JP5071191B2 - 複合型ｎ型糖鎖の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、複合型N型糖鎖の検出方法などに関し、より詳細には、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の検出方法などに関する。

糖タンパク質のアスパラギンにN−グリコシド結合した糖鎖は、５糖からなるコア構造に、シアル酸、ガラクトースおよびN-アセチルグルコサミンで構成される側鎖（N-アセチルラクトサミン構造、ポリN-アセチルラクトサミン構造）が１〜６本付加された構造を有する。このような糖鎖は、側鎖の数によって２本鎖、３本鎖などの複合型Ｎ型糖鎖と呼ばれている。

ガン化に伴い、ヒト血清中の前立腺がんマーカー（prostate specific antigen； PSA）やトランスフェリンにおいては、高分岐糖鎖が増加することが知られている。

高分岐糖鎖の増加は、ポリN-アセチルラクトサミン量の増加にもつながる（非特許文献１など）。３本鎖以上の複合型N型糖鎖は、ガンの発症、転移、再発などと関連している疑いが高い。そこで、高分岐の複合型N型糖鎖を特異的に検出して正確にプロファイリングすることが、癌の診断や予後の観察に役立つ。

従来、３本鎖や４本鎖に結合することが知られているレクチンの例として、ヒマレクチン（RCA120）やデイゴマメレクチン（ECA）がある。これらのレクチンは、ガラクトース骨格やラクトース骨格、１本鎖または２本鎖のN型糖鎖、O型糖鎖のポリラクトサミンとも結合しやすい。RCA120やECAは、末端ガラクトースにシアル酸が付加していないアシアロ糖鎖には親和性を有するが、シアロ糖鎖（シアリル糖鎖ともいう）との親和性は低くなる。

このように３本鎖や４本鎖を特異的に検出するレクチンが存在しない現状において、３本鎖や４本鎖を特異的に検出するために二種類以上のレクチンを用いる方法が採用されている。例えば、チョウセンアサガオレクチン（DSA）は、N型糖鎖だけの高分岐に親和性を持つが、さらにO型糖鎖のポリラクトサミンやキチンなどに含まれるキトオリゴ糖にも強く結合する。一方、インゲンマメレクチン-L（PHA−L）は、O型糖鎖のポリラクトサミンやキチンのキトオリゴ糖と親和性を持たないが、高分岐のN型糖鎖と結合する。そこで、DSAで結合するものを一次スクリーニングし、結合したものをさらにPHA−Lで二次スクリーニングすることで、高分岐のN型糖鎖の存在を判別する。同様に、ポリラクトサミンの伸長の研究（免疫学機能研究など）では、チョウセンアサガオレクチン（DSA）とトマトレクチン（LEL）が用いられる。

しかし、上記方法は、高分岐N型糖鎖を調べるだけでも煩雑過ぎる。また、シアル酸がついたN型糖鎖となると、その反応性が低下するなどの問題もある。二種以上のレクチンを使用するとしても、高分岐N型糖鎖のより詳細な構造を調べられることが望ましい。
実験医学 vol. 25 No.7, 2007

上記した従来のレクチンの問題に鑑み、本発明の目的は、高分岐のN型糖鎖を簡便に検出および分別する方法を提供することにある。

さらに、本発明の目的は、二種以上のレクチンを組み合わせて、高分岐のN型糖鎖のより詳細な構造を検出および分別する方法を提供することにある。

さらに、本発明の目的は、高分岐型糖鎖を特異的に検出するレクチンを用いて、３本鎖以上の複合型N型糖鎖を測定する試薬を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、ドクヤマドリ由来のキノコレクチン（以下、ドクヤマドリレクチンまたはBVLという）が、３本以上の側鎖を有する複合型N型糖鎖と特異的に結合することを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、ドクヤマドリレクチンを検出手段とする、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の検出方法および分別方法を提供する。該検出手段の具体的な使用方法は、特に制限されず、常法のものを使用可能である。

上記の「側鎖」とは、本明細書において、コア構造に結合するN-アセチルラクトサミン構造（Galβ１→４GlcNAｃ）および／またはポリN-アセチルラクトサミン構造（Galβ１→４GlcNAｃβ１→３の繰り返し構造）の意味で使用される。

BVLは、従来のレクチンと比べて３本以上の側鎖を高分岐型N型糖鎖により特異的に結合する。しかも、BVLを使用した本発明の検出および分別方法では、側鎖の末端ガラクトースにシアル酸が付加していても親和性が低下しない。

本発明の検出および分別方法は、また、前記検出または分別手段に、分岐度で親和性の異なるレクチンを含めてもよい。このようなレクチンとしては、例えば４本鎖に親和性を示すが、３本鎖に親和性を示さないPHA−Lが挙げられる。BVLとPHA−Lとを組み合わせると、３本鎖以上の複合型N型糖鎖が３本側鎖またはそれ以上なのかの調査が可能になる。

本発明の検出および分別方法は、前記検出または分別手段に、さらに、シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンを含めてもよい。本明細書において、「シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチン」とは、シアロ糖鎖との親和性を有するレクチン、またはアシアロ糖鎖との親和性を有するレクチンの意味である。このようなレクチンは、例えばシアル酸末端付加の３本鎖に親和性の低いDSAや、シアル酸末端付加の４本鎖に親和性の低いPHA−Eである。これらのレクチンとBVLとを組み合わせると、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の末端ガラクトースにシアル酸が付加されているか否かについて検出などが可能にある。

BVLが必須の本発明の検出または分別方法によれば、３本以上の側鎖を有するN型糖鎖を特異的に検出し、また分離精製することが可能である。従来の方法では、３本以上の側鎖を有するシアロN型糖鎖を特異的に検出し、また分離精製することができなかったが、本発明では、３本以上の側鎖を有するN型糖鎖の検出、または分離が確実に可能である。

BVLからなる検出・分別手段に、さらに、３本側鎖と４本側鎖とで親和性の異なるレクチンを組み合わせると、３本以上の側鎖の有する複合型N型糖鎖をさらに詳細にプロファイリングすることができる。高分岐側鎖の微細な変異は疾患と関連するので、本発明での詳細なプロファイリングは疾患の解明などに役立つことが多いに期待される。

BVLからなる検出・分別手段に、さらにシアル酸（±）の糖鎖との親和性を有するレクチンを組み合わせると、３本以上の側鎖のN型糖鎖のシアル酸（±）に関するプロファイリングが可能になる。末端シアル酸の有無もまた、疾患と関連するので、本発明による詳細なプロファイリングは疾患の解明などに役立つことが大いに期待される。

以下に、添付の図面を用いて、本発明の実施の形態をより詳細に説明する。
（ＢＶＬ）
まず、本発明の検出・分別方法に使用するドクヤマドリレクチン（BVL）を説明する。該レクチンは、イグチ科イグチ属ドクヤマドリ（Boletus sp.）を原料とし、例えば図１に示す方法で単離精製することができる。図１の方法を、以下に詳細に説明する。

（粗抽出液の調製）
ドクヤマドリの子実体100ｇに、リン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）（以下、PBSとする）を200ml加えて、ミキサーにて破砕する。これを4℃で2時間かけて抽出する。抽出液を遠心分離(8,500×g,15min,4℃)後、吸引濾過により上清を得る。再び、残渣にPBSを250ml加えて、攪拌する。攪拌液を4℃で一晩抽出する。このPBS抽出を6回繰り返す。

（硫安塩析）
上記抽出液に、硫酸アンモニウムを最終濃度が80％飽和になるように加える。この混合液を4℃で2時間放置して、タンパク質を充分沈殿させる。遠心分離(8,500×g,15min,4℃)させた沈殿物を、PBSで溶かし、水で透析する。凍結乾燥したものを80％硫安画分とする。

（Super Q強陰イオン交換クロマトグラフィー）
80％硫安画分150mgをMilli Q水5mlに溶解する。遠心分離（7,000×g,10min）後、上清を回収する。沈殿物にMilli Q水5mlを加え遠心分離し、上清を回収し、合わせて、硫安上清10mlを得る。50mM Tris-HCl(pH8.5)であらかじめ平衡化したSuper Q強陰イオン交換クロマトグラフィー(φ5.0×20cm)に供する。非吸着部を同緩衝液で充分に洗浄した後、50mM NaCl/50mM Tris-HCl(pH8.5)、1M NaCl/50mM Tris-HCl(pH8.5)で、順次溶出する。

（ゲル濾過クロマトグラフィー）
Super Q強陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた活性画分を、HPLCシステムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供する。試料10.0mgをPBS 1mlに溶解し、あらかじめ同緩衝液であるPBSで平衡化しておいたTSK-gel G3000SWカラム（φ1.6×60cm）に流速5.0ml/minで供し、溶出させる。

赤血球凝集活性および吸光度（OD280ｎｍ）の両方が高い画分を回収する。回収された画分は、透析膜（Spectra/Por Membrane MWCO:6-8,000）に入れ、100倍量の蒸留水による4℃での透析に３回供する。透析後、各画分を凍結乾燥して、凍結乾燥粉末をBVLとする。

（BVLの特異性）
次に、BVLの糖鎖結合性を説明する。糖鎖結合性は、例えばフロンタルアフィニティクロマトグラフィー（FAC）法によって測定することができる。このフロンタルアフィニティクロマトグラフィーは、レクチンを固定化したカラムに、蛍光標識した糖鎖の一定濃度の希釈液を流した際、レクチンと糖鎖とが相互作用がなければ糖鎖は短時間でカラムから流れ出、溶出前端（フロント）が即座に観察され、一方、レクチンとの親和性がある場合、糖鎖の溶出が遅れるという原理に基づく。

レクチンカラムの調製は、以下のようにして行われる。
１． 精製レクチンを0.1〜0.2M NaHCO₃緩衝液(pH8.3〜8.5)に溶解する。
２． レクチンの一級アミノ基を介してNHS活性化セファロース（GEヘルスケアバイオサイエンス）などの担体に固定化する。
３． 一級アミンを含むトリス緩衝液やエタノールアミンなどでブロッキングする。
４． 0.8％ NaClを含む10mM Tris-HCl緩衝液（pH7.4、TBS)中にレクチン固定化樹脂を懸濁させ、レクチン固定化樹脂を、ミニチュアカラム(φ2mm x 10mm, 31.4μl)に充填する。
５． レクチン固定化樹脂を充填したミニチュアカラムをホルダーで保護し、レクチンカラムをFAC自動分析装置（FAC-1装置、（株）島津製作所製）に接続する。

平衡化したレクチンカラムに対し、分析用緩衝液（0.8％NaClを含む10mMTris-HCl緩衝液（ｐH7.4））でレクチンが持つ解離定数（K_d）よりも充分低い濃度（2.5nM）に希釈したピリジルアミノ化糖鎖（PA化糖鎖）を、流速0.125ml／minで500μl注入する。カラムからのPA化糖鎖の溶出を、蛍光検出器（励起波長／蛍光波長：310nm／380nm）を用いて検出する。

検出データから、レクチンと相互作用しない糖鎖（PA化ラムノース）の溶出前端容積（V₀）を基準とし、相互作用する糖鎖の溶出前端容積（V）の遅れ（V-V₀）（単位μl）を相互作用強度として算出する。相互作用強度（V-V₀）が大きいほど、糖鎖との親和性が高い。

さらに、FAC法の以下の基準式に基づいて、V-V₀およびB_tから糖鎖とレクチンとの結合定数（K_a）を求めることもできる。

〔式中、Aは溶出に用いる物質、A_０は物質Aの初濃度、Bは固定化リガンド、Vは溶出容積、V_０は固定化リガンドBと全く相互作用しない物質の溶出前端容積、B_tは有効リガンド量、K_dは解離定数（結合定数の逆数）を意味する〕。上記の基準式において、A_０がK_dと比較して無視できるほど小さいときは、(2)は(3)のように簡略化できる。

（各種レクチンの特異性）
フロンタルアフィニティクロマトグラフィーを用いて測定したBVL、DSA、PHA−L、PHA−E、ECA、RCA120およびLELの特異性を表１に示す。表１において、評価基準は以下のとおりである。
○ ： 糖鎖との親和性が強い
△ ： 糖鎖との親和性が弱い
× ： 糖鎖との親和性が見られない／検出限界以下

表１に示すように、BVLは、N型糖鎖のコア構造に結合するN-アセチルラクトサミン構造と特異的に結合する。すなわち、高分岐型糖鎖に親和性を有することが知られているDSAは、O型糖鎖のポリラクトサミンやキチンのキトオリゴ糖とも親和性を有する。一方、BVLは、O型糖鎖のポリラクトサミンやキチンのキトオリゴ糖とは親和性を有さない。さらに、BVLは、末端ガラクトースにシアル酸が付加した側鎖に対しても強い親和性を有する。この点でも、シアロ糖鎖に対しては親和性が弱いDSAやPHA−L、PHA−Eと対照的である。

（BVLを使った糖タンパクの検出）
本発明の検出方法は、複合型N型糖鎖の存在が予想または疑われる糖鎖試料に対して、検出手段としてBVLを作用させる以外は、特に限定されない。検出方法の例には、レクチンクロマトグラフィー、レクチンチップ、レクチン染色などが挙げられる。レクチンクロマトグラフィーは、固定化されたBVLが糖鎖と特異的に結合する性質を利用したアフィニティクロマトグラフィーである。HPLCと組み合わせる（HPLAC）と、ハイスループットを期待できる。

BVLには、標識手段が組み込まれていることが好ましい。このようなレクチンを以下、標識レクチンということがある。標識レクチンは、BVLと標識手段とを少なくとも含み、検出可能に標識化されていることを特徴とする。

標識手段としては、特に制限なく公知の標識化方法を適用することができ、例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合などを挙げることができる。前記標識化合物としては、この用途に通常用いられるものであれば特に制限なく適用することができ、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物などを挙げることができる。具体的には、ビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅなどを挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりレクチンと結合することができる。

BVLを固定化する担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース、スターチ、ポリアクリルアミドなどのゲル材が一般的である。これらには、市販のものを特に制限なく使用でき、例えばセファロース４Bやセファロース６B（共にGEヘルスケアバイオサイエンス）が挙げられる。

また、レクチンクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、マイクロプレートやナノウエルにレクチンを固定化したものも含まれる。

固定化するレクチンの濃度は、通常、0.0001〜100mg/mlでよく、好ましくは0.01〜20mg/mlである。担体がアガロースゲルの場合、それをCNBrなどで活性化してからレクチンとカップリングさせる。活性化スペーサーを導入したゲルにレクチンを固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルにレクチンを固定化してからNaCNBH₃で還元してもよい。また、NHS-セファロース（GEヘルスケアバイオサイエンス）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。

糖鎖試料は、複合型Ｎ型糖鎖の存在が予想されるものであればよく、遊離のオリゴ糖鎖、Ｃｙ３、アミノピリジンなどで蛍光標識された糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、細胞などのすべてを含有する。さらに、シアリダーゼ、ガラクシトターゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼのいずれかを使用してあるいはこれらを段階的に使用して、前記糖鎖を部分的に分解したものであってもよい。

糖鎖試料を採取する検体は、例えば、ヒトを含む動物の組織（特に病理組織）や体液（血漿、血清、唾液、乳汁、尿、涙など）である。これらの検体に界面活性剤および緩衝液を添加して、糖タンパク質を可溶化した後、アセトン、硫酸アンモニウムなどを添加して、さらに遠心分離して沈殿物中の糖タンパク質などを回収するとよい。

以下に、レクチンクロマトグラフィーの手順を説明する。BVLを固定化したカラムに糖鎖試料を通液する。糖鎖試料をカラムにかけた後、洗浄と平衡化の目的で緩衝液を流す。緩衝液の一例は、モル濃度が５〜500mM、好ましくは10〜500mMであり、pHが4.0〜10.0、好ましくは6.0〜9.0であり、NaCl含量が0〜0.5M、好ましくは0.1〜0.2Mであり、CaCl₂、MgCl₂またはMnCl₂含量が０〜10mM、好ましくは０〜５mMの緩衝液である。

アフィニティカラムの洗浄後、糖鎖の溶出を、該糖鎖を有効に溶出できる中性の非変性緩衝液中で、塩化ナトリウム、ハプテン糖などの脱着剤を用いて行う。この緩衝液は、上記と同様であってもよい。脱着剤の濃度は、好ましくは１〜500mM、特に好ましくは10〜200ｍMである。

糖鎖の検出には、上記以外のクロマトグラフィー、レクチンチップ、酵素免疫測定（ELISA）法、凝集法、Biacore（登録商標）システム、表面プラズモン共鳴バイオセンサなどの当業者に周知の方法を使用することができる。

図２の上段に示すように、BVL固定化カラムに糖鎖試料を通して吸着されたものは、３本以上の側鎖を有する複合型N型糖鎖であることが判明する。一方、吸着されなかったものは、そのような複合型N型糖鎖でないことが判明する。

本発明の検出方法は、また、BVLからなる検出手段に、さらに、分岐度で親和性の異なるレクチンからなる検出手段を組み合わせることも可能である。BVLレクチンを用いた検出工程と、分岐度で親和性の異なるレクチンを用いた検出工程とは、いずれが前後しても、あるいは同時に行ってもよい。

分岐度で親和性の異なるレクチンの例としては、４本鎖には親和性を示すが、３本鎖には親和性を示さないPHA−Lである。BVLとPHA−Lとを組み合わせると、３本鎖以上の複合型N型糖鎖が、３本かまたは４本以上の側鎖であるかを決定できる。

図２の中段に示すように、BVL固定化カラムに試料を通して吸着されたもの（３本鎖以上の糖鎖）をPHA−Lに通し、そこに吸着されなかったものは、３本側鎖の糖鎖であることが判明する。一方、吸着されたものは、４本以上の側鎖を有する糖鎖であることが判明する。

本発明の検出方法は、また、BVLからなる検出手段に、さらに、シアル酸（±）の糖鎖との親和性を有するレクチンからなる検出手段を組み合わせることも可能である。このような二種類のレクチンを組み合わせることで、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の末端シアル酸（±）に関するプロファイリングが可能となる。BVLを用いた検出工程と、シアル酸（±）の糖鎖との親和性を有するレクチンを用いた検出工程とは、いずれが前後しても、あるいは同時に行ってもよい。

シアロ糖鎖との親和性を有するレクチンの例としては、カブトムシレクチン（Allo-A）、ナメクジレクチン（LFA）、カブトガニレクチン（limulin）、イヌエンジュレクチン（MAM,MAH,MAL）およびセイヨウニワトコレクチン（SNA）、ニホンニワトコレクチン（SSA）、キカラスウリレクチン(TJA-I)が挙げられる。BVLにて吸着された３本鎖以上の糖鎖をさらに上記レクチンに通して吸着されたものは、３本鎖以上のシアロ複合型N型糖鎖と判断される。一方、上記レクチンに吸着されなかったものは、３本鎖以上のアシアロ糖鎖と判断される。

アシアロ糖鎖との親和性を有するレクチンには、シアル酸の付加した糖鎖との親和性の低いものを制限なく使用できる。好ましくは、N-アセチルラクトサミンには親和性を有するが、末端にシアル酸を有するN-アセチルラクトサミンには親和性を有さないものである。このようなレクチンの例には、DSA、PHA−E、RCA120、ECA、PHA−Lなどが挙げられる。糖鎖試料をBVLカラムに通して吸着された３本鎖以上の複合型N型糖鎖をさらに上記レクチンに通して吸着されたものは、アシアロの３本鎖以上の複合型N型糖鎖と判断される。一方、上記レクチンに吸着されなかったものは、シアロの３本鎖以上の複合型N型糖鎖と判断される。

特に好ましくは、アシアロ３本鎖に対して親和性を有するがシアロ３本鎖に対しては親和性の低いDSA、あるいはアシアロ４本鎖に対して親和性を有するがシアロ４本鎖に対しては親和性の低いPHA−Lである。

図２の下段に示すように、BVL固定化カラムに吸着された３本鎖以上の複合型N型糖鎖をPHA−L固定化カラムに通し、そこに吸着されなかった３本側鎖のN型糖鎖を、DSA固定化カラムに通す。このカラムに吸着されたものは、アシアロの３本側鎖のN型糖鎖であることが判明する。カラムに吸着されなかったものは、シアロの３本側鎖のN型糖鎖であることが判明する。また、PHA−L固定化カラムに吸着された４本以上の側鎖のN型糖鎖をPHA−E固定化カラムに通して吸着されたものは、アシアロの４本以上側鎖のN型糖鎖である。カラムに吸着されなかったものは、シアロの４本以上側鎖のN型糖鎖である。

上記シアロ糖鎖またはアシアロ糖鎖との親和性を有するレクチンには、BVLと同様に、標識手段が組み込まれていることが好ましい。

本発明はまた、BVLを分別手段とする、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の分別方法を提供する。本発明の分別方法は、例えば固定化された前記BVLを用いるレクチンクロマトグラフィーである。その詳細は、前記検出方法で説明したものと同様である。３本鎖以上の複合型Ｎ型糖鎖の精製を行う場合、BVLを、アガロースやセルロースからなるカラム担体に官能基を介して共有結合させて親和性カラムを調製し、糖鎖試料を通す。通液後、吸着した複合型糖鎖を回収する。上記以外の糖鎖の精製を行う場合、上記カラムに糖鎖試料を通液する際、吸着されずに通過する糖鎖試料を回収する。

前記分別手段に、さらに、分岐度で親和性の異なるレクチンからなる分別手段を組み合わせるも可能である。BVLを用いた分別工程と、分岐度で親和性の異なるレクチンを用いた分別工程とは、いずれが前後しても、あるいは同時に行ってもよい。

前記分岐度で親和性の異なるレクチンの例は、PHA−Lである。BVLとPHA−Lを組み合わせて使用すると、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の３本側鎖と４本以上の側鎖とを分別できる。

前記分別手段に、さらに、シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンからなる分別手段を組み合わせることも可能である。BVLレクチンを用いた分別工程と、シアル酸（±）の糖鎖との親和性を有するレクチンを用いた分別工程とは、いずれが前後しても、あるいは同時に行ってもよい。

前記シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンの例は、DSAおよび／またはPHA−Eレクチンである。

本発明はまた、前記BVLを有効成分とする、３本鎖以上の複合型Ｎ型糖鎖を検出するための試薬、および該試薬を含む試薬キットを提供する。

本発明の試薬または試薬キットは、さらに分岐度で親和性の異なるレクチンからなる検出手段、および／またはシアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンからなる検出手段を含んでもよい。

本発明の試薬または試薬キットは、通常この分野で用いられる公知の試薬をBVLやその他のレクチンの反応を阻害しない範囲で添加してもよい。そのような例には、緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、安定化剤、防腐剤などが挙げられる。

以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕（赤血球凝集阻害試験）
ウサギ赤血球凝集阻害試験を利用して、BVL、DSA、ECA、RCA120、PHA−E、PHA−LおよびLELの糖結合特異性を評価した。具体的には、以下の手順で評価した。

まず、表２および３に示す糖、糖タンパク質及び合成ポリマーを適量秤量し、PBSを添加して糖類なら300mM、糖タンパク質なら1.5mg/mlの糖類溶液を作製した。

次に、表２および３に示すレクチンを、PBSに溶かして0.2mg/mlに調製後、赤血球が凝集する最低希釈倍率の２〜４倍になるようにPBSでさらに希釈してレクチン溶液を得た。

次いで、96穴プレート（Falcon）の各ウェルにPBSを50μlずつ入れ、これに糖類溶液を50μl入れ、順次、1/2希釈系列を作製した。その後、各ウェルに、前記レクチン溶液を25μlずつ添加した。

室温で60分間放置後、各ウェルに4％ウサギ赤血球液（PHA-Lはヒツジ赤血球を使用）を25μlずつ添加した。室温で１時間放置後、各ウェルの底部への赤血球の沈降状態により凝集の有無を判定した。各糖類の凝集阻害を起こすことができた最低濃度を算出した。その結果を、表２および表３に示す。

*N-アセチルラクトサミン合成ポリマーpoly(LacNAc-pAP/Gln-co-Gln)は文献を参考。
Arch. Biochem. Biophys., 2000, 383(1):28-37
Glycobiology, 2003, 13(5):315-326

表２および３から、以下のことがわかる。ECAおよびRCA120は、ガラクトースを有する糖と結合する。ECAおよびRCA120は、N型糖鎖もＯ型糖鎖も結合する。LELは、キトオリゴ糖で阻害される。DSAは、ポリラクトサミンに強く結合する。それに対して、BVLは、N型糖鎖の３本鎖および／または４本鎖を有するフェツイン、アシアロフェツイン、α１−酸性糖タンパクおよびチログロブリンで凝集阻害される。また、BVLは、N-アセチルラクトサミン合成ポリマーpoly(LacNAc-pAP/Gln-co-Gln)には凝集阻害されない。

〔実施例２〕（糖鎖の検出）
BVL、DSA、ECA、RCA120、PHA−E、PHA−LおよびLELの固定化カラムを用いて、図３〜８に示す標識化糖との相互作用解析を行った。

相互作用解析には、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー法（測定装置：FAC−１自動分析装置、（株）島津製作所製）を用いた。詳細には、調製したレクチンカラムを、ステンレスホルダーに差し込み、FAC-1装置に接続した。流速およびカラム温度を、それぞれ0.125ml/minおよび25℃に保った。前記TBS緩衝液でミニチュアカラムを平衡後、過剰容積(0.5〜0.8ml)のPA-糖鎖(2.5または5.0nM)を、自動サンプリング装置を用いてカラム中へ連続注入した。

PA糖鎖の溶出液の蛍光強度(励起波長310nmおよび蛍光波長380nm)をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（PA-ラムノース）に対する前端溶出液の差：V-V₀〕を測定した。次いで、レクチン毎に、溶出の遅れの強い糖鎖を100％とし、各糖鎖に対する相対値を計算した。相互作用強度の算出結果を表４および図９〜１５に示す。

図表から以下のことがわかる。BVLのみが、N型糖鎖の４本鎖および３本鎖に特異的に結合する。DSAおよびECAは、糖鎖410のアシアロ糖鎖に親和性を有するものの、糖鎖番号５０４のシアロ糖鎖には結合し難くなっている。それに対して、ＢVLは、シアロ糖鎖に対しても親和性が維持する。

〔実施例３〕（糖タンパク質の結合性評価）
ビオチン標識化したBVL、DSA、ECA、RCA120、PHA−E、PHA−LおよびLELを用いて、酵素免疫測定法による糖タンパク質結合性評価を行った。

まず、0.1M炭酸緩衝液（pH9.5）で糖タンパク質溶液を調製し、マイクロタイタープレート(Nunc 439454)に添加し、4℃で一晩インキュベートした。0.05％Tween/PBSで３回洗浄後、1％BSA/PBSをウェルに添加して37℃で1時間インキュベートした。0.05％Tween/PBSで３回洗浄後、1％ BSA/0.05％ Tween/PBSで適宜希釈したビオチン標識化レクチン溶液をウェルに添加して37℃で1時間インキュベートした。0.05％Tween/PBSで３回洗浄後、1％ BSA/0.05％ Tween/PBSで希釈したHRP標識ストレプトアビジン溶液を添加して37℃で30分間インキュベートした。0.05％Tween/PBSで３回洗浄後、TMB Peroxidase substrate system (KPL 50-76-00)を添加し、遮光して室温で10分間インキュベートした。1Mリン酸で反応を停止し、マイクロプレートリーダー(TOSOH MPR-A4i)で450nmにおける吸光度を測定した。

反応させたプレートの450nmにおける吸光度を測定し、この値から反応値（[450nmにおける吸光度]-[糖タンパク質をプレートに固相化せず反応させたウェルの値]）を算出した。次いで、各レクチンにおいて吸光度が高い糖タンパク質の相互作用強度を100％とし、その他の糖タンパク質の相互作用強度を相対値として計算した。結果を表５および図１６〜２２に示す。

図表から、BVLのみが、N型糖鎖の３本鎖以上の糖鎖を含有する糖タンパクを検出できることがわかる。

BVLの精製フローの一例を示す図である。 BVLの特異性と他のレクチンを利用した糖鎖の検出および分別方法を示す図である。 A群の糖鎖構造の模式図である。 B群の糖鎖構造の模式図である。 C群の糖鎖構造の模式図である。 D群の糖鎖構造の模式図である。 E群の糖鎖構造の模式図である。 F群の糖鎖構造の模式図である。 BVLの親和性を示す図である。 DSAの親和性を示す図である。 PHA−Lの親和性を示す図である。 PHA−Eの親和性を示す図である。 ECAの親和性を示す図である。 RCA120の親和性を示す図である。 LELの親和性を示す図である。 BVLによる糖タンパク質検出を示す図である。 DSAによる糖タンパク質検出を示す図である。 PHA−Lによる糖タンパク質検出を示す図である。 PHA−Eによる糖タンパク質検出を示す図である。 ECAによる糖タンパク質検出を示す図である。 RCA120による糖タンパク質検出を示す図である。 LELによる糖タンパク質検出を示す図である。

符号の説明

１： Ｇａｌ
２： ＧｌｃＮＡｃ
３： Ｍａｎ
４： Ｌ−Ｆｕｃ
５： Ｎｅｕ５Ａｃ
６： Ｇｌｃ

Claims (12)

1. ドクヤマドリレクチンを検出手段とする、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の検出方法。
2. 前記検出手段に、さらに、分岐度で親和性の異なるレクチンからなる検出手段を組み合わせることを特徴とする、請求項１に記載の３本鎖以上の複合型N型糖鎖の検出方法。
3. 前記分岐度で親和性の異なるレクチンがインゲンマメレクチン-Lである、請求項２に記載の３本鎖以上の複合型N型糖鎖の検出方法。
4. 前記検出手段に、さらに、シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンからなる検出手段を組み合わせることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の３本鎖以上の複合型N型糖鎖の検出方法。
5. 前記シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンが、チョウセンアサガオレクチンおよび／またはインゲンマメレクチン-Eである、請求項４に記載の３本鎖以上の複合型N型糖鎖の検出方法。
6. ドクヤマドリレクチンを分別手段とする、３本鎖以上の複合型N型糖鎖の分別方法。
7. 前記分別手段に、さらに、分岐度で親和性の異なるレクチンからなる分別手段を組み合わせることを特徴とする、請求項６に記載の３本鎖以上の複合型N型糖鎖の分別方法。
8. 前記分岐度で親和性の異なるレクチンがインゲンマメレクチン-Lである、請求項７に記載の３本鎖以上の複合型N型糖鎖の分別方法。
9. 前記分別手段に、さらに、シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンからなる分別手段を組み合わせることを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載の３本鎖以上の複合型N型糖鎖の分別方法。
10. 前記シアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンが、チョウセンアサガオレクチンおよび／またはインゲンマメレクチン-Eである、請求項９に記載の３本鎖以上の複合型N型糖鎖の分別方法。
11. ドクヤマドリレクチンを検出手段とする、３本鎖以上の複合型N型糖鎖測定用試薬。
12. さらに、分岐度で親和性の異なるレクチンからなる検出手段、および／またはシアル酸（±）糖鎖との親和性を有するレクチンからなる検出手段を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の３本鎖以上の複合型N型糖鎖測定用試薬。