JP5124440B2

JP5124440B2 - フラバノン誘導体を含む皮膚外用剤

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Publication number: JP5124440B2
Application number: JP2008500534A
Authority: JP
Inventors: 尚子木田; 明弘多田; 晶子金丸
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc
Current assignee: Pola Orbis Holdings Inc
Priority date: 2006-02-15
Filing date: 2007-02-15
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2027-02-15
Also published as: US20110021619A1; US20090030070A1; CA2642524A1; AU2007215822A1; KR20080094950A; EP1987810A4; CN101384246B; EP1987810B1; MY154397A; CA2642524C; CN101384246A; EP1987810A1; HK1126397A1; SG169995A1; KR101329936B1; WO2007094384A1; AU2007215822B2; JPWO2007094384A1

Description

本発明は、皮膚外用剤に関し、更に詳細には、フラバノン誘導体を含有する皮膚外用剤に関する。また、本発明は、線維芽細胞のコラーゲン産生能を増強する方法に関する。また本発明は、創傷治癒効果を有する物質のスクリーニング方法に関する。

皮膚は、角層、表皮、基底層、真皮から構成されており、通常、認識される「肌」の性状において大きな影響を与えるのは真皮の構造であると言われている。この真皮の重要構成成分の一つは、弾性などに大きな影響を与えるコラーゲン類であると言われている。真皮にはコラーゲン類には、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩＩ等が存し、それぞれが重要な機能を担っており、これらは線維芽細胞が産生するプロコラーゲンから派生する（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３を参照）。線維芽細胞によるプロコラーゲンを含むコラーゲン類の産生能は、老化や紫外線ダメージによって低下することも知られており、この低下が皮膚の機能の低下の原因になっている。即ち、この様に低下した線維芽細胞のコラーゲン類産生能を回復させることが、皮膚機能の回復の重要な因子となる。

人間は年齢とともにその形態が変化し、老化の兆候を見せる。皮膚に於けるこの様な兆候の一つにしわの形成が挙げられ、この様な兆候の形成の抑制が化粧料の大きなテーマとなっている。この様なしわの形成の発生メカニズムの一つは、真皮コラーゲン線維束構造の崩壊乃至はその構造の乱れであるといわれている。時に、真皮コラーゲン線維束構造の崩壊乃至はその構造の乱れは、部分的に真皮コラーゲン線維束そのものの欠落を引き起こす。この状態の皮膚の部分は、創傷皮膚と類似した構造を有するといわれており、これが俗に言う、「大じわ」である。真皮コラーゲン線維束構造の崩壊乃至はその構造の乱れを改善するために、モノテルペン或いはトリテルペンなどのテルペン乃至はその誘導体により真皮コラーゲン線維束を再構築することが知られている（例えば、特許文献１を参照）。又、植物の抽出物にも真皮コラーゲン線維束再構築作用を有するものが存することが知られている（例えば、特許文献２、特許文献３を参照）。この様な植物の抽出物の内、真皮コラーゲン線維束再構築作用が優れるものとしては、オトギリソウの抽出物が知られている（例えば、特許文献４を参照）。これらのテルペン類及び抽出物は、線維芽細胞自体のコラーゲン産生能を向上させる作用を有し、周囲にコラーゲン線維束が存在する場合には、この線維束に沿ってコラーゲン線維束を構築することができる。しかしながら、これらの成分は、真皮コラーゲン線維束自体が欠落し、線維芽細胞の周囲に存在しない場合には、十分にコラーゲン繊維束を構築することができない。従って、上記成分や抽出物は、大じわなどのコラーゲン線維が欠落した部位においては、コラーゲン線維束の再構築を十分に促進することができず、上記症状の改善効果を十分に発揮しないという問題があった。

また、皮膚は重要な生体防御組織であるとともに、呼吸器でもあり、この皮膚の欠損は、防御機構と、呼吸機能の両者を脅かすことになる。この為、やけどなどで表皮の１／３を喪うと、生命を脅かすとの定説もできあがっている。この様な状況から、欠損した皮膚部位を速やかに再生させる技術の開発は長年にわたって望まれていた。創傷治癒作用を有する成分としては、例えば、クルクマ抽出物、やラクトフェリンなどが知られているが（例えば、特許文献５、特許文献６を参照）、これらには真皮コラーゲン線維束構造の再構築作用はないため、皮膚組織を再生する作用は十分ではない。この様な背景において、細胞の増殖を促進し、コラーゲン産生能を高める創傷治癒の為の素材として、イヌリン類（例えば、特許文献７を参照）、コラーゲン加水分解物類（例えば、特許文献８を参照）、ラクトフェリン類（例えば、特許文献６を参照）などが開発されてきた。これらの成分の創傷治癒作用は、線維芽細胞の増殖活性や皮膚組織再生に関与する酵素のＲＮＡ発現などを介して確かめられている。しかしながら、これらの成分によって、実際に皮膚が明らかに再生されるような現象は全く観察されていない。更に、これらの成分は、創傷によってコラーゲン線維束構造が欠落したような、欠損した生体部位の構築に影響を与えることは全く観察されていない。

このように、コラーゲン線維束構造の欠落などによって欠損した生体組織において、組織を再生し、しわの改善や創傷治癒などに優れた効果を有する成分は、未だ発見されていない。

一方、ファレロールはフラバノン構造を有する化合物であり、種々の植物に含有されることが知られており、その合成方法も既に知られている（例えば、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１を参照）。しかしながら、皮膚外用剤に含有させる技術は全く知られていないし、真皮コラーゲン線維束再構築作用についても、創傷治癒促進作用についても、全く知られていない。

また、線維芽細胞によるコラーゲン類産生能の向上に、ケラチノサイトの作用が影響していることが、共培養による検討で知られている（例えば、非特許文献４を参照）。しかしながら、ケラチノサイトに影響を与えることにより、線維芽細胞のコラーゲン類産生能を増大するような成分は知られていなかった。

一方、上述したイヌリン類、コラーゲン加水分解物類、ラクトフェリン類などの創傷治癒のための物質は、いずれも線維芽細胞のコラーゲン産生能を指標に、該コラーゲン産生能を高める物質としてスクリーニングされたものである。しかしながら、線維芽細胞のコラーゲン産生能の向上は、創傷治癒促進のための必要条件ではあるが、十分条件ではなく、コラーゲン産生能を向上させる成分であっても創傷治癒促進効果を有しないものも存するのが現状でる。

また、線維芽細胞の遊走能を指標とした、創傷治癒促進効果のスクリーニング方法も考案されている（例えば、非特許文献５を参照）。この方法では、線維芽細胞を用いてコラーゲンゲルを作製し、これに欠損部を設け、この欠損部に遊走してくる線維芽細胞を計数する。しかしながら、線維芽細胞の遊走能の向上は創傷治癒促進のための必要条件ではあるが、十分条件ではないため、線維芽細胞の遊走能を指標にスクリーニングされた成分であっても十分な創傷治癒促進効果を示さないものも存する。

すなわち、これらのスクリーニング方法では、創傷治癒促進に必要な線維芽細胞のコラーゲン産生能を向上させる作用、及び線維芽細胞の遊走能を向上させる作用を共に有する成分をスクリーニングすることができなかった。このような背景において、優れた創傷治癒促進作用を有する成分を得る技術の開発が望まれていた。

特開２００２−１０４９２１号公報特開２００２−２９９８８号公報特開２００２−２９９８７号公報特開２００２−２９９８６号公報特開平１１−１９９４６１号公報特開平０７−１９６５２９号公報特表２００４−５０１１７６号公報特開２００３−１３７８０７号公報国際公開第０２／０９２１１０号パンフレット欧州特許出願公開第１２２０５３号明細書特開昭５８−２１６７８号公報 Keene et al., J. Cell Biol., 104, 611-621 (1987) Shimizu et al., Lab. Invest., Jun., 76 (6), 753-63 (1997) Vazquez F. et al, Maturitas, 25, 209-15 (1996) Eming S. A. et al., Hum. Gene Ther., 9 (4), 529-39 (1998) Roman O' Leary, Mark Rerek, and Edward John Wood, Biol. Pharm. Bull., 27 (2), 266-270 (2004)

本発明は、乱れた真皮コラーゲン線維束構造（以下、単に「コラーゲン線維束」ともいう）の再構築作用に優れる皮膚外用剤を提供することを課題とする。特に、大しわや創傷に代表される皮膚の欠損部位において、真皮内に存在する線維芽細胞のコラーゲン類産生能などに代表される生体の組織再生能を高めることにより、創傷治癒を促進する技術を提供することを課題とする。
また、本発明は、皮膚組織を再生する技術を提供することを課題とする。具体的には、ケラチノサイトに作用することにより、線維芽細胞のコラーゲン類産生能を増強する技術を提供することを課題とする。
また、本発明は、創傷治癒を促進する効果に優れる物質をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、線維芽細胞のコラーゲン類産生能を増強し、創傷治癒を促進する作用を有し、皮膚外用剤に含有させることが可能な成分を探し求めた結果、ファレロールなどのフラバノン誘導体が、このような作用に優れていることを知見した。また、フラバノン誘導体は、ケラチノサイトに作用することにより、線維芽細胞のコラーゲン類産生能を増強することも知見した。そして、フラバノン誘導体を含有する化粧料はしわを改善する効果に優れ、フラバノン誘導体を含有する皮膚外用医薬は創傷治癒を促進する効果に優れることを知見し、本発明を完成するに至った。

また、本発明者らは、創傷治癒を促進する作用を有する成分を探し求める過程で、皮膚の創傷モデルを用いた方法により、コラーゲン線維束の再構築作用を試験することにより、創傷治癒の促進に有効な物質を効率良くスクリーニングし得ることを知見し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。

［１］第一の発明は、下記一般式（１）に表されるフラバノン誘導体及び／又はその塩を含有する、皮膚外用剤（以下、「本発明の皮膚外用剤」ともいう）である。

一般式（１）において、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。
前記フラバノン誘導体は、好ましくはファレロールである。

また、前記フラバノン誘導体及び／又はその塩を１０^-6〜０．１質量％含むオトギリソウ科オトギリソウの抽出物として含有することも好ましい形態である。

また、本発明の皮膚外用剤は、皮膚構造を正常化するために用いることができる。特に、乱れた真皮コラーゲン線維束構造を再構築するために用いることが好ましい。また、皮膚の欠損部位の再生及び再生組織による該欠損部位の閉塞を促進し、創傷を治癒するために用いることが好ましい。また、ケラチノサイトの線維芽細胞コラーゲン類産生能を増大する作用の増強のために用いることも好ましい。

［２］第二の発明は、皮膚外用剤の製造における前記一般式（１）に表されるフラバノン誘導体及び／又はその塩の使用である。

［３］第三の発明は、前記一般式（１）に表されるフラバノン誘導体及び／又はその塩を含む皮膚外用剤を皮膚に投与することを特徴とする、皮膚構造を正常化する方法である。
上記第二及び第三の発明におけるフラバノン誘導体の好ましい態様及び皮膚外用剤の好ましい用途は、第一の発明と同様である。

［４］第四の発明は、ケラチノサイトの繊維芽細胞コラーゲン類産生能を増大する作用を増強する方法であって、ケラチノサイトと繊維芽細胞の共存下に、前記一般式（１）に表されるフラバノン誘導体及び／又はその塩を投与することを特徴とする方法である。
前記フラバノン誘導体の好ましい態様は、第一の発明と同様である。

前記投与は経皮的投与であってもよく、具体的には、前記フラバノン誘導体及び／又はその塩を皮膚外用剤に含有させ皮膚に塗布することが好ましい。

［５］第五の発明は、創傷治癒効果を有する物質をスクリーニングする方法であって、動物の正常線維芽細胞を被験物質の存在下培養し、得られた培養物にコラーゲン培地溶液を加えてコラーゲンゲルを作製し、前記コラーゲンゲル内の前記線維芽細胞を前記被験物質の存在下培養した後、該コラーゲンゲルに欠損部を設け、該欠損部を設けたコラーゲンゲル及び前記被験物質を共存させて前記線維芽細胞を培養し、該培養の間、前記欠損部の補填、収縮の程度を観察することを特徴とする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」ともいう）である。

また、本発明のスクリーニング方法においては、被験物質の存在下での前記欠損部の補填、収縮の程度と、被験物質の非存在下での前記欠損部の補填、収縮の程度を比較することにより、創傷治癒促進効果を有する被験物質をスクリーニングすることができる。
具体的には、被験物質の存在下での前記欠損部の補填、収縮の程度が、被験物質の非存在下での前記欠損部の補填、収縮の程度に比して大きい場合に、前記被験物質は創傷治癒促進効果を有すると判別することができる。

実施例１で得られた結果を示す図である。グラフ１は、ヘパリン未処理下での培養日数と細胞数の関係を示し、グラフ２は、ヘパリン０．０１％処理下での培養日数と細胞数の関係を示す。実施例２の創傷治癒モデルで観察された線維芽細胞の挙動を示す写真である。実施例３で観察されたコラーゲン線維束の構築の挙動を示す写真である。実施例６で観察されたコラーゲンゲルの欠損部の状態を示す写真である。実施例９の実験１で得られた結果を示す図である。各濃度のファレロール溶液を添加した場合のＯＤ値（４５０ｎｍ）を示す。実施例９の実験２で得られた結果を示す図である。各濃度のファレロール溶液を添加した場合のケラチノサイトの増殖率を示す。実施例９の実験２で観察されたケラチノサイトの形態を示す写真である。実施例９の実験３で得られた結果を示す図である。各濃度のファレロール溶液を添加した場合のプロコラーゲンの産生量を示す。実施例１１で観察されたコラーゲンゲルの欠損部の状態を示す写真である。

（Ａ）本発明で使用するフラバノン誘導体及びその塩
本発明で使用されるフラバノン誘導体は、前記一般式（１）で表される化合物である。
一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４の少なくとも１つは、水素原子であることが好ましく、特に好ましくは３つ全てが水素原子である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基などが例示できるが、メチル基であることが特に好ましい。

また、前記Ｒ３、Ｒ５の少なくとも１つは、炭素数１〜４のアルキル基であることが好ましく、特に好ましくは両方とも炭素数１〜４のアルキル基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基などが例示できるが、メチル基であることがより好ましい。特に、ともにメチル基であることが特に好ましい。

このようなフラバノン誘導体としては、例えば、ファレロール、メチルファレロール、ジメチルファレロールなどが挙げられる。

この様なフラバノン誘導体は、特開昭５８−２１６７８号公報に従えば、既知の化合物より合成できるが、これは植物体中にも存在するため、植物体の抽出物より、分離精製することもできる。一般式（１）に表される化合物の一つであるファレロールはオトギリソウ科オトギリソウの植物体の抽出物より単離精製することができる。この製造過程の一例を下記に示す。勿論、植物体由来のフラバノン誘導体及び／又はその塩を後述する皮膚外用剤に含有させる際には、目的とする効果を発揮し得る濃度のフラバノン誘導体及びその塩を含有する抽出物を用いることもできる。

＜製造例１＞
オトギリソウ科オトギリソウ（Hypericum erectum Thunberg (Guttiferae)）の地上部の乾燥物１ｋｇに８０％エタノール水溶液１０ｌを加え、攪拌下４時間還流を行った。冷却後不溶物を濾過で除去し、減圧濃縮した後、凍結乾燥し、アモルファスを５１ｇ得た。このものを水に分散させ、ダイアイオンＨＰ２０にチャージし、５ｌの水、次いで５ｌの５０％エタノール水溶液を流して洗浄し、９９％のエタノールで溶出させ、溶出分をフラクショネーションし、フラクションを薄層クロマトグラフィーとＨＰＬＣでチェックしながら、同一の単一物質を含むフラクションは合一させ、複数の成分を含むフラクションは再度クロマトグラフィーで精製した。得られた単一成分を含むフラクションのコラーゲン線維束再構築作用を調べ、この作用の強いフラクションに含まれる単一成分の構造をプロトンＮＭＲ、元素分析、質量分析、¹³Ｃ−ＮＭＲより同定した。この成分は、ファレロールであり、収量は３．２ｍｇであった。また、ファレロールは８０％エタノール水溶液抽出物の溶媒除去物中に約０．００６質量％含有されていた。

前記フラバノン誘導体の塩としては、生理的に許容されるものであれば特段の制限はなく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩、モノエタノールアミン塩等の有機アミン塩、リジン塩、アルギン酸塩等の塩基性アミノ酸塩等が好ましく例示できる。

上記フラバノン誘導体及びその塩は、線維芽細胞による真皮コラーゲン線維束構造の再構築を促進する作用を有する。具体的には、前記フラバノン誘導体が、コラーゲン線維の存しない場所でも線維芽細胞を遊走せしめ、同時に、線維芽細胞自体のコラーゲン産生能を高めることにより、組織の欠損部分にコラーゲン線維束を再構築させる。また、皮膚の欠損部位における皮膚組織の再生を促進し、さらに再生した組織による欠損部位の閉塞作用を高めることにより、創傷治癒を促進する。

（Ｂ）本発明の皮膚外用剤
本発明の皮膚外用剤は、前記フラバノン誘導体及び／又はその塩を含有することを特徴とする。例えば、植物体の抽出物として、前記フラバノン誘導体及び／又はその塩を含有させることができる。前記フラバノン誘導体としては、ファレロールが好ましく挙げられる。本発明の皮膚外用剤においては、ファレルロールを含有するオトギリソウ抽出物を含有させることが好ましい。

上述したように、前記フラバノン誘導体及びその塩は、真皮コラーゲン線維束構造を再構築する作用を有する。従って、本発明の皮膚外用剤は、皮膚構造を正常化するために用いることができる。「皮膚構造を正常化する」とは、皮膚を構成する表皮、真皮、皮下組織の構造の破壊の度合いを小さくすることをいう。具体的には、例えば、乱れた真皮コラーゲン線維束構造を再構築することを含む。「乱れた真皮コラーゲン線維束構造を再構築する」とは、真皮内に存在するコラーゲン線維束構造が乱れている部位において、真皮コラーゲン線維束構造を構築することをいう。「真皮コラーゲン線維束構造が乱れている」とは、コラーゲン線維束構造が正常な構造を維持できなくなることをいい、例えば、コラーゲン線維束が細く弱くなったり、コラーゲン線維の量が少なくなったり、コラーゲン線維が切れたり、コラーゲン線維束が欠落したりすること等を含む。また、「皮膚構造を正常化する」とは、皮膚の欠損部位を再生することも含む。また、皮膚の欠損部位を再生し、再生組織による該欠損部位の閉塞を促進することにより、当該欠損部位より感染が生じることを防ぎ、皮膚の防御機構、呼吸機能を復活させることも含む。「皮膚の欠損」とは、皮膚構造が破壊された状態をいい、例えば、肌荒れ、しわ、創傷などが生じることをいう。本発明の皮膚外用剤は、特に創傷治癒に好適である。また、「皮膚構造を正常化する」とは、ケラチノサイトの線維芽細胞コラーゲン産生能を増大する作用を増強することも含む。

本発明の皮膚外用剤は、皮膚に外用で適用されるものであれば特段の限定なく応用でき、例えば、医薬部外品を含有する化粧料、皮膚外用医薬、皮膚外用雑貨などが例示できる。中でも、化粧料及び皮膚外用医薬に応用することが特に好ましい。例えば、しわの改善、軽度の肌荒れの改善などを目的とする場合には、化粧料とすることが好ましい。具体的には、光老化による真皮コラーゲン線維束の乱れを再構築したり、創傷や重度の光損傷で欠損した真皮コラーゲン線維束構造の再生のために使用することが好ましい。一方、重度の肌荒れの改善や創傷治癒を目的とする場合には、皮膚外用医薬とすることが好ましい。

本発明の皮膚外用剤の剤形は特に制限されず、使用目的に応じて通常皮膚外用剤がとり得る剤形をとることができる。例えば、化粧料の剤形としては、ローション、乳液、エッセンス、クリーム、パックなどの基礎化粧料に常用される剤形が好ましい。皮膚外用医薬の剤形としては、軟膏、ローション、クリーム、ミルク、エッセンスなどが好ましい。

本発明の皮膚外用剤における前記フラバノン誘導体及び／又はその塩の含有量は、皮膚外用剤の用途、対象、投与方法などによって調節することができるが、好ましい下限値は１×１０^-6質量％であり、より好ましくは１×１０^-4質量％である。好ましい上限値は、１質量％であり、より好ましくは０．１質量％である。
また、特に創傷治癒を目的とした皮膚外用医薬においては、前記フラバノン誘導体及び／又はその塩の含有量の下限値を好ましくは１×１０^-6Ｍ、より好ましくは１×１０^-4Ｍ、上限値を好ましくは１Ｍ、より好ましくは０．１Ｍとすることもよい。

また、本発明の皮膚外用剤に前記フラバノン誘導体及び／又はその塩を含有する植物体の抽出物を含有させる場合は、前記フラバノン誘導体及び／又はその塩を精製することにより、その濃度を高めたものを用いることが好ましい。なお、本発明の皮膚外用剤は、精製されていないオトギリソウ抽出物を含む真皮コラーゲン線維束再構築用の皮膚外用剤であって、該抽出物に含まれるフラバノン誘導体／及び又はその塩以外のフラバノン誘導体／及び又はその塩を含まないものは含まない。本発明の皮膚外用剤に用いることができる植物体の抽出物としては、オトギリソウの植物体の抽出物を精製してファレロール濃度を高めた抽出物が好ましく挙げられる。植物体抽出物における前記フラバノン誘導体及び／又はその塩の濃度は好ましくは１０^-6〜０．１質量％、より好ましくは１０^-5〜０．０１質量％である。このような植物体抽出物を用いる場合の、皮膚外用剤における植物体抽出物の含有量は、好ましくは０．００１〜１０質量％、より好ましくは０．０１〜１質量％である。ここで、植物体抽出物の含有量とは、溶媒除去物における含有量である。

本発明の皮膚外用剤には、前記必須成分以外に、通常皮膚外用剤で使用される任意成分を含有することができる。この様な任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類；流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール等；イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の合成エステル油類；ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン；オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン；アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類；脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類；塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類；イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類；ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類；ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキサンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等の多価アルコール類；ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、；表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類；表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類；レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類；パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤；アントラニル酸系紫外線吸収剤；サリチル酸系紫外線吸収剤、；桂皮酸系紫外線吸収剤、；ベンゾフェノン系紫外線吸収剤；糖系紫外線吸収剤；２−（２'−ヒドロキシ−５'−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４'−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類；ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ₆塩酸塩、ビタミンＢ₆トリパルミテート、ビタミンＢ₆ジオクタノエート、ビタミンＢ₂又はその誘導体、ビタミンＢ₁₂、ビタミンＢ₁₅又はその誘導体等のビタミンＢ類；α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類等；フェノキシエタノール等の抗菌剤などが好ましく例示できる。

中でも、創傷治癒の促進を目的とした皮膚外用医薬に含有させる任意成分として特に好ましいものは、創傷により欠損した皮膚組織の再生に有効な成分であり、具体的には、微生物感染を防ぐためのペニシリン、フラジオマイシン、テトラサイクリン又はこれらの塩などの抗生物質、アクリノールやイソジン等の殺菌剤などが好ましく例示できる。また、トラニラスト等の瘢痕形成抑制剤も好ましい。これらの皮膚組織の再生に有効な成分の含有量は０．１〜１０質量％が好ましい。

本発明の皮膚外用剤は、前記フラバノン誘導体及び／又はその塩と前記任意成分とを常法に従って処理することにより製造できる。
また、本発明の皮膚外用剤の使用方法は、皮膚外用剤の用途、剤形、使用部位、症状などに応じて調節することができる。

（Ｃ）ケラチノサイトの線維芽細胞コラーゲン類産生能を増大する作用を増強する方法
本発明のケラチノサイトの線維芽細胞コラーゲン類産生能を増大する作用を増強する方法（以下「本発明の方法」ともいう）は、ケラチノサイトと線維芽細胞の共存下に、前記一般式（１）に表されるフラバノン誘導体及び／又はその塩を投与することを特徴とする。
本発明の方法に使用する前記フラバノン誘導体及び／又はその塩は、上記（Ａ）で説明した通りである。前記フラバノン誘導体及び／又はその塩は、ケラチノサイトに働きかけることにより、線維芽細胞のコラーゲン類産生能を増大させる作用を有する。
「コラーゲン類」とは、コラーゲン及びコラーゲンに派生分化する前のプロコラーゲンを合わせた概念である。

ケラチノサイトと線維芽細胞の共存下とは、in vitro又はin vivoにおいてこれらの細胞が共存している状態をいう。例えばin vitroでは、これらの細胞を共培養することによってこのような状態をつくることができ、in vivoであれば、表皮及び真皮を含む皮膚にこのような状態が存在する。
前記フラバノン誘導体及び／又はその塩の投与は、in vitroでは、例えばケラチノサイトと線維芽細胞の供培養に用いる培地に前記フラバノン誘導体及び／又はその塩を混在させることにより行うことができる。この場合の混在（投与）量は、培地中の濃度で、下限値が好ましくは１０^-8Ｍであり、より好ましくは１０^-7Ｍであり、上限値が好ましくは１０^-3Ｍであり、より好ましくは１０^-5Ｍである。
また、in vivoで投与する方法としては、経皮的投与が挙げられる。経皮的投与の方法は、通常用いられる方法であれば特に制限されないが、前記フラバノン誘導体及び／又はその塩を含有する皮膚外用剤を皮膚に塗布する方法が好ましい。本発明の方法に用いることができる皮膚外用剤は、上述した本発明の皮膚外用剤であり、その好ましい態様も上述したとおりである。

（Ｄ）本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、動物の正常線維芽細胞を被験物質の存在下培養し、得られた培養物にコラーゲン培地溶液を加えてコラーゲンゲルを作製し、前記コラーゲンゲル内の前記線維芽細胞を前記被験物質の存在下培養した後、該コラーゲンゲルに欠損部を設け、該欠損部を設けたコラーゲンゲル及び前記被験物質を共存させて前記線維芽細胞を培養し、該培養の間、前記欠損部の補填、収縮の程度を観察することを特徴とする。

本発明のスクリーニング方法で用いる動物の正常線維芽細胞は、通常試験に用いられるものであれば特段限定されない。動物としては、例えば、マウス、ラット、ラビット、ヒトなどが好ましく挙げられ、動物種差が少ないことから、ヒトが特に好ましい。正常線維芽細胞とは、癌化していない細胞であって、秩序だったコラーゲンゲルを形成させる能力を有しているものをいう。このような正常線維芽細胞は、口腔内粘膜や皮膚などにより採取することができ、これを初代培養して用いることもできるが、確立した培養細胞系で市販されているものも存し、かかる市販品を用いることもできる。このような市販品としては、例えば三光純薬株式会社製の「正常ヒト皮膚線維芽細胞（初代培養）」、クラボウ株式会社製の「正常ヒト線維芽細胞」等が好ましく例示できる。
なお、以下、このような動物の正常線維芽細胞を単に、線維芽細胞ともいう。

線維芽細胞は、予め前培養し、細胞数を適当な数に増やしてから次の培養に用いることが好ましい。前培養は、通常の培養細胞の培養条件、例えば、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）等を培地として、５％炭酸ガス気流条件下、３７℃で、６０〜９０％コンフルエントになるまで行えばよい。前培養によって得られた細胞塊は、０．０１〜０．１％のトリプシンの存在下、個々の細胞にほぐして、細胞浮遊液とし、以下の被験物質の存在下での培養に用いることが好ましい。このとき、トリプシンとともにエチレンジアミン四酢酸塩を存在させるとより好ましい。

線維芽細胞の被験物質の存在下での培養における、被験物質の添加方法は特に制限されず、予め培地に添加しておいてもよいし、細胞の播種と同時に添加してもよいし、細胞の播種後、適当な時間培養した後に添加してもよい。好ましくは、まず細胞をプレートに播種し、被験物質を含まない培地を用いて培養を行った後、被験物質を含む培地に交換して培養する方法が挙げられる。被験物質の添加量は、任意の濃度とすることができる。好ましくは、被験物質の有効量を試験するために種々の被験物質の濃度を有する培地を用いて、培養を行うことが好ましい。また、培養に用いる線維芽細胞の細胞数は、特に制限されず、培養に用いるプレートの大きさに合わせて調整すればよい。例えば、１０³／ｃｍ²〜１０⁵／ｃｍ²の細胞数となるよう調整することが好ましい。培養条件も前培養と同様に通常の条件で行えばよい。培養時間は、細胞数を適当な数に増やすことができる限り特に制限されず、例えば、３〜５日程度を目安とすればよい。この間、必要に応じて、培地を新鮮なものに交換する。
具体的には、例えば、前培養で得た線維芽細胞を個々の細胞にほぐした細胞浮遊液をプレートに播種し、２４時間前後培養した後、種々の濃度の被験物質の溶液を添加し、３〜５日培養を行うことが好ましい。

次に、上記で得られた線維芽細胞の培養物にコラーゲン培地溶液を加えることによりコラーゲンゲルを作製する。加えるコラーゲン培地溶液の量、及びコラーゲン培地溶液中のコラーゲンの濃度は、コラーゲンゲルを作製することができ、コラーゲンゲル中に線維芽細胞を分散させることができる範囲であれば特に制限されない。コラーゲン培地溶液としては、例えば、０．３〜０．８質量％タイプＩコラーゲン溶液、ＤＭＥＭ培地、１００〜３００ｍＭＨＥＰＥＳ、２〜４質量％炭酸水素ナトリウム溶液、０．０５〜０．１５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、ＦＢＳ、水を４：４：２：２：１：２：３程度の比率で混合したものなどを用いることができる。コラーゲン培地溶液の添加量としては、例えば、コラーゲン培地溶液と線維芽細胞の培養物の割合を、８〜１０質量部：１〜２質量部とすることができる。

次に、作製したコラーゲンゲル内の前記線維芽細胞を、前記被験物質の存在下で培養する。すなわち、前記で作製したコラーゲンゲルを前記被験物質を含む培地中に置くことにより、コラーゲンゲル内の前記線維芽細胞を浮遊培養する。
培養に用いる培地における被験物質の濃度は、前記被験物質の存在下での線維芽細胞の培養に用いた培地の濃度に対応させればよい。培養時間は、コラーゲンゲルの収縮状況により調節することができる。具体的には、ゲルの大きさがコラーゲン溶液を添加してゲルを作製した時点より１／５〜１／１０程度のサイズまで収縮した時点まで培養することが好ましい。このような培養時間として３〜５日間を目安とすることができる。

次に、収縮したコラーゲンゲルに欠損部を設ける。欠損部とは、コラーゲンゲルの一部が貫通し、穴の状態となっている部分をいう。欠損部の形状及び大きさは、形状の変化を観察するのに適していればよく、特に制限されない。例えば、収縮したコラーゲンゲルの中央部分をパンチで円状に打ち抜いて、ドーナツ状のゲルとすることができる。このようなパンチによる打ち抜きには、例えば直径１〜５ｍｍの生検トレパンを用いることができる。
なお、このようなコラーゲンゲルの損傷モデルの作製方法は、Roman O' Leary, Mark Rerek, and Edward John Wood, Biol. Pharm. Bull., 27 (2), 266-270 (2004)に開示されている。

次に、欠損部を設けたコラーゲンゲルを被験物質の存在下に置いて、コラーゲンゲルに含まれる線維芽細胞の培養を行う。培養に用いるプレートは、作製したコラーゲンゲルの大きさに合わせて選択することができる。例えば、コラーゲンゲルの直径が２〜７ｍｍ程度の場合には、６ウェルのプレートを選択することができる。また、コラーゲンゲルはウェル底面に定着させることが好ましい。コラーゲンゲルの定着は、例えば、ウェルの中央部分にコラーゲン溶液を滴下し、そこにコラーゲンゲルを乗せて３７℃で１５分間培養することにより行うことができる。培地中の被験物質の濃度は、前記線維芽細胞の被験物質の存在下での培養に用いた培地における濃度に対応させればよい。培養条件も、前記培養条件と同様に通常の条件で行うことができる。培養期間、すなわち観察期間は特に制限されないが、５〜２０日を目安とすればよい。

上記培養の間、コラーゲンゲルの欠損部の補填、収縮の程度を観察する。この観察結果を記録することにより、被験物質のコラーゲン再構築作用を判定することができる。例えば、欠損部の形状は、写真などにより客観的に記録することができ、この様な写真を、必要に応じてデジタル画像データに変換するなどして、比較、判定することができる。具体的には、被験物質の存在下での前記欠損部の補填、収縮の程度が、被験物質の非存在下での前記欠損部の補填、収縮の程度に比して大きい場合に、前記被験物質は創傷治癒促進効果を有すると判別することができる。また、補填、収縮の程度をスコアなどを用いて、数値に置き換えて評価することもできる。例えば、被験物質の存在下での前記欠損部の体積が、被験物質の非存在下での前記欠損部の体積の８５％以下、好ましくは５０％以下である場合に、前記被験物質は創傷治癒促進効果を有すると判別することができる。
この様な方法で被験物質の創傷治癒促進効果を評価することにより、線維芽細胞の遊走を促進するのみで線維芽細胞のコラーゲン産生を促進しない物質や、線維芽細胞のコラーゲン産生を促進するのみで線維芽細胞の遊走（移動）を促進しない物質を除外することができ、損傷治癒に有効な物質のスクリーニングをより効率化できる。

ファレロールの真皮コラーゲン線維束再構築作用について、ｉｎｖｉｔｒｏの実験で確かめた。即ち、ヘパリン添加培地中で線維芽細胞をコラーゲンゲル内培養すると、細胞が産生するコラーゲン線維がダメージを受け、強固なコラーゲン線維束が形成されないことを利用し、このヘパリン添加系にファレロールを共存させ、コラーゲン線維のダメージの軽減の程度を調べた。手技は以下に示す。

＜使用細胞および試薬類＞
・正常ヒト線維芽細胞（クラボウ）
・１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）
・ＷＳＴ−８／１−ＭｅｔｈｙｌＰＭＳ（ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８：同仁化学研究所）
尚、ファレロールはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して用いた。

ＭＴＴアッセーにてファレロールの毒性を試験し、ヘパリン添加系へのファレロールの添加ドーズを求めた。
＜プロトコール＞
１．８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに増殖した線維芽細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ・ＥＤＴＡで分散した。これを９６ｗｅｌｌ／ｐｌａｔｅに３×１０³ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した。
２．２４時間後、濃度調製したファレロールを１０ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加した（ｎ＝８）。
３．ファレロール添加２４時間後、４８時間後、７２時間後にＷＳＴ−８／１−ＭｅｔｈｙｌＰＭＳを１０ｍｌ／ｗｅｌｌで添加、３７℃で４時間インキュベートした。
４．測定波長４５０ｎｍ、参考波長６５０ｎｍで吸光度を測定した。
＜結果＞
検討したいずれの濃度においても顕著な細胞毒性は確認されなかった。逆に、ファレロールを添加する事で細胞増殖を促進する効果が確認された。特に、ファレロールの濃度が１０^-6ｍｌ／ｍｌ−ＤＭＥＭ、５ｘ１０^-7ｍｌ／ｍｌ−ＤＭＥＭ、１０^-7ｍｌ／ｍｌ−ＤＭＥＭにおいて特に増殖促進が見られたことから、以下のコラーゲン産生試験は、この３つの濃度で行うこととした。

上記の結果を元にヘパリン添加系を用いて、ファレロールのコラーゲン産生促進作用について試験を行った。
＜使用細胞および試薬類＞
・正常ヒト線維芽細胞（クラボウ）
・ＨＥＰＡＲＩＮ（ＳＩＧＭＡ：Ｈ−３１４９）
・ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）
・ＦＢＳ
＜プロトコール＞
１．１０％ＦＢＳを含む培地でｃｏｎｆｌｕｅｎｔに増殖した線維芽細胞をトリプシン処理により分散させ、遠心分離を行った。
２．上清を除去して１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに再懸濁し、線維芽細胞を１２ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（４．５ｃｍ²／ｗｅｌｌ）に３×１０³ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²で播種した。
３．細胞播種４時間後に、上清のＤＭＥＭを除去し、０．４％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに交換して細胞増殖抑制条件下にて７２時間培養を行った（３７℃、５％ＣＯ₂）。
４．０．４％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを除去して１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに交換することで、細胞増殖抑制を解除した。この時の培養条件はヘパリンによる影響を見るため、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ、０．１％ヘパリン／１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ、１．０％ヘパリン／１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（各ｎ＝３）とした。さらに、ここにファレロールを１０^-6ｍｌ／ｍｌ−ＤＭＥＭ、５ｘ１０^-7ｍｌ／ｍｌ−ＤＭＥＭ、１０^-7ｍｌ／ｍｌ−ＤＭＥＭ濃度で添加したものを作製した。
＜結果＞
結果を図１のグラフに示した。グラフ１はヘパリン未処理条件、グラフ２は０．１％ヘパリン処理条件で、各濃度のファレロール溶液を培地に加えた場合の細胞増殖効果を示している。何れの条件においても、ファレロールを添加した群の方が、コントロールであるＤＭＳＯ添加群よりも細胞増殖が促進される傾向が示された。これより、ファレロールに線維芽細胞増殖促進作用が存することがわかる。

ファレロールが細胞増殖促進作用を持つことが上記の実験によって確認された。さらに、ファレロールの線維芽細胞の移動能への影響を確認するため、三次元コラーゲンゲルを生検トレパンで打ち抜いて作製した「創傷治癒モデル」を用いて、創傷部位から派生する線維芽細胞の挙動をファレロール添加群と未添加群で比較した。
＜使用細胞および試薬類＞
・正常ヒト線維芽細胞（クラボウ）
・１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）
・コラーゲン培地溶液（05% typeI collagen：5×DMEM：200mM HEPES：2.2%NaHCO₃：0.1N NaOH：FBS：水を4：4：2：2：1：2：3の割合で混合）
・生検トレパン（先端径φ３．０ｍｍ）
＜プロトコール＞
１）実施例１のプロトコールの４で得た線維芽細胞の培養物とコラーゲン培地溶液を１：９（体積）の割合で混合してコラーゲンゲルを作製し、１０％ＦＢＳ培地で１週間浮遊培養した。
２）ゲルの大きさがコラーゲン培地溶液を加えてコラーゲンゲルを作製した時点から１／５〜１／１０程度のサイズまで収縮したら、直径３ｍｍの生検トレパンでゲルの中央部分を打ち抜いた。
３）６ｗｅｌｌｐｌａｔｅを準備し、ウェルの中央にコラーゲン溶液を１５μｌ滴下し、そこに打ち抜いた三次元コラーゲンゲルを乗せて１０分間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ₂）
４）滴下したコラーゲンが固まり、三次元コラーゲンゲルがウェルの底面に接着したら、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ、０．１％ヘパリン／１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ、１．０％ヘパリン／１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを３ｍｌ／ｗｅｌｌで添加した。
５）さらに、４）の各培養条件にファレロールを１０^-6ｍｌ／ｍｌ−ＤＭＥＭで添加した群を作製した。
＜結果＞
「創傷治癒モデル」を作製してから２４時間後の線維芽細胞の挙動を観察した。生検トレパンで打ち抜いた創傷部位から派生した線維芽細胞の写真を図２に示した。ヘパリンを添加していない１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭにおいては、ファレロールを添加した群の方が添加していない群よりも線維芽細胞の移動距離が長く、細胞が活発に動いている傾向があった。一方、０．１％ヘパリン／１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ、１．０％ヘパリン／１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭにおいては、ファレロールを添加した群と添加していない群の間に、細胞移動の差は見られず、両方ともヘパリンの作用によって移動が抑制されていた。
これより、ファレロールは、ヘパリンの線維芽細胞の移動能への影響を抑制するのではなく、線維芽細胞に直接作用し、細胞の移動能を高めることが推察できる。

下記に示す手順に従って、ヘパリンの添加によるコラーゲン線維束の構築阻害を抑制する作用の有無をファレロールについて調べた。結果を図３に示す。ファレロールはヘパリンのコラーゲン線維束構築阻害を抑制し、以て、真皮コラーゲン線維束再構築作用を発揮することがわかる。

＜プロトコール＞
05% typeI collagen：5×DMEM：200mM HEPES：2.2%NaHCO₃：0.1N NaOH：FBS：水を4：4：2：2：1：2：3の割合で混合し、コラーゲン溶液を作製する。（冷やしながら行う）
↓
コラーゲン溶液：水＝９：１の割合で混合し、下層コラーゲン溶液を作製する。
↓
48穴プレートに下層コラーゲン溶液を100μl/wellづつ分注する。
↓
CO₂ インキュベーター内で固める。（15min位）
↓
NHDFを定法に従い回収する。
↓
(細胞をセルストレイナーにてバラバラにする。)
↓
細胞をカウントし（トリパンブルー）、1×10⁵cells/mlに調整する。
↓
コラーゲン溶液：細胞浮遊液＝９：１（体積）の割合で混合し、300μl/wellずつ分注する。
（細胞が不均一にならないよう、時々混ぜながら作業する。（final 1×10⁴cells/ml））
↓
CO₂ インキュベーター内で４時間静置。
↓
注射針の針でゲルをwellの内壁から離し、ゲルの収縮を妨げないようにする。
↓
1.8% Heparin/10% FBS-DMEMを500μl/well添加。(final 1% Heparin/well)
↓
ファレロール(DMSOに溶解)を0.9μl/well添加。(1000倍希釈)
↓
CO₂インキュベーター内にて培養。（5日間）
↓
SEM観察の試料とする。

下記に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である化粧料（エッセンス）を作製した。即ち、イ、ロ、ハを８０℃に加熱し、イに攪拌下徐々にロを加え乳化し、更にハを加え中和し、攪拌冷却してエッセンス１を得た。同様に操作して、エッセンス１のファレロールをエタノールに置換した比較例１も作製した。

＜試験例１＞
１群５名、２群計１０名の４０〜５０歳のパネラーを用いて、上記で作製したエッセンス１及び比較例１の化粧料について８週間の使用テストを行った。これらの化粧料を朝晩２回連日使用してもらい、使用テストの前後で目尻のレプリカを採取した。斜め４５度からの光の照射下、シワによってできる陰影を顕微鏡から画像に取り込み、二値化を行い、視野における陰影の面積比を求め、この値の群の平均値を求めた。結果を表２に示す。これより、本発明の皮膚外用剤である化粧料（エッセンス）は優れたシワ改善効果を有することがわかる。

＜試験例２＞
エッセンス１と同様に下記処方に従って本発明の皮膚外用剤であるエッセンス２を作製した。このものを試験例１の方法で評価したところ、試験前のシワ面積比が８．２±３．２％であったものが、試験後３．９±１．１％となっており、効果が確認された。

コラーゲンゲルをパンチして欠損部を設けた「創傷による皮膚組織欠損モデル」を用いて、ファレロールの欠損部位の組織再生促進作用を調べた。手順を以下に示す。この結果は図４に示す。この図より、ファレロールの終濃度が１０^-5Ｍ、１０^-6Ｍであれば、パンチ穴の収縮は明瞭に促進されているが、１０^-7Ｍでは収縮の促進が不明瞭であることがわかる。これより、本発明の皮膚外用剤に於いて、ファレロールの下限値は１０^-6Ｍが好ましいことがわかる。
１）８０％コンフルエントに増殖した正常ヒト線維芽細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ・ＥＤＴＡで分散した。これを３×１０⁵ｃｅｌｌｓ／２５ｃｍ²で播種した。
２）２４時間後に、ファレロール（Ｆａｒｒｅｒｏｌ；終濃度１０^-5Ｍ、１０^-6Ｍ、１０^-7Ｍ）およびＤＭＳＯを添加した培地に交換し、４日間培養した。
３）それぞれの条件での培養により得た培養物に、実施例２と同様にコラーゲン培地溶液を加えてコラーゲンゲルを作製した。作製したコラーゲンゲルを、２）の培養条件と同様の培地で１週間浮遊培養した。すなわち２）で、１０^-5Ｍ、１０^-6Ｍ、１０^-7Ｍのファレロールを含む培地で培養した線維芽細胞は、コラーゲンゲル作製後も、それぞれファレロール終濃度が１０^-5Ｍ、１０^-6Ｍ、１０^-7Ｍの培地を用いて培養した。
４）ゲルの大きさがコラーゲン培地溶液を加えてコラーゲンゲルを作製した時点より１／５〜１／１０程度のサイズまで収縮したら、直径３ｍｍの生検トレパンでゲルの中央部分をドーナツ状に打ち抜き、「創傷モデル」を作製した。
５）６ウェルプレートを準備してウェルの中央部分に５μｌのコラーゲンを滴下し、そこに創傷モデルのコラーゲンゲルを乗せて３７℃で１５分間インキュベートした。
６）適下したコラーゲンが固まりゲルがウェルの底面に接着したら、３）と同条件の培地を３ｍｌ加えて、「創傷による皮膚組織欠損モデル」として培養を行った。その後、コラーゲンゲルの創傷部位がふさがっていく過程を目視観察した。

下記に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である化粧料（エッセンス）を作製した。即ち、イ、ロ、ハを８０℃に加熱し、イに攪拌下徐々にロを加え乳化し、更にハを加え中和し、攪拌冷却してエッセンス３を得た。同様に操作して、エッセンス３のファレロールをエタノールに置換した比較例２も作成した。

＜試験例３＞
エッセンス３と比較例２とを用いて、パネラーを用いて創傷による欠損部位の組織再生促進作用を検討した。即ち、パネラーの上腕内側部に、抜き型を当て、メスで表皮をはぎ取り、１ｍｍ×１ｍｍの部位を３つ作製した。１部位はエッセンス３を表皮を除去した日より５日間、１日１回塗布し、１部位は比較例２を表皮を除去した日より５日間、１日１回塗布し、残る１部位は何の処置もしなかった。塗布後１週間及び２週間に観察を行い、欠損部位の組織再生の度合いを観察した。結果を表５に示す。これより、本発明の皮膚外用剤であるエッセンス３は欠損部位の組織再生促進作用に優れることがわかる。又、瘢痕の生成も全く観察されなかった。

＜試験例４＞
下記に示す処方に従って、実施例７と同様の方法により、本発明の皮膚外用剤である皮膚外用医薬１を作製した。試験例３と同様の評価を行ったところ、皮膚外用医薬１は、抗生物質が共存するにもかかわらず、優れた欠損皮膚組織の再生促進作用を示していた。

以下に示す手順に従って、ファレロールのケラチノサイトに対する作用を検討した。

＜実験１：ファレロールのケラチノサイトに対する細胞毒性評価＞
〔使用細胞および試薬類〕
・正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ株式会社製）
・Humedia KG2 （GIBCO社製）
・WST-8/1-Methyl PMS (Cell Counting Kit-8:同仁化学研究所株式会社製)
〔サンプル調製〕
DMSOに溶解された１０^-2 M ファレロールをDMSOで希釈して、濃度調整したファレロールのサンプルを作製した。
〔プロトコール〕
１）80%confluentに増殖した正常ヒト表皮角化細胞を0.05%Trypsin・EDTAで分散した。これを96 well/plateに３×１０³ cells/ well、６×１０³cells/wellの2条件の細胞濃度で播種した。
２）24時間後、濃度調製したファレロールのサンプルを100 μl /wellずつ添加した(n=8)。
３）サンプル添加24 時間後、48時間後にWST-8/1-Methyl PMSを10 μl/wellで添加し、37℃で4時間インキュベートした。
４）測定波長450 nm、参考波長650 nmで吸光度（OD値）を測定した。
＜結果＞
MTTによる評価結果を以下の図５のグラフに示す。OD値はファレロールの濃度依存的に増加することが示された。３×１０³ cells/ wellの24時間においては、コントロールであるDMSOに比較して１０^-5Mファレロールは2倍以上のOD値を示した。48時間においてもDMSOに比べて1.7倍程度の値を示した。しかし、細胞数が少なく元々のOD値が低かったため、播種細胞数を倍にした６×１０³cells/wellにおいて再現性を確認した。その結果、ほぼ同様の結果を得ることができた。
一方、目視評価においては、DMSOに比較してファレロール添加群における細胞増殖が促進されている印象を受けなかった。

＜実験２：ファレロールのケラチノサイトに対する細胞増殖効果（直接評価）＞
〔使用細胞および試薬類〕
・正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ株式会社製）
・Humedia KG2（GIBCO社製）
〔プロトコール〕
１）正常ヒト表皮角化細胞を６×１０³ cells/mlに調製し、これを96 well/plateに１mlずつ播種した。
２）24時間後に上清を除去して、DMSOで濃度調製したファレロールのサンプルを加えた培地を1mlずつ添加した。
３）サンプル添加24 時間後、48時間後、72時間後に細胞を0.05%Trypsin・EDTAで分散し、これを血球計算盤を用いてセルカウントした。なお、実験１ではWST-8での評価を細胞数の指標としたが、この方法はミトコンドリア内の脱水素酵素に作用して間接的に細胞数を評価する方法であることから、本検討では直接的に細胞数を測定した。
〔結果〕
セルカウントの結果を図６に示す。グラフは、コントロール（DMSO添加群）の細胞数を100%とした場合の細胞増殖率で示している。コントロールと比較して、濃度依存的に細胞増殖率は抑制される傾向が示された。１０^-5Mファレロールを添加した群の細胞増殖率は24時間後で75.1±5.2%に抑制され、その他の濃度においても１０^-6 Mでは75.5±5.8%、１０^-7Mでは77.1±8.6%の細胞増殖率に留まっていた。48時間後では、１０^-5 M ファレロールを添加した群では約71.9±16.6%の増殖率であったが、それ以下の濃度においてはコントロール群と同等程度の細胞増殖率を示した。また、細胞形態においては変化は認められなかった（図７）。すなわち直接評価による結果は、WST-8による間接的な細胞数の評価とは一致しなかった。この結果より、ファレロールはケラチノサイト1細胞当りのミトコンドリア内のクエン酸回路の反応を促進していることが推測される。従って、クエン酸回路の反応時に生じるNADHの作用により、次の反応段階である酸化的リン酸化反応も促進されることが予想され、その結果細胞内のエネルギー源となるATPの生成、すなわちエネルギー代謝能が亢進している可能性が示唆される。

＜実験３：表皮角化細胞を介した線維芽細胞への影響の検討＞
〔概要〕
表皮角化細胞と線維芽細胞との間に何らかの相互作用があるか、また共培養においてファレロールが線維芽細胞に対して作用するかを見出すためにプロコラーゲン産生量を指標とした評価を実施した。方法はEming SA et al., Hum. Gene. Ther., 9 (4), 529-39 (1998)に記載の方法に準じた。
〔使用細胞および試薬類〕
・正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ株式会社製）
・Humedia KG2 （クラボウ株式会社製）
・正常ヒト線維芽細胞（クラボウ株式会社製）
・DMEM （GIBCO社製）
・PIP EIA Kit （タカラバイオ株式会社製）
〔プロトコール〕
１）表皮角化細胞
Day1 ：24ウェルプレートに３×１０⁴cells/ well播種する。
Day6 ：PBSで洗浄後、DMEM＋2%FBSに培地交換し、ファレロール（１０^-6 M、１０^-7M、１０^-8 M、DMSO）を添加する。
Day7 ：培養上清を採取
２）線維芽細胞
Day3 ：24ウェルプレートに２．５×１０⁴ cells/ well播種する。
Day7 ：PBSで洗浄後、表皮角化細胞の培養上清（900 μl）を添加して48時間培養する。
Day9 ：PBS及び無血清DMEMで洗浄後、無血清DMEM500μlに培地交換し、2時間培養し、培養上清を回収し、遠心上清（15000 rpm、5sec）のプロコラーゲン量を下記の方法に従って、測定した。
〔プロコラーゲン産生量の定量〕
１）標準抗体液を100μlずつプレートの各ウェルに加えた後、あらかじめ調製した各濃度のPIP標準液（320、160、80、40、20、10μl/ml：検体の希釈はDMEMで実施した）および検体を20μlずつマイクロピペットで2連ずつ加え、37℃で3時間反応する。（第一次反応）
２）反応液を捨て、PBSで4回洗浄後、Substrate Solution(TMBZ)を100μlずつ8連ピペットで各ウェルに加え、室温（20℃〜30℃）で15分反応させる。（第二次反応）
３）Stop solutionを100μlずつ、Substrate Solutionを入れた順番に各ウェルに加え反応を停止させた後よく混和する。
４）培地を対照としてゼロ調節し、波長450nmで吸光度をプロットして標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応するPIP濃度を読み取る。
〔結果〕
結果を図８に示す。ファレロールの濃度依存的にプロコラーゲン産生量が有意に増加した。一方、線維芽細胞培養時にファレロールを添加して、その後表皮角化細胞の培養上清を添加した方法で評価した別の系では、プロコラーゲンの産生量に大きな変化が見られなかった。このことから、ファレロールが線維芽細胞に対して直接的にプロコラーゲン産生増加を促す作用は小さいと考えられる。従って、ファレロールは表皮角化細胞に作用して、表皮角化細胞が線維芽細胞のコラーゲン類の産生を高める作用を増大させていると判断できる。この様に、共培養系で角化細胞を介して線維芽細胞のコラーゲン産生能を変化させることができるので、例えば、三次元培養皮膚などに於いて、三次元皮膚の性状を、望む形に変化させることにも応用できる。

下記に示す処方に従って、ファレロールを含有する皮膚外用剤（化粧料：ローション）を作製した。即ち、処方成分を室温で攪拌可溶化しローションを得た。このローションをネズミやヒトの皮膚に経皮投与することにより、皮膚真皮におけるプロコラーゲンの産生量を増やすことができ、以て、真皮内のコラーゲン量を増大させることができる。これは、皮膚には角化細胞（ケラチノサイト）と線維芽細胞が共存するためである。

＜被験物質の作製＞
スクリニーングの被験物質として、オトギリソウの抽出物を作製した。即ち、オトギリソウ科オトギリソウ（Hypericum erectum Thunberg (Guttiferae)）の地上部の乾燥物１ｋｇに８０％エタノール水溶液１０ｌを加え、攪拌下４時間還流を行った。冷却後不溶物を濾過で除去し、減圧濃縮した後、凍結乾燥し、アモルファスを５１ｇ得た。このものを水に分散させ、ダイアイオンＨＰ２０にチャージし、５ｌの水、次いで５ｌの５０％エタノール水溶液を流して洗浄し、９９％のエタノールで溶出させ、溶出分をフラクショネーションし、フラクションを薄層クロマトグラフィーとＨＰＬＣでチェックしながら、同一の単一物質を含むフラクションは合一させ、複数の成分を含むフラクションは再度クロマトグラフィーで精製し、単一成分を含むフラクションを７本得た。

＜スクリーニング例＞
上記で得られた単一成分を含むフラクションを被験物質として、以下の方法を用いて、各被験物質のコラーゲン構築作用を評価することにより、創傷治癒効果を有する物質をスクリーニングした。具体的な手順は後述する。
動物の線維芽細胞を含むコラーゲンゲルをパンチして欠損部を設けた「創傷モデル」を用いて、被験物質存在下での欠損部の補填、収縮の程度を観察した。手順を以下に示す。試験物質のうち、最も欠損部の補填、収縮の程度が最も大きかったものについて、単一成分の構造をプロトンＮＭＲ、質量分析、¹³Ｃ−ＮＭＲより同定したところ、ファレロールであった。なお、上記抽出物からのファレロールの収量は３．２ｍｇであった。ファレロールは８０％エタノール水溶液抽出物の溶媒除去物中に約０．００６質量％含有されていた。
更に、ファレロールの終濃度を、１０^-5Ｍ、１０^-6Ｍ、１０^-7Ｍに調節して、それぞれの濃度における欠損部の収縮の程度を観察した。この結果を図９に示す。この図より、ファレロールの終濃度が１０^-5Ｍ、１０^-6Ｍであれば、パンチ穴（欠損部）の収縮は明瞭に促進されているが、１０^-7Ｍでは収縮の促進が不明瞭であることがわかる。これより、ファレロールのコラーゲン構築促進効果は、ファレロールを少なくとも１０^-6Ｍ用いることで、創傷治癒促進効果を発揮しうることがわかる。この様に本発明のスクリーニング方法によれば、創傷治癒促進作用を有する被験物質の有効濃度を求めることもできる。

＜手順＞
１）前培養により、８０％コンフルエントに増殖した正常ヒト線維芽細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ・ＥＤＴＡで分散した。これを３×１０⁵ｃｅｌｌｓ／２５ｃｍ²（１×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²）でプレートに播種した。
２）２４時間培養した後、ファレロール（Ｆａｒｒｅｒｏｌ；終濃度１０^-5Ｍ、１０^-6Ｍ、１０^-7Ｍ）およびＤＭＳＯを添加した培地に交換し、４日間培養した。
３）得られた培養物に、実施例３と同様にコラーゲン培地溶液を加えてコラーゲンゲルを作製した後、２）で使用した培地を用いてコラーゲンゲル内の線維芽細胞を培養した。培地における被験物質の濃度は、２）の培地における濃度に対応させた。すなわち２）で、１０^-5Ｍ、１０^-6Ｍ、１０^-7ＭのＦａｒｒｅｒｏｌを含む培地で培養した線維芽細胞は、コラーゲンゲル作製後も、それぞれファレロールの終濃度が１０^-5Ｍ、１０^-6Ｍ、１０^-7Ｍの培地で培養した。
４）１週間の培養後、コラーゲンゲルの大きさがコラーゲン溶液を加えた時点より１／５〜１／１０程度のサイズまで収縮した。続いて、直径３ｍｍの生検トレパンでコラーゲンゲルの中央部分をドーナツ状に打ち抜き、「創傷モデル」を作製した。
５）６ウェルプレートを準備してウェルの中央部分に５μｌのコラーゲン溶液を滴下し、創傷モデルのコラーゲンゲルを乗せて３７℃で１５分間インキュベートし、コラーゲンゲルをウェルの底面に接着させた。
６）続いて、各ウェルに、２）の培地と同じ培地を３ｍｌずつ加えて、前記コラーゲンゲルに含まれる線維芽細胞の培養を７日行った。この培養の期間中、コラーゲンゲルの創傷部位がふさがっていく過程を目視観察した。

産業上の利用の可能性

本発明の皮膚外用剤は、化粧料や皮膚外用医薬などに応用できる。また、本発明の皮膚外用剤を用いて、創傷治癒を促進することができる。
また、本発明の線維芽細胞コラーゲン産生能の増強方法を用いて、例えば、三次元培養皮膚などに於いて、三次元皮膚の性状を望む形に変化させ、人工皮膚を作ることにも応用できる。
また、本発明のスクリーニング方法を用いて、皮膚外用医薬に好適な創傷治癒促進作用を有する物質をスクリーニングすることができる。

Claims

下記一般式（１）に表されるフラバノン誘導体及び／又はその塩を含有する、創傷治癒用の皮膚外用剤。
（但し、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
前記フラバノン誘導体が、ファレロールであることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚外用剤。
前記フラバノン誘導体及び／又はその塩を１０^−６〜０．１質量％含むオトギリソウ科オトギリソウの抽出物を含有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の皮膚外用剤。
前記フラバノン誘導体及び又はその塩の含有量が、１×１０^−６〜１質量％であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の皮膚外用剤。
下記一般式（１）に表されるフラバノン誘導体及び／又はその塩を含有する、創傷治癒剤。