では電気泳動的にＣＫ−ＭＭとして測定されてしまう。その他にアイソザイムではないが、免疫グロブリンが結合したマクロＣＫも存在する。これらは移動度、免疫向流法などによりザイモグラムから確認することができる。
【０００５】
臨床検査においてはＣＫ、ＣＫアイソザイムの定量が広く行われている。中でもＣＫ−ＭＢは心筋梗塞のマーカーとして重要である。ＣＫ−ＭＢの定量はＥＩＡ法、免疫阻害法、電気泳動法などにより行われている。ＥＩＡ法はＣＫ−ＭＢだけを特異性高く測定できる反面、専用の機器が必要で迅速性に欠ける。電気泳動法は操作が煩雑で熟練を要する上に、結果を出すまでにデンシトメーターでＣＫ−ＭＢの存在比率を出す必要があり迅速性に欠ける。免疫阻害法は自動分析装置により迅速簡便に測定ができる利点があるが特異性に欠ける欠点を有していた。
【０００６】
しかし現状では、急性心筋梗塞の早期診断が求められる為、迅速簡便に測定ができる免疫阻害法が広く使用されている。この方法は、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する特異抗体（以下、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体ということもある）を用いてＭサブユニットを失活させ、残存するＢサブユニット活性を測定するものである。この方法だと、ＣＫ−ＭＢの他にＣＫ−ＢＢ、ｍＣＫ（２量体＋８量体）を測定してしまう。この内ＣＫ−ＢＢは、血中にほとんど存在しないため無視できるし、ＣＫ−ＢＢが逸脱する疾患も少ない。しかし、ｍＣＫは健常者の血清中でもＣＫ−ＭＢとほぼ同じ活性量含まれており（豊田陽子他：生物物理化学，４１，２４４，１９９７、星野忠他：小児を対象としたＣＫアイソザイム分画の年齢別推移に関する検討．生物物理化学，４２補冊２，２１，１９９８）、さらに肝疾患などの細胞壊死、悪性腫瘍などでｍＣＫの逸脱が起こり結果の判定を混乱させる。最近では、ロタウイルスによる腸炎、新生児仮死などでもｍＣＫの逸脱が起こることが報告されている（星野忠他：臨床病理，４６，総会号，５７，１９９８、金光房江他：臨床病理，４６，総会号，５６，１９９８）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来の免疫阻害法は、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いてＣＫ‐ＭＢを測定するものであり、簡便で迅速に測定できるが、この方法だとｍＣＫも同時に測定してしまい、正確なＣＫ−ＭＢの測定は期待できない。しかし、ｍＣＫを阻害する抗体および抗ＣＫ‐Ｍ阻害抗体を添加することにより、ｍＣＫの影響を回避して正確で特異性の高い簡便なＣＫ‐ＭＢ測定が可能となる。そこで本発明の目的は、免疫阻害法によるＣＫ‐ＭＢ測定法において、ｍＣＫの影響を回避して正確で特異性の高い簡便なＣＫ‐ＭＢ測定法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、たとえば哺乳動物をｍＣＫで免疫して得られた抗血清や、免疫した各種動物由来のＢリンパ球と各種骨髄腫細胞との細胞融合により作製したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、前記目的を達成せしめる抗体を得て本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）免疫阻害法によりクレアチンキナーゼ（ＣＫ）ＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）の酵素活性を測定する方法であって、ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性を阻害するモノクローナル抗体およびクレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットの酵素活性を阻害する抗体を用いて検体を処理し、ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性およびｍＣＫの酵素活性を阻害する処理がなされた検体中に残存するクレアチンキナーゼＢ（ＣＫ−Ｂ）サブユニットの酵素活性を測定し、測定されたＣＫ−Ｂサブユニットの酵素活性からＣＫ−ＭＢの酵素活性を求めることを特徴とするＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（２）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、サルコメラｍＣＫの酵素活性を阻害するが、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）、クレアチンキナーゼＭＭアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）およびクレアチンキナーゼＢＢアイソザイム（ＣＫ−ＢＢ）の酵素活性は阻害しない（１）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定方法、
（３）ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を一つの工程中で同時に作用させることを特徴とする（１）または（２）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（４）ＣＫ−Ｍサブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を別々の工程で作用させることを特徴とする（１）または（２）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（５）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７１３３号により寄託されているハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であることを特徴とする（１）〜（４）の何れか１項に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法、
（６）（１）記載のＣＫ−ＭＢ活性測定法に用いるＣＫ−ＭＢ活性測定試薬であって、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットの酵素活性を阻害する抗体およびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を含むことを特徴とするＣＫ−ＭＢ活性測定試薬、
（７）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、サルコメラｍＣＫの酵素活性を阻害するが、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）、クレアチンキナーゼＭＭアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ）およびクレアチンキナーゼＢＢアイソザイム（ＣＫ−ＢＢ）の酵素活性は阻害しない（６）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬、
（８）前記ｍＣＫの酵素活性を阻害するモノクローナル抗体が、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７１３３号により寄託されているハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であることを特徴とする（６）または（７）に記載のＣＫ−ＭＢ活性測定試薬、
を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害抗体（抗ｍＣＫ阻害抗体とよぶこともある）は、ｍＣＫ蛋白質を特異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害する抗体である。本発明の抗体は、後述する本発明のＣＫアイソザイムの分別定量法に使用できるが、このＣＫアイソザイムの分別定量法において実質的にｍＣＫ以外のＣＫアイソザイムの測定に影響が無い程度にまでｍＣＫを阻害できれる抗体であればよく、ｍＣＫを６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上阻害する抗体であり得る。ｍＣＫは多くの場合、試料中に５〜２０Ｕ／Ｌ含まれており、８０％以上のｍＣＫ阻害能を有すれば臨床上問題なく使用可能である。ｍＣＫ阻害能の低い抗体であっても、複数の抗体を組み合わせて使用する、またはｍＣＫを阻害しうる化合物と共に使用することにより、実質的に８０％以上の阻害効果を得ることができるので、本発明の範囲に含まれる。また、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００１１】
具体的には例えば、本発明の抗体は、ヒトｍＣＫを特異的に認識して阻害しうるモノクローナル抗体であって、マウス由来かつイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）クラスのｍＣＫＩ−５７８と命名された抗体であり、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７１３３号により平成１２年４月１３日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体である。ｍＣＫＩ−５７８は、試料中のｍＣＫ酵素活性を特異的に８０％以上阻害することができる。また、ｍＣＫＩ−５７８は、少なくともサルコメラｍＣＫを９０％以上阻害する。本発明の抗体は、この具体例に限定されるものではなく、ヒトｍＣＫを特異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害しうる抗体であればよい。また、本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体は、ｍＣＫ酵素活性を阻害する目的で使用する時、単独で用いてもよいし、複数の抗ｍＣＫ阻害抗体、例えば認識部位が異なる抗体を適宜組み合わせて用いることも可能である。
【００１２】
本発明の抗体の由来である動物種はマウスに限るものではなく、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマなどが例示されるが、好ましくはマウスである。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されるものではなく、ＩｇＭなどでもよい。
【００１３】
本発明の抗体は、従来公知の免疫学的手法を用いて、例えば抗原としてｍＣＫを用い、好ましくはアジュバントと共に哺乳類に免疫し、免疫した動物の血清などから得ることができる。モノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、免疫した動物由来のＢリンパ球と各種骨髄腫細胞とを融合することにより、具体的には以下に記載する方法で作製することができる。
【００１４】
抗原としては、目的とする特異性によっても異なるが、ｍＣＫに対して特異的に親和性を有し且つその酵素活性を阻害する抗体を得る場合には、ヒトまたは哺乳類のｍＣＫが用いられるが、特異性を高めるためには種特異的な抗原を用いることが好ましい。ヒトｍＣＫに対して特異的に親和性を有し且つその酵素活性を特異的に阻害する抗体を得る場合には、抗原として好ましくはヒトｍＣＫを用いる。当該抗原は、ｍＣＫを心筋組織や血液などから精製することにより調製できるし、また遺伝子工学的手法によっても得ることができる。
【００１５】
感作抗原としては、精製したｍＣＫ蛋白質、またはそのアミノ酸配列に基づき遺伝子工学的手法により発現させたｍＣＫ蛋白質やその部分ペプチドをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）などの適当な緩衝液中に溶解、あるいは懸濁したものが用いられる。抗原液は通常抗原物質を５０〜５００μｇ／ｍＬ程度含む濃度に調製すればよい。また、ペプチド抗原など、それだけでは抗原性が低い場合は、アルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの適当なキャリアータンパク質に架橋して用いることが好ましい。当該抗原で免疫感作する動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギなどが例示される。好ましくはマウス、より好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウスである。
【００１６】
このとき、被免疫動物の抗原への応答性を高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投与することが好ましい。ここで用いられるアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）。百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合せが例示されるが、初回免疫時にＦＣＡ、追加免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉアジュバントを使用する組合せが特に好ましい。
【００１７】
免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュバント混合の有無などにより、注射部位、スケジュールなどを適宜変化させることができるが、例えば、被免疫動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗原液０．０５〜１ｍＬ（抗原物質１０〜２００μｇ）を腹腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。当該抗原溶液をアジュバントを使用せずに投与する場合には、抗原量を多くして、腹腔内注射してもよい。抗体価は追加免疫の約５〜６日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の抗体価アッセイに準じ、通常行われる方法で行うことができる。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物から脾細胞を分離して抗体産生細胞を得る。
【００１８】
骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒトなど由来のものが使用される。例えばマウスミエローマＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３などの株化骨髄腫細胞が例示される。骨髄腫細胞には免疫グロブリン軽鎖を産生しているものがあり、これを融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生する免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダムに結合することがあるので、好ましくは免疫グロブリン軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３やＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４などを用いることが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。骨髄腫細胞の維持は、凍結保存するか、またはウマ、ウサギもしくはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代培養することにより行われる。また細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。
【００１９】
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが例示される。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１，０００〜６，０００）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を１〜１０：１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、細胞を洗浄しＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、マイクロタイタープレート中に播種して培養を続ける。
【００２０】
融合操作後の細胞は選択培地で培養して、ハイブリドーマの選択を行う。選択培地は、親細胞株が死滅し、融合細胞のみが増殖しえる培地であり、通常ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合操作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換することによって開始し、さらに２、３日毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養することにより行う。顕微鏡観察によりハイブリドーマのコロニーが生育しているウエルを確認する。
【００２１】
生育しているハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを知るには、培養上清を採取して抗体価アッセイを自体公知の方法により行えばよい。例えば固相化した抗原タンパク質に段階希釈した該上清を加えて反応させ、さらに蛍光物質、酵素、もしくは放射性同位体（ＲＩ）などで標識した二次抗体（抗グロブリン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体など）を反応させれば、該上清中に産生されている抗体を検出することができ、また抗体価を測定することができる。抗原が酵素などの場合は、その酵素と該上清とを反応させた後、適当な基質を反応させて酵素阻害活性の有無により、抗体の検出および抗体価の測定を行うことができる。このように各ウエルの培養上清をスクリーニングし、適切な抗体を産生しているハイブリドーマを得る。
【００２２】
さらに限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いた方法などにより単一クローンを分離する。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマのコロニーを１細胞／ウエル前後となるように培地で段階希釈して培養することにより目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを単離することができる。得られた抗体産生ハイブリドーマクローンは、約１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）あるいはグリセリンなどの凍結保護剤の共存下に凍結させて−７０〜−１９６℃で保存すると、約半年〜半永久的に保存可能である。細胞は用時３７℃前後の恒温槽中で急速に融解して使用する。凍結保護剤の細胞毒性が残存しないようによく洗浄してから使用するのが望ましい。
【００２３】
ハイブリドーマが産生する抗体の免疫グロブリンサブクラスを調べるためには、該ハイブリドーマを一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された抗体を市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなどを用いて分析することにより知ることができる。
【００２４】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得方法は、必要量やハイブリドーマの性状などによって適宜選択して用いる。例えば、該ハイブリドーマを移植したマウス腹水から取得する方法、細胞培養により培養上清から取得する方法などが例示される。マウス腹腔内で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数ｍｇ／ｍＬの高濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。インビボで増殖できないハイブリドーマは細胞培養の培養上清から取得する。細胞培養によるモノクローナル抗体の取得は、抗体産生量はインビボより低いが、マウス腹腔内に含まれる免疫グロブリンや他の夾雑物質の混入が少なく、精製が容易であるという利点がある。
【００２５】
抗体をハイブリドーマを移植したマウス腹腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（２、６、１０、１４−テトラメチルペンタデカン）などの免疫抑制作用を有する物質を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へハイブリドーマ（約１０^６個以上）を移植し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異種ハイブリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射線処理マウスを使用することが好ましい。
【００２６】
一方、細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、高密度培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法などの培養法を用い、当該ハイブリドーマを培養し抗体を含有する培養上清を得る。培養液に含まれる血清は、他の抗体やアルブミンなどの夾雑物が含まれ、抗体精製が煩雑になることが多いので、培養液への添加は少なくすることが望ましい。または、ハイブリドーマを常法により無血清培地に馴化し、無血清培地を用いて培養すれば、抗体精製が容易になるので、より好ましい。
【００２７】
腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、免疫グロブリンの精製法として従来既知の硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法などを応用することで、容易に達成される。
【００２８】
さらに、モノクローナル抗体が、マウスＩｇＧである場合には、プロテインＡ結合単体あるいは抗マウスイムノグロブリン結合単体を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製することが可能であり、簡便である。
【００２９】
かくして得られた本発明のモノクローナル抗体は試料中のｍＣＫ酵素活性を特異的に阻害できる。従って、本抗体を用いることにより、試料中のｍＣＫを選択的に排除することができ、ＣＫ−Ｍサブユニットを選択的に排除せしめる抗体と共に使用することで、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムであるＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢおよびｍＣＫを分別定量することが可能となる。
本発明は、本発明のモノクローナル抗体で処理することにより、ｍＣＫを排除することを特徴とするクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの分別定量法を提供する。本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害モノクローナル抗体は、単独で用いてもよいし、複数の抗ｍＣＫ阻害抗体、例えば認識部位が異なる抗体を適宜組み合わせて用いることも可能である。
【００３０】
ＣＫアイソザイム測定法の基本原理は、免疫阻害法によるＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に測定する方法を利用する。一般に、例えばこの方法によるＣＫ−ＭＢの活性測定は次のようにして行われている。すなわち、ヒトＣＫ−Ｍサブユニットに特異的な活性阻害抗体を使用し、試料中のＣＫ−ＭＭおよびＭＢ中のＭサブユニット活性（ＭＢは約半分の活性が阻害される）を阻害したのち、残存するＢサブユニット活性を２倍することによりＣＫ−ＭＢ活性を測定する。ＣＫ−ＭＢ活性の測定は、下述の反応式（化１）の左行反応によって生成するＡＴＰを、さらにヘキソキナーゼ（ＨＫ）とグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）からなる共役反応によりＮＡＤＰＨを生成させ、ＮＡＤＰＨの量的変化を定量することにより行う（化２）。
【００３１】
【化１】

【００３２】
【化２】

【００３３】
従来法では、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体のみを用いてＣＫ−ＭＢの測定を行っていたため、ｍＣＫも同時に測定され正確なＣＫ−ＭＢ活性の測定が期待できなかったが、本発明のＣＫアイソザイムの分別定量法において、クレアチンキナーゼＭ（ＣＫ−Ｍ）サブユニットおよびミトコンドリア局在クレアチンキナーゼアイソザイム（ｍＣＫ）の酵素活性を、ＣＫ−Ｍサブユニットに対する阻害抗体およびｍＣＫに対する阻害抗体で試料を処理することにより選択的に排除する処理をした後、残存するＣＫ活性を測定すれば、実用上十分に正確なＣＫ−ＭＢ測定を簡便迅速に実施できる。
【００３４】
上記本発明のＣＫ−ＭＢ測定法では、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体および本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体とを同一の工程中、例えば測定用酵素液中、で作用させてもよいし、別々の工程で、例えば本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を基質液に添加し、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体は測定用酵素液中で、作用させてもよい。
活性測定を目的とするアイソザイムがＣＫ−ＭＢの場合は、好ましくは同時に、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体および本発明で得た抗ｍＣＫ阻害抗体で試料を処理して測定を行うのが簡便でよい
【００３５】
さらに本発明は、抗ｍＣＫ阻害抗体で試料を処理することによりｍＣＫの酵素活性を選択的に排除することを特徴とするｍＣＫ測定法を提供する。すなわち、本発明のｍＣＫ測定法においては、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を用いてｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定とを行い、得られた２つの測定値の差からｍＣＫ活性のみを求めることができる。この時、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を用いてｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定とは、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体などを含んでいる測定用試薬を使用して行ってもよいし、含んでいない測定用試薬を使用して行ってもよい。２つの測定において使用する測定用試薬が抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体の含有に関して同条件であれば問題はない。
【００３６】
例えば、試料中の全ＣＫ活性を測定し、測定後さらに本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を加えて再度測定を行い、得られた２つの測定値の差によりｍＣＫ活性を求めることができる。この時、試料をまず抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いて処理しＣＫ−ＭＭ活性とＣＫ−ＭＢの約半分の活性とを阻害したのちに一旦測定を行って、１／２ＣＫ−ＭＢ＋ｍＣＫ酵素活性を測定し（測定値Ａ）、測定後さらに本発明の抗ｍＣＫ阻害抗体を加えて再度測定を行い、１／２ＣＫ−ＭＢ酵素活性（測定値Ｂ）を測定することにより、ｍＣＫ活性のみならずＣＫ−ＭＢ活性を同一試料を用いて同時に簡便迅速に測定できる。すなわち、ＣＫ−ＭＢ活性は測定値Ｂを２倍することにより求めることができるし、ｍＣＫ活性は測定値Ａと測定値Ｂとの差により求めることができる。
【００３７】
また例えば、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、試料中のｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定とを別々に行い、得られた２つの測定値の差からｍＣＫ活性を得ることもできる。すなわち、試料中のｍＣＫを含むクレアチンキナーゼ活性を例えば全ＣＫ活性測定試薬（キットＡ）を用いて測定し、試料中のｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性を別に調製した抗ｍＣＫ阻害抗体をキットＡに添加したキットＢを用いて測定を行い、得られた２つの測定値の差からｍＣＫ活性を得ることができる。この時、キットＡとして抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体を添加したＣＫ−ＭＢ活性測定試薬を使用すれば、ｍＣＫ活性のみならず、ＣＫ−ＭＢ活性をも求めることができる。
【００３８】
さらに、本発明のＣＫアイソザイムの分別定量法において、抗ｍＣＫ阻害抗体を用いて試料中のｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活性の測定を行い（測定値Ｃ）、抗ＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ｍＣＫ阻害抗体とを用いてｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、および１／２ＣＫ−ＭＢ以外のＣＫ活性の測定を行い（測定値Ｄ）、測定値Ｃと測定値Ｄの２倍の値との差により、ＣＫ−ＭＭ活性を求めることができる。
【００３９】
本発明の方法により測定される試料は特に制限はないが、通常臨床検査の分野で行われているＣＫアイソザイムが測定されている方法や試料に適用しうる。
【００４０】
また本発明は、本発明のＣＫアイソザイム測定法、ＣＫ−ＭＢ測定法、ｍＣＫ測定法に必要な試薬をキット化または単品で構成してなるＣＫアイソザイム活性測定用試薬を提供する。本発明のＣＫアイソザイム活性測定用試薬は、本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害モノクローナル抗体を試薬中に含むかまたは単品として構成してなる。ここでいう試薬には、全ＣＫ活性測定試薬や、急性心筋梗塞の生化学的診断に用いられているＣＫ−ＭＢ測定用試薬を、その一部として利用できるがこれに限定されるものではない。
【００４１】
【実施例】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
（１）免疫原（抗原）の調製
ヒトｍＣＫはヒト心筋組織を用い、ＲｏｂｅｒｔＲｏｂｅｒｔｓら、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５５巻、２８７０〜２８７７項、１９８０、およびＡｎｎＭｅｒｚＧｒａｃｅら、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５８巻、１５３４６〜１５３５４項、１９８３に記載されている方法により精製した。４００ｇのヒト心筋より約１０ｍｇの精製ヒトｍＣＫが得られた。これを使用するまで凍結保存した。
【００４２】
（２）被免疫動物
５〜８週令の近交系ＢＡＬＢ／ｃ系マウス雌を、動物飼育チェンバー内（２３±１℃、湿度７０％）で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
【００４３】
（３）免疫方法
上記（１）で調製した精製ヒトｍＣＫを抗原として用い、１００μｇ／０．５ｍＬとなる様にＰＢＳで調製し、同量（０．５ｍＬ）のフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｄｉｆｃｏ社製）を混合して乳化した。この乳化状の抗原を、５週令の４匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に１匹あたり２００μＬ投与した。さらに２週間毎に、Ｒｉｂｉアジュバントにて１００μｇ／ｍＬとなるように調製した上記抗原をマウス当たり２０μｇずつ４回投与した。さらに１ヶ月の後Ｒｉｂｉアジュバントで１００μｇ／ｍＬとなるように調製した上記抗原を同様に追加免疫した後、マウスの抗体価を測定した。抗体価の高いマウスはさらに２週間後、抗原である精製ヒトｍＣＫをＰＢＳで１００μｇ／ｍＬに調製し、マウス尾静脈より注射して最終免疫した。
【００４４】
（４）抗体価測定（抗体価アッセイ）
抗体価の測定に当たっては、定期的にマウス眼底網膜より少量の全血を採取し、血清を分離した後使用直前まで凍結保存した。免疫開始時より、ヒトｍＣＫに対する抗体価をｍＣＫ酵素活性阻害抗体法により調べた。
【００４５】
すなわち、各マウスの抗血清をＰＢＳで１０〜１，０００倍希釈して調製した抗体液２５μＬと２５μＬのｍＣＫ酵素液（２００Ｕ／Ｌ）とを９６穴マイクロタイタープレートに加え室温で１０分間反応した後、１００μＬの酵素試薬〔１００ｍＭイミダゾール、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭアデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭＰ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ１−チオグリセロール、２８ｍＭＤ−グルコース、２ｍＭＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍＬＨＫ、２Ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０ｍＭクレアチンリン酸二ナトリウム、０．３ｍｇ／ｍＬニトロブルーテトラゾリウムクロライド、０．６Ｕ／ｍＬダイアフォラーゼ、ｐＨ６．６〕を９６穴マイクロタイタープレートに加え、３７℃で１０分間反応させた。ついで、波長５７０ｎｍにおける吸光度を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体陰性コントロールとして抗血清の代わりに非免疫マウス血清を添加し、陰性コントロールとした。
【００４６】
得られた吸光度から、ｍＣＫ酵素活性阻害特異抗体が血液中に産生されていればｍＣＫの酵素活性が阻害され基質反応が抑制されて吸光度の変化量が低くなるため、ｍＣＫ酵素活性阻害特異抗体の存在を特定することができた。
【００４７】
（５）反応特異性の検討
得られた抗ｍＣＫ酵素活性阻害ポリクローナル抗体はさらに、ヒトｍＣＫの代りにヒトＣＫ−ＭＢまたはヒトＣＫ−ＭＭを至適濃度に加えた酵素液をそれぞれ調製し、上記（４）と同様の方法により各ＣＫアイソザイムに対する酵素活性阻害を確認した。
【００４８】
（６）細胞融合
最終免疫から３日後にＢＡＬＢ／ｃマウスの摘脾を行い、ＥＭＥＭ培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の浮遊液を作製した。ついで、脾細胞をＥＭＥＭ培養液で４回洗浄した後、細胞数を算定し、７．０×１０^８個の脾細胞を得た。
【００４９】
細胞融合は、８−アザグアニン（２−ａｍｉｎｏ−６−ｏｘｙ−８ａｚａｐｕｒｉｎｅ）耐性のＢＡＬＢ／ｃマウス由来骨髄腫培養細胞株（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３、以下、Ｘ６３細胞という）を親細胞株として用いた。
【００５０】
Ｘ６３細胞は、非働化した牛胎児血清（ｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）１０％を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液（２０μｇ／ｍＬ，８−アザグアニン含有）で継代培養した。細胞融合の３日前より８−アザグアニンを含有しない１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培養液でさらに培養し、対数増殖期の細胞を用いた。Ｘ６３細胞はＲＰＭＩ−１６４０培養液で３回洗浄した後、細胞数を算定し、７×１０^７個の生細胞を得た。
【００５１】
ＲＰＭＩ−１６４０培養液で、ポリエチレングリコール−４０００が５０（Ｗ／Ｖ）％濃度となるように溶解し、上記の脾細胞とＸ６３細胞との比が１０：１となるように混合し、ケーラーおよびミルシュタイン共著：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ第２５６巻，４９５−４９７，１９７５）およびヨーロピアンジャーナルオブイムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第６巻，５１１−５１９，１９７６年）の方法に準じて細胞融合を行った。
【００５２】
その後、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培養液に、１×１０^−４Ｍのヒポキサンチン、４×１０^−７Ｍのアミノプテリンおよび１．６×１０^−５Ｍのチミジン（ＨＡＴ）を含有するＨＡＴ選択培地に、脾細胞が２．０×１０^６個／ｍＬとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液を５０μＬずつ、９６穴マイクロタイタープレートの各ウエルに分注した後、ＣＯ_２無菌培養器において温度３７℃、湿度９５％、８％のＣＯ_２雰囲気で培養を行なった。培養開始後、１日目と２日目にＨＡＴ選択培地を各ウエルに１滴ずつ、また培養開始後７日目と９日目にＨＡＴ選択培地を、各ウエルに２滴ずつ添加してさらに培養を行った。その後、ＨＡＴを含まない培養液で育成させ、約１０日〜２週間後に、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを下記に記載したスクリーニング方法によって選別した。
【００５３】
（７）スクリーニング
上記ハイブリドーマの培養上清を用いて、ｍＣＫ酵素活性阻害による方法により実施した。
【００５４】
すなわち、２５μＬのハイブリドーマ培養上清と２５μＬのｍＣＫ酵素液（２００Ｕ／Ｌ）とを９６穴マイクロタイタープレートに加え室温で１０分間反応した後、１００μＬの酵素試薬〔１００ｍＭイミダゾール、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭアデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭＰ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ１−チオグリセロール、２８ｍＭＤ−グルコース、２ｍＭＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍＬＨＫ、２Ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０ｍＭクレアチンリン酸二ナトリウム、０．３ｍｇ／ｍＬニトロブルーテトラゾリウムクロライド、０．６Ｕ／ｍＬダイアフォラーゼ、ｐＨ６．６〕を９６穴マイクロタイタープレートに加え、３７℃で１０分間反応させた。ついで、波長５７０ｎｍにおける吸光度を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体陰性コントロールとしてハイブリドーマ培養上清の代わりに培養液のみを添加し、陰性コントロールとした。
【００５５】
得られた吸光度から、ｍＣＫの酵素活性を阻害する抗体が存在した場合には基質反応が抑制されるため吸光度の変化量が低くなるので、ｍＣＫに対する阻害抗体を産生しているハイブリドーマを特定することができた。
【００５６】
得られた抗ヒトｍＣＫ酵素活性阻害モノクローナル抗体はさらに、ヒトｍＣＫの代りにヒトＣＫ−ＭＢまたはヒトＣＫ−ＭＭを用い、上記と同様の方法により各酵素に対する酵素活性阻害を確認した。
上記（７）のスクリーニング方法により、ハイブリドーマの増殖が認められた９６穴マイクロタイタープレートの２４９６穴についてスクリーニングを実施し、１０穴についてｍＣＫ酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの存在が認められた。
【００５７】
（８）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株の樹立（クローニング）
上記（７）のスクリーニングにより得られた１０穴中のハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングした。その結果、上記１０穴中のハイブリドーマの内、安定にｍＣＫ酵素活性阻害を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を１クロ−ン選択した。このハイブリドーマを樹立株とし、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７１３３号として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００５８】
（９）マウスイムノグロブリンサブクラスの同定
上記、クローニングにより単一クローンとして得られたハイブリドーマクローン（ＦＥＲＭＢＰ−７１３３）の産生するモノクローナル抗体のマウスイムノグロブリンサブクラスを、ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）社製モノアブタイピングキット（ＭＯＮＯＡｂｔｙｐｉｎｇｋｉｔ）を使用して同定した。その結果ＦＥＲＭＢＰ−７１３３が産生するモノクローナル抗体（ｍＣＫＩ−５７８）はイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ１，κ）であることが判明した。
【００５９】
（１０）ｍＣＫＩ−５７８のヒトＣＫアイソザイムに対する特異性
得られた抗体ｍＣＫＩ−５７８の、ヒトＣＫアイソザイムに対する特異性を確認するため、ヒトｍＣＫ、ヒトＣＫ−ＭＭ、ヒトＣＫ−ＢＢまたはヒトＣＫ−ＭＢを用い、上記（７）と同様の方法により各アイソザイムに対する酵素活性阻害を確認した。
その結果を表１に示した。ｍＣＫＩ−５７８は、ｍＣＫの酵素活性を約９０％阻害したが、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢ、およびＣＫ−ＭＢの酵素活性は阻害しなかった。従って、ｍＣＫＩ−５７８は、ｍＣＫのみを特異的に認識し、ｍＣＫ酵素活性を選択的に阻害する抗体であることが確認された。一方、ＦＥＲＭＢＰ−７１３３と同様に作製された別のハイブリドーマクローンから産生されたＣＫ−１７７３はいずれのＣＫアイソザイムも阻害しなかった。
【００６０】
【表１】
モノクローナル抗体ｍＣＫＩ−５７８の特異性

【００６１】
（１１）ｍＣＫＩ−５７８のサルコメラｍＣＫに対する阻害活性
ｍＣＫＩ−５７８のサルコメラｍＣＫに対する阻害能を上記（７）と同様の方法で検討したところ、図１に示すように約９８％の阻害が認められた。
【００６２】
【実施例２】
実施例１で得られたｍＣＫＩ−５７８を用いたＣＫ−ＭＢ測定
ヒト健常人検体またはヒトｍＣＫ陽性検体１００μｌに生理食塩水、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）、抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（実施例１）または２つの抗体を混合したものを各々１０μｌ加えて電気泳動を行った。電気泳動はポルＥフィルムシステム（アガロース電気泳動）を使用し、４０分間泳動した。泳動後、ＣＫ発色試薬〔１００ｍＭイミダゾール、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭアデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）、５ｍＭアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、４０μＭＰ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’−五リン酸（ＡＰ５Ａ）、３０ｍＭ１−チオグリセロール、２０ｍＭＤ−グルコース、２ｍＭＮＡＤＰ、３Ｕ／ｍｌヘキソキナーゼ、２Ｕ／ｍｌグルコース−６−リン酸脱水素酵素、３０ｍＭクレアチンリン酸、１ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム、３Ｕ／ｍｌのダイアフォラーゼ、ＰＨ６．６〕を泳動したゲルに染み込ませて３７℃で３０分間インキュベートした。５％酢酸水溶液で反応を停止し、精製水で洗浄後、ゲルを乾燥させてコピーした。抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体だけではｍＣＫを阻害できないため、ｍＣＫもＣＫ−ＭＢとして測定されてしまうが、抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体と抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（実施例１）を併用して使用することによりＣＫ−ＭＢが特異的に測定されることが示唆された。
【００６３】
【実施例３】
ｍＣＫＩ−５７８を用いた筋肉疾患患者検体のＣＫ−ＭＢ測定
測定用酵素液（１４０ｍＭイミダゾール、２．８ｍＭＥＤＴＡ、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、２．８ｍＭアデノシン−５’−ニリン酸（ＡＤＰ）、７ｍＭアデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、１４μＭＰ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）五リン酸（ＡＰ５Ａ）、４２ｍＭ１−チオグリセロール、２８ｍＭＤ−グルコース、２ｍＭＮＡＤＰ、４．２Ｕ／ｍｌヘキソキナーゼ、２．１Ｕ／ｍｌＧ６ＰＤＨ、ｐＨ６．６）に抗ヒトＣＫ−Ｍ阻害抗体（ヤギ）１．０Ｕ／ｍｌ添加したもの（対照法）とさらに１Ｕ／ｍｌの抗ヒトｍＣＫ阻害抗体（実施例１）を添加したもの（本発明）を調製した。ＣＫ活性が３００Ｕ／Ｌ以上の筋肉疾患検体１５例について、血清２０μｌに、本発明の抗体を添加していない上記測定用酵素液を２５０μｌ加えて３７℃で恒温とした後、波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定した（Ａ）。さらに、これに基質液として１５０ｍＭクレアチンリン酸二ナトリウム１００μｌを添加し２〜３分後より吸光度変化を測定した（Ｂ）。ＣＫ−ＭＢ活性は以下の計算式（数１）により算出した。次に、同一検体について、本発明の抗体を添加した測定用酵素液を用いて同様に操作し、ＣＫ活性を測定した。
【００６４】
【数１】

２^※：ＣＫ−Ｂ活性をＣＫ−ＭＢ活性に変換するファクター
【００６５】
この結果、筋肉疾患患者検体は従来行われていた対照法では急性心筋梗塞患者検体でないにもかかわらず１０検体が２５Ｕ／Ｌ以上の活性を示した。しかしながら、本発明においてはすべての検体が２５Ｕ／Ｌ以下となった（表２）。
【００６６】
【表２】

【００６７】
以上の結果より、本発明はＣＫ−ＭＢの非特異反応を減少させることにより急性心筋梗塞に対する早期マーカーとして従来よりも感度が高くなることが期待される。
【００６８】
【発明の効果】
本発明の抗ヒトｍＣＫ阻害モノクローナル抗体を用いたＣＫアイソザイム分別定量法により、従来の測定方法では不可能であった、ＣＫ−ＭＢ、ｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢの選択的かつ正確な定量が可能となった。特にＣＫ−ＭＢは心筋梗塞のマーカーであり、本発明のＣＫ−ＭＢ測定法により急性心筋梗塞の重篤度や病態の把握が確度高く迅速に行えるので、急性心筋梗塞における早期診断のみならずその治療のモニターなどの臨床検査上、本発明は大きな意義を持つ。
また、ｍＣＫは肝疾患、悪性腫瘍、ロタウイルス腸炎などで増加することが知られており、本発明はこれら疾患の診断に有用である。
【００６９】
【図面の簡単な説明】
【図１】モノクローナル抗体ｍＣＫＩ−５７８の、サルコメラｍＣＫに対する阻害能を示す図面である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a monoclonal antibody that specifically inhibits the activity of mitochondrial creatine kinase (mCK). Used Creatine kinase MB isozyme (CK-MB )of Measuring method And measuring reagent About.
[0002]
[Prior art]
Human creatine kinase (CK) has three proteins with different genes. Two types of proteins derived from the cytoplasm (muscle type (M type) and brain type (B type) depending on localization) and the other are proteins derived from mitochondria. Cytoplasmic CK isozymes are composed of dimers composed of combinations of M and B types, and are classified into three types: CK-MM, CK-MB, and CK-BB. Mitochondrial CK (mCK) is a tissue-specific synthesis of ubiquitous ubiquitous Mia-CK and sarcomeric Mib-CK.
[0003]
In addition, mCK is very stable as an octamer, but in the presence of a transition state-like substance complex of creatine, MgADP and nitrate, it is rapidly dissociated into a dimer within a few minutes. In blood, it is said to gradually become a dimer with time (Karin Fritz-Wolf et al .: Nature, 381, 341-345, 1996).
[0004]
The mobility of electrophoresis of these isozymes is in the order of mCK (octamer), mCK (dimer) = CK-MM, CK-MB, CK-BB from the cathode side. Since mCK (dimer) shows the same mobility as CK-MM, it is measured electrophoretically as CK-MM in stored blood. In addition, although not an isozyme, there is a macro CK to which an immunoglobulin is bound. These can be confirmed from the zymogram by mobility, immune countercurrent method and the like.
[0005]
Quantification of CK and CK isozymes is widely performed in clinical examinations. Among them, CK-MB is important as a marker for myocardial infarction. Quantification of CK-MB is performed by EIA method, immunoinhibition method, electrophoresis method and the like. Although the EIA method can measure only CK-MB with high specificity, it requires a dedicated device and lacks speed. The electrophoresis method is complicated and requires skill, and it is necessary to obtain the abundance ratio of CK-MB with a densitometer before results are obtained. The immunoinhibition method has the advantage that it can be measured quickly and easily by an automatic analyzer, but has the disadvantage of lack of specificity.
[0006]
However, under the present circumstances, since an early diagnosis of acute myocardial infarction is required, an immunosuppression method that can be measured quickly and easily is widely used. This method comprises inactivating the M subunit using a specific antibody against the CK-M subunit (hereinafter sometimes referred to as an anti-CK-M inhibitory antibody), and measuring the remaining B subunit activity. In this method, CK-BB and mCK (dimer + octamer) are measured in addition to CK-MB. Of these, CK-BB is negligible because it is hardly present in the blood, and there are few diseases that CK-BB deviates from. However, mCK is contained in the serum of healthy individuals in almost the same amount as CK-MB (Yoko Toyoda et al .: Biophysical Chemistry, 41,244, 1997, Tadashi Hoshino et al .: CK isozyme fractionation for children. Study on transitions by age, biophysical chemistry, 42 supplements 2, 21, 1998), mCK deviation occurs in cell necrosis such as liver disease and malignant tumors, and the determination of results is confused. Recently, it has been reported that mCK deviation also occurs in rotavirus enteritis, neonatal asphyxia, etc. (Tadayoshi Hoshino et al .: Clinical Pathology, 46, General Meeting No., 57, 1998, Kane Kobo et al .: Clinical Pathology, 46, General Meeting No., 56, 1998).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The conventional immunoinhibition method measures CK-MB using an anti-CK-M inhibitory antibody and can measure it simply and quickly. However, this method also measures mCK at the same time, and accurate CK- MB measurement is not expected. However, by adding an antibody that inhibits mCK and an anti-CK-M inhibitory antibody, it is possible to avoid the influence of mCK and perform simple and accurate CK-MB measurement with high specificity. Therefore, the object of the present invention is to Simple and highly accurate CK-MB avoiding the influence of mCK in CK-MB measurement by immunosuppression It is to provide a measurement method.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive research to achieve the above-mentioned problems, for example, by antiserum obtained by immunizing a mammal with mCK, or by cell fusion between various immunized animal B lymphocytes and various myeloma cells. From the produced monoclonal antibody-producing hybridoma, an antibody that achieves the above object was obtained, and the present invention was completed.
[0009]
That is, the present invention
(1) A method for measuring the enzyme activity of creatine kinase (CK) MB isozyme (CK-MB) by an immunoinhibition method, wherein the monoclonal antibody and creatine kinase inhibit the enzyme activity of mitochondrial localized creatine kinase isozyme (mCK) Treating the specimen with an antibody that inhibits the enzymatic activity of the M (CK-M) subunit; There is no treatment that inhibits the enzyme activity of CK-M subunit and the enzyme activity of mCK. In the collected samples In Remain Creatine kinase B ( CK -B) subunit enzyme Measured CK measured activity -Enzyme of B subunit Activity To C KM B enzyme CK-MB activity measurement method characterized by determining activity,
(2) The monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK inhibits the enzyme activity of sarcomera mCK, but creatine kinase MB isozyme (CK-MB), creatine kinase MM isozyme (CK-MM) and creatine kinase BB isozyme ( (CK-BB activity measuring method according to (1), which does not inhibit the enzyme activity of CK-BB)
(3) The CK according to (1) or (2), wherein an antibody that inhibits the enzyme activity of the CK-M subunit and a monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK are allowed to act simultaneously in one step. -MB activity assay,
(4) The CK-MB according to (1) or (2), wherein an antibody that inhibits the enzyme activity of the CK-M subunit and a monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK are allowed to act in separate steps. Activity measurement method,
(5) Any of (1) to (4), wherein the monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK is a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited under accession number FERM BP-7133 CK-MB activity measurement method according to item 1,
(6) (1) Measurement of CK-MB activity used in the method for measuring CK-MB activity CK-MB comprising a reagent that inhibits the enzyme activity of creatine kinase M (CK-M) subunit and a monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mitochondrial localized creatine kinase isozyme (mCK) Activity measuring reagent,
(7) The monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK inhibits the enzyme activity of sarcomera mCK, but creatine kinase MB isozyme (CK-MB), creatine kinase MM isozyme (CK-MM) and creatine kinase BB isozyme ( The CK-MB activity measuring reagent according to (6), which does not inhibit the enzyme activity of (CK-BB),
(8) The monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK is a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited under accession number FERM BP-7133, described in (6) or (7) CK-MB activity measurement reagent,
I will provide a.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The anti-mCK enzyme activity inhibitory antibody of the present invention (sometimes referred to as an anti-mCK inhibitory antibody) is an antibody that specifically recognizes mCK protein and specifically inhibits its enzyme activity. The antibody of the present invention can be used for the fractional quantification method of the CK isozyme of the present invention, which will be described later. Any antibody can be used, and it can be an antibody that inhibits mCK by 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more. In many cases, mCK is contained in the sample in an amount of 5 to 20 U / L, and can be used without any clinical problems as long as it has an mCK inhibitory capacity of 80% or more. Even an antibody having a low mCK inhibitory ability can be used in combination with a plurality of antibodies, or when used together with a compound capable of inhibiting mCK, an inhibitory effect of 80% or more can be obtained substantially. It is included in the scope of the invention. The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
[0011]
Specifically, for example, the antibody of the present invention is a monoclonal antibody capable of specifically recognizing and inhibiting human mCK, and is an antibody derived from a mouse and named as immunoglobulin C (IgG) class mCKI-578. Yes, it is an antibody produced by a hybridoma deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on April 13, 2000, under the accession number FERM BP-7133. mCKI-578 can specifically inhibit mCK enzyme activity in a sample by 80% or more. MCKI-578 inhibits at least 90% of sarcomera mCK. The antibody of the present invention is not limited to this specific example, and any antibody that specifically recognizes human mCK and can specifically inhibit its enzyme activity may be used. The anti-mCK inhibitory antibody of the present invention may be used alone when used for the purpose of inhibiting mCK enzyme activity, or a plurality of anti-mCK inhibitory antibodies, for example, antibodies having different recognition sites may be used in appropriate combination. Is also possible.
[0012]
The animal species from which the antibody of the present invention is derived is not limited to mice, and examples thereof include rats, hamsters, rabbits, goats, horses, etc., but mice are preferred. The subclass of the antibody is not limited to IgG, but may be IgM.
[0013]
The antibody of the present invention can be obtained from a serum of an immunized animal using conventionally known immunological techniques, for example, using mCK as an antigen, preferably immunizing a mammal together with an adjuvant. A monoclonal antibody and a hybridoma producing the monoclonal antibody can be specifically prepared by fusing immunized animal-derived B lymphocytes with various myeloma cells by the method described below.
[0014]
As an antigen, human or mammalian mCK is used to obtain an antibody having specific affinity for mCK and inhibiting its enzyme activity, although it varies depending on the target specificity. In order to increase specificity, it is preferable to use a species-specific antigen. When obtaining an antibody having specific affinity for human mCK and specifically inhibiting its enzyme activity, human mCK is preferably used as the antigen. The antigen can be prepared by purifying mCK from myocardial tissue or blood, or can be obtained by a genetic engineering technique.
[0015]
As the sensitizing antigen, the purified mCK protein, or the mCK protein expressed by a genetic engineering technique based on the amino acid sequence or a partial peptide thereof is dissolved in an appropriate buffer such as a phosphate buffer (PBS), or A suspended one is used. What is necessary is just to prepare an antigen liquid to the density | concentration which contains about 50-500 microgram / mL of an antigen substance normally. In addition, when the antigenicity is low by itself, such as a peptide antigen, it is preferably used after being crosslinked with an appropriate carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin (KLH). Examples of animals immunized with the antigen include mice, rats, hamsters, horses, goats, rabbits and the like. Preferred are mice, more preferred are BALB / c mice.
[0016]
At this time, in order to increase the responsiveness of the immunized animal to the antigen, it is preferable to administer the antigen solution mixed with an adjuvant. Adjuvants used here include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), Ribi (MPL), Ribi (TDM), Ribi (MPL + TDM). Examples include pertussis vaccine (Bordetella pertussis vaccine), muramyl dipeptide (MDP), aluminum adjuvant (ALUM), and combinations thereof, but a combination using FCA at the first immunization and FIA or Ribi adjuvant at the boost is particularly preferable. .
[0017]
The immunization method can appropriately change the injection site, schedule, etc. depending on the type of antigen used and the presence or absence of adjuvant mixing. For example, when a mouse is used as the immunized animal, an adjuvant mixed antigen solution 0.05 -1 mL (10 to 200 μg of antigenic substance) is injected intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly, or (tail) intravenously, and boosted 1 to 4 times every about 4 to 21 days from the first immunization, and further about 1 to 4 Final immunization is performed after a week. When administering the antigen solution without using an adjuvant, the antigen amount may be increased and injected intraperitoneally. The antibody titer is examined by collecting blood about 5 to 6 days after the booster immunization. The antibody titer can be measured by a conventional method according to the antibody titer assay described below. About 3 to 5 days after the final immunization, spleen cells are separated from the immunized animal to obtain antibody-producing cells.
[0018]
As myeloma cells, those derived from mice, rats, humans and the like are used. For example, cell line myeloma cells such as mouse myeloma P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, SP2 / o-Ag14, P3X63-Ag8.653 are exemplified. Some myeloma cells produce an immunoglobulin light chain, and if this is used as a fusion target, the immunoglobulin heavy chain produced by the antibody-producing cell and this light chain may bind randomly. Preferably, myeloma cells that do not produce an immunoglobulin light chain, such as P3X63-Ag8 · 653 and SP2 / o-Ag14, are preferably used. The antibody-producing cells and the myeloma cells are preferably derived from the same species, particularly the same strain. Myeloma cells are maintained by cryopreservation or by subculture in a common medium supplemented with horse, rabbit or fetal calf serum. For cell fusion, cells in the logarithmic growth phase are preferably used.
[0019]
Examples of the method for producing a hybridoma by fusing antibody-producing cells and myeloma cells include a method using polyethylene glycol (PEG), a method using Sendai virus, and a method using an electrofusion device. For example, in the case of the PEG method, splenocytes and myeloma cells are placed in an appropriate medium or buffer containing about 30 to 60% PEG (average molecular weight 1,000 to 6,000), 1 to 10: 1, preferably 5 The suspension may be suspended at a mixing ratio of 10 to 10: 1 and allowed to react for about 30 seconds to 3 minutes under conditions of a temperature of about 25 to 37 ° C. and a pH of 6 to 8. After completion of the reaction, the cells are washed, the PEG solution is removed, the cells are resuspended in a medium, seeded in a microtiter plate, and the culture is continued.
[0020]
Cells after the fusion operation are cultured in a selective medium to select hybridomas. The selection medium is a medium in which the parent cell line can be killed and only the fused cells can grow, and usually a hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium is used. Selection of hybridoma is usually started by exchanging a part of the medium, preferably about half of the medium, with the selective medium 1 to 7 days after the fusion operation, and further cultivating while repeating the same medium exchange every few days. By doing. The well where the hybridoma colony is growing is confirmed by microscopic observation.
[0021]
In order to know whether the growing hybridoma is producing the desired antibody, the culture supernatant may be collected and an antibody titer assay may be performed by a method known per se. For example, secondary antibody (antiglobulin antibody, anti-IgG antibody, anti-globulin antibody, anti-globulin antibody, anti-IgG antibody, anti-globulin antibody, anti-IgG, etc.) labeled with a fluorescent substance, an enzyme, or a radioisotope (RI) is reacted. If an IgM antibody or the like is reacted, the antibody produced in the supernatant can be detected, and the antibody titer can be measured. When the antigen is an enzyme or the like, an antibody can be detected and an antibody titer can be measured based on the presence or absence of enzyme inhibition activity by reacting the enzyme with the supernatant and then reacting with an appropriate substrate. Thus, the culture supernatant of each well is screened to obtain a hybridoma producing an appropriate antibody.
[0022]
Further, single clones are separated by a limiting dilution method, a soft agar method, or a method using a fluorescence excitation cell sorter. For example, in the case of the limiting dilution method, a hybridoma clone producing a target monoclonal antibody can be isolated by serially diluting a hybridoma colony with a medium so as to be about 1 cell / well. The obtained antibody-producing hybridoma clone is frozen in the presence of about 10% (v / v) dimethyl sulfoxide (DMSO) or a lyoprotectant such as glycerin and stored at −70 to −196 ° C. Can be stored. The cells are used after being rapidly thawed in a constant temperature bath at around 37 ° C. It is desirable to use after thoroughly washing so that the cytotoxicity of the cryoprotectant does not remain.
[0023]
In order to examine the immunoglobulin subclass of the antibody produced by the hybridoma, the hybridoma is cultured under general conditions, and the antibody secreted in the culture supernatant is obtained using a commercially available antibody class / subclass determination kit or the like. You can know by analyzing.
[0024]
The method for obtaining the monoclonal antibody from the hybridoma is appropriately selected depending on the required amount and the properties of the hybridoma. For example, a method of obtaining from mouse ascites transplanted with the hybridoma, a method of obtaining from the culture supernatant by cell culture, and the like are exemplified. A hybridoma capable of growing in the mouse abdominal cavity can obtain a high concentration of monoclonal antibody of several mg / mL from ascites. Hybridomas that cannot grow in vivo are obtained from the culture supernatant of the cell culture. Acquiring monoclonal antibodies by cell culture has the advantage that antibody production is lower than in vivo, but there is little contamination with immunoglobulins and other contaminants contained in the mouse abdominal cavity, and purification is easy.
[0025]
When the antibody is obtained from the abdominal cavity of a mouse transplanted with a hybridoma, for example, into the abdominal cavity of a BALB / c mouse to which a substance having an immunosuppressive action such as pristane (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane) has been administered in advance. Hybridoma (about 10 ⁶ Ascites collected after about 1 to 3 weeks is collected. In the case of heterologous hybridomas (for example, mice and rats), it is preferable to use nude mice or radiation-treated mice.
[0026]
On the other hand, when the antibody is obtained from the cell culture supernatant, for example, in addition to the stationary culture method used for cell maintenance, the hybridoma is cultured by using a culture method such as a high-density culture method or a spinner flask culture method. A culture supernatant containing is obtained. The serum contained in the culture solution contains other contaminants such as antibodies and albumin, and antibody purification is often complicated, so it is desirable to reduce the addition to the culture solution. Alternatively, it is more preferable that the hybridoma is acclimated to a serum-free medium by a conventional method and cultured using the serum-free medium, since antibody purification becomes easy.
[0027]
Monoclonal antibody purification from ascites and culture supernatant is performed by conventional fractionation by salting out using ammonium sulfate or sodium sulfate, polyethylene glycol fractionation method, ethanol fractionation method, DEAE ion exchange. This can be easily achieved by applying a chromatography method, a gel filtration method, or the like.
[0028]
Furthermore, when the monoclonal antibody is mouse IgG, it can be easily purified by affinity chromatography using a protein A-binding simple substance or an anti-mouse immunoglobulin binding simple substance.
[0029]
The monoclonal antibody of the present invention thus obtained can specifically inhibit mCK enzyme activity in the sample. Therefore, by using this antibody, mCK in the sample can be selectively eliminated, and CK, which is a creatine kinase (CK) isozyme, can be used together with an antibody that selectively eliminates the CK-M subunit. -MB, CK-MM, CK-BB and mCK can be separately quantified.
The present invention provides a differential quantification method for creatine kinase (CK) isozyme, characterized in that mCK is eliminated by treatment with the monoclonal antibody of the present invention. The anti-mCK enzyme activity-inhibiting monoclonal antibody of the present invention may be used alone, or a plurality of anti-mCK inhibitory antibodies, for example, antibodies having different recognition sites may be used in appropriate combination.
[0030]
The basic principle of the CK isozyme measurement method uses a method of selectively measuring the enzyme activity of CK isozyme by an immunoinhibition method. Generally, for example, the activity measurement of CK-MB by this method is performed as follows. That is, using an activity-inhibiting antibody specific for human CK-M subunit and inhibiting the activity of M subunit in CK-MM and MB (MB inhibits about half of the activity) in the sample, CK-MB activity is measured by doubling the remaining B subunit activity. The measurement of CK-MB activity is carried out by coupling ATP generated by the left-hand reaction of the following reaction formula (Chemical Formula 1) to a conjugate consisting of hexokinase (HK) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH). NADPH is produced by the reaction, and quantitative change of NADPH is quantified (Chemical Formula 2).
[0031]
[Chemical 1]

[0032]
[Chemical formula 2]

[0033]
In the conventional method, since CK-MB was measured using only an anti-CK-M inhibitory antibody, mCK was also measured at the same time, and accurate measurement of CK-MB activity could not be expected. In a differential quantification method, the enzymatic activity of creatine kinase M (CK-M) subunit and mitochondrial localized creatine kinase isozyme (mCK) is determined by treating a sample with an inhibitory antibody against CK-M subunit and an inhibitory antibody against mCK. If the remaining CK activity is measured after the selective elimination process, a sufficiently accurate CK-MB measurement can be carried out simply and quickly in practice.
[0034]
In the CK-MB measurement method of the present invention, the anti-CK-M inhibitory antibody and the anti-mCK inhibitory antibody of the present invention may be allowed to act in the same step, for example, in an enzyme solution for measurement, or in separate steps. For example, the anti-mCK inhibitory antibody of the present invention may be added to the substrate solution, and the anti-CK-M inhibitory antibody may be allowed to act in the enzyme solution for measurement.
When the isozyme for measuring the activity is CK-MB, it is preferable that the measurement is preferably performed by simultaneously treating the sample with the anti-CK-M inhibitory antibody and the anti-mCK inhibitory antibody obtained in the present invention.
[0035]
Furthermore, the present invention provides a method for measuring mCK, characterized by selectively eliminating the enzyme activity of mCK by treating the sample with an anti-mCK inhibitory antibody. That is, the mCK measurement method of the present invention was obtained by measuring creatine kinase activity containing mCK in a sample and measuring creatine kinase activity other than mCK using the anti-mCK inhibitory antibody of the present invention. Only mCK activity can be determined from the difference between the two measurements. At this time, measurement of creatine kinase activity including mCK in the sample and measurement of creatine kinase activity other than mCK using the anti-mCK inhibitory antibody of the present invention include measurement including anti-CK-M inhibitory antibody and the like. It may be performed using a reagent for measurement, or may be performed using a reagent for measurement that does not contain. There is no problem as long as the measurement reagent used in the two measurements has the same conditions with respect to the inclusion of the anti-CK-M inhibitory antibody.
[0036]
For example, the total CK activity in a sample is measured, and after the measurement, the anti-mCK inhibitory antibody of the present invention is added and the measurement is performed again. The mCK activity can be determined from the difference between the two measured values obtained. At this time, the sample was first treated with an anti-CK-M inhibitory antibody to inhibit CK-MM activity and about half the activity of CK-MB, and then measured once to determine 1 / 2CK-MB + mCK enzyme activity. Measure (measured value A), add the anti-mCK inhibitory antibody of the present invention after measurement, measure again, and measure 1 / 2CK-MB enzyme activity (measured value B). -MB activity can be measured easily and rapidly simultaneously using the same sample. That is, the CK-MB activity can be obtained by doubling the measured value B, and the mCK activity can be obtained by the difference between the measured value A and the measured value B.
[0037]
In addition, for example, measurement of creatine kinase activity including mCK in a sample and measurement of creatine kinase activity other than mCK in a sample can be performed separately, and mCK activity can be obtained from the difference between the two obtained measurement values. . That is, creatine kinase activity including mCK in a sample is measured using, for example, a total CK activity measuring reagent (kit A), and an anti-mCK inhibitory antibody prepared separately for creatine kinase activity other than mCK in the sample is added to kit A Measurement is performed using the kit B, and mCK activity can be obtained from the difference between the two obtained measurement values. At this time, if a CK-MB activity measurement reagent to which an anti-CK-M inhibitory antibody is added is used as kit A, not only mCK activity but also CK-MB activity can be determined.
[0038]
Furthermore, in the differential quantification method of CK isozyme of the present invention, creatine kinase activity other than mCK in a sample is measured using an anti-mCK inhibitory antibody (measured value C), and an anti-CK-M inhibitory antibody and an anti-mCK inhibitory antibody are measured. CK activity other than mCK, CK-MM, and 1 / 2CK-MB (measured value D), and the difference between measured value C and twice the measured value D is CK-MM. Activity can be determined.
[0039]
The sample measured by the method of the present invention is not particularly limited, but can be applied to a method or sample in which CK isozyme is usually measured in the field of clinical examination.
[0040]
The present invention also provides a reagent for measuring CK isozyme activity, which comprises a kit or a single product of reagents necessary for the CK isozyme measurement method, CK-MB measurement method, and mCK measurement method of the present invention. The reagent for measuring CK isozyme activity of the present invention comprises the anti-mCK enzyme activity-inhibiting monoclonal antibody of the present invention in the reagent or is constituted as a single product. As the reagent here, a reagent for measuring total CK activity or a reagent for measuring CK-MB used for biochemical diagnosis of acute myocardial infarction can be used as a part thereof, but is not limited thereto. .
[0041]
【Example】
The following examples are illustrative of the invention but are not intended to limit the scope of the invention.
[Example 1]
Production of hybridomas producing monoclonal antibodies
(1) Preparation of immunogen (antigen)
Human mCK uses human myocardial tissue, and Robert Roberts et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 255, 2870-2877, 1980, and Ann Merz Grace et al., The Journal of Biol. Purified by the method described in 1983. About 10 mg of purified human mCK was obtained from 400 g of human myocardium. This was stored frozen until use.
[0042]
(2) Immunized animals
5-8 week old inbred BALB / c mice females were bred using standard pellets in an animal breeding chamber (23 ± 1 ° C., humidity 70%) and optionally fed with water.
[0043]
(3) Immunization method
Using the purified human mCK prepared in (1) above as an antigen, it was prepared in PBS to be 100 μg / 0.5 mL, and the same amount (0.5 mL) of Freund's complete adjuvant (Difco) Product) was mixed and emulsified. This emulsified antigen was administered into the peritoneal cavity of 4 female BALB / c mice at 5 weeks of age, 200 μL per mouse. Further, every 2 weeks, the above antigen prepared to 100 μg / mL with Ribi adjuvant was administered 4 times, 20 μg per mouse. Further, one month later, the above antigen prepared to 100 μg / mL with Ribi adjuvant was boosted in the same manner, and then the antibody titer of the mice was measured. Mice with high antibody titers were further immunized two weeks later by preparing purified human mCK as an antigen to 100 μg / mL with PBS and injecting from the mouse tail vein.
[0044]
(4) Antibody titer measurement (antibody titer assay)
In measuring the antibody titer, a small amount of whole blood was periodically collected from the mouse fundus retina, and the serum was separated and stored frozen until just before use. From the start of immunization, the antibody titer against human mCK was examined by the mCK enzyme activity inhibition antibody method.
[0045]
That is, 25 μL of an antibody solution prepared by diluting the antiserum of each mouse 10 to 1,000 times with PBS and 25 μL of mCK enzyme solution (200 U / L) were added to a 96-well microtiter plate and reacted at room temperature for 10 minutes. Thereafter, 100 μL of enzyme reagent [100 mM imidazole, 2 mM EDTA, 10 mM magnesium acetate, 2 mM adenosine-5′-niphosphate (ADP), 5 mM adenosine-5′-monophosphate (AMP), 40 μM P1, P5-di (adenosine) -5 ′) pentaphosphate (AP5A), 30 mM 1-thioglycerol, 28 mM D-glucose, 2 mM NADP, 3 U / mL HK, 2 U / mL glucose-6-phosphate dehydrogenase, 30 mM creatine phosphate disodium, 0.3 mg / mL nitro blue tetrazolium chloride, 0.6 U / m Dia follower hydrolase, pH 6.6] was added to 96-well microtiter plates, and reacted at 37 ° C. 10 min. Subsequently, the absorbance at a wavelength of 570 nm was measured using a reagent blind test as a control. As an antibody negative control, non-immune mouse serum was added instead of antiserum, and used as a negative control.
[0046]
If the mCK enzyme activity inhibition specific antibody is produced in the blood from the obtained absorbance, the enzyme activity of mCK is inhibited, the substrate reaction is suppressed, and the amount of change in absorbance is reduced. The existence was able to be identified.
[0047]
(5) Examination of reaction specificity
The obtained anti-mCK enzyme activity-inhibiting polyclonal antibody was further prepared by preparing an enzyme solution in which human CK-MB or human CK-MM was added to the optimal concentration instead of human mCK, and the same method as in (4) above. Inhibition of enzyme activity against each CK isozyme was confirmed.
[0048]
(6) Cell fusion
Three days after the final immunization, BALB / c mice were splenectomized, and the splenocytes were suspended in the EMEM culture solution to prepare a suspension of splenocytes. Subsequently, the spleen cells were washed 4 times with EMEM culture solution, and the number of cells was calculated to be 7.0 × 10 ⁸ Individual splenocytes were obtained.
[0049]
For cell fusion, 8-aza-6-oxy-8azapurine-resistant BALB / c mouse-derived myeloma cell line (P3X63-Ag8.653, hereinafter referred to as X63 cells) was used as a parent cell line. .
[0050]
X63 cells were subcultured in RPMI-1640 culture medium (20 μg / mL, containing 8-azaguanine) containing 10% of inactivated fetal calf serum (FCS). From 3 days before cell fusion, the cells were further cultured in RPMI-1640 culture medium containing 10% FCS and not containing 8-azaguanine, and cells in the logarithmic growth phase were used. X63 cells were washed 3 times with RPMI-1640 culture solution, then the number of cells was calculated and 7 × 10 7 ⁷ Individual live cells were obtained.
[0051]
In RPMI-1640 culture solution, polyethylene glycol-4000 is dissolved to a concentration of 50 (W / V) and mixed so that the ratio of spleen cells to X63 cells is 10: 1. Co-authored by Milstein: Cell fusion was performed according to the methods of Nature (Nature 256, 495-497, 1975) and European Journal of Immunology (Eur. J. Immunol. 6, 511-519, 1976). .
[0052]
Thereafter, 1 × 10 3 was added to the RPMI-1640 culture medium supplemented with 10% FCS. ^-4 M hypoxanthine, 4 × 10 ^-7 M aminopterin and 1.6 × 10 ^-5 In a HAT selection medium containing M 3 thymidine (HAT), splenocytes were 2.0 × 10 ⁶ It was made to float so that it might become a piece / mL. Next, 50 μL of this cell suspension was dispensed into each well of a 96-well microtiter plate, and then CO 2 was added. ₂ CO in temperature 37 ° C, humidity 95%, 8% in a sterile incubator ₂ Incubation was performed in an atmosphere. Add 1 drop of HAT selection medium to each well on day 1 and 2 after the start of culture, and add 2 drops of HAT selection medium to each well on days 7 and 9 after the start of culture. Culture was performed. Thereafter, the cells were grown in a culture solution containing no HAT, and after about 10 days to 2 weeks, hybridomas producing the target monoclonal antibody were selected by the screening method described below.
[0053]
(7) Screening
Using the hybridoma culture supernatant, the method was carried out by inhibition of mCK enzyme activity.
[0054]
Specifically, 25 μL of hybridoma culture supernatant and 25 μL of mCK enzyme solution (200 U / L) were added to a 96-well microtiter plate and reacted at room temperature for 10 minutes, and then 100 μL of enzyme reagent [100 mM imidazole, 2 mM EDTA, 10 mM magnesium acetate. 2 mM adenosine-5′-niphosphate (ADP), 5 mM adenosine-5′-monophosphate (AMP), 40 μM P1, P5-di (adenosine-5 ′) pentaphosphate (AP5A), 30 mM 1-thioglycerol 28 mM D-glucose, 2 mM NADP, 3 U / mL HK, 2 U / mL glucose-6-phosphate dehydrogenase, 30 mM creatine phosphate disodium, 0.3 mg / mL nitroblue tetrazolium chloride, 0.6 U / mL Dia Forase, pH 6.6] In addition to the microtiter plate and allowed to react for 10 minutes at 37 ° C.. Subsequently, the absorbance at a wavelength of 570 nm was measured using a reagent blind test as a control. As an antibody negative control, only the culture broth was added instead of the hybridoma culture supernatant to obtain a negative control.
[0055]
From the obtained absorbance, if an antibody that inhibits the enzyme activity of mCK is present, the substrate reaction is suppressed and the amount of change in absorbance is reduced. Therefore, the hybridoma producing the inhibitory antibody against mCK should be identified. I was able to.
[0056]
The obtained anti-human mCK enzyme activity inhibition monoclonal antibody was further confirmed to inhibit enzyme activity against each enzyme by the same method as above using human CK-MB or human CK-MM instead of human mCK.
According to the screening method of (7) above, 2496 wells of a 96-well microtiter plate in which hybridoma growth was observed were screened, and the presence of hybridomas producing monoclonal antibodies that inhibit mCK enzyme activity was observed in 10 wells. It was.
[0057]
(8) Establishment of monoclonal antibody-producing hybridoma strain (cloning)
The hybridoma in 10 wells obtained by the above screening (7) was cloned by the limiting dilution method. As a result, among the hybridomas in the 10 wells, one clone of a hybridoma cell that stably produces a monoclonal antibody that inhibits mCK enzyme activity was selected. This hybridoma was established as an established strain and deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry under the accession number FERM BP-7133.
[0058]
(9) Identification of mouse immunoglobulin subclass
The mouse immunoglobulin subclass of the monoclonal antibody produced by the hybridoma clone (FERM BP-7133) obtained as a single clone by the above cloning was obtained using a monoabtyping kit (MONOAb typing kit) manufactured by Zymed. Identified. As a result, it was found that the monoclonal antibody (mCKI-578) produced by FERM BP-7133 was immunoglobulin G (IgG1, κ).
[0059]
(10) Specificity of mCKI-578 for human CK isozyme
In order to confirm the specificity of the obtained antibody mCKI-578 for human CK isozyme, human mCK, human CK-MM, human CK-BB or human CK-MB was used, and each was performed in the same manner as in (7) above. Inhibition of enzyme activity against isozymes was confirmed.
The results are shown in Table 1. mCKI-578 inhibited the enzyme activity of mCK by about 90%, but did not inhibit the enzyme activities of CK-MM, CK-BB, and CK-MB. Therefore, it was confirmed that mCKI-578 is an antibody that specifically recognizes only mCK and selectively inhibits mCK enzyme activity. On the other hand, CK-1773 produced from another hybridoma clone prepared in the same manner as FERM BP-7133 did not inhibit any of the CK isozymes.
[0060]
[Table 1]
Specificity of monoclonal antibody mCKI-578

[0061]
(11) Inhibitory activity of mCKI-578 on sarcomera mCK
When the inhibitory ability of mCKI-578 on sarcomera mCK was examined by the same method as in (7) above, inhibition of about 98% was observed as shown in FIG.
[0062]
[Example 2]
CK-MB measurement using mCKI-578 obtained in Example 1
10 μl each of a healthy human sample or a human mCK positive sample added with 100 μl of physiological saline, an anti-human CK-M inhibitory antibody (goat), an anti-human mCK inhibitory antibody (Example 1) or a mixture of two antibodies is added Electrophoresis was performed. Electrophoresis was performed for 40 minutes using a Pol E film system (agarose electrophoresis). After electrophoresis, CK coloring reagent [100 mM imidazole, 2 mM EDTA, 10 mM magnesium acetate, 2 mM adenosine-5′-diphosphate (ADP), 5 mM adenosine-5′-monophosphate (AMP), 40 μM P1, P5-di ( Adenosine-5′-pentaphosphate (AP5A), 30 mM 1-thioglycerol, 20 mM D-glucose, 2 mM NADP, 3 U / ml hexokinase, 2 U / ml glucose-6-phosphate dehydrogenase, 30 mM creatine phosphate, 1 mg / Ml nitroblue tetrazolium, 3U / ml diaphorase, PH 6.6] and soaked for 30 minutes at 37 ° C. The reaction was stopped with 5% aqueous acetic acid and washed with purified water. The gel was dried and copied.An anti-human CK-M inhibitor antibody alone blocked mCK. MCK is also measured as CK-MB because it cannot be harmed, but CK-MB is specifically measured by using an anti-human CK-M inhibitor antibody and an anti-human mCK inhibitor antibody (Example 1) in combination. It was suggested that
[0063]
[Example 3]
CK-MB measurement of muscular disease patient sample using mCKI-578
Enzyme solution for measurement (140 mM imidazole, 2.8 mM EDTA, 14 mM magnesium acetate, 2.8 mM adenosine-5′-niphosphate (ADP), 7 mM adenosine-5′-monophosphate (AMP), 14 μM P1, P5-di (Adenosine-5 ′) pentaphosphate (AP5A), 42 mM 1-thioglycerol, 28 mM D-glucose, 2 mM NADP, 4.2 U / ml hexokinase, 2.1 U / ml G6PDH, pH 6.6) and anti-human CK− M inhibitory antibody (goat) added with 1.0 U / ml (control method) and 1 U / ml anti-human mCK inhibitory antibody (Example 1) added (invention) were prepared. For 15 muscular disease specimens with a CK activity of 300 U / L or more, 250 μl of the above-described enzyme solution to which the antibody of the present invention was not added was added to 20 μl of serum, and the temperature was kept constant at 37 ° C., and then the absorbance at a wavelength of 340 nm was measured. Measured (A). Further, 100 μl of 150 mM creatine phosphate disodium was added as a substrate solution, and the change in absorbance was measured after 2 to 3 minutes (B). The CK-MB activity was calculated by the following calculation formula (Formula 1). Next, the CK activity was measured for the same specimen in the same manner using the measurement enzyme solution to which the antibody of the present invention was added.
[0064]
[Expression 1]

2 ^* : Factor that converts CK-B activity into CK-MB activity
[0065]
As a result, 10 specimens showed activity of 25 U / L or more even though the specimens of patients with muscle diseases were not specimens of patients with acute myocardial infarction in the conventional control method. However, in the present invention, all specimens were 25 U / L or less (Table 2).
[0066]
[Table 2]

[0067]
From the above results, the present invention is expected to be more sensitive than the prior art as an early marker for acute myocardial infarction by reducing the non-specific reaction of CK-MB.
[0068]
【Effect of the invention】
Selective and accurate quantification of CK-MB, mCK, CK-MM, and CK-BB, which was impossible with the conventional measurement method, by the CK isozyme fractionation quantification method using the anti-human mCK inhibition monoclonal antibody of the present invention. Became possible. In particular, CK-MB is a marker of myocardial infarction, and the CK-MB measurement method of the present invention can accurately and quickly grasp the severity and pathology of acute myocardial infarction. The present invention has great significance in clinical tests such as treatment monitoring.
Further, mCK is known to increase in liver diseases, malignant tumors, rotavirus enteritis and the like, and the present invention is useful for diagnosis of these diseases.
[0069]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a drawing showing the inhibitory ability of monoclonal antibody mCKI-578 against sarcomera mCK.

Claims

A method for measuring the enzyme activity of creatine kinase (CK) MB isozyme (CK-MB) by an immune inhibition method, comprising a monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mitochondrial localized creatine kinase isozyme (mCK) and creatine kinase M (CK -M) processing the sample using antibodies that inhibit the enzymatic activity of the subunit, creatine kinase B remaining in the specimen processing is such to inhibit the enzymatic activity and mCK enzyme activity of CK-M subunit ( CK -B) measuring the enzymatic activity of the subunit, CK-MB activity measurement method characterized by determining the enzymatic activity of C K-M B from the measured CK -B subunit of the enzyme activity.

The monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK inhibits the enzyme activity of sarcomera mCK. The method for measuring CK-MB activity according to claim 1, wherein the enzyme activity is not inhibited.

The method for measuring CK-MB activity according to claim 1 or 2, wherein an antibody that inhibits the enzyme activity of the CK-M subunit and a monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK are allowed to act simultaneously in one step. .

The method for measuring CK-MB activity according to claim 1 or 2, wherein an antibody that inhibits the enzyme activity of CK-M subunit and a monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK are allowed to act in separate steps.

5. The monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK is a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited under accession number FERM BP-7133. 5. CK-MB activity measurement method.

A reagent for measuring CK-MB activity used in the method for measuring CK-MB activity according to claim 1, wherein the antibody inhibits the enzyme activity of creatine kinase M (CK-M) subunit and mitochondrial localized creatine kinase isozyme (mCK) A reagent for measuring CK-MB activity, which comprises a monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of.

The monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK inhibits the enzyme activity of sarcomera mCK. The reagent for measuring CK-MB activity according to claim 6, which does not inhibit the enzyme activity of

The CK-MB according to claim 6 or 7, wherein the monoclonal antibody that inhibits the enzyme activity of mCK is a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited under accession number FERM BP-7133. Activity measuring reagent.