【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、ヒト心筋ミオシン重鎖のアイソザイ
ムに対して特異性を有する新規な単一クローン抗
体に関するものである。
近年、特異性の高い抗体を大量に得る方法とし
て、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合し、ハイブ
リドーマ（融合細胞）を作製し、これを培養する
ことにより単一クローン抗体を産生する方法（ミ
ルシユタインら、Nature.Vol.256，p495（1975））
が知られ、多数の単一クローン抗体が取得されて
いる。
一方、筋研究の分野において筋蛋白質に対する
抗体を利用することは以前から行われている。筋
は、横紋筋と平滑筋の２つに大別され、さらに横
紋筋は心筋と骨格金に、骨格金では速筋と遅筋に
分けることができる。これらは筋の主要構成成分
であるミオシン分子の抗原性の差によつても免疫
化学的に区別することが報告されている（真崎
ら、J.Bio.Chem.、Vol.76、p441（1974））。
最近、心筋に関しても、ATPase活性の高い
V1（α型）とATPase活性の低いV3（β型）の２
つのアイソザイムのあることが明らかになつた
（矢崎ら、Circulation Research，Vol.35、p15
（1974）、ホーら、J.Mol.Cell.Cardiol.Vol.10、
p1053（1978））。一般にヒト、ウシ、イヌなどの
動物では、心房筋はすべてV1（α型）であり、心
室筋はほとんどV3（β型）と考えられる。したが
つて、α型、β型を識別できるような単一クロー
ン抗体を作ることができれば、心房筋と心室筋を
ビオチン−アビジン系染色方法などにより染め分
けることができる。さらに、これらの抗体を放射
性同位元素でラベルして心筋梗塞の部位別診断に
用いることもできる。
クラークらは、ニワトリおよびウサギ心筋ミオ
シンをマウスおよびラツトに免疫し、心筋ミオシ
ン重鎖と反応する単一クローン抗体を取得してい
る（Biochem.Biophys.Res.Commun.Vol.95、
p1680（1980））。このうちの１株はニワトリの心
筋に得意的でヒト心筋とは反応しない。他の２株
は、ニワトリ、ウサギ、ラツトの心筋と反応し、
ヒト心筋とも反応すると述べているが、骨格筋と
の反応も見られ、心筋に対して得意的なものでは
ない。また、ヒトの心筋ミオシンのα型とβ型を
識別できるものではない。
さらに、クラークらは、ニワトリ心筋ミオシン
またはウサギ心筋ミオシンで免疫して心筋ミオシ
ン重鎖V1型および心筋ミオシン重鎖V3型に対す
る単一クローン抗体を得ている（J.Biol.Chem.，
Vol.257、p5449（1982））。しかしながら、これら
の抗体は、互いのアイソザイムにも交差反応性を
示し、またヒト心筋ミオシンに対する特異性も明
らかではない。
本発明は、このような技術背景のもとに完成さ
れたものであり、ヒト心筋ミオシン重鎖のアイソ
ザイムに対して特異性を有する単一クローン抗体
を提供するものである。さらに具体的には、ヒト
心筋ミオシン重鎖α型に対して特異性を有し、ヒ
ト心筋ミオシン重鎖β型およびヒト骨格筋を実質
的に認識しないIgGクラスに属する単一クローン
抗体、ならびにヒト心筋ミオシン重鎖β型に対し
て特異性を有し、ヒト心筋ミオシン重鎖α型およ
びヒト骨格筋を実質的に認識しないIgGクラスに
属する単一クローン抗体を提供するものである。
本発明抗体は、心筋ミオシンのアイソザイムを
識別し、ヒト骨格筋を実質的に認識しない特性を
有する点で従来公知の抗体と区別される。
本発明抗体の調整法、調整形態については特に
限定されず、目的に応じて適宜に選択されるべき
である。本発明抗体を産生するハイブリドーマは
一般の細胞融合法を応用して得ることができる。
このような細胞融合法について説明すれば次のと
おりである。
抗体産生細胞の調製
抗体産生細胞の調製は、ヒト心房筋ミオシン
（α型）、ヒト心室筋ミオシン（β型）、あるい
はウシ、ウマ、ブタなどから調製された免疫化
学的にヒト心筋ミオシンα型もしくはβ型と同
等の心筋ミオシンをマウス、ラツト、ウサギ、
ヒツジ、ウマ、ウシなどの異種動物に免疫し、
その免疫を獲得した脾細胞、胸腺細胞、リンパ
節細胞および／または末梢血細胞の抗体産生細
胞を取得することにより行う。
ミエマローマ細胞の調製
ミエローマ細胞としては、マウス、ラツト、
ウサギ、ヒトなどの種々の動物の細胞株を適用
できる。使用する細胞株は、好ましくは薬剤抵
抗性のものであり、未融合の状態では選択培地
で生存できず、融合した状態で生存できる性質
を有するものであることが好ましい。最も普通
に用いられるのは、８−アザクアニン抵抗性の
細胞株であり、これはヒポキサンチン・ホスホ
リボシルトランスフエラーゼ（hypoxanthine
phosphoribosyl transferase）を欠損し、ヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジン
（HAT）培地に生育できない性質を有する。
また、いわゆる「非分泌型」の細胞株であるこ
とが好ましい。このような細胞株の具体例とし
ては、マウスミエローマ・MOPC−21ライン
由来のP3／X63−Ag8U1（P3U1）、P3／X63−
Ag8・６・５・３（X63.6・５・３）、P3／NSI
−１−Ag4−１（NS−１）、Sp210−Ag14
（SP2）ラツトミエローマ210・RCY3Ag1・
２・３（Y3・Ag1.2.3）、ヒトミエローマＵ−
266−AR1、GM1500などを挙げることができ
る。
細胞融合
細胞融合は、イーグル最小基本培地
（MEM）、RPMI 1640などの動物細胞培養用培
地中で107〜108のミエローマ細胞と抗体産生細
胞を混合比１：４〜10で混合して行う。融合促
進剤としては平均分子量1000〜6000のポリエチ
レングリコール（PEG）をはじめ、ポリビニ
ルアルコール、ウイルスなどが使用される。
選択培地におけるハイブリドーマの選別
細胞融合処理後の細胞からハイブリドーマを
選別するには選択培地における選択的増殖によ
り行う。たとえば、細胞を15％ウシ胎児血清含
有RPMI1640培地などで適当に希釈し、マイク
ロタイタープレート上に105〜106／ウエル程度
にまき、各ウエルに選択培地（たとえば、
HAT培地など）を加え、以後適当に選択培地
を交換して培養する。たとえばミエローマ細胞
として８−アザグアニン抵抗性株、選択培地と
してHAT培地を用いれば、末融合のミエロー
マ細胞は培養10日目ぐらいまでに死滅し、また
正常細胞である抵抗産生細胞もinvitroでは長
期間生育できない。したがつて、培養10〜14日
目から生育してくる細胞はすべてハイブリドー
マとなる。
抗ヒト心筋ミオシン重鎖α型抗体および抗ヒ
ト心筋ミオシン重鎖β型抗体産生ハイブリドー
マの検索
抗ヒト心筋ミオシン重鎖α型抗体産生ハイブ
リドーマおよび抗ヒト心筋ミオシン重鎖β型抗
体産生ハイブリドーマの検索は、酸素免疫測定
法（Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay、ELISA）によつて行つた。
すなわち、ウシ心房筋ミオシンなどの心筋ミ
オシン重鎖α型またはヒト心室筋ミオシンなど
の心筋ミオシン重鎖β型を予め10〜100μｇ／
mlに酸緩衝生理食塩水（PBS）、炭酸水素ナト
リウム（PH8.0）などの緩衝液に溶解させ、
ELISA用ポリ塩化ビニル（PVC）などのソフ
トプレート（96穴）に50μずつ添加し、４℃
で一晩放置する。次に上記抗原を捨て、PBS
で洗浄後、１％ウシ血清アルブミン（BSA）
含有PBSを加えて室温で１時間静置し、抗原
の結合していない部位をBSAでブロツクする。
ハイブリドーマの上清を50μずつ加え、室温
で１時間放置し、PBSで３回洗浄する。次に
抗マウスイムノグロブリン抗血清（第２抗体）
をビオチン化したものを加え、室温で１時間放
置する。PBSで３回洗浄後、アビシンＤ−酵
素結合体を加え、室温で15分間静置する。
PBSで４回洗浄後、酵素の基質を加えて発色
させる。
抗原と結合力のある抗体を産生している培養
上清を加えたウエルは、以上の操作で容易に判
別でき、ハイブリドーマの検索を行うことがで
きる。
クローニング
各ウエル中には２種以上のハイブリドーマが
生育している可能性があるので、限界希釈法な
どによりクローニングを行い、単一クローン抗
体産生ハイブリドーマを取得する。
抗体の産生
最も純粋な単一クローン抗体は、その産生ハ
イブリドーマを10〜15％ウシ胎児血清含有
RPMI 1640培地などの動物細胞培養用培地ま
たは無血清培地で培養し、その培養上清液から
得ることができる。その細胞培養法および条件
は、通常の動物細胞培養法のものを適宜に応用
すればよい。
一方、さらに大量に抗体を生産する方法とし
て、ハイブリドーマの親ミエローマ細胞の由来
動物と同系動物にプリスタン（２，６，10，14
−テトラムチルペンタデカン）などの鉱物油を
腹腔内に投与した後、ハイブリドーマを腹腔内
投与して大量に増殖させる方法を採用すること
ができる。ハイブリドーマは10〜18日ほどで腹
水腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度
（約１〜20mg／ml）の抗体が生産される。精製
を必要とする場合には、腹水を硫安分画後、
DEAEセルロースイオン交換クロマトグラフイ
ー、心筋ミオシンを結合させたセフアロース
4Bなどを用いたアフイニテイカラムクロマト
グラフイー、分子ふるいカラムクロマトグラフ
イーなどによつて精製することにより目的を達
成することができる。
本発明抗体を生産するに好適なハイブリドー
マの例として、ヒト心筋ミオシン重鎖α型に特
異性を有する抗体産生株としてはハイブリドー
マCMA−19株、ヒト心筋ミオシン重鎖β型に
特異性を有する抗体産生株としてはハイブリド
ーマHMC−14株、HMC−48株、HMC−50株
などが取得されている。
以下、こられのハイブリドーマの調整法と、そ
れらから生産される本発明抗体の性質についてよ
り具体的な説明を加える。
ハイブリドーマの取得
ウシ心房筋ミオシン（１mg／ml）またはヒト
心室筋ミオシン（１mg／ml）を生理食塩水に溶
解させ、完全フロインドアジユバンドと１：１
で混合してエマルジヨンとしたものを、
BALB：／Ｃマウス（雌、６週令）に２週間
おきに50μｇを数回腹腔内投与し、最後にウシ
心房筋ミオシンまたはヒト心室筋ミオシン30μ
ｇを静注した。
最終免疫から３日後にマウスの脾細胞を取り
出し、MEMで洗浄した。マウスミエローマ
P3U1をMEMで洗浄し、脾細胞とP3U1を10：
１で混合して遠心後、ペレツトに50％
PEG1000MEM溶液１mlを徐々に加えて細胞融
合を行わせた。さらにMEM溶液を徐々に加
え、最終的に10mlとした。再び遠心し、ペレツ
トを15％ウシ胎児血清含有RPMI1640培地に
P3U1として１×105cell／0.1mlとなるように懸
濁させ、96ウエルマイクロプレートに0.1mlず
つまいた。
１日後、HAT培地を0.1mlずつ添加し、その
後３〜４日ごとに培地の半分量を新しいHAT
培地で交換した。７日目あたりから、いくつか
のウエルでハイブリドーマの生育が認められ
た。
ハイブリドーマが生育してきたウエルの上清
50μずつをそれぞれ予めウシ心房筋ミオシン
（α型）またはヒト心室筋ミオシン（β型）で
コートした96穴ソフトプレートに添加した。ア
ビシンＤ−酸素結合体としてアビシンＤ−ペル
オキシダーゼ（ベクター社製）、基質および発
色剤として過酸化水素、４−アミノアンチピリ
ン、フエノールを用いて前記したELISA法に
より、ウシ心房筋ミオシンとは反応するが、ヒ
ト心室筋ミオシンとは反応しなもの（この上清
中に心筋ミオシン重鎖α型に特異性を有する単
一クローン抗体が含まれる）、およびヒト心室
筋ミオシンとは反応するが、ウシ心房筋ミオシ
ンとは反応しないもの（この上清中に心筋ミオ
シンβ型に特異性を有する単一クローン抗体が
含まれる）を選び、限界希釈法によりクローニ
ングを行つた。
その結果、心筋ミオシン重鎖α型に特異性を
有する抗体を産生するハイブリドーマCMA−
19株と、心筋ミオシン重鎖β型に特異性を有す
る抗体を産生するHMC−14株、HMC−48株、
HMC−50株を取得した。
単一クローン抗体の産生
ハイブリドーマCMA−19株、HMC−14株、
HMC−48株、HMC−50株をそれぞれ15％ウ
シ胎児血清含有RPMI1640培地で96ウエルプレ
ート、25cm2フラスコ、75cm2フラスコとスケール
アツプしながら培養し、培養上清を集めた。
これらの上清中の抗心筋ミオシン抗体の力価
をELISA法により測定した結果を第１表に示
した。なお、力価は、固定化された抗原に対し
て十分量の抗体が存在する試料について
ELISA法により得られた吸光度を100％とし、
その値の50％を与える抗体試料の原液からの希
釈倍率で表わした。
The present invention relates to novel monoclonal antibodies with specificity for human cardiac myosin heavy chain isozymes. In recent years, as a method to obtain large amounts of highly specific antibodies, a method of producing a single clone antibody by fusing antibody-producing cells and myeloma cells to create a hybridoma (fused cell) and culturing it (milcyutine) et al., Nature.Vol.256, p495 (1975))
is known, and many monoclonal antibodies have been obtained. On the other hand, in the field of muscle research, antibodies against muscle proteins have been used for some time. Muscles are broadly classified into two types: striated muscles and smooth muscles. Striated muscles can be further divided into cardiac and skeletal muscles, and skeletal muscles can be divided into fast twitch muscles and slow twitch muscles. It has been reported that these can be distinguished immunochemically by differences in the antigenicity of myosin molecules, which are the main constituents of muscle (Masaki et al., J.Bio.Chem., Vol. 76, p. 441 (1974 )). Recently, cardiac muscle has been shown to have high ATPase activity.
V1 (α type) and V 3 (β type) with low ATPase activity.
It became clear that there are three isozymes (Yazaki et al., Circulation Research, Vol. 35, p15
(1974), Ho et al., J.Mol.Cell.Cardiol.Vol.10,
p1053 (1978)). Generally, in animals such as humans, cows, and dogs, all atrial muscles are considered to be V 1 (α type), and most ventricular muscles are considered to be V 3 (β type). Therefore, if a monoclonal antibody capable of distinguishing between the α type and the β type can be produced, atrial muscle and ventricular muscle can be differentially stained using a biotin-avidin staining method or the like. Furthermore, these antibodies can be labeled with radioisotopes and used for site-specific diagnosis of myocardial infarction. Clark et al. immunized mice and rats with chicken and rabbit cardiac myosin and obtained monoclonal antibodies that reacted with cardiac myosin heavy chain (Biochem.Biophys.Res.Commun.Vol.95,
p1680 (1980)). One of these strains is good at chicken heart muscle and does not react with human heart muscle. The other two strains reacted with chicken, rabbit, and rat heart muscle;
Although it is said that it also reacts with human cardiac muscle, it also reacts with skeletal muscle, so it is not particularly strong against cardiac muscle. Furthermore, it is not possible to distinguish between the α-type and β-type of human cardiac myosin. Furthermore, Clark et al. obtained monoclonal antibodies against cardiac myosin heavy chain type V 1 and cardiac myosin heavy chain type V 3 by immunization with chicken cardiac myosin or rabbit cardiac myosin (J. Biol. Chem.,
Vol.257, p5449 (1982)). However, these antibodies also show cross-reactivity with each other's isozymes, and their specificity for human cardiac myosin is not clear. The present invention was completed based on this technical background, and provides a monoclonal antibody having specificity for a human cardiac myosin heavy chain isozyme. More specifically, a single clone antibody belonging to the IgG class that has specificity for human cardiac myosin heavy chain α type and does not substantially recognize human cardiac myosin heavy chain β type and human skeletal muscle, and human The present invention provides a monoclonal antibody belonging to the IgG class that has specificity for cardiac myosin heavy chain β type and does not substantially recognize human cardiac myosin heavy chain α type or human skeletal muscle. The antibodies of the present invention are distinguished from conventionally known antibodies in that they identify cardiac myosin isozymes and do not substantially recognize human skeletal muscle. The method and form of preparation of the antibody of the present invention are not particularly limited and should be appropriately selected depending on the purpose. Hybridomas producing the antibodies of the present invention can be obtained by applying general cell fusion methods.
This cell fusion method will be explained as follows. Preparation of antibody-producing cells Antibody-producing cells are prepared using human atrial myosin (α type), human ventricular myosin (β type), or human cardiac myosin α type immunochemically prepared from cows, horses, pigs, etc. Alternatively, cardiac myosin equivalent to β-type can be used in mice, rats, rabbits,
Immunize foreign animals such as sheep, horses, and cows,
This is carried out by obtaining antibody-producing cells such as splenocytes, thymocytes, lymph node cells, and/or peripheral blood cells that have acquired immunity. Preparation of myeloma cells As myeloma cells, mouse, rat,
Cell lines of various animals such as rabbits and humans can be applied. The cell line used is preferably drug-resistant, and preferably has the property that it cannot survive in the selective medium in an unfused state, but can survive in a fused state. The most commonly used are 8-azaquanine-resistant cell lines, which are hypoxanthine phosphoribosyltransferase (hypoxanthine phosphoribosyltransferase).
phosphoribosyl transferase) and cannot grow on hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium.
Furthermore, a so-called "non-secreting" cell line is preferable. Specific examples of such cell lines include P 3 /X63-Ag8U 1 (P 3 U 1 ) derived from mouse myeloma MOPC-21 line, P 3 /X63-
Ag8・6・5・3 (X63.6・5・3), P 3 /NSI
-1-Ag4-1 (NS-1), Sp210-Ag14
(SP2) Rat myeloma 210・RCY3Ag1・
2.3 (Y3・Ag1.2.3), human myeloma U-
266−AR 1 , GM1500, etc. Cell fusion Cell fusion is performed by mixing 10 7 to 10 8 myeloma cells and antibody-producing cells at a mixing ratio of 1:4 to 10 in an animal cell culture medium such as Eagle's minimal essential medium (MEM) or RPMI 1640. . As the fusion promoter, polyethylene glycol (PEG) having an average molecular weight of 1,000 to 6,000, polyvinyl alcohol, viruses, etc. are used. Selection of hybridomas in selective medium Selective growth of hybridomas in selective medium is performed to select hybridomas from cells after cell fusion treatment. For example, cells are appropriately diluted with RPMI1640 medium containing 15% fetal bovine serum, plated on a microtiter plate at approximately 10 5 to 10 6 per well, and each well is coated with a selective medium (e.g.
HAT medium, etc.), and then culture by replacing the selection medium appropriately. For example, if an 8-azaguanine resistant strain is used as myeloma cells and HAT medium is used as the selective medium, the terminally fused myeloma cells will die by about the 10th day of culture, and resistance-producing cells, which are normal cells, will also grow for a long time in vitro. Can not. Therefore, all cells that grow from day 10 to 14 of culture become hybridomas. Search for hybridomas producing anti-human cardiac myosin heavy chain α-type antibodies and anti-human cardiac myosin heavy chain β-type antibodies To search for hybridomas producing anti-human cardiac myosin heavy chain α-type antibodies and anti-human cardiac myosin heavy chain β-type antibodies, Enzyme Linked Immuno Sorbent
(Assay, ELISA). That is, 10 to 100 μg of cardiac myosin heavy chain α type such as bovine atrial myosin or cardiac myosin heavy chain β type such as human ventricular myosin was added in advance.
Dissolve in a buffer solution such as acid-buffered saline (PBS) or sodium bicarbonate (PH8.0) to ml.
Add 50μ to a soft plate (96 wells) such as polyvinyl chloride (PVC) for ELISA, and incubate at 4℃.
Leave it overnight. Then discard the above antigen and PBS
After washing with 1% bovine serum albumin (BSA)
PBS containing PBS is added and left to stand at room temperature for 1 hour, and sites where antigen is not bound are blocked with BSA.
Add 50 μl of hybridoma supernatant, leave at room temperature for 1 hour, and wash three times with PBS. Next, anti-mouse immunoglobulin antiserum (second antibody)
Add biotinylated material and leave at room temperature for 1 hour. After washing three times with PBS, add the avidin D-enzyme conjugate and let stand at room temperature for 15 minutes.
After washing four times with PBS, an enzyme substrate is added to develop color. Wells to which culture supernatant producing antibodies with antigen-binding ability have been added can be easily identified by the above procedure, and hybridomas can be searched for. Cloning Since there is a possibility that two or more types of hybridomas are growing in each well, cloning is performed by a limiting dilution method or the like to obtain a single clone antibody-producing hybridoma. Antibody Production The purest single-clonal antibodies are produced by hybridomas containing 10-15% fetal bovine serum.
It can be obtained from the culture supernatant obtained by culturing in an animal cell culture medium such as RPMI 1640 medium or a serum-free medium. The cell culture method and conditions may be appropriately adapted from ordinary animal cell culture methods. On the other hand, as a method for producing antibodies in larger quantities, pristane (2,6,10,14
A method can be adopted in which a mineral oil such as (-tetramythylpentadecane) is intraperitoneally administered, and then hybridomas are intraperitoneally administered to grow in large quantities. Hybridomas form ascites tumors in about 10 to 18 days, and high concentrations of antibodies (approximately 1 to 20 mg/ml) are produced in serum and ascites. If purification is required, ascites is fractionated with ammonium sulfate,
DEAE cellulose ion exchange chromatography, Cepharose conjugated with cardiac myosin
The purpose can be achieved by purification by affinity column chromatography using 4B or the like, molecular sieve column chromatography, or the like. Examples of hybridomas suitable for producing the antibodies of the present invention include hybridoma strain CMA-19 as an antibody producing strain having specificity for human cardiac myosin heavy chain α type, and hybridoma strain CMA-19 for producing antibodies having specificity for human cardiac myosin heavy chain β type. Hybridoma strains HMC-14, HMC-48, and HMC-50 have been obtained as producing strains. More specific explanations will be given below regarding the method for preparing these hybridomas and the properties of the antibodies of the present invention produced therefrom. Obtaining hybridomas Bovine atrial myosin (1 mg/ml) or human ventricular myosin (1 mg/ml) was dissolved in physiological saline and mixed with complete Freund's adjuvant at a ratio of 1:1.
Mix it to make an emulsion,
BALB:/C mice (female, 6 weeks old) were given 50 μg intraperitoneally several times every two weeks, and finally 30 μg of bovine atrial myosin or human ventricular myosin was administered.
g was administered intravenously. Three days after the final immunization, mouse splenocytes were removed and washed with MEM. mouse myeloma
Wash P3U1 with MEM and combine splenocytes and P3U10 :
After mixing and centrifugation, 50%
Cell fusion was performed by gradually adding 1 ml of PEG1000MEM solution. Furthermore, the MEM solution was gradually added to the solution to make a final volume of 10 ml. Centrifuge again and transfer the pellet to RPMI1640 medium containing 15% fetal bovine serum.
The suspension was suspended as P 3 U 1 at 1×10 5 cells/0.1 ml, and 0.1 ml of the suspension was spread onto a 96-well microplate. After 1 day, add 0.1 ml of HAT medium, then add half of the medium every 3-4 days to fresh HAT.
Replaced with medium. From around the 7th day, hybridoma growth was observed in some wells. Supernatant of wells where hybridomas have grown
50μ of each was added to a 96-well soft plate previously coated with bovine atrial myosin (α type) or human ventricular myosin (β type). Although it reacts with bovine atrial muscle myosin, it was determined by the ELISA method described above using avicin D-peroxidase (manufactured by Vector) as the avidin D-oxygen conjugate and hydrogen peroxide, 4-aminoantipyrine, and phenol as the substrate and coloring agent. , which does not react with human ventricular myosin (this supernatant contains a monoclonal antibody with specificity for cardiac myosin heavy chain α type), and which reacts with human ventricular myosin but does not react with bovine atrial myosin. One that did not react with muscle myosin (the supernatant contained a monoclonal antibody specific for cardiac myosin β type) was selected and cloned by limiting dilution. As a result, the hybridoma CMA-, which produces antibodies specific for cardiac myosin heavy chain alpha type
19 strains, HMC-14 strains, HMC-48 strains, which produce antibodies specific to cardiac myosin heavy chain beta type,
HMC-50 stock was acquired. Production of monoclonal antibodies Hybridoma strain CMA-19, HMC-14 strain,
HMC-48 strain and HMC-50 strain were each cultured in RPMI1640 medium containing 15% fetal bovine serum while being scaled up in a 96-well plate, 25 cm 2 flask, and 75 cm 2 flask, and culture supernatants were collected. Table 1 shows the results of measuring the titers of anti-cardiac myosin antibodies in these supernatants by ELISA. Note that the titer is calculated for a sample in which there is a sufficient amount of antibody against the immobilized antigen.
The absorbance obtained by ELISA method is taken as 100%,
It is expressed as the dilution factor from the original solution of the antibody sample that gives 50% of that value.
【表】
なお、これらの抗体のヒト骨格筋との交差性
はほとんど認められなかつた。
抗体のサブクラスの決定
96穴ソフトマイクロプレートに各単一クロー
ン抗体をコートし、１％BSA含有PBSでブロ
ツキングした後、MONOABID EIA KIT
（ZYMED社製）により抗IgA抗体、抗IgG1抗
体、抗IgG2a抗体、抗IgG2b抗体、抗IgG3抗体、
抗IgM抗体との反応をみて、各単一クローン抗
体のサブクラスを決定した。
またＬ鎖の抗ｘ抗体、抗λ抗体との反応性を
調べてタイプを決定した。
その結果、CMA−19株の産生する抗体は
IgG1／ｘ、HMC−14株の産生する抗体は
IgG2a／ｘ、HMC−48株およびHMC−50株の
産生する抗体はIgG2b／ｘであることが判明し
た。
本発明抗体による組織染色
心臓弁膜症等の心臓手術時に採取したヒト心
房筋、心室筋をTissue−TEKにより固定し
た後、クリオスタツトにより切片標本を作製し
た。
これらの切片標本を本発明抗体を用いてビオ
チン−アビジン系により染色した。
すなわち、切片標本をPBS（0.01M、PH7.2）
にて、一次抗体として本発明抗体と40分間、37
℃でインキユベーシヨンした。その後、再度洗
浄した後、二次抗体として抗マウスIgGビオチ
ン標識抗体（TAGO社、ヒト肝ホモジネート
および血清で吸収後、20倍希釈したものを使
用）を同様に反応させた。さらに再度洗浄後、
フルオレセイン標識アビジン（E.Yラボラトリ
ーズ社、ヒト肝ホモジネート、血清にて吸収し
たものを20倍希釈したものを使用）と同様に反
応させ、これを洗浄したものをグリセリンにて
封入し、染色標本を作製した。
これらの標本を蛍光顕微鏡により倹鏡した。
その結果、CMA−19株の産生する抗体を用い
た場合は、正常人心房筋では95〜96％の細胞が
染色され（写真１参照）、心室筋は10％以下し
か染色されなかつた（写真２参照）。また、
HMC−14株の産生する抗体を用いた場合は、
心室筋が100％染色され（写真３参照）、心房筋
は20〜30％しか染色されなかつた（写真４参
照）。（正常人心房筋では20〜30％はαβの形で
存在する。）
一方、心臓弁膜症の患者の心筋では、心房筋
でHMC−14株の産生する抗体で染色される細
胞が増加し（写真５参照）、CMA−19株の産生
する抗体で染色される部分がその分だけ減少し
ていた（写真６参照）。この現象は、心臓弁膜
症において心房筋がα型からβ型に変換する病
理学的変化を示唆している。
また、本発明抗体を用いた組織染色により心
房圧と心房筋中のV3ミオシンアイソザイム
（β型）の割合との相関をみた結果は第１図の
とおりである。すなわち、正常人では心房圧は
５mmHg以下であり、β型アイソザイムは10％
以下と少ない。一方、心臓弁膜症患者において
は、心房圧が10mmHg以上となり、心房筋ミオ
シンのアイザイムパターンはα型が減少し、β
型が増加する。
本発明抗体は、以上のようにヒト心筋ミオシン
重鎖のアイソザイムに特異性を有し、心筋につい
ての生化学的、病理学的研究に重要な試薬として
有用である。さらに、本発明抗体をテクネチウ
ム、インジユウム等の放射性同位元素で標識し、
患者に投与後全身オートガンマーで測定するイム
ノデイテクシヨンに応用すれば、心筋梗塞の部位
別診断が可能となる。特に心室筋梗塞と約20％の
確立で合併がみられる心房筋梗塞の診断も可能と
なる点で有用である。また、本発明抗体でイムノ
アツセツセイを行うことにより、心筋梗塞時にお
けるミオシン重鎖の血中への漏出を検出すること
も可能と考えられ、心筋梗塞の予後の判定等に使
用できる可能性がある。[Table] In addition, almost no cross-reactivity of these antibodies with human skeletal muscle was observed. Determination of antibody subclass Coat each single clone antibody on a 96-well soft microplate, block with PBS containing 1% BSA, and then use MONOABID EIA KIT.
(manufactured by ZYMED) to produce anti-IgA antibodies, anti-IgG 1 antibodies, anti-IgG 2 a antibodies, anti-IgG 2 b antibodies, anti-IgG 3 antibodies,
The subclass of each single clone antibody was determined by observing the reaction with anti-IgM antibodies. The type was also determined by examining the reactivity of the L chain with anti-x antibodies and anti-λ antibodies. As a result, the antibodies produced by CMA-19 strain were
IgG 1 /x, the antibody produced by HMC-14 strain is
The antibodies produced by IgG 2 a/x, HMC-48 strain, and HMC-50 strain were found to be IgG 2 b/x. Tissue Staining with Antibodies of the Invention Human atrial and ventricular muscles collected during cardiac surgery for valvular heart disease, etc., were fixed with Tissue-TEK, and then section specimens were prepared using a cryostat. These section specimens were stained with the biotin-avidin system using the antibody of the present invention. i.e. section specimens in PBS (0.01M, PH7.2)
with the antibody of the present invention as the primary antibody for 40 minutes at 37°C.
Incubation was carried out at °C. Thereafter, after washing again, an anti-mouse IgG biotin-labeled antibody (TAGO, diluted 20 times after absorption with human liver homogenate and serum was used) as a secondary antibody was reacted in the same manner. After washing again,
A stained specimen was prepared by reacting in the same manner as with fluorescein-labeled avidin (EY Laboratories, human liver homogenate, absorbed with serum and diluted 20 times), washed, and sealed in glycerin. . These specimens were examined using a fluorescence microscope.
As a result, when using the antibody produced by the CMA-19 strain, 95-96% of cells in normal human atrial muscle were stained (see Photo 1), while less than 10% of ventricular muscle was stained (see Photo 1). (see 2). Also,
When using antibodies produced by HMC-14 strain,
100% of the ventricular muscle was stained (see Photo 3), and only 20-30% of the atrial muscle was stained (see Photo 4). (20-30% of normal atrial muscle exists in the form of αβ.) On the other hand, in the myocardium of patients with valvular heart disease, the number of cells stained with the antibody produced by the HMC-14 strain increases in the atrial muscle ( (See Photo 5), and the area stained with the antibody produced by the CMA-19 strain was reduced accordingly (See Photo 6). This phenomenon suggests a pathological change in the atrial muscle that converts from α-type to β-type in heart valve disease. Furthermore, the correlation between atrial pressure and the proportion of V 3 myosin isozyme (β type) in atrial muscle was determined by tissue staining using the antibody of the present invention, and the results are shown in FIG. In other words, in a normal person, the atrial pressure is less than 5 mmHg, and the β-type isozyme is 10%
Fewer than below. On the other hand, in patients with heart valve disease, the atrial pressure is 10 mmHg or higher, and the Izyme pattern of atrial muscle myosin is reduced in α-type and β-type.
Type increases. As described above, the antibody of the present invention has specificity for the isozyme of human cardiac muscle myosin heavy chain, and is useful as an important reagent for biochemical and pathological research on cardiac muscle. Furthermore, the antibody of the present invention is labeled with a radioisotope such as technetium or indium,
If applied to immunodetection, which measures whole body autogamma after administration to a patient, it will become possible to diagnose myocardial infarction by location. It is especially useful in that it enables the diagnosis of ventricular myocardial infarction and atrial myocardial infarction, which has a probability of about 20%. Furthermore, by performing immunoassay with the antibody of the present invention, it is considered possible to detect the leakage of myosin heavy chain into the blood during myocardial infarction, and it may be used to determine the prognosis of myocardial infarction. There is.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図は、本発明抗体を用いた組織染色による
心房圧と心房筋中のV3ミオシンアイソザイム
（β型）の割合との相関を示すものである。
FIG. 1 shows the correlation between atrial pressure and the proportion of V 3 myosin isozyme (β type) in atrial muscle as determined by tissue staining using the antibody of the present invention.