JP5071191B2 - Method for detecting complex N-type sugar chain - Google Patents
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Description
本発明は、複合型N型糖鎖の検出方法などに関し、より詳細には、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の検出方法などに関する。 The present invention relates to a method for detecting complex N-type sugar chains and the like, and more particularly to a method for detecting complex N-type sugar chains having three or more chains.
糖タンパク質のアスパラギンにN−グリコシド結合した糖鎖は、５糖からなるコア構造に、シアル酸、ガラクトースおよびN-アセチルグルコサミンで構成される側鎖（N-アセチルラクトサミン構造、ポリN-アセチルラクトサミン構造）が１〜６本付加された構造を有する。このような糖鎖は、側鎖の数によって２本鎖、３本鎖などの複合型Ｎ型糖鎖と呼ばれている。 The sugar chain N-glycosidically linked to the asparagine glycoprotein has a pentasaccharide core structure with side chains composed of sialic acid, galactose and N-acetylglucosamine (N-acetyllactosamine structure, poly N-acetyllacto 1 to 6 (samine structures) are added. Such sugar chains are called complex N-type sugar chains such as double chains and triple chains depending on the number of side chains.
ガン化に伴い、ヒト血清中の前立腺がんマーカー（prostate specific antigen； PSA）やトランスフェリンにおいては、高分岐糖鎖が増加することが知られている。 It is known that hyperbranched sugar chains increase in prostate cancer markers (prostate specific antigen (PSA)) and transferrin in human serum with canceration.
高分岐糖鎖の増加は、ポリN-アセチルラクトサミン量の増加にもつながる（非特許文献１など）。３本鎖以上の複合型N型糖鎖は、ガンの発症、転移、再発などと関連している疑いが高い。そこで、高分岐の複合型N型糖鎖を特異的に検出して正確にプロファイリングすることが、癌の診断や予後の観察に役立つ。 An increase in hyperbranched sugar chains also leads to an increase in the amount of poly N-acetyllactosamine (Non-patent Document 1, etc.). Complex N-type sugar chains of three or more chains are highly suspected to be associated with cancer onset, metastasis, recurrence and the like. Therefore, specific detection and accurate profiling of highly branched complex N-type sugar chains are useful for cancer diagnosis and prognostic observation.
従来、３本鎖や４本鎖に結合することが知られているレクチンの例として、ヒマレクチン（RCA120）やデイゴマメレクチン（ECA）がある。これらのレクチンは、ガラクトース骨格やラクトース骨格、１本鎖または２本鎖のN型糖鎖、O型糖鎖のポリラクトサミンとも結合しやすい。RCA120やECAは、末端ガラクトースにシアル酸が付加していないアシアロ糖鎖には親和性を有するが、シアロ糖鎖（シアリル糖鎖ともいう）との親和性は低くなる。 Conventionally, examples of lectins that are known to bind to three or four strands include castor lectin (RCA120) and deigo bean lectin (ECA). These lectins easily bind to a galactose skeleton, a lactose skeleton, a single-chain or double-chain N-type sugar chain, and an O-type sugar chain polylactosamine. RCA120 and ECA have an affinity for an asialo sugar chain in which sialic acid is not added to terminal galactose, but have a low affinity for a sialo sugar chain (also called a sialyl sugar chain).
このように３本鎖や４本鎖を特異的に検出するレクチンが存在しない現状において、３本鎖や４本鎖を特異的に検出するために二種類以上のレクチンを用いる方法が採用されている。例えば、チョウセンアサガオレクチン（DSA）は、N型糖鎖だけの高分岐に親和性を持つが、さらにO型糖鎖のポリラクトサミンやキチンなどに含まれるキトオリゴ糖にも強く結合する。一方、インゲンマメレクチン-L（PHA−L）は、O型糖鎖のポリラクトサミンやキチンのキトオリゴ糖と親和性を持たないが、高分岐のN型糖鎖と結合する。そこで、DSAで結合するものを一次スクリーニングし、結合したものをさらにPHA−Lで二次スクリーニングすることで、高分岐のN型糖鎖の存在を判別する。同様に、ポリラクトサミンの伸長の研究（免疫学機能研究など）では、チョウセンアサガオレクチン（DSA）とトマトレクチン（LEL）が用いられる。 Thus, in the present situation where there is no lectin that specifically detects three or four strands, a method using two or more kinds of lectins has been adopted to specifically detect three or four strands. Yes. For example, datura morning glory lectin (DSA) has affinity for hyperbranching of only N-type sugar chains, but also strongly binds to chi-oligosaccharides contained in O-type sugar chains such as polylactosamine and chitin. On the other hand, kidney bean lectin-L (PHA-L) has no affinity for polylactosamine of O-type sugar chain or chitooligosaccharide of chitin, but binds to highly branched N-type sugar chain. Therefore, the presence of hyperbranched N-type sugar chains is discriminated by primary screening for those that bind with DSA and further secondary screening for those that bind with PHA-L. Similarly, in the study of polylactosamine elongation (such as immunological functional studies), Datura morning glory lectin (DSA) and tomato lectin (LEL) are used.
しかし、上記方法は、高分岐N型糖鎖を調べるだけでも煩雑過ぎる。また、シアル酸がついたN型糖鎖となると、その反応性が低下するなどの問題もある。二種以上のレクチンを使用するとしても、高分岐N型糖鎖のより詳細な構造を調べられることが望ましい。
上記した従来のレクチンの問題に鑑み、本発明の目的は、高分岐のN型糖鎖を簡便に検出および分別する方法を提供することにある。 In view of the above-described problems of conventional lectins, an object of the present invention is to provide a method for easily detecting and fractionating highly branched N-type sugar chains.
さらに、本発明の目的は、二種以上のレクチンを組み合わせて、高分岐のN型糖鎖のより詳細な構造を検出および分別する方法を提供することにある。 Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for detecting and fractionating a more detailed structure of a highly branched N-type sugar chain by combining two or more lectins.
さらに、本発明の目的は、高分岐型糖鎖を特異的に検出するレクチンを用いて、３本鎖以上の複合型N型糖鎖を測定する試薬を提供することにある。 Furthermore, an object of the present invention is to provide a reagent for measuring complex N-type sugar chains of three or more chains using a lectin that specifically detects hyperbranched sugar chains.
本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、ドクヤマドリ由来のキノコレクチン（以下、ドクヤマドリレクチンまたはBVLという）が、３本以上の側鎖を有する複合型N型糖鎖と特異的に結合することを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、ドクヤマドリレクチンを検出手段とする、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の検出方法および分別方法を提供する。該検出手段の具体的な使用方法は、特に制限されず、常法のものを使用可能である。 As a result of intensive studies on the above-mentioned problems, the present inventors have specifically found that edible mushroom lectin mushroom collectin (hereinafter referred to as Docian lectin or BVL) specifically binds to complex N-type sugar chains having three or more side chains. The present invention has been found. That is, the present invention provides a detection method and a separation method for complex N-type sugar chains having three or more chains, which uses Docander lectin as a detection means. A specific method of using the detection means is not particularly limited, and a conventional method can be used.
上記の「側鎖」とは、本明細書において、コア構造に結合するN-アセチルラクトサミン構造（Galβ１→４GlcNAｃ）および／またはポリN-アセチルラクトサミン構造（Galβ１→４GlcNAｃβ１→３の繰り返し構造）の意味で使用される。 In the present specification, the above-mentioned “side chain” means an N-acetyllactosamine structure (Galβ1 → 4GlcNAc) and / or a polyN-acetyllactosamine structure (Galβ1 → 4GlcNAcβ1 → 3 repeat structure) binding to the core structure. Used in the sense of
BVLは、従来のレクチンと比べて３本以上の側鎖を高分岐型N型糖鎖により特異的に結合する。しかも、BVLを使用した本発明の検出および分別方法では、側鎖の末端ガラクトースにシアル酸が付加していても親和性が低下しない。 BVL specifically binds three or more side chains with a highly branched N-type sugar chain as compared with conventional lectins. Moreover, in the detection and fractionation method of the present invention using BVL, the affinity does not decrease even if sialic acid is added to the terminal galactose of the side chain.
本発明の検出および分別方法は、また、前記検出または分別手段に、分岐度で親和性の異なるレクチンを含めてもよい。このようなレクチンとしては、例えば４本鎖に親和性を示すが、３本鎖に親和性を示さないPHA−Lが挙げられる。BVLとPHA−Lとを組み合わせると、３本鎖以上の複合型N型糖鎖が３本側鎖またはそれ以上なのかの調査が可能になる。 In the detection and fractionation method of the present invention, lectins having different degrees of branching and affinity may be included in the detection or separation means. An example of such a lectin is PHA-L, which shows affinity for four strands but does not show affinity for three strands. When BVL and PHA-L are combined, it is possible to investigate whether the complex type N-type sugar chain having 3 or more chains is 3 side chains or more.
本発明の検出および分別方法は、前記検出または分別手段に、さらに、シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンを含めてもよい。本明細書において、「シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチン」とは、シアロ糖鎖との親和性を有するレクチン、またはアシアロ糖鎖との親和性を有するレクチンの意味である。このようなレクチンは、例えばシアル酸末端付加の３本鎖に親和性の低いDSAや、シアル酸末端付加の４本鎖に親和性の低いPHA−Eである。これらのレクチンとBVLとを組み合わせると、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の末端ガラクトースにシアル酸が付加されているか否かについて検出などが可能にある。 In the detection and fractionation method of the present invention, a lectin having affinity for a sialic acid (±) sugar chain may be further included in the detection or fractionation means. In the present specification, “lectin having affinity with sialic acid (±) sugar chain” means lectin having affinity with sialo sugar chain or lectin having affinity with asialo sugar chain. . Such a lectin is, for example, DSA having a low affinity for a sialic acid-terminated three-strand or PHA-E having a low affinity for a sialic acid-terminated four-strand. When these lectins and BVL are combined, it is possible to detect whether or not sialic acid is added to the terminal galactose of a complex type N-type sugar chain of 3 or more chains.
BVLが必須の本発明の検出または分別方法によれば、３本以上の側鎖を有するN型糖鎖を特異的に検出し、また分離精製することが可能である。従来の方法では、３本以上の側鎖を有するシアロN型糖鎖を特異的に検出し、また分離精製することができなかったが、本発明では、３本以上の側鎖を有するN型糖鎖の検出、または分離が確実に可能である。 According to the detection or fractionation method of the present invention in which BVL is essential, an N-type sugar chain having three or more side chains can be specifically detected and separated and purified. In the conventional method, a sialo N-type sugar chain having three or more side chains could not be specifically detected and separated and purified, but in the present invention, an N-type having three or more side chains It is possible to reliably detect or separate sugar chains.
BVLからなる検出・分別手段に、さらに、３本側鎖と４本側鎖とで親和性の異なるレクチンを組み合わせると、３本以上の側鎖の有する複合型N型糖鎖をさらに詳細にプロファイリングすることができる。高分岐側鎖の微細な変異は疾患と関連するので、本発明での詳細なプロファイリングは疾患の解明などに役立つことが多いに期待される。 When combined with the detection / sorting means consisting of BVL and lectins with different affinity between the three side chains and the four side chains, profiling of complex N-type sugar chains possessed by three or more side chains is further detailed. can do. Since minute mutations in highly branched side chains are associated with diseases, it is expected that detailed profiling in the present invention is often useful for elucidation of diseases.
BVLからなる検出・分別手段に、さらにシアル酸（±）の糖鎖との親和性を有するレクチンを組み合わせると、３本以上の側鎖のN型糖鎖のシアル酸（±）に関するプロファイリングが可能になる。末端シアル酸の有無もまた、疾患と関連するので、本発明による詳細なプロファイリングは疾患の解明などに役立つことが大いに期待される。 Profiling of sialic acid (±) of N-type sugar chains of 3 or more side chains is possible by combining detection and fractionation means consisting of BVL with a lectin having affinity for sialic acid (±) sugar chain become. Since the presence or absence of terminal sialic acid is also associated with the disease, it is highly expected that detailed profiling according to the present invention will help elucidate the disease.
以下に、添付の図面を用いて、本発明の実施の形態をより詳細に説明する。
（ＢＶＬ）
まず、本発明の検出・分別方法に使用するドクヤマドリレクチン（BVL）を説明する。該レクチンは、イグチ科イグチ属ドクヤマドリ（Boletus sp.）を原料とし、例えば図１に示す方法で単離精製することができる。図１の方法を、以下に詳細に説明する。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.
(BVL)
First, Docula lectin (BVL) used in the detection / sorting method of the present invention will be described. The lectin can be isolated and purified by, for example, the method shown in FIG. 1 using a raw material of the genus Iguchi genus Boletus sp. The method of FIG. 1 is described in detail below.
（粗抽出液の調製）
ドクヤマドリの子実体100ｇに、リン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）（以下、PBSとする）を200ml加えて、ミキサーにて破砕する。これを4℃で2時間かけて抽出する。抽出液を遠心分離(8,500×g,15min,4℃)後、吸引濾過により上清を得る。再び、残渣にPBSを250ml加えて、攪拌する。攪拌液を4℃で一晩抽出する。このPBS抽出を6回繰り返す。
(Preparation of crude extract)
200 ml of phosphate buffered saline (pH 7.4) (hereinafter referred to as PBS) is added to 100 g of fruit body of Dokumadori and crushed with a mixer. This is extracted at 4 ° C. for 2 hours. The extract is centrifuged (8,500 × g, 15 min, 4 ° C.), and the supernatant is obtained by suction filtration. Again, add 250 ml of PBS to the residue and stir. The stirred solution is extracted overnight at 4 ° C. Repeat this PBS extraction 6 times.
（硫安塩析）
上記抽出液に、硫酸アンモニウムを最終濃度が80％飽和になるように加える。この混合液を4℃で2時間放置して、タンパク質を充分沈殿させる。遠心分離(8,500×g,15min,4℃)させた沈殿物を、PBSで溶かし、水で透析する。凍結乾燥したものを80％硫安画分とする。
(Ammonium sulfate salting out)
To the above extract, ammonium sulfate is added to a final concentration of 80% saturation. This mixture is left at 4 ° C. for 2 hours to sufficiently precipitate the protein. The centrifuged precipitate (8,500 × g, 15 min, 4 ° C.) is dissolved in PBS and dialyzed against water. The lyophilized product is the 80% ammonium sulfate fraction.
（Super Q強陰イオン交換クロマトグラフィー）
80％硫安画分150mgをMilli Q水5mlに溶解する。遠心分離（7,000×g,10min）後、上清を回収する。沈殿物にMilli Q水5mlを加え遠心分離し、上清を回収し、合わせて、硫安上清10mlを得る。50mM Tris-HCl(pH8.5)であらかじめ平衡化したSuper Q強陰イオン交換クロマトグラフィー(φ5.0×20cm)に供する。非吸着部を同緩衝液で充分に洗浄した後、50mM NaCl/50mM Tris-HCl(pH8.5)、1M NaCl/50mM Tris-HCl(pH8.5)で、順次溶出する。
(Super Q strong anion exchange chromatography)
Dissolve 150 mg of 80% ammonium sulfate fraction in 5 ml of Milli Q water. After centrifugation (7,000 × g, 10 min), the supernatant is collected. Add 5 ml of Milli Q water to the precipitate, centrifuge, collect the supernatant, and combine to obtain 10 ml of ammonium sulfate supernatant. Subject to Super Q strong anion exchange chromatography (φ5.0 × 20 cm) pre-equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 8.5). The non-adsorbed part is thoroughly washed with the same buffer, and then eluted sequentially with 50 mM NaCl / 50 mM Tris-HCl (pH 8.5) and 1 M NaCl / 50 mM Tris-HCl (pH 8.5).
（ゲル濾過クロマトグラフィー）
Super Q強陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた活性画分を、HPLCシステムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供する。試料10.0mgをPBS 1mlに溶解し、あらかじめ同緩衝液であるPBSで平衡化しておいたTSK-gel G3000SWカラム（φ1.6×60cm）に流速5.0ml/minで供し、溶出させる。
(Gel filtration chromatography)
The active fraction obtained by Super Q strong anion exchange chromatography is subjected to gel filtration chromatography using an HPLC system. Dissolve 10.0 mg of the sample in 1 ml of PBS, and apply to a TSK-gel G3000SW column (φ1.6 × 60 cm) equilibrated with PBS, which is the same buffer, at a flow rate of 5.0 ml / min for elution.
赤血球凝集活性および吸光度（OD280ｎｍ）の両方が高い画分を回収する。回収された画分は、透析膜（Spectra/Por Membrane MWCO:6-8,000）に入れ、100倍量の蒸留水による4℃での透析に３回供する。透析後、各画分を凍結乾燥して、凍結乾燥粉末をBVLとする。 The fraction with both high hemagglutination activity and absorbance (OD 280 nm) is collected. The collected fraction is put into a dialysis membrane (Spectra / Por Membrane MWCO: 6-8,000) and subjected to dialysis at 4 ° C. with 100 times the amount of distilled water three times. After dialysis, each fraction is lyophilized and the lyophilized powder is designated as BVL.
（BVLの特異性）
次に、BVLの糖鎖結合性を説明する。糖鎖結合性は、例えばフロンタルアフィニティクロマトグラフィー（FAC）法によって測定することができる。このフロンタルアフィニティクロマトグラフィーは、レクチンを固定化したカラムに、蛍光標識した糖鎖の一定濃度の希釈液を流した際、レクチンと糖鎖とが相互作用がなければ糖鎖は短時間でカラムから流れ出、溶出前端（フロント）が即座に観察され、一方、レクチンとの親和性がある場合、糖鎖の溶出が遅れるという原理に基づく。
(Specificity of BVL)
Next, the sugar chain binding property of BVL will be described. The sugar chain binding property can be measured by, for example, a frontal affinity chromatography (FAC) method. In frontal affinity chromatography, when a diluted solution of a fluorescently labeled sugar chain is passed through a column on which a lectin is immobilized, the sugar chain is removed from the column in a short time if there is no interaction between the lectin and the sugar chain. Based on the principle that the elution front (front) is observed immediately, while the elution of sugar chains is delayed when there is affinity for lectins.
レクチンカラムの調製は、以下のようにして行われる。
１． 精製レクチンを0.1〜0.2M NaHCO3緩衝液(pH8.3〜8.5)に溶解する。
２． レクチンの一級アミノ基を介してNHS活性化セファロース（GEヘルスケアバイオサイエンス）などの担体に固定化する。
３． 一級アミンを含むトリス緩衝液やエタノールアミンなどでブロッキングする。
４． 0.8％ NaClを含む10mM Tris-HCl緩衝液（pH7.4、TBS)中にレクチン固定化樹脂を懸濁させ、レクチン固定化樹脂を、ミニチュアカラム(φ2mm x 10mm, 31.4μl)に充填する。
５． レクチン固定化樹脂を充填したミニチュアカラムをホルダーで保護し、レクチンカラムをFAC自動分析装置（FAC-1装置、（株）島津製作所製）に接続する。
The lectin column is prepared as follows.
1. The purified lectin is dissolved in 0.1-0.2 M NaHCO 3 buffer (pH 8.3-8.5).
2. It is immobilized on a carrier such as NHS-activated Sepharose (GE Healthcare Bioscience) via the primary amino group of the lectin.
3. Block with Tris buffer containing primary amine or ethanolamine.
4). The lectin immobilization resin is suspended in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4, TBS) containing 0.8% NaCl, and the lectin immobilization resin is loaded onto a miniature column (φ2 mm × 10 mm, 31.4 μl).
5. The miniature column filled with the lectin immobilization resin is protected with a holder, and the lectin column is connected to a FAC automatic analyzer (FAC-1 apparatus, manufactured by Shimadzu Corporation).
平衡化したレクチンカラムに対し、分析用緩衝液（0.8％NaClを含む10mMTris-HCl緩衝液（ｐH7.4））でレクチンが持つ解離定数（Kd）よりも充分低い濃度（2.5nM）に希釈したピリジルアミノ化糖鎖（PA化糖鎖）を、流速0.125ml／minで500μl注入する。カラムからのPA化糖鎖の溶出を、蛍光検出器（励起波長／蛍光波長：310nm／380nm）を用いて検出する。 The equilibrated lectin column is diluted to a concentration (2.5 nM) sufficiently lower than the dissociation constant (K d ) of the lectin with an analytical buffer (10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.8% NaCl). Inject 500 μl of the pyridylaminated sugar chain (PA sugar chain) at a flow rate of 0.125 ml / min. The elution of the PA sugar chain from the column is detected using a fluorescence detector (excitation wavelength / fluorescence wavelength: 310 nm / 380 nm).
検出データから、レクチンと相互作用しない糖鎖（PA化ラムノース）の溶出前端容積（V0）を基準とし、相互作用する糖鎖の溶出前端容積（V）の遅れ（V-V0）（単位μl）を相互作用強度として算出する。相互作用強度（V-V0）が大きいほど、糖鎖との親和性が高い。 Based on the detection data, the elution front volume (V 0 ) of the sugar chain that does not interact with the lectin (V 0 ) is used as a reference, and the elution front volume (V) of the sugar chain that interacts (V V 0 ) (unit μl) Is calculated as the interaction strength. The greater the interaction strength (VV 0 ), the higher the affinity with the sugar chain.
さらに、FAC法の以下の基準式に基づいて、V-V0およびBtから糖鎖とレクチンとの結合定数（Ka）を求めることもできる。 Furthermore, the binding constant (K a ) between the sugar chain and the lectin can also be determined from VV 0 and B t based on the following standard formula of the FAC method.
〔式中、Aは溶出に用いる物質、A０は物質Aの初濃度、Bは固定化リガンド、Vは溶出容積、V０は固定化リガンドBと全く相互作用しない物質の溶出前端容積、Btは有効リガンド量、Kdは解離定数（結合定数の逆数）を意味する〕。上記の基準式において、A０がKdと比較して無視できるほど小さいときは、(2)は(3)のように簡略化できる。
[Where A is the substance used for elution, A 0 is the initial concentration of substance A, B is the immobilized ligand, V is the elution volume, V 0 is the elution front volume of the substance that does not interact with the immobilized ligand B, B t is the amount of effective ligand, and K d is the dissociation constant (reciprocal of the binding constant). In the above-referencing, when A 0 is negligibly small compared to the K d, (2) it can be simplified to (3).
（各種レクチンの特異性）
フロンタルアフィニティクロマトグラフィーを用いて測定したBVL、DSA、PHA−L、PHA−E、ECA、RCA120およびLELの特異性を表１に示す。表１において、評価基準は以下のとおりである。
○ ： 糖鎖との親和性が強い
△ ： 糖鎖との親和性が弱い
× ： 糖鎖との親和性が見られない／検出限界以下
(Specificity of various lectins)
Table 1 shows the specificity of BVL, DSA, PHA-L, PHA-E, ECA, RCA120 and LEL measured using frontal affinity chromatography. In Table 1, the evaluation criteria are as follows.
○: Strong affinity with sugar chain △: Low affinity with sugar chain ×: No affinity with sugar chain / not more than detection limit
表１に示すように、BVLは、N型糖鎖のコア構造に結合するN-アセチルラクトサミン構造と特異的に結合する。すなわち、高分岐型糖鎖に親和性を有することが知られているDSAは、O型糖鎖のポリラクトサミンやキチンのキトオリゴ糖とも親和性を有する。一方、BVLは、O型糖鎖のポリラクトサミンやキチンのキトオリゴ糖とは親和性を有さない。さらに、BVLは、末端ガラクトースにシアル酸が付加した側鎖に対しても強い親和性を有する。この点でも、シアロ糖鎖に対しては親和性が弱いDSAやPHA−L、PHA−Eと対照的である。 As shown in Table 1, BVL specifically binds to the N-acetyllactosamine structure that binds to the core structure of the N-type sugar chain. That is, DSA, which is known to have an affinity for hyperbranched sugar chains, also has affinity for polylactosamines of O-type sugar chains and chitooligosaccharides of chitin. On the other hand, BVL has no affinity with O-type polylactosamine or chitin oligosaccharide. Furthermore, BVL has a strong affinity for the side chain in which sialic acid is added to terminal galactose. This is also in contrast to DSA, PHA-L, and PHA-E, which have a weak affinity for sialosugar chains.
（BVLを使った糖タンパクの検出）
本発明の検出方法は、複合型N型糖鎖の存在が予想または疑われる糖鎖試料に対して、検出手段としてBVLを作用させる以外は、特に限定されない。検出方法の例には、レクチンクロマトグラフィー、レクチンチップ、レクチン染色などが挙げられる。レクチンクロマトグラフィーは、固定化されたBVLが糖鎖と特異的に結合する性質を利用したアフィニティクロマトグラフィーである。HPLCと組み合わせる（HPLAC）と、ハイスループットを期待できる。
(Glycoprotein detection using BVL)
The detection method of the present invention is not particularly limited, except that BVL is allowed to act as a detection means on a sugar chain sample in which the presence of a complex N-type sugar chain is predicted or suspected. Examples of the detection method include lectin chromatography, lectin chip, lectin staining and the like. Lectin chromatography is affinity chromatography that utilizes the property that immobilized BVL specifically binds to sugar chains. Combined with HPLC (HPLAC), high throughput can be expected.
BVLには、標識手段が組み込まれていることが好ましい。このようなレクチンを以下、標識レクチンということがある。標識レクチンは、BVLと標識手段とを少なくとも含み、検出可能に標識化されていることを特徴とする。 BVL preferably incorporates a labeling means. Hereinafter, such a lectin may be referred to as a labeled lectin. The labeled lectin includes at least a BVL and a labeling means, and is characterized by being detectably labeled.
標識手段としては、特に制限なく公知の標識化方法を適用することができ、例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合などを挙げることができる。前記標識化合物としては、この用途に通常用いられるものであれば特に制限なく適用することができ、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物などを挙げることができる。具体的には、ビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅなどを挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりレクチンと結合することができる。 As the labeling means, a known labeling method can be applied without particular limitation, and examples thereof include labeling with a radioisotope, binding of a labeling compound, and the like. The labeling compound is not particularly limited as long as it is usually used for this purpose, and examples thereof include a direct or indirect labeling compound, an enzyme, and a fluorescent compound. Specific examples include biotin, digoxigenin, horseradish-derived peroxidase, fluorescein isothiocyanate, and CyDye. These labeling compounds can be bound to lectins by a conventional method.
BVLを固定化する担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース、スターチ、ポリアクリルアミドなどのゲル材が一般的である。これらには、市販のものを特に制限なく使用でき、例えばセファロース４Bやセファロース６B（共にGEヘルスケアバイオサイエンス）が挙げられる。 As a carrier for immobilizing BVL, gel materials such as agarose, dextran, cellulose, starch and polyacrylamide are generally used. For these, commercially available products can be used without particular limitation, and examples thereof include Sepharose 4B and Sepharose 6B (both GE Healthcare Bioscience).
また、レクチンクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、マイクロプレートやナノウエルにレクチンを固定化したものも含まれる。 The column used for lectin chromatography includes a column in which a lectin is immobilized on a microplate or nanowell.
固定化するレクチンの濃度は、通常、0.0001〜100mg/mlでよく、好ましくは0.01〜20mg/mlである。担体がアガロースゲルの場合、それをCNBrなどで活性化してからレクチンとカップリングさせる。活性化スペーサーを導入したゲルにレクチンを固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルにレクチンを固定化してからNaCNBH3で還元してもよい。また、NHS-セファロース（GEヘルスケアバイオサイエンス）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。 The concentration of the lectin to be immobilized is usually 0.0001 to 100 mg / ml, preferably 0.01 to 20 mg / ml. When the carrier is an agarose gel, it is activated with CNBr and then coupled with the lectin. A lectin may be immobilized on a gel into which an activation spacer has been introduced. Further, the lectin may be immobilized on a gel into which a formyl group has been introduced and then reduced with NaCNBH 3 . A commercially available activated gel such as NHS-Sepharose (GE Healthcare Bioscience) may also be used.
糖鎖試料は、複合型Ｎ型糖鎖の存在が予想されるものであればよく、遊離のオリゴ糖鎖、Ｃｙ３、アミノピリジンなどで蛍光標識された糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、細胞などのすべてを含有する。さらに、シアリダーゼ、ガラクシトターゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼのいずれかを使用してあるいはこれらを段階的に使用して、前記糖鎖を部分的に分解したものであってもよい。 The sugar chain sample may be any sugar chain sample that is expected to have a complex N-type sugar chain, and is a sugar chain, sugar amino acid, glycopeptide, glycoprotein that is fluorescently labeled with a free oligosaccharide chain, Cy3, aminopyridine, or the like. Contains all of proteoglycans, cells and more. Further, the sugar chain may be partially decomposed using sialidase, galactositase, N-acetylhexosaminidase, mannosidase, or fucosidase or using them stepwise.
糖鎖試料を採取する検体は、例えば、ヒトを含む動物の組織（特に病理組織）や体液（血漿、血清、唾液、乳汁、尿、涙など）である。これらの検体に界面活性剤および緩衝液を添加して、糖タンパク質を可溶化した後、アセトン、硫酸アンモニウムなどを添加して、さらに遠心分離して沈殿物中の糖タンパク質などを回収するとよい。 The specimen from which the sugar chain sample is collected is, for example, animal tissues including humans (particularly pathological tissues) or body fluids (plasma, serum, saliva, milk, urine, tears, etc.). A surfactant and a buffer solution may be added to these specimens to solubilize glycoproteins, and then acetone, ammonium sulfate, etc. may be added, followed by centrifugation to recover glycoproteins in the precipitate.
以下に、レクチンクロマトグラフィーの手順を説明する。BVLを固定化したカラムに糖鎖試料を通液する。糖鎖試料をカラムにかけた後、洗浄と平衡化の目的で緩衝液を流す。緩衝液の一例は、モル濃度が５〜500mM、好ましくは10〜500mMであり、pHが4.0〜10.0、好ましくは6.0〜9.0であり、NaCl含量が0〜0.5M、好ましくは0.1〜0.2Mであり、CaCl2、MgCl2またはMnCl2含量が０〜10mM、好ましくは０〜５mMの緩衝液である。 Below, the procedure of lectin chromatography is demonstrated. The sugar chain sample is passed through the column to which BVL is immobilized. After the sugar chain sample is applied to the column, a buffer solution is flowed for washing and equilibration purposes. An example of the buffer is a molar concentration of 5 to 500 mM, preferably 10 to 500 mM, a pH of 4.0 to 10.0, preferably 6.0 to 9.0, and a NaCl content of 0 to 0.5 M, preferably 0.1 to 0.2 M. There is a buffer having a CaCl 2 , MgCl 2 or MnCl 2 content of 0 to 10 mM, preferably 0 to 5 mM.
アフィニティカラムの洗浄後、糖鎖の溶出を、該糖鎖を有効に溶出できる中性の非変性緩衝液中で、塩化ナトリウム、ハプテン糖などの脱着剤を用いて行う。この緩衝液は、上記と同様であってもよい。脱着剤の濃度は、好ましくは１〜500mM、特に好ましくは10〜200ｍMである。 After washing of the affinity column, elution of sugar chains is performed using a desorbing agent such as sodium chloride or hapten sugar in a neutral non-denaturing buffer solution that can effectively elute the sugar chains. This buffer may be the same as described above. The concentration of the desorbing agent is preferably 1 to 500 mM, particularly preferably 10 to 200 mM.
糖鎖の検出には、上記以外のクロマトグラフィー、レクチンチップ、酵素免疫測定（ELISA）法、凝集法、Biacore（登録商標）システム、表面プラズモン共鳴バイオセンサなどの当業者に周知の方法を使用することができる。 For detection of sugar chains, methods well known to those skilled in the art such as chromatography, lectin chips, enzyme immunoassay (ELISA) method, aggregation method, Biacore (registered trademark) system, surface plasmon resonance biosensor, etc. are used. be able to.
図２の上段に示すように、BVL固定化カラムに糖鎖試料を通して吸着されたものは、３本以上の側鎖を有する複合型N型糖鎖であることが判明する。一方、吸着されなかったものは、そのような複合型N型糖鎖でないことが判明する。 As shown in the upper part of FIG. 2, what is adsorbed through the sugar chain sample on the BVL-immobilized column is found to be a complex N-type sugar chain having three or more side chains. On the other hand, those that were not adsorbed are found not to be such complex N-type sugar chains.
本発明の検出方法は、また、BVLからなる検出手段に、さらに、分岐度で親和性の異なるレクチンからなる検出手段を組み合わせることも可能である。BVLレクチンを用いた検出工程と、分岐度で親和性の異なるレクチンを用いた検出工程とは、いずれが前後しても、あるいは同時に行ってもよい。 In the detection method of the present invention, it is also possible to combine a detection means consisting of BVL and a detection means consisting of lectins having different degrees of branching and affinity. Any of the detection step using BVL lectin and the detection step using lectins with different degrees of branching and affinity may be performed before or after or simultaneously.
分岐度で親和性の異なるレクチンの例としては、４本鎖には親和性を示すが、３本鎖には親和性を示さないPHA−Lである。BVLとPHA−Lとを組み合わせると、３本鎖以上の複合型N型糖鎖が、３本かまたは４本以上の側鎖であるかを決定できる。 An example of a lectin having a different degree of branching and affinity is PHA-L, which shows affinity for four strands but does not show affinity for three strands. When BVL and PHA-L are combined, it can be determined whether three or more complex N-type sugar chains are three or four or more side chains.
図２の中段に示すように、BVL固定化カラムに試料を通して吸着されたもの（３本鎖以上の糖鎖）をPHA−Lに通し、そこに吸着されなかったものは、３本側鎖の糖鎖であることが判明する。一方、吸着されたものは、４本以上の側鎖を有する糖鎖であることが判明する。 As shown in the middle of FIG. 2, the sample adsorbed through the BVL-immobilized column (three or more sugar chains) was passed through PHA-L, and the one not adsorbed there was the three side chains. It turns out to be a sugar chain. On the other hand, what has been adsorbed is found to be a sugar chain having four or more side chains.
本発明の検出方法は、また、BVLからなる検出手段に、さらに、シアル酸（±）の糖鎖との親和性を有するレクチンからなる検出手段を組み合わせることも可能である。このような二種類のレクチンを組み合わせることで、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の末端シアル酸（±）に関するプロファイリングが可能となる。BVLを用いた検出工程と、シアル酸（±）の糖鎖との親和性を有するレクチンを用いた検出工程とは、いずれが前後しても、あるいは同時に行ってもよい。 In the detection method of the present invention, it is also possible to combine a detection means consisting of BVL with a detection means consisting of a lectin having an affinity for a sialic acid (±) sugar chain. By combining these two types of lectins, profiling of terminal sialic acid (±) of a complex N-type sugar chain of three or more chains can be performed. Any of the detection step using BVL and the detection step using a lectin having affinity for the sugar chain of sialic acid (±) may be performed before or after or simultaneously.
シアロ糖鎖との親和性を有するレクチンの例としては、カブトムシレクチン（Allo-A）、ナメクジレクチン（LFA）、カブトガニレクチン（limulin）、イヌエンジュレクチン（MAM,MAH,MAL）およびセイヨウニワトコレクチン（SNA）、ニホンニワトコレクチン（SSA）、キカラスウリレクチン(TJA-I)が挙げられる。BVLにて吸着された３本鎖以上の糖鎖をさらに上記レクチンに通して吸着されたものは、３本鎖以上のシアロ複合型N型糖鎖と判断される。一方、上記レクチンに吸着されなかったものは、３本鎖以上のアシアロ糖鎖と判断される。 Examples of lectins having affinity for sialic sugar chains include beetle lectin (Allo-A), slug lectin (LFA), horseshoe crab lectin (limulin), dog endurectin (MAM, MAH, MAL), and elder collectin (SNA). ), Japanese elder collectin (SSA), and Kikarasuri lectin (TJA-I). Those adsorbed through the lectin through three or more sugar chains adsorbed by BVL are judged to be three or more sialo complex N-type sugar chains. On the other hand, those not adsorbed to the lectin are judged to be three or more asialo sugar chains.
アシアロ糖鎖との親和性を有するレクチンには、シアル酸の付加した糖鎖との親和性の低いものを制限なく使用できる。好ましくは、N-アセチルラクトサミンには親和性を有するが、末端にシアル酸を有するN-アセチルラクトサミンには親和性を有さないものである。このようなレクチンの例には、DSA、PHA−E、RCA120、ECA、PHA−Lなどが挙げられる。糖鎖試料をBVLカラムに通して吸着された３本鎖以上の複合型N型糖鎖をさらに上記レクチンに通して吸着されたものは、アシアロの３本鎖以上の複合型N型糖鎖と判断される。一方、上記レクチンに吸着されなかったものは、シアロの３本鎖以上の複合型N型糖鎖と判断される。 As a lectin having an affinity for an asialo sugar chain, one having a low affinity for a sialic acid-added sugar chain can be used without limitation. Preferably, it has an affinity for N-acetyllactosamine, but has no affinity for N-acetyllactosamine having a sialic acid at the terminal. Examples of such lectins include DSA, PHA-E, RCA120, ECA, PHA-L and the like. Three or more complex N-type glycans adsorbed by passing a glycan sample through a BVL column and further adsorbed through the lectin are combined with three or more complex N-type glycans of Asialo. To be judged. On the other hand, those not adsorbed to the lectin are judged to be complex N-type sugar chains of three or more sialo chains.
特に好ましくは、アシアロ３本鎖に対して親和性を有するがシアロ３本鎖に対しては親和性の低いDSA、あるいはアシアロ４本鎖に対して親和性を有するがシアロ４本鎖に対しては親和性の低いPHA−Lである。 Particularly preferably, DSA has affinity for asialo 3 strands but has low affinity for sialo 3 strands, or has affinity for asialo 4 strands but for sialo 4 strands. Is PHA-L with low affinity.
図２の下段に示すように、BVL固定化カラムに吸着された３本鎖以上の複合型N型糖鎖をPHA−L固定化カラムに通し、そこに吸着されなかった３本側鎖のN型糖鎖を、DSA固定化カラムに通す。このカラムに吸着されたものは、アシアロの３本側鎖のN型糖鎖であることが判明する。カラムに吸着されなかったものは、シアロの３本側鎖のN型糖鎖であることが判明する。また、PHA−L固定化カラムに吸着された４本以上の側鎖のN型糖鎖をPHA−E固定化カラムに通して吸着されたものは、アシアロの４本以上側鎖のN型糖鎖である。カラムに吸着されなかったものは、シアロの４本以上側鎖のN型糖鎖である。 As shown in the lower part of FIG. 2, three or more complex N-type sugar chains adsorbed on the BVL-immobilized column are passed through the PHA-L-immobilized column, and the three side-chain N not adsorbed there The type sugar chain is passed through a DSA-immobilized column. Those adsorbed on this column are found to be N-type sugar chains of the three side chains of Asialo. Those that were not adsorbed on the column were found to be N-type sugar chains of the three side chains of sialo. In addition, four or more side-chain N-type sugar chains adsorbed on the PHA-L-immobilized column are passed through the PHA-E-immobilized column, and asialo four or more side-chain N-type sugar chains are adsorbed. Is a chain. Those that were not adsorbed on the column were N-type sugar chains of four or more side chains of sialo.
上記シアロ糖鎖またはアシアロ糖鎖との親和性を有するレクチンには、BVLと同様に、標識手段が組み込まれていることが好ましい。 Like the BVL, it is preferable that a labeling means is incorporated in the lectin having an affinity for the above sialosugar chain or asialosugar chain.
本発明はまた、BVLを分別手段とする、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の分別方法を提供する。本発明の分別方法は、例えば固定化された前記BVLを用いるレクチンクロマトグラフィーである。その詳細は、前記検出方法で説明したものと同様である。３本鎖以上の複合型Ｎ型糖鎖の精製を行う場合、BVLを、アガロースやセルロースからなるカラム担体に官能基を介して共有結合させて親和性カラムを調製し、糖鎖試料を通す。通液後、吸着した複合型糖鎖を回収する。上記以外の糖鎖の精製を行う場合、上記カラムに糖鎖試料を通液する際、吸着されずに通過する糖鎖試料を回収する。 The present invention also provides a method for fractionating complex N-type sugar chains of three or more chains using BVL as a means for fractionation. The fractionation method of the present invention is, for example, lectin chromatography using the immobilized BVL. The details are the same as those described in the detection method. When purifying complex N-type sugar chains having three or more chains, an affinity column is prepared by covalently bonding BVL to a column carrier made of agarose or cellulose via a functional group, and the sugar chain sample is passed through. After passing through, the adsorbed complex type sugar chain is recovered. When purifying sugar chains other than those described above, when the sugar chain sample is passed through the column, the sugar chain sample that passes without being adsorbed is collected.
前記分別手段に、さらに、分岐度で親和性の異なるレクチンからなる分別手段を組み合わせるも可能である。BVLを用いた分別工程と、分岐度で親和性の異なるレクチンを用いた分別工程とは、いずれが前後しても、あるいは同時に行ってもよい。 In addition to the sorting means, a sorting means composed of lectins having different degrees of branching and affinity may be combined. Any of the fractionation step using BVL and the fractionation step using lectins having different degrees of branching affinity may be performed before or after or simultaneously.
前記分岐度で親和性の異なるレクチンの例は、PHA−Lである。BVLとPHA−Lを組み合わせて使用すると、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の３本側鎖と４本以上の側鎖とを分別できる。 An example of a lectin having a different affinity depending on the degree of branching is PHA-L. When BVL and PHA-L are used in combination, the three side chains and the four or more side chains of the complex N-type sugar chain of three or more chains can be separated.
前記分別手段に、さらに、シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンからなる分別手段を組み合わせることも可能である。BVLレクチンを用いた分別工程と、シアル酸（±）の糖鎖との親和性を有するレクチンを用いた分別工程とは、いずれが前後しても、あるいは同時に行ってもよい。 In addition to the fractionation means, a fractionation means composed of a lectin having affinity for sialic acid (±) sugar chains can be combined. The fractionation step using BVL lectin and the fractionation step using lectin having affinity for sialic acid (±) sugar chains may be performed either before or after or simultaneously.
前記シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンの例は、DSAおよび／またはPHA−Eレクチンである。 Examples of lectins having affinity for the sialic acid (±) sugar chain are DSA and / or PHA-E lectins.
本発明はまた、前記BVLを有効成分とする、３本鎖以上の複合型Ｎ型糖鎖を検出するための試薬、および該試薬を含む試薬キットを提供する。 The present invention also provides a reagent for detecting a complex type N-type sugar chain having three or more chains, wherein BVL is an active ingredient, and a reagent kit containing the reagent.
本発明の試薬または試薬キットは、さらに分岐度で親和性の異なるレクチンからなる検出手段、および／またはシアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンからなる検出手段を含んでもよい。 The reagent or reagent kit of the present invention may further comprise a detection means comprising a lectin having a different degree of branching and a different affinity and / or a detection means comprising a lectin having an affinity for a sialic acid (±) sugar chain.
本発明の試薬または試薬キットは、通常この分野で用いられる公知の試薬をBVLやその他のレクチンの反応を阻害しない範囲で添加してもよい。そのような例には、緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、安定化剤、防腐剤などが挙げられる。 In the reagent or reagent kit of the present invention, a known reagent usually used in this field may be added within a range not inhibiting the reaction of BVL or other lectins. Examples thereof include buffers, reaction accelerators, saccharides, proteins, salts, stabilizers, preservatives and the like.
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail using examples, but the present invention is not limited to the following examples.
〔実施例１〕（赤血球凝集阻害試験）
ウサギ赤血球凝集阻害試験を利用して、BVL、DSA、ECA、RCA120、PHA−E、PHA−LおよびLELの糖結合特異性を評価した。具体的には、以下の手順で評価した。
[Example 1] (Hemagglutination inhibition test)
The rabbit hemagglutination inhibition test was used to evaluate the sugar binding specificity of BVL, DSA, ECA, RCA120, PHA-E, PHA-L and LEL. Specifically, the evaluation was performed according to the following procedure.
まず、表２および３に示す糖、糖タンパク質及び合成ポリマーを適量秤量し、PBSを添加して糖類なら300mM、糖タンパク質なら1.5mg/mlの糖類溶液を作製した。 First, sugars, glycoproteins and synthetic polymers shown in Tables 2 and 3 were weighed appropriately, and PBS was added to prepare a saccharide solution of 300 mM for saccharides and 1.5 mg / ml for glycoproteins.
次に、表２および３に示すレクチンを、PBSに溶かして0.2mg/mlに調製後、赤血球が凝集する最低希釈倍率の２〜４倍になるようにPBSでさらに希釈してレクチン溶液を得た。 Next, the lectins shown in Tables 2 and 3 were dissolved in PBS to a concentration of 0.2 mg / ml, and then further diluted with PBS to obtain a lectin solution at 2 to 4 times the lowest dilution factor at which erythrocytes aggregate. It was.
次いで、96穴プレート（Falcon）の各ウェルにPBSを50μlずつ入れ、これに糖類溶液を50μl入れ、順次、1/2希釈系列を作製した。その後、各ウェルに、前記レクチン溶液を25μlずつ添加した。 Next, 50 μl of PBS was added to each well of a 96-well plate (Falcon), 50 μl of saccharide solution was added thereto, and a 1/2 dilution series was sequentially prepared. Thereafter, 25 μl of the lectin solution was added to each well.
室温で60分間放置後、各ウェルに4％ウサギ赤血球液（PHA-Lはヒツジ赤血球を使用）を25μlずつ添加した。室温で１時間放置後、各ウェルの底部への赤血球の沈降状態により凝集の有無を判定した。各糖類の凝集阻害を起こすことができた最低濃度を算出した。その結果を、表２および表３に示す。 After standing at room temperature for 60 minutes, 25 μl of 4% rabbit erythrocyte liquid (PHA-L uses sheep erythrocytes) was added to each well. After standing at room temperature for 1 hour, the presence or absence of aggregation was determined by the sedimentation state of red blood cells at the bottom of each well. The minimum concentration that could cause aggregation inhibition of each saccharide was calculated. The results are shown in Table 2 and Table 3.
*N-アセチルラクトサミン合成ポリマーpoly(LacNAc-pAP/Gln-co-Gln)は文献を参考。
Arch. Biochem. Biophys., 2000, 383(1):28-37
Glycobiology, 2003, 13(5):315-326
* Refer to literature for N-acetyllactosamine synthetic polymer poly (LacNAc-pAP / Gln-co-Gln).
Arch. Biochem. Biophys., 2000, 383 (1): 28-37
Glycobiology, 2003, 13 (5): 315-326
表２および３から、以下のことがわかる。ECAおよびRCA120は、ガラクトースを有する糖と結合する。ECAおよびRCA120は、N型糖鎖もＯ型糖鎖も結合する。LELは、キトオリゴ糖で阻害される。DSAは、ポリラクトサミンに強く結合する。それに対して、BVLは、N型糖鎖の３本鎖および／または４本鎖を有するフェツイン、アシアロフェツイン、α１−酸性糖タンパクおよびチログロブリンで凝集阻害される。また、BVLは、N-アセチルラクトサミン合成ポリマーpoly(LacNAc-pAP/Gln-co-Gln)には凝集阻害されない。 Tables 2 and 3 show the following. ECA and RCA120 bind to sugars with galactose. ECA and RCA120 bind both N-type and O-type sugar chains. LEL is inhibited with chitooligosaccharides. DSA binds strongly to polylactosamine. In contrast, BVL is aggregation-inhibited by fetuin, asialofetuine, α1-acid glycoprotein and thyroglobulin having triple and / or quadruple N-type sugar chains. Further, BVL is not inhibited from aggregation by the N-acetyllactosamine synthetic polymer poly (LacNAc-pAP / Gln-co-Gln).
〔実施例２〕（糖鎖の検出）
BVL、DSA、ECA、RCA120、PHA−E、PHA−LおよびLELの固定化カラムを用いて、図３〜８に示す標識化糖との相互作用解析を行った。
[Example 2] (Detection of sugar chain)
Using the BVL, DSA, ECA, RCA120, PHA-E, PHA-L and LEL immobilized columns, the interaction analysis with the labeled sugar shown in FIGS.
相互作用解析には、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー法（測定装置：FAC−１自動分析装置、（株）島津製作所製）を用いた。詳細には、調製したレクチンカラムを、ステンレスホルダーに差し込み、FAC-1装置に接続した。流速およびカラム温度を、それぞれ0.125ml/minおよび25℃に保った。前記TBS緩衝液でミニチュアカラムを平衡後、過剰容積(0.5〜0.8ml)のPA-糖鎖(2.5または5.0nM)を、自動サンプリング装置を用いてカラム中へ連続注入した。 For the interaction analysis, a frontal affinity chromatography method (measuring device: FAC-1 automatic analyzer, manufactured by Shimadzu Corporation) was used. Specifically, the prepared lectin column was inserted into a stainless steel holder and connected to a FAC-1 apparatus. The flow rate and column temperature were kept at 0.125 ml / min and 25 ° C., respectively. After equilibrating the miniature column with the TBS buffer, an excess volume (0.5 to 0.8 ml) of PA-sugar chain (2.5 or 5.0 nM) was continuously injected into the column using an automatic sampling device.
PA糖鎖の溶出液の蛍光強度(励起波長310nmおよび蛍光波長380nm)をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（PA-ラムノース）に対する前端溶出液の差：V-V0〕を測定した。次いで、レクチン毎に、溶出の遅れの強い糖鎖を100％とし、各糖鎖に対する相対値を計算した。相互作用強度の算出結果を表４および図９〜１５に示す。 The fluorescence intensity (excitation wavelength: 310 nm and fluorescence wavelength: 380 nm) of the eluate of PA sugar chain was monitored, and the interaction intensity [difference in front eluate with respect to standard oligosaccharide (PA-rhamnose: VV 0 )] was measured. Next, for each lectin, the sugar chain with a strong elution delay was taken as 100%, and the relative value for each sugar chain was calculated. The calculation results of the interaction strength are shown in Table 4 and FIGS.
図表から以下のことがわかる。BVLのみが、N型糖鎖の４本鎖および３本鎖に特異的に結合する。DSAおよびECAは、糖鎖410のアシアロ糖鎖に親和性を有するものの、糖鎖番号５０４のシアロ糖鎖には結合し難くなっている。それに対して、ＢVLは、シアロ糖鎖に対しても親和性が維持する。 The chart shows the following. Only BVL specifically binds to the 4 and 3 chains of N-type sugar chains. DSA and ECA have affinity for the asialo sugar chain of sugar chain 410, but are difficult to bind to the sialo sugar chain of sugar chain number 504. In contrast, BVL maintains affinity for sialosaccharide chains.
〔実施例３〕（糖タンパク質の結合性評価）
ビオチン標識化したBVL、DSA、ECA、RCA120、PHA−E、PHA−LおよびLELを用いて、酵素免疫測定法による糖タンパク質結合性評価を行った。
[Example 3] (Evaluation of glycoprotein binding)
Using biotin-labeled BVL, DSA, ECA, RCA120, PHA-E, PHA-L and LEL, glycoprotein binding was evaluated by enzyme immunoassay.
まず、0.1M炭酸緩衝液（pH9.5）で糖タンパク質溶液を調製し、マイクロタイタープレート(Nunc 439454)に添加し、4℃で一晩インキュベートした。0.05％Tween/PBSで３回洗浄後、1％BSA/PBSをウェルに添加して37℃で1時間インキュベートした。0.05％Tween/PBSで３回洗浄後、1％ BSA/0.05％ Tween/PBSで適宜希釈したビオチン標識化レクチン溶液をウェルに添加して37℃で1時間インキュベートした。0.05％Tween/PBSで３回洗浄後、1％ BSA/0.05％ Tween/PBSで希釈したHRP標識ストレプトアビジン溶液を添加して37℃で30分間インキュベートした。0.05％Tween/PBSで３回洗浄後、TMB Peroxidase substrate system (KPL 50-76-00)を添加し、遮光して室温で10分間インキュベートした。1Mリン酸で反応を停止し、マイクロプレートリーダー(TOSOH MPR-A4i)で450nmにおける吸光度を測定した。 First, a glycoprotein solution was prepared with 0.1 M carbonate buffer (pH 9.5), added to a microtiter plate (Nunc 439454), and incubated overnight at 4 ° C. After washing 3 times with 0.05% Tween / PBS, 1% BSA / PBS was added to the wells and incubated for 1 hour at 37 ° C. After washing 3 times with 0.05% Tween / PBS, a biotin-labeled lectin solution appropriately diluted with 1% BSA / 0.05% Tween / PBS was added to the wells and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After washing 3 times with 0.05% Tween / PBS, an HRP-labeled streptavidin solution diluted with 1% BSA / 0.05% Tween / PBS was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After washing 3 times with 0.05% Tween / PBS, TMB Peroxidase substrate system (KPL 50-76-00) was added and incubated for 10 minutes at room temperature, protected from light. The reaction was stopped with 1M phosphoric acid, and the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (TOSOH MPR-A4i).
反応させたプレートの450nmにおける吸光度を測定し、この値から反応値（[450nmにおける吸光度]-[糖タンパク質をプレートに固相化せず反応させたウェルの値]）を算出した。次いで、各レクチンにおいて吸光度が高い糖タンパク質の相互作用強度を100％とし、その他の糖タンパク質の相互作用強度を相対値として計算した。結果を表５および図１６〜２２に示す。 The absorbance at 450 nm of the reacted plate was measured, and the reaction value ([absorbance at 450 nm]-[value of well reacted without immobilizing glycoprotein on the plate]) was calculated from this value. Subsequently, the interaction intensity of glycoproteins having high absorbance in each lectin was calculated as 100%, and the interaction intensity of other glycoproteins was calculated as a relative value. The results are shown in Table 5 and FIGS.
図表から、BVLのみが、N型糖鎖の３本鎖以上の糖鎖を含有する糖タンパクを検出できることがわかる。 From the chart, it can be seen that only BVL can detect glycoproteins containing 3 or more sugar chains of N-type sugar chains.
１： Ｇａｌ
２： ＧｌｃＮＡｃ
３： Ｍａｎ
４： Ｌ−Ｆｕｃ
５： Ｎｅｕ５Ａｃ
６： Ｇｌｃ
1: Gal
2: GlcNAc
3: Man
4: L-Fuc
5: Neu5Ac
6: Glc
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