JP5196448B2 - アミノオキシ基を含有する反応性化合物 - Google Patents

Description

本発明は、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する分子に対して高い反応性を有する化合物、該化合物を含む標識試薬、及び該化合物を用いた生体分子固定化用支持体に関する。

アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基に反応する構造として、一級アミノ基、アミノオキシ基などが知られている。一級アミノ基の場合は、不安定なシッフベースを形成するため、その結合を還元して安定化させる必要がある。一方、アミノオキシ基は高い反応性を有し、アミノ基のように還元剤を必要としない。このため、アルデヒド基を有する分子を効率的に検出する試薬として、アミノオキシ基をもった試薬がこれまで広く利用されてきた（非特許文献１、非特許文献２）。この試薬（ＡＲＰ；Ａｌｄｅｈｙｄｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅ）は、アミノオキシ基とビオチンがリンカーを介して結合したシンプルな構造を有する。この試薬を、標的分子に反応させて結合させ、ビオチン−アビジン複合体形成を利用して、蛍光又は発光など分光学的な検出法により標的分子を検出することができる。
この試薬を用いて定量する代表的な分子として、ＲＮＡ及びＤＮＡなどの核酸がある。ＲＮＡには、遺伝子をコードしたｍＲＮＡ、タンパク質合成に関与するｒＲＮＡ、及びｔＲＮＡの他に、種々の機能性ＲＮＡが存在していることが近年明らかになってきた。これらの機能性ＲＮＡは、細胞内でタンパク質の発現などにおいて機能し、癌化にも関与していることが報告されている。そのため、ｍＲＮＡとこれら機能性ＲＮＡの細胞内量を正確に定量することは、遺伝子相互作用の詳細な解明や疾病の診断にもつながる。また、ＤＮＡは種々の環境因子によって損傷を受け、その代表的な損傷に塩基部が失われたアベイシックサイト（アプリニックサイト；ＡＰサイト）がある。アベイシックサイトはヘミアセタール構造とアルデヒド構造の平衡状態で存在し、上記ＡＲＰ試薬を作用させるとアルデヒド構造に反応するため、アベイシックサイトを検出することが可能になっている。種々の化学物質、環境因子のＤＮＡに対する損傷度を測定して見積もることで、食品に含まれる化学物質、紫外線等の遺伝子変異原性評価にも役立つ。
生体分子の中でも特にＤＮＡ及びＲＮＡを正確に定量するには、標的分子に対して高い反応性を有する試薬が必要である。しかしながら、これまでに用いられてきた試薬はその反応効率が不十分で、多量の試薬を作用させる必要があった。そのため、多くの条件下で標的分子を定量する必要がある場合には、コスト高となり時間を要していた。この他、糖鎖などの反応にもアミノオキシ基が用いられているが、反応性が不十分であった。
そのため、生体分子のなかでも特にこれらＲＮＡ、ＤＮＡなどの分子に対し、少量でも迅速に反応する新規な試薬の開発が望まれていた。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，３７０３−３７０８（１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，８２７６−８２８３（１９９３）

本発明の課題は、アルデヒド基などのアミノオキシ基と反応性の官能基を有する生体分子に対して高い反応性を有する化合物を提供することである。
本発明者らは、アミノオキシ基、芳香族基及び親水性基を有する化合物が、アルデヒド基などのアミノオキシ基と反応性の官能基を有する生体分子に対して高い反応性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）一般式１：
Ｒ_１−ＮＨ−Ｏ−Ｌ_１−Ｄ−Ｌ_２−Ａ （１）
（式中、Ｒ_１は、水素原子、アルキル基又はアミノ基の保護基であり、Ｄは、２価の芳香族基であり、Ｌ_１は、直接結合又はリンカー基であり、Ｌ_２は、直接結合又はリンカー基であり、Ａは親水性基を含む有機基である）
で表される化合物又はその塩。
（２）Ａが、親水性基として、置換又は無置換のグアニジノ基、置換又は無置換のポリエチレングリコール基、カルボキシル基、アミノオキシ基及びヒドロキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの基を含む、（１）記載の化合物又はその塩。
（３）Ａが、親水性基として、置換又は無置換のグアニジノ基を含む、（２）記載の化合物又はその塩。
（４）Ａが、以下の一般式２：
（式中、Ｘ_１及びＸ_２は、水素原子又は有機基である）
で表される、（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物又はその塩。
（５）Ｄが、置換若しくは無置換のフェニレン基、置換若しくは無置換のアントリレン基、置換若しくは無置換のナフチレン基、置換若しくは無置換のフェナントリレン基、置換若しくは無置換のアントラキノリレン、又は置換若しくは無置換のアクリジニレンである、（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物又はその塩。
（６）Ｄが、以下の一般式：
（式中、一方の結合部位がＬ_１又はＯに結合し、他方の結合部位がＬ_２又はＡに結合する）
で表される２価の芳香族基、及びこれらの芳香族基において芳香環が１〜３個の置換基を有する芳香族基から選択される、（５）記載の化合物又はその塩。
（７） Ｌ_１が、以下の一般式３又は４：
（式中、Ｒ_３は、置換若しくは無置換のＣ_１−９アルキレン基又は−（ＣＨ_２）_ｏ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ−（ＣＨ_２）_ｑ−であり、ここで、ｏ〜ｑは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｏ＋ｐ＋ｑは、１〜１５である）
のいずれかで表される２価の基であり、Ｌ_２が、以下の一般式５又は６：
（式中、Ｒ_４は、置換若しくは無置換のＣ_１−９アルキレン基又は−（ＣＨ_２）_ｒ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｓ−（ＣＨ_２）_ｔ−であり、ここで、ｒ〜ｔは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｒ＋ｓ＋ｔは、１〜１５であるである）
のいずれかで表される２価の基である、（１）〜（６）のいずれかに記載の化合物又はその塩。
（８）以下の一般式７：
（式中、Ｒ_１は、水素原子又はアミノ基の保護基であり、ｎは、１〜５の整数であり、ｍは、１〜５の整数であり、Ｒ_ａ〜Ｒ_ｆは、それぞれ独立して、水素原子又は置換基であり、Ｘ_１及びＸ_２は、水素原子又は有機基である）
で表される、（１）記載の化合物又はその塩。
（９）以下の一般式８：
（式中、Ｒ_１は、水素原子又はアミノ基の保護基であり、ｎは、１〜５の整数であり、Ｒ_ａ〜Ｒ_ｆは、それぞれ独立して、水素原子又は置換基であり、Ｘ_２は、水素原子又は有機基である）
で表される、（１）記載の化合物又はその塩。
（１０）以下の一般式：
（式中、Ｒ_１及びＲ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基の保護基であり、ｎ及びｉは、それぞれ独立して、１〜５の整数であり、Ｒ_ａ〜Ｒ_ｆは、それぞれ独立して、水素原子又は置換基である）
で表される、（１）記載の化合物又はその塩。
（１１）Ａが標識基をさらに含む、（１）〜（９）のいずれかに記載の化合物又はその塩。
（１２）Ｘ_１及びＸ_２の少なくとも一方が有機基であり、該有機基が標識基である、（４）、（８）、又は（９）記載の化合物又はその塩。
（１３）アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する生体分子を標識するための試薬であって、（１１）又は（１２）記載の化合物又はその塩を含む前記試薬。
（１４）（１１）又は（１２）記載の化合物と、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する生体分子とが結合してなる標識化生体分子であって、該化合物のアミノオキシ基と該生体分子のアルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基とが反応して共有結合を形成している、前記標識化生体分子。
（１５）アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する生体分子を固定化するための生体分子固定化用支持体であって、担体及び該担体表面に存在する（１）〜（１０）のいずれかに記載の化合物又はその塩の層を含む、前記支持体。
本発明により、アルデヒド基などのアミノオキシ基と反応性の官能基を有する生体分子に対して高い反応性を有する化合物が提供される。

図１ａはＤＮＡのアベイシックサイトを表し、図１ｂはＤＮＡのアベイシックサイトへの反応を表し、図１ｃはＲＮＡの３’末端酸化反応を表す。
図２は、３’末端が酸化されたＲＮＡ（Ｆ−Ｌｒ１７Ｘｏｘ）に対するＡＲＰとａｏＮｇの結合反応を示す。ｓｓは１本鎖を表し、括弧内に反応部位で形成される塩基対（ＸＹ）の組み合わせを示す。Ｇｒａｙ ｂａｒ，ＡＲＰ；ｂｌａｃｋ ｂａｒ，ａｏＮｇ。
図３は、アベイシックサイトを有するＤＮＡへのＡＲＰとａｏＮｇの結合反応を示す。アベイシックサイトを有するＤＮＡの一本鎖（ｓｓ）及び二本鎖（ｄｓ）に対し、３７℃、４２℃、４７℃で反応を行ったときの速度定数のグラフを示す。
図４は、２’−デオキシウリジンを含むＤＮＡに対するＡＲＰ、ａｏＮｇ、ａｏＮｇ−ｂｉｏの結合反応を示す。２’−デオキシウリジンを含むＤＮＡ２本鎖をＵＤＧで処理した後に、標識試薬（ＡＲＰ、ａｏＮｇ、ａｏＮｇ−ｂｉｏ）を添加し、各時間の反応産物の精製率を調べた。反応液のポリアクリルアミドゲルによる分析の結果と、各時間の反応率のグラフを示した。
図５は、アベイシックサイトを含む２本鎖ＤＮＡ間の架橋反応の結果を示す。２’−デオキシウリジンを含むＤＮＡをＵＤＧで処理してアベイシックサイトを生成させた後にａｏＮａｏを反応させた。反応液のポリアクリルアミドゲルによる分析の結果と、各時間の反応率のグラフを示した。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００７−３３０３１５号の明細書、特許請求の範囲、及び図面に記載された内容を包含する。

一実施形態において本発明は、一般式１：
Ｒ_１−ＮＨ−Ｏ−Ｌ_１−Ｄ−Ｌ_２−Ａ （１）
（式中、Ｒ_１は、水素原子、アルキル基（好ましくはＣ_１−６アルキル基）又はアミノ基の保護基であり、Ｄは、２価の芳香族基であり、Ｌ_１は、直接結合又はリンカー基であり、Ｌ_２は、直接結合又はリンカー基であり、Ａは、親水性基を含む有機基である）で表される化合物又はその塩（以下、本発明の化合物と称する場合がある）に関する。
塩としては、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、及び塩基性又は酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられる。酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
本発明の化合物は、無水物であっても、溶媒和物であってもよい。一般式１の化合物又はその塩の溶媒和物もまた本発明の化合物に包含される。ここで溶媒は溶質（一般式１の化合物又はその塩）の生物活性を妨げるものでなければ特に制限されない。適当な溶媒の具体例としては、水、メタノール、エタノール及び酢酸が含まれる。好ましくは、溶媒は水である。
一般式１のＲ_１におけるアミノ基の保護基は、特に制限されないが、例えば、アシル基、カルバメート基、トリアルキルシリル基、フタリル基、カルボキシアルキルカルボニル基、トシル基、トリフルオロアセチル基、トリチル基、及びモノ又はジ置換トリチル基が挙げられ、好ましくはアルキル基である。これらの基は置換されていてもよい。
Ｒ_１は、好ましくは炭素数１〜１０、より好ましくは炭素数１〜６の、置換若しくは無置換のアルキル基である。アルキル基は、直鎖でも分岐鎖でもよい。ここで、置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、Ｃ_１−６アルキル基、Ｃ_１−６アルキルアミノ基、カルバモイル基、チオカルボキシ基、スルホ基、スルフィノ基、イソシアナト基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ_２−６アルケニル基、Ｃ_３−１０シクロアルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基、Ｃ_１−１０アシル基、Ｃ_１−１０アルコキシカルボニル基並びにカルボキシル基等を挙げることができる。置換基が複数存在する場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。置換基の数は、好ましくは１〜３個である。
本明細書において「Ｃ_１−６アルキル基」等の記載における「Ｃ_１−６」等の表現は、その基が１〜６個の炭素原子を含むことをさす、該基は直鎖でも分岐鎖でもよい。
一般式１のＤにおける２価の芳香族基は、ベンゼン環を有するものであればよく、縮合環中にベンゼン環を有するものでもよい。２価の芳香族基としては、５〜２５個の炭素原子、好ましくは６〜２０個の炭素原子を含む単環式又は多環式の２価の芳香族基が挙げられる。より具体的には、置換又は無置換のフェニレン基、置換又は無置換のピリジレン基、置換又は無置換のピリダジニル基、置換又は無置換のピリミジニレン基、置換又は無置換のピラジニレン基、置換又は無置換のフリレン基、置換又は無置換のチエニレン基、置換又は無置換のピロリレン基、置換又は無置換のイミダゾリレン基、置換又は無置換のチアゾリレン基、置換又は無置換のオキサゾリレン基、置換又は無置換のナフチレン基、置換又は無置換のアントリレン基、置換又は無置換のピレニレン基、置換又は無置換のインダニレン基、置換又は無置換のテトラヒドロナフチレン基、置換又は無置換のキノリレン基、イソキノリレン基、置換又は無置換のシンノリニレン基、置換又は無置換のキナゾリニレン基、置換又は無置換のキノキサリニレン基、置換又は無置換のナフチリジニレン基、置換又は無置換のフタラジニレン基、置換又は無置換のインドリレン基、置換又は無置換のイソインドリレン基、置換又は無置換のベンゾフリレン基、置換又は無置換のベンゾチエニレン基、置換又は無置換のインダゾリレン基、置換又は無置換のベンゾイミダゾリレン基、置換又は無置換のベンゾチアゾリレン基、置換若しくは無置換のフェナントリレン基、置換若しくは無置換のアントラキノリレン、又は置換若しくは無置換のアクリジニレンが挙げられる。Ｄとしては、置換又は無置換のフェニレン基、置換又は無置換のアントリレン基、置換又は無置換のナフチレン基、及び置換若しくは無置換のフェナントリレン基、置換若しくは無置換のアントラキノリレン、又は置換若しくは無置換のアクリジニレンが好ましく、特に置換又は無置換のアントリレン基及び置換又は無置換のナフチレン基が好ましい。
より具体的には、Ｄは、以下の一般式：
（式中、一方の結合部位がＬ_１又はＯに結合し、他方の結合部位がＬ_２又はＡに結合する）
で表される２価の芳香族基、及びこれらの芳香族基において芳香環が１〜３個の置換基を有する芳香族基から選択される。
あるいは、Ｄは、以下の一般式：
（式中、一方の結合部位がＬ_１又はＯに結合し、他方の結合部位がＬ_２又はＡに結合する）
で表される２価の芳香族基、及びこれらの芳香族基において芳香環が１〜３個の置換基を有する芳香族基から選択される。
あるいは、Ｄとしては、以下の一般式：
で表される２価の芳香族基、及びこれらの芳香族基において芳香環が１〜３個の置換基を有する芳香族基もまた好ましい。
一般式１のＤにおける芳香族基の置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、オキソ基、Ｃ_１−６アルキル基、Ｃ_１−６アルキルアミノ基、カルバモイル基、チオカルボキシ基、スルホ基、スルフィノ基、イソシアナト基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ_２−６アルケニル基、Ｃ_３−１０シクロアルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基、Ｃ_１−１０アシル基、Ｃ_１−１０アルコキシカルボニル基並びにカルボキシル基等を挙げることができる。置換基が複数存在する場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。置換基の数は、好ましくは１〜１０個、好ましくは１〜３個である。
一般式１のＬ_１におけるリンカー基は、アミノオキシ基の酸素原子と芳香族基Ｄを結合する基であって、式１の化合物の反応性を阻害しないものであれば特に制限されない。リンカー基は、通常、２価の有機基、例えば主鎖に１〜１５個、好ましくは１〜１２個の炭素原子並びに／又は複素原子（酸素、窒素又は硫黄原子）を含む２価の有機基である。主鎖に含まれる原子の数は、リンカー基がつなぐ原子間において最短距離を形成する鎖に含まれる原子の数をさす。Ｌ_１としては、例えば、−（ＣＨ_２）_ｏ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ−（ＣＨ_２）_ｑ−が挙げられる。ここで、ｏ〜ｑは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｏ＋ｐ＋ｑは、１〜１５である。
Ｌ_１としては、例えば、以下の一般式３又は４：
（式中、Ｒ_３は、置換若しくは無置換のＣ_１−９アルキレン基又は−（ＣＨ_２）_ｏ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ−（ＣＨ_２）_ｑ−であり、ここで、ｏ〜ｑは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｏ＋ｐ＋ｑは、１〜１５である）
で表される２価の基も例示できる。一般式３においては、Ｒ_３がアミノオキシ基の酸素原子に結合し、−ＮＨ−の窒素原子が芳香族基Ｄに結合する。一般式４においては、Ｒ_３がアミノオキシ基の酸素原子に結合し、−（ＣＯ）−の炭素原子が芳香族基Ｄに結合する。
ここでＣ_１−９アルキレン基の置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、Ｃ_１−６アルキル基、Ｃ_１−６アルキルアミノ基、カルバモイル基、チオカルボキシ基、スルホ基、スルフィノ基、イソシアナト基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ_２−６アルケニル基、Ｃ_３−１０シクロアルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基、Ｃ_１−１０アシル基、Ｃ_１−１０アルコキシカルボニル基並びにカルボキシル基等を挙げることができる。置換基が複数存在する場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。置換基の数は、好ましくは１〜３個である。
一般式１のＬ_２におけるリンカー基は、芳香族基Ｄと親水性基を含む有機基Ａとを結合する基であって、式１の化合物の反応性を阻害しないものであれば特に制限されない。リンカー基は、通常、２価の有機基、例えば主鎖に１〜１５個、好ましくは１〜１２個の炭素原子及び／又は複素原子（酸素、窒素又は硫黄原子）を含む２価の有機基である。Ｌ_２としては、例えば、−（ＣＨ_２）_ｒ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｓ−（ＣＨ_２）_ｔ−が挙げられる。ここで、ｒ〜ｔは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｒ＋ｓ＋ｔは、１〜１５である。
Ｌ_２としては、例えば、以下の一般式５又は６：
（式中、Ｒ_４は、置換若しくは無置換のＣ_１−９アルキレン基又は−（ＣＨ_２）_ｒ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｓ−（ＣＨ_２）_ｔ−であり、ここで、ｒ〜ｔは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｒ＋ｓ＋ｔは、１〜１５である）
で表される２価の基も例示できる。一般式５においては、−ＮＨ−の窒素原子が芳香族基Ｄに結合し、Ｒ_４が親水性基を有する有機基Ａに結合する。一般式６においては、−（ＣＯ）−の炭素原子が芳香族基Ｄに結合し、Ｒ_４が親水性基を有する有機基Ａに結合する。Ｃ_１−９アルキレン基の置換基は、一般式３又は４について記載したのと同様である。
一般式１のＡにおける親水性基を含む有機基は、親水性基を少なくとも１つ含む有機基であれば特に制限されず、親水性基を複数、例えば、２〜３個含んでいてもよい。Ａが複数の親水性基を含む場合、それらは同一でも異なっていてもよい。本発明の化合物においてＡが親水性基を含むことにより、化合物の水溶性が向上し、標的分子との相互作用を向上させることができる。その結果、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する分子との反応性を向上させることができる。
有機基Ａは、好ましくは親水性基として、置換又は無置換のグアニジノ基、置換又は無置換のポリエチレングリコール基、カルボキシル基、アミノオキシ基及びヒドロキシル基からなる群から選択される少なくとも１つの親水性基、より好ましくは置換又は無置換のグアニジノ基を含む。
グアニジノ基及びポリエチレングリコール基の置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選ばれるハロゲン原子、ヒドロキシル基、メルカプト基、アミノ基、Ｃ_１−６アルキル基、Ｃ_１−６アルキルアミノ基、カルバモイル基、チオカルボキシ基、スルホ基、スルフィノ基、イソシアナト基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ_２−６アルケニル基、Ｃ_３−１０シクロアルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基、Ｃ_１−１０アシル基、Ｃ_１−１０アルコキシカルボニル基、カルボキシル基並びにグアニジノ基等を挙げることができる。
置換又は無置換のグアニジノ基は、例えば、以下の一般式２：
（式中、Ｘ_１及びＸ_２は、水素原子又は有機基である）
で表される。ここでＸ_１及びＸ_２における有機基は、グアニジノ基の親水性を妨げるものでなければ特に制限されず、例えば、上記グアニジノ基の置換基が例示できる。
本発明において、置換又は無置換のグアニジノ基には、以下の一般式２’及び２”：
（式中、Ｘ_３〜Ｘ_７は、水素原子又は有機基である）
で表される基も包含される。ここでＸ_３〜Ｘ_７における有機基は、グアニジノ基の親水性を妨げるものでなければ特に制限されず、例えば、上記グアニジノ基の置換基が例示できる。
本発明の化合物におけるアミノオキシ基は、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基、特にアルデヒド基と高い反応性で共有結合を形成できることから、本発明の化合物は、アミノオキシ基は、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する化合物、例えば生体分子に、高い反応性で結合させることができる。親水性基として置換又は無置換のグアニジノ基を含む本発明の化合物は、核酸、特に２本鎖の核酸に対し、高い反応性で結合させることができる。
有機基Ａは、さらに標識基を有していてもよい。本発明の化合物は、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する生体分子と高い反応性をもって結合しうることから、有機基Ａが標識基を有する本発明の化合物をこのような生体分子と反応させることにより、該生体分子を効率的に標識することができる。従って、一実施形態において本発明は、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する生体分子を標識するための試薬であって、標識基を有する本発明の化合物を含む前記標識試薬に関する。本発明はまた、本発明の化合物と、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する生体分子とが結合してなる標識化生体分子であって、該化合物のアミノオキシ基と該生体分子のアルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基とが反応して共有結合を形成している、前記標識化生体分子に関する。
アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基、又はケトン基を有する生体分子としては、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び糖鎖などが挙げられる。ポリペプチドには、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質が包含される。ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び非天然型核酸等の核酸が包含され、これらは１本鎖でも２本鎖でもよく、又、ポリヌクレオチドにはオリゴヌクレオチドも包含される。本発明においてポリヌクレオチドの塩基長は、通常２〜１００００塩基、好ましくは２〜１０００塩基である。核酸の任意の位置に、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基、又はケトン基を複数導入または生成させることが可能であり、こうして得られたアルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基、又はケトン基を有する非天然型核酸も本発明においてポリヌクレオチドに包含される。また、ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ及びＲＮＡの誘導体、例えば、３’末端のヒドロキシル基が酸化されたアルデヒド基を有するＲＮＡ、アベイシックサイトを有するＤＮＡ、及びそのヒドロキシル基が酸化されてアルデヒド基となったものも包含される。特に、核酸におけるこれらの基の導入、生成、及びそれらの基に対する標識に関して以下に記載する。
核酸におけるアルデヒド基の生成方法は幾つかの種類に分けることができる。その代表的な方法の一つに、アベイシックサイト（またはアプリニックサイト（ＡＰサイト））形成を通してのアルデヒド構造の形成がある。核酸のアベイシックサイトは、核酸の塩基部分が除去された糖部分の構造を示し（図１−ａ）、閉環と開環構造の平衡で存在している。アベイシックサイトは、閉環状態ではヘミアセタール構造であるが、開環型ではアルデヒド構造となっており、アミノオキシ基を作用させるとそのアルデヒド構造に反応する（図１−ｂ）。
このアベイシックサイトは、天然の核酸や非天然型核酸を酸性条件で処理することによって生成させることができる。非天然型核酸としては、２−ピリミジドン体（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１，１７５−１７８（１９９０））、２’−デオキシ−キサントシン体（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，１０４５−１０５１（２００３））、１−デアザ−２’−デオキシグアノシン体（Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ，７，７０９−７１２（２００５））などが挙げられる。また、その他にも特別な反応条件でヘミアセタール構造の保護基を脱保護させてアベイシックサイトを形成する２’−デオキシ−Ｄ−リボース誘導体（非特許文献６；非特許文献７）なども知られている。
また、上記のように誘導体を用いてアベイシックサイトを生成させる他に、損傷塩基をオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに導入後、その損傷塩基を除去する酵素で処理し、アベイシックサイトを生成させる方法もある。この損傷塩基には、２’−デオキシウリジン、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジンなどが挙げられ、２’−デオキシウリジンに対してはウラシルＮグリコシラーゼを作用させることによってアベイシックサイトを生成させることができる。２’−デオキシウリジンは、化学合成によっても、またそのトリリン酸体（ｄＵＴＰ）を基質に用いてＤＮＡポリメラーゼによる伸張反応を行うことによっても、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド中に複数導入することが可能である。この２’−デオキシウリジンをＤＮＡ中に取り込ませてウラシルＮグリコシラーゼを作用させて生成したアベイシックサイトを標識後にＤＮＡを断片化させ、その断片を化学的に標識するキット（Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ（登録商標））も市販されている（特表２００５−５３４３０４）。この市販キット中に含まれる標識試薬と本発明の試薬の構造は異なり、本発明の試薬を用いることによって、より迅速、かつ高収率で標的核酸を標識することが可能となる。
アベイシックサイトを経由せずにアルデヒド基を核酸中に生成させる方法もある。例えばあらかじめ非天然型核酸をオリゴヌクレオチドに導入し、その後酸化反応を行うことでアルデヒド基を生成させることが可能である（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３７，９０６７−９０７０（１９９６））。また、ＲＮＡの場合には、天然型であってもアルデヒド基を形成可能である。例えばＲＮＡの３’末端の２’位、３’位の水酸基を過ヨウ素酸等によって酸化させ、その３’末端にアルデヒド基を発生させることが可能である（図１−ｃ）。この場合、２’位と３’位にアルデヒド基が生じるため、アミノオキシ基及び標識基を有する化合物を作用させると２’位または３’位においてＲＮＡが標識される。
ケトン基を持つ非天然型核酸も報告されており（Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ，３，３９８３−３９８６（２００１））、これらを導入した核酸に対し、本発明のアミノオキシ基を有する化合物を反応させることでケト基に対して標識することも可能である。
標識基は、標識物質を含む基をさす。標識物質としては、生体分子の標識に慣用される標識物質、例えば、放射性同位元素、色素（蛍光色素、発光色素）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン、メチレンブルー、フェロセンなどを例示できるがこれらに限定されない。
本発明の化合物が標識基を含む態様において、有機基Ａが、上記一般式２のグアニジノ基を含むか、又は一般式２のグアニジノ基である場合は、Ｘ_１及びＸ_２のどちらかが有機基であり、該有機基が上記標識基であることが好ましい。有機基Ａが、上記一般式２’又は２”のグアニジノ基であるかこれを含む場合も、Ｘ_３〜Ｘ_５のいずれか、又はＸ_６若しくはＸ_７が標識基であることが好ましい。
その場合、標識物質は、グアニジノ基の窒素原子に直接結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーとしては、特に制限されないが、通常、２価の有機基、例えば主鎖に１〜１５個、好ましくは１〜１２個の炭素原子及び／又は複素原子（酸素、窒素又は硫黄原子）を含む２価の有機基である。例えば、−（ＣＨ_２）_ｖ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｗ−（ＣＨ_２）_ｘ−ＮＨ−が挙げられる。ここで、ｖ、ｗ及びｘは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｖ＋ｗ＋ｘは、１〜１５である。好ましくは、−（ＣＨ_２）_２−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２−ＮＨ−である。
標識物質としてビオチンを含む標識基（一般式２においては、Ｘ_１又はＸ_２）としては、以下の式：
で表される基を例示することができる。
有機基Ａが、標識基が結合したグアニジノ基を含む有機基である本発明の化合物は、特に、核酸に標識を付すために好適に用いることができる。
本発明の標識試薬によって標識された生体分子は、様々な検出系によって定量可能である。そのため、本標識試薬は検出系、検出機器の影響を受けず、高い汎用性をもつため、広く利用される可能性を有する。
あるいは、有機基Ａは、生体分子基を含んでいてもよい。生体分子基は、糖鎖、ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）、ポリペプチド（例えば、酵素）などの生体分子を含む基をさす。Ａがポリヌクレオチドを含む場合、ＰＣＲのプライマーとして用いることができる。例えば、本発明の化合物を標的分子に結合させた後、鋳型ＤＮＡと蛍光またはビオチンなどで標識された基質（ｄＮＴＰ）共存下でプライマーの伸長反応を行った場合、ポリヌクレオチドに蛍光物質（またはビオチンなど）が取り込まれ、それによって標的分子が標識される。
有機基Ａが、上記一般式２のグアニジノ基を含むか、又は一般式２のグアニジノ基である場合は、Ｘ_１及びＸ_２のどちらかが有機基であり、該有機基が上記生体分子基であることが好ましい。有機基Ａが、上記一般式２’の基を含むか、又は一般式２’の基である場合は、Ｘ_３〜Ｘ_５のいずれかが有機基であり、該有機基が上記生体分子基であることが好ましい。上記一般式２”の基を含むか、又は一般式２”の基である場合は、Ｘ_６及びＸ_７のどちらかが有機基であり、該有機基が上記生体分子基であることが好ましい。その場合、生体分子は、グアニジノ基の窒素原子に直接結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーは、上記標識基におけるリンカーと同様である。
本発明の化合物におけるアミノオキシ基は、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する分子、例えば生体分子に、高い反応性で結合することから、担体の表面に本発明の化合物の層を形成し、本発明の化合物を介して生体分子を担体に固定化することができる。従って、一実施形態において本発明は、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する生体分子を固定化するための生体分子固定化用支持体であって、担体及び該担体表面に存在する本発明の化合物の層を含む、前記支持体に関する。
本発明の化合物の層の形成は、単に本発明の化合物を担体上に塗布することにより実施してもよいし、担体上の官能基と共有結合を形成することにより実施してもよい。
担体上の官能基と共有結合を形成する場合、本発明の化合物における有機基Ａは、担体への結合に適した官能基を含むことが好ましい。そのような官能基としては、固定化しようとする担体上に存在する官能基と共有結合を形成しうる基が挙げられ、例えば、活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基又はイソシアネート基と共有結合しうる基（例えば、アミノ基、アミノオキシ基など）、あるいはマレイミド基又はジスルフィド基と反応しうる基（例えば、メルカプト基など）等が挙げられる。これらの官能基は保護された形態でもよい。保護された形態とは、官能基の水素原子が保護基で置換された形態を意味する。アミノ基、アミノオキシ基などの保護基としては、特に制限されないが、アルキル基、アシル基、カルバメート基、トリアルキルシリル基、フタリル基、カルボキシアルキルカルボニル基、トシル基、トリフルオロアセチル基、トリチル基、及びモノ又はジ置換トリチル基が挙げられる。モノ置換トリチル基としては、例えば、モノアルコキシトリチル基、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１のアルコキシ基を有するモノアルコキシトリチル基、具体的には、モノメトキシトリチル基、モノエトキシトリチル基、モノプロポキシトリチル基、モノイソプロポキシトリチル基及びモノブトキシトリチル基が挙げられる。
本発明の化合物を結合させる担体の材料としては、例えば、石英ガラス、ホウ珪酸ガラス及びソーダライムガラスなどのガラス、シリコン、金属、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）が挙げられる。本発明においては、ガラス、シリコン、セラミックス又はプラスチックを使用するのが好ましい。上記担体の表面に本発明の化合物の層を形成する。担体に官能基を導入する場合、導入する官能基としては、例えば、活性エステル基、エポキシ基、アミノ基、クロロ基、ジスルフィド基、アルデヒド基、マレイイミド基、カルボジイミド基、イソチオシアナト基、イソシアナト基等が挙げられる。アミノ基またはアミノオキシ基を有する本発明の化合物を結合する場合は、活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基、イソシアネート基が導入された担体を用いるのが好ましく、メルカプト基を有する本発明の化合物を結合する場合は、マレイミド基、ジスルフィド基が導入された担体を用いるのが好ましい。
担体の形状は、特に制限されず、基板状、糸状、球状、ビーズ状、多角形状、粉末状、多孔質状などが挙げられ、本発明においては基板状が好ましい。
置換又は無置換のグアニジノ基を含む有機基Ａを有する本発明の化合物は、核酸に特異的に結合し得ることから、当該化合物を担体に結合させることにより、優れた核酸固定化用支持体を製造することができる。得られた核酸固定化用支持体にＤＮＡなどの核酸を固定化することにより、効率的にマイクロアレイを製造するができる。
本発明の化合物により、特に、ＲＮＡ及びＤＮＡなどの核酸への標識反応を効率化することができ、遺伝子検出に要する時間を短縮することができる。さらに本発明の化合物の高い反応性によって、検出感度の向上、及び検出値の定量化が可能となり、遺伝子に関わるより詳細な情報を正確に得ることができる。また、担体上に本発明の化合物の層を形成し、その表面上で標的生体分子との結合反応を行う場合にも、担体上で効率的に標的生体分子の捕捉が行えるようになり、生体分子の同定に応用することができる。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されない。

（実施例１）アミノオキシナフタレン試薬（ａｏＮｇ、化合物６およびａｏＮｇ−ｂｉｏｔｉｎ、化合物１０）の合成
薄層クロマトグラフィーはＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ２５４プレート（Ｍｅｒｃｋ社）上で行った。カラムクロマトグラフィーにはＷａｋｏｇｅｌ Ｃ−２００（和光純薬工業）を用いた。^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲはテトラメチルシランを内部標準とし、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＸ２７０を用いて測定した。
ａｏＮｇ、化合物６の合成
スキーム１
Ｎ ^１ −（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物２）
アルゴン雰囲気下、１，５−ジアミノナフタレン（化合物１）４４０ｍｇ（２．８０ｍｍｏｌ）及びＮ−トリチルアミノオキシ酢酸１．００ｇ（３．００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍｌに溶解し、ＥＤＣ［塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド］５９０ｍｇ（３．１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間撹拌した。反応液に酢酸エチル２００ｍｌを加え、水７０ｍｌで４回洗浄した。溶液を減圧下濃縮した後、酢酸エチルで３回共沸し、生じた沈殿を酢酸エチル（２０ｍｌ）とヘキサン（１２０ｍｌ）の混合溶液に懸濁させた。沈殿を吸引濾過により濾取して標記化合物（化合物２）１．０３ｇ（収率７２％）を淡茶色粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ４７３．３（Ｍ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：４７３．２１０３（Ｃ_３１Ｈ_２７Ｎ_３Ｏ_２［Ｍ^＋］），実測値：４７３．２０９３．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：９．３３（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３８（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９３（ｄ，１Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．６４（ｄ，１Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．３４−７．２５（ｍ，１６Ｈ，Ｔｒ ａｎｄ ｎａｐｈ），７．２０（ｔ，１Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），６．９９（ｄ，１Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），６．７０（ｄ，１Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．７８（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ_２），４．２０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１６８．２６（Ｃ），１４４．９６（Ｃ），１４４．０１（Ｃ），１３２．１３（Ｃ），１２８．７０（ＣＨ），１２７．５７（ＣＨ），１２６．６８（ＣＨ），１２３．０５（Ｃ），１２２．７６（ＣＨ），１２１．０６（ＣＨ），１１９．８８（ＣＨ），１０９．１５（ＣＨ），１０７．５８（ＣＨ），７３．６４（Ｃ），７３．３１（ＣＨ_２）。
Ｎ ^１ −［２−（トリフルオロアセチルアミノ）エチルカルボニル］−Ｎ ^５ −（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物３）
アルゴン雰囲気下、Ｎ^１−（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物２）１．００ｇ（２．１１ｍｍｏｌ）及びＮ−トリフルオロアセチル−β−アラニン７８０ｍｇ（４．２２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２５ｍｌに溶解し、ＥＤＣ［塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド］８１０ｍｇ（４．２２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１７時間撹拌した。反応液に酢酸エチル２２０ｍｌを加え、水８０ｍｌで４回洗浄した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物３）９６１ｍｇ（収率７１％）を白色固体状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ６４０．３（Ｍ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：６４０．２２９７（Ｃ_３６Ｈ_３１Ｆ_３Ｎ_４Ｏ_４［Ｍ^＋］），実測値：６４０．２３０８．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１０．０４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．６１（ｓ，２Ｈ，ＮＨ ａｎｄ ＮＨ），８．３６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９４（ｄ，１Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．７４−７．６９（ｍ，３Ｈ，ｎａｐｈ），７．５５−７．４８（ｍ，２Ｈ，ｎａｐｈ），７．３５−７．２５（ｍ，１５Ｈ，Ｔｒ），４．２３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２），３．５６（ｂｒ ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．７８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２，Ｊ＝６．８Ｈｚ）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１６９．２７（Ｃ），１６８．７６（Ｃ），１５６．１２（Ｃ，ｑ，Ｊ＝３５．８Ｈｚ），１４４．０１（Ｃ），１３３．５７（Ｃ），１３２．７３（Ｃ），１２８．７３（ＣＨ），１２８．４６（Ｃ），１２８．４１（Ｃ），１２７．５８（ＣＨ），１２６．７０（ＣＨ），１２５．３６（ＣＨ），１２５．１１（ＣＨ），１２２．０４（ＣＨ），１２０．５２（ＣＨ），１１９．６７（ＣＨ），１１５．８０（Ｃ，ｑ，Ｊ＝２８７．９Ｈｚ），７３．６７（Ｃ），７３．３３（ＣＨ_２），３６．０４（ＣＨ_２），３４．８０（ＣＨ_２）。
Ｎ ^１ −（２−アミノエチルカルボニル）−Ｎ ^５ −（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物４）
Ｎ^１−［２−（トリフルオロアセチルアミノ）エチルカルボニル］−Ｎ^５−（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物３）９５０ｍｇ（１．４８ｍｍｏｌ）にエタノール４０ｍｌ及び濃アンモニア水２０ｍｌを加えて耐圧ガラス容器に密封し、６０℃で４時間加熱した。溶液を室温に戻した後、減圧下濃縮し、残渣をアセトニトリルで３回共沸して標記化合物（化合物４）を淡黄色泡状物質として得た。本化合物はこれ以上の精製を行わず、次の反応に用いた。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ５４５．４（ＭＨ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：５４５．２５５３（Ｃ_３４Ｈ_３３Ｎ_４Ｏ_３［ＭＨ^＋］），実測値：５４５．２５７３．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１０．１９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．６２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９８（ｄ，１Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．８０（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ_２），７．７５−７．７０（ｍ，３Ｈ，ｎａｐｈ），７．５８−７．４９（ｍ，２Ｈ，ｎａｐｈ），７．３８−７．２５（ｍ，１５Ｈ，Ｔｒ），４．２３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２），３．１６（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．８９（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２，Ｊ＝６．６Ｈｚ）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１６８．８９（Ｃ），１６８．７８（Ｃ），１４３．９８（Ｃ），１３３．２９（Ｃ），１３２．７７（Ｃ），１２８．７０（ＣＨ），１２８．４９（Ｃ），１２８．２９（Ｃ），１２７．５６（ＣＨ），１２６．７０（ＣＨ），１２５．３２（ＣＨ），１２５．１９（ＣＨ），１２２．１３（ＣＨ），１２１．９４（ＣＨ），１２０．４９（ＣＨ），１１９．８２（ＣＨ），７３．６４（Ｃ），７３．３０（ＣＨ_２），３５．１１（ＣＨ_２），３２．８２（ＣＨ_２）。
Ｎ ^１ −（２−グアニジノエチルカルボニル）−Ｎ ^５ −（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物５）
アルゴン雰囲気下、前反応により合成したＮ^１−（２−アミノエチルカルボニル）−Ｎ^５−（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物４）全量（１．４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１５ｍｌに溶解し、塩酸１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミジン３２０ｍｇ（２．２０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン０．６１ｍｌ（４．４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で６時間撹拌した。反応液に酢酸エチル１５０ｍｌを加え、水５０ｍｌで４回洗浄した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物（化合物５）５６７ｍｇ（収率６６％）を淡茶色泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ５８７．３（ＭＨ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：５８７．２７７１（Ｃ_３５Ｈ_３５Ｎ_６Ｏ_３［ＭＨ^＋］），実測値：５８７．２７７２．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１０．１１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．６１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９６（ｍ，１Ｈ，ｎａｐｈ），７．７５−７．７０（ｍ，３Ｈ，ｎａｐｈ），７．６７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．５７−７．４８（ｍ，２Ｈ，ｎａｐｈ），７．３８−７．２６（ｍ，１５Ｈ，Ｔｒ），７．２５（ｂｒ ｓ，３Ｈ，ＮＨ_２ ａｎｄ ＮＨ），４．２３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２），３．４９（ｄｔ，２Ｈ，ＣＨ_２，Ｊ＝５．６，６．３Ｈｚ），２．７９（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２，Ｊ＝６．３Ｈｚ）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１６９．３９（Ｃ），１６８．６０（Ｃ），１５６．５２（Ｃ），１４３．８３（Ｃ），１３３．３０（Ｃ），１３２．６０（Ｃ），１２８．５５（ＣＨ），１２８．３３（Ｃ），１２８．２２（Ｃ），１２７．４０（ＣＨ），１２６．５３（ＣＨ），１２５．１７（ＣＨ），１２５．０２（ＣＨ），１２１．９３（ＣＨ），１２１．７９（ＣＨ），１２０．３６（ＣＨ），１１９．６２（ＣＨ），７３．４９（Ｃ），７３．１４（ＣＨ_２），３６．９７（ＣＨ_２），３４．８８（ＣＨ_２）。
Ｎ ^５ −（アミノオキシアセチル）−Ｎ ^１ −（２−グアニジノエチルカルボニル）−１，５−ジアミノナフタレン・２塩酸塩（化合物６）
アルゴン雰囲気下、Ｎ^１−（２−グアニジノエチルカルボニル）−Ｎ^５−（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物５）５９ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン４．０ｍｌに溶解し、濃塩酸６０μｌを加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液中に生じた白色の沈殿物質を塩化メチレンで洗浄した後に、エタノール（２ｍｌ）とジエチルエーテル（３ｍｌ）の混合溶液に懸濁させ、沈殿を吸引濾過により濾取して標記化合物（化合物６）２６ｍｇ（収率６２％）を白色粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ３４５．２（ＭＨ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：３４５．１６７５（Ｃ_１６Ｈ_２１Ｎ_６Ｏ_３［ＭＨ^＋］），実測値：３４５．１６８７．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１１．０１（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．４０（ｓ，１Ｈ，ＮＨＣＯ），１０．２４（ｓ，１Ｈ，ＮＨＣＯ），７．９９（ｔ，２Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．７８（ｂｒ ｔ，１Ｈ，ＮＨ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），７．７３−７．６９（ｍ，２Ｈ，ｎａｐｈ），７．５６（ｄｄ，１Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝４．０，８．３Ｈｚ），７．５３（ｄｄ，１Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝４．０，７．９Ｈｚ），７．２８（ｂｒ ｓ，４Ｈ），４．９２（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２），３．５０（ｄｔ，２Ｈ，ＣＨ_２，Ｊ＝５．８，６．３Ｈｚ），２．８０（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２，Ｊ＝６．３Ｈｚ）。
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１６９．５０（Ｃ），１６６．８７（Ｃ），１５６．８１（Ｃ），１３３．４３（Ｃ），１３２．５８（Ｃ），１２８．５３（Ｃ），１２８．４７（Ｃ），１２５．２５（ＣＨ），１２５．１１（ＣＨ），１２２．１３（ＣＨ），１２２．０６（ＣＨ），１２０．７６（ＣＨ），１２０．１９（ＣＨ），７２．１５（ＣＨ_２），３７．１７（ＣＨ_２），３５．１８（ＣＨ_２）。
ａｏＮｇ−ｂｉｏｔｉｎ試薬（以下ａｏＮｇ−ｂｉｏ；化合物１０）の合成
スキーム２
Ｎ ^１ −〔２−（Ｎ ^３ −フルオレニルメチルオキシカルボニルチオウレイド）エチルカルボニル〕−Ｎ ^５ −（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物７）
アルゴン雰囲気下、Ｎ^１−（２−アミノエチルカルボニル）−Ｎ^５−（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物４）（化合物３より前述の方法により合成、１．００ｍｍｏｌ）を塩化メチレン−アセトニトリルの混合溶液（１：２）１５ｍｌに溶解した。別のガラス容器にフルオレニルメチルオキシカルボニルイソチオシアナート３１０ｍｇ（１．１０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン０．１９ｍｌ（１．１０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２０ｍｌに溶解し、ここに上記化合物４の溶液をゆっくりと滴下して加え、さらに室温で１時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、生じた沈殿を酢酸エチル（１５ｍｌ）とヘキサン（３０ｍｌ）の混合溶液に懸濁させた。沈殿を吸引濾過により濾取して標記化合物（化合物７）７８０ｍｇ（収率９４％）を淡茶色粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ８２５．２（Ｍ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：８２５．２９８５（Ｃ_５０Ｈ_４３Ｎ_５Ｏ_５Ｓ［Ｍ^＋］），実測値：８２５．２９８５．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１１．４２（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．１６（ｂｒ ｔ，１Ｈ，ＮＨ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），１０．０７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．５８（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３５（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９３（ｍ，１Ｈ，ｎａｐｈ），７．９１−７．８２（ｍ，４Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．７３−７．６７（ｍ，３Ｈ，ｎａｐｈ），７．５２−７．３８（ｍ，４Ｈ，ｎａｐｈ ａｎｄ Ｆｍｏｃ），７．３６−７．２４（ｍ，１７Ｈ，Ｆｍｏｃ ａｎｄ Ｔｒ），４．３６−４．３３（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−ＣＨ_２），４．２９−４．２５（ｍ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ−ＣＨ），４．２３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２），３．９５（ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ_２，Ｊ＝５．５，６．１Ｈｚ），２．８９（ｔ，２Ｈ，ＣＨ_２，Ｊ＝６．１Ｈｚ）。
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１７９．１４（Ｃ），１６９．９６（Ｃ），１６８．７１（Ｃ），１５３．１０（Ｃ），１４３．９８（Ｃ），１４３．１０（Ｃ），１４０．５０（Ｃ），１３３．４７（Ｃ），１３２．７１（Ｃ），１２８．７０（ＣＨ），１２８．４１（Ｃ），１２８．３１（Ｃ），１２７．６４（ＣＨ），１２７．５６（ＣＨ），１２６．９５（ＣＨ），１２６．６９（ＣＨ），１２５．４２（ＣＨ），１２５．３４（ＣＨ），１２５．１０（ＣＨ），１２１．９３（ＣＨ），１２０．４４（ＣＨ），１１９．９７（ＣＨ），１１９．６３（ＣＨ），７３．６４（Ｃ），７３．３１（ＣＨ_２），６７．１４（ＣＨ_２），４５．９９（ＣＨ），４０．９３（ＣＨ_２），３４．１９（ＣＨ_２）。
Ｎ ^１ −〔２−（Ｎ ^３ −｛２−〔２−（２−ビオチニルアミノエトキシ）エトキシ〕エチル｝−Ｎ ^２ −フルオレニルメチルオキシカルボニルグアニジノ）エチルカルボニル〕−Ｎ ^５ −（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物８）
アルゴン雰囲気下、Ｎ^１−〔２−（Ｎ^３−フルオレニルメチルオキシカルボニルチオウレイド）エチルカルボニル〕−Ｎ^５−（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物７）４１０ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１５ｍｌに溶解し、０℃に冷却した。この溶液にジイソプロピルエチルアミン０．２６ｍｌ（１．５０ｍｍｏｌ）を加えた後、（＋）−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタンジアミン・２／３酢酸塩３１０ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）および塩化第二水銀２０５ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（７ｍｌ）をゆっくりと滴下して加え、さらに０℃で１時間撹拌した。反応液に酢酸エチル８０ｍｌを加えた後、セライト濾過により沈殿物を除去した。ろ液に酢酸エチルを加えて全量を１５０ｍｌとし、水５０ｍｌで４回洗浄した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物（化合物８）３００ｍｇ（収率５１％）を白色泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ １１６６．６（ＭＨ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：１１６６．５１７４（Ｃ_６６Ｈ_７２Ｎ_９Ｏ_９Ｓ［ＭＨ^＋］），実測値：１１６６．５１６５。
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１０．０５（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．５８（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３５（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９５−７．８７（ｍ，３Ｈ，ｎａｐｈ ａｎｄ Ｆｍｏｃ），７．８１（ｂｒ ｔ，１Ｈ，ＮＨ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．７２−７．６３（ｍ，５Ｈ，ｎａｐｈ ａｎｄ Ｆｍｏｃ），７．５２−７．３７（ｍ，４Ｈ，ｎａｐｈ ａｎｄ Ｆｍｏｃ），７．３４−７．２４（ｍ，１７Ｈ，Ｆｍｏｃ ａｎｄ Ｔｒ），６．４０（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．３５（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．３０−４．２３（ｍ，６Ｈ），４．０９（ｍ，１Ｈ），３．５１（ｍ，８Ｈ），３．４０−３．３６（ｍ，４Ｈ），３．１８（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｍ，１Ｈ），２．８２−２．７６（ｍ，３Ｈ），２．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ），２．０５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６２−１．３７（ｍ，４Ｈ），１．３３−１．２７（ｍ，２Ｈ）。
Ｎ ^１ −〔２−（Ｎ ^３ −｛２−〔２−（２−ビオチニルアミノエトキシ）エトキシ〕エチル｝−Ｎ ^２ −フルオレニルメチルオキシカルボニルグアニジノ）エチルカルボニル〕−Ｎ ^５ −（アミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物９）
アルゴン雰囲気下、Ｎ^１−〔２−（Ｎ^３−｛２−〔２−（２−ビオチニルアミノエトキシ）エトキシ〕エチル｝−Ｎ^２−フルオレニルメチルオキシカルボニルグアニジノ）エチルカルボニル〕−Ｎ^５−（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物８）２９２ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、トリフルオロ酢酸２８０μｌ（３．８ｍｍｏｌ）およびトリイソプロピルシラン５１０μｌ（２．５ｍｍｏｌ）を加えて室温で３０分撹拌した。反応液にクロロホルム６０ｍｌを加え、飽和炭酸水素ナトリウム溶液３０ｍｌで２回、水３０ｍｌで１回、飽和食塩水３０ｍｌで１回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。有機層を減圧下濃縮した後、生じた沈殿をクロロホルム２．５ｍｌとエタノール２．５ｍｌの混合溶媒に溶解し、この溶液を撹拌させたジエチルエーテル２５ｍｌに滴下した。生じた白色の沈殿物質を吸引濾過により濾取して標記化合物（化合物９）１８４ｍｇ（収率８０％）を白色粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ９２４．４（ＭＨ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：９２４．４０７８（Ｃ_４７Ｈ_５８Ｎ_９Ｏ_９Ｓ［ＭＨ^＋］），実測値：９２４．４０５３．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１０．１７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．９５（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９７−７．８９（ｍ，４Ｈ，ｎａｐｈ ａｎｄ Ｆｍｏｃ），７．８２（ｂｒ ｔ，１Ｈ，ＮＨ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．７１−７．６６（ｍ，４Ｈ），７．５３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．４２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．３１（ｍ，２Ｈ），６．４１（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．３７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．４６（ｍ，２Ｈ），４．３７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２），４．３４−４．２６（ｍ，２Ｈ），４．１０（ｍ，１Ｈ），３．５５−３．４７（ｍ，８Ｈ），３．３９−３．３４（ｍ，４Ｈ），３．１７（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｍ，１Ｈ），２．８７（ｍ，２Ｈ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３，１２．２Ｈｚ），２．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ），２．０４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６２−１．３７（ｍ，４Ｈ），１．２７（ｍ，２Ｈ）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１７２．０５（Ｃ），１６９．１６（Ｃ），１６２．５９（Ｃ），１４３．４１（Ｃ），１４０．６４（Ｃ），１３３．３６（Ｃ），１３３．１６（Ｃ），１２８．９２（Ｃ），１２８．５４（Ｃ），１２７．６５（ＣＨ），１２７．０３（ＣＨ），１２５．３１（ＣＨ），１２５．２３（ＣＨ），１２５．０４（ＣＨ），１２２．５０（ＣＨ），１２２．１７（ＣＨ），１２０．５６（ＣＨ），１２０．３８（ＣＨ），１２０．１０（ＣＨ），７３．８８（ＣＨ_２），６９．５７（ＣＨ_２），６９．２９（ＣＨ_２），６９．０１（ＣＨ_２），６７．０２（ＣＨ_２），６０．９１（ＣＨ），５９．０６（ＣＨ），５５．３１（ＣＨ），４６．２２（ＣＨ），３９．７２（ＣＨ_２），３８．２６（ＣＨ_２），３４．９７（ＣＨ_２），２８．０８（ＣＨ_２），２７．９２（ＣＨ_２），２５．１４（ＣＨ_２）。
Ｎ ^１ −〔２−（Ｎ ^３ −｛２−〔２−（２−ビオチニルアミノエトキシ）エトキシ〕エチル｝グアニジノ）エチルカルボニル〕−Ｎ ^５ −（アミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物１０）
アルゴン雰囲気下、Ｎ^１−〔２−（Ｎ^３−｛２−〔２−（２−ビオチニルアミノエトキシ）エトキシ〕エチル｝−Ｎ^２−フルオレニルメチルオキシカルボニルグアニジノ）エチルカルボニル〕−Ｎ^５−（アミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物９）５０ｍｇ（０．０５４ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン３ｍｌとメタノール３ｍｌの混合溶媒に溶解し、ピペリジン２２０μｌ（２．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２０時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、残渣を水３０ｍｌに溶解し、クロロホルム２０ｍｌで６回洗浄した。水層を減圧下濃縮後、凍結乾燥して標記化合物（化合物１０）３５ｍｇ（収率９３％）を白色綿状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ７０２．４（ＭＨ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：７０２．３３９７（Ｃ_３２Ｈ_４８Ｎ_９Ｏ_７Ｓ［ＭＨ^＋］），実測値：７０２．３４０５．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１０．１１（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．８８（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９６（ｄ，１Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．９０（ｄ，１Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．８４（ｔ，１Ｈ，ＮＨ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），７．７１−７．６５（ｍ，２Ｈ，ｎａｐｈ），７．５８−７．５０（ｍ，２Ｈ，ｎａｐｈ），６．５７（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ_２Ｏ），６．４１（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．３７（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．３０（ｍ，１Ｈ，ｂｉｏ），４．２７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２），４．１１（ｍ，１Ｈ），３．５２（ｍ，８Ｈ），３．３９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），３．３１（ｍ，２Ｈ），３．１９（ｍ，２Ｈ），３．０７（ｍ，１Ｈ），２．８４−２．７８（ｍ，３Ｈ），２．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ），２．０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６４−１．４１（ｍ，４Ｈ），１．２９（ｍ，２Ｈ）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１７２．１０（Ｃ），１６９．７３（Ｃ），１６９．６９（Ｃ），１６２．５９（Ｃ），１５５．８６（Ｃ），１３３．３９（Ｃ），１３３．３０（Ｃ），１２９．０３（Ｃ），１２８．４７（Ｃ），１２５．３１（ＣＨ），１２５．２３（ＣＨ），１２２．６３（ＣＨ），１２２．００（ＣＨ），１２０．５３（ＣＨ），１２０．３７（ＣＨ），７４．３０（ＣＨ_２），６９．５７（ＣＨ_２），６９．３１（ＣＨ_２），６９．０１（ＣＨ_２），６８．４６（ＣＨ_２），６０．９１（ＣＨ），５９．０６（ＣＨ），５５．３１（ＣＨ），４０．９６（ＣＨ_２），３９．８３（ＣＨ_２），３８．２５（ＣＨ_２），３７．２８（ＣＨ_２），３４．９８（ＣＨ_２），３４．９１（ＣＨ_２），２８．０８（ＣＨ_２），２７．９３（ＣＨ_２），２５．１５（ＣＨ_２）。
（実施例２）Ｂｉｓアミノオキシナフタレン試薬（以下ａｏＮａｏ；化合物１２）の合成
スキーム３
Ｎ ^１ ，Ｎ ^５ −ビス（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物１１）
アルゴン雰囲気下、１，５−ジアミノナフタレン（化合物１）１５８ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ）をピリジン３０ｍｌに溶解し、Ｎ−トリチルアミノオキシ酢酸３３３ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ［塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド］２３０ｍｇ（１．２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で撹拌した。反応開始３時間後、６時間後にそれぞれＮ−トリチルアミノオキシ酢酸３３３ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ２３０ｍｇ（１．２０ｍｍｏｌ）を追加して、さらに室温で１６時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、沈殿を水２０ｍｌに懸濁し、酢酸エチル５０ｍｌで１回、クロロホルム２０ｍｌで３回洗浄した。水層の白色沈殿物質を吸引濾過により濾取し、さらにエタノールおよびエーテルで洗浄して標記化合物（化合物１１）５５０ｍｇ（収率７０％）を白色粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ（＋ＮａＩ）７８９．３（ＭＨ^＋），８１１．３（［Ｍ^＋Ｎａ］^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：８１１．３２６０（Ｃ_５２Ｈ_４４Ｎ_４Ｏ_４Ｎａ［Ｍ^＋Ｎａ］^＋），実測値：８１１．３２７４。
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：９．６２（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ），８．３６（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ），７．７７−７．７１（ｍ，４Ｈ，ｎａｐｈ），７．５２（ｔ，２Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．４１−７．２５（ｍ，３０Ｈ，Ｔｒ），４．２３（ｓ，４Ｈ，ＣＨ_２）。
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１６８．８９（Ｃ），１４４．０７（Ｃ），１３２．９０（Ｃ），１２８．７８（ＣＨ），１２７．６３（ＣＨ），１２６．７６（ＣＨ），１２５．４３（ＣＨ），１２３．８０（Ｃ），１２２．１５（ＣＨ），１２０．１１（ＣＨ），７３．６１（Ｃ），７３．２７（ＣＨ_２）。
Ｎ ^１ ，Ｎ ^５ −ビス（アミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物１２）
アルゴン雰囲気下、Ｎ^１，Ｎ^５−ビス（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物１１）３９４ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）をクロロホルム２０ｍｌに懸濁して氷冷し、トリフルオロ酢酸０．９４ｍｌ（１０．０ｍｍｏｌ）およびトリイソプロピルシラン１．０２ｍｌ（５．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温に戻して３．５時間撹拌した。反応液に水４０ｍｌおよびクロロホルム１０ｍｌを加えて沈殿物を溶解した後に分液し、さらに水層をクロロホルム３０ｍｌで２回、酢酸エチル３０ｍｌで１回洗浄した。続いて、水層にアセトニトリル６０ｍｌを加えた後、ＤＯＷＥＷ（１×４−１００（ＯＨ⁻フォーム）により中和した。ＤＯＷＥＷ（１×４−１００を濾過して除き、さらに８０％のアセトニトリル水溶液でＤＯＷＥＷ（１×４−１００を洗浄した。溶液を合わせて減圧下濃縮した後、残渣を水３０ｍｌに溶解してＣ−１８カラムカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：水−アセトニトリル）により精製することで、標記化合物（化合物１２）１０９ｍｇ（収率７２％）を白色粉状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ３０５．２（ＭＨ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：３０５．１２５０（Ｃ_１４Ｈ_１７Ｎ_４Ｏ_４［ＭＨ^＋］），実測値：３０５．１２５９．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：９．８８（ｓ，２Ｈ，ＮＨ），７．９３（ｄ，２Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．６６（ｄ，２Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．５４（ｄｄ，２Ｈ，ｎａｐｈ，Ｊ＝７．２，８．６Ｈｚ），６．５７（ｓ，４Ｈ，ＮＨ_２），４．２８（ｓ，４Ｈ，ＣＨ_２）。
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１６９．７５（Ｃ），１３３．３５（Ｃ），１２９．１１（Ｃ），１２５．４１（ＣＨ），１２２．６６（ＣＨ），１２０．７５（ＣＨ），７４．４２（ＣＨ_２）。
（実施例３）オリゴヌクレオチドの合成と精製
オリゴヌクレオチドの合成はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー上で行った。０．２又は１μｍｏｌスケールで合成した。ＨＰＬＣにはＧｉｌｓｏｎの装置を用い、分析はＷａｔｅｒｓ９９６フォトダイオードアレイ検出器を用いて行った。
逆相ＨＰＬＣ溶液
Ａ溶液 ５％ アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
Ｂ溶液 ２５％ アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
カラム温度：５０℃
カラムは、μ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラムΦ３．９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ製）を使用した。
イオン交換ＨＰＬＣ溶液
Ａ溶液 ２０％ アセトニトリル
Ｂ溶液 ２０％ アセトニトリル、２Ｍ ギ酸アンモニウム
カラム温度：５０℃
カラムは、ＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−２ＳＷ Φ４．６ｘ２５０ｍｍ（東ソー社）を使用した。
ＨＰＬＣ条件
条件１ Ｂ溶液の％ ２０→４０％／２０分
条件２ Ｂ溶液の％ ３５→５５％／２０分
（実施例４）オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）の酸化反応
オリゴヌクレオチド（Ｆ−Ｌｒ１７Ｘ：Ｘ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）（１．６ｎｍｏｌ）を、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）及び８００μＭ過ヨウ素酸ナトリウムに溶解し（反応液総量２００μｌ）、３７℃、９０分で酸化反応を行った。反応後、ＮＡＰ１０カラム（ＧＥヘルスケア）で脱塩し、得られた酸化オリゴヌクレオチド（Ｆ−Ｌｒ１７Ｘｏｘ）をＵＶ定量した。
（実施例５）酸化オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）へのＡＲＰ、ａｏＮｇの標識反応
一本鎖への反応
酸化オリゴヌクレオチド（Ｆ−Ｌｒ１７Ｘｏｘ；Ｘ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）（１２ｐｍｏｌ）を１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）３μｌ及び滅菌水２１μｌに溶解した後、あらかじめ滅菌水に溶解させた２ｍＭ 標識試薬（ＡＲＰ又は実施例１で調製したａｏＮｇ）６μｌを加え、３７℃で反応を開始した。ＡＲＰ（Ａｌｄｅｈｙｄｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅ；ＤＯＪＩＮＤＯ社）は、以下の構造を有する。
一定時間後に２．５μｌをサンプリングしてｌｏａｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｘ ５μｌ（５０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０Ｍ 尿素，０．１％ ＢＰＢ；４μｌ、４０ｍＭ グルタルアルデヒド；１μｌを混合して調製）に加えて反応を止めた。その後、変性２０％ポリアクリルアミドゲル（１９：１）で解析した。各バンドのフルオレセインの蛍光強度を測定し、反応効率を算出した。反応の結果を図２に示した。
二本鎖での反応
二本鎖で反応を行う場合は、酸化オリゴヌクレオチド（Ｆ−Ｌｒ１７Ｘｏｘ）（１２ｐｍｏｌ）に相補鎖ＡＳ３２Ｙ（２４ｐｍｏｌ）を加えて、その他の反応条件は一本鎖の反応と同様に行った。
Ｆ−Ｌｒ１７Ｘｏｘの一本鎖（ｓｓ Ｆ−Ｌｒ１７Ｘｏｘ）、及び相補鎖（ＡＳ３２Ｙ）の２本鎖について、ＡＲＰ又はａｏＮｇとの結合率を測定し、見かけの反応速度定数を算出した。ＲＮＡの３’末端の塩基の種類がいずれの場合でも、ａｏＮｇはＡＲＰよりも高い反応性を示した。また、一本鎖よりも二本鎖を形成した場合に、反応効率が上がることが明らかになった。
（実施例６）ＲＮＡの、酸化から標識の連続反応
実施例４、５では、あらかじめＲＮＡを酸化して精製した後に標識反応を行った。次にＲＮＡの酸化から標識までを連続して行うことが可能であるかを確かめる実験を行った。ＲＮＡ（Ｆ−Ｌｒ１７Ｘ；Ｘ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）（１２ｐｍｏｌ）を、１５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）及び１５０μＭ過ヨウ素酸ナトリウムに溶解し（反応液総量２０μｌ）、３７℃、６０分で酸化反応を行った。続いて２ｍＭ ＤＴＴ ５μｌを添加して３７℃、３０分加温し、２４０μＭ ａｏＮｇ（又はａｏＮｇ−ｂｉｏ）５μｌを加えて３７℃で標識反応を行った（反応液総量３０μｌ）。実施例５と同様に一定時間後にサンプリングして解析した。反応の結果、酸化に用いた過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを還元することで、酸化から標識反応まで連続して行えることを確認した。
（実施例７）アベイシックサイトを含むオリゴヌクレオチドの合成
アベイシックホスホロアミダイト試薬（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓ．社）を用いて、アベイシックサイト（Ｚ）を含むオリゴヌクレオチド（Ｆ−２０Ｚ）を合成した。Ｆ−２０Ｚは、５’ Ｆ−ＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＺＧＴＴＴ ３’を表す。合成したオリゴヌクレオチドは、通常の方法に従い濃アンモニア水で脱保護反応を行った後、４０％酢酸４ｍＬを加えて室温で４時間攪拌しＴＢＤＭＳ基の脱保護を行った。反応後、減圧下酢酸を留去し、さらに水を加えて減圧下で溶媒を留去した。この操作を数回繰り返して酢酸を取り除いた。その後、滅菌水にオリゴヌクレオチドを溶解し、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣによって精製した。Ｆ−２０Ｚの相補鎖となるＳｐ３５も同様に合成し精製した（表４、表５）。Ｓｐ３５Ｃは、３’ ＣＧＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＧＡＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＣＧＡ ５’を表す。各ＨＰＬＣの条件は、Ｆ−Ｌｒ１７Ｘ及びＡＳ３２Ｙの精製と同様とした。
ＨＰＬＣ条件
条件１ Ｂ溶液の％ ２０→４０％／２０分
条件２ Ｂ溶液の％ ３５→５５％／２０分
条件３ Ｂ溶液の％ ３０→５０％／２０分
（実施例８）アベイシックサイトを含むオリゴヌクレオチドの酸化
実施例７で調製したアベイシックサイトを含むオリゴヌクレオチドＦ−２０Ｚ（２．６ｎｍｏｌ）を、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）及び１０ｍＭ 過ヨウ素酸ナトリウムに溶解し、３７℃、６０分で酸化反応を行った。反応後、ＮＡＰ５カラム（ＧＥヘルスケア）で脱塩し、濃縮後、変性２０％ポリアクリルアミドゲル（１９：１）によって精製した。ゲル片からはＹＭＣカートリッジ（１００ｍｇ／１ｍｌ）を用いて脱塩した。得られた酸化オリゴヌクレオチド（Ｆ−２０Ｚｏｘ）をＵＶで定量し、反応に供した。
（実施例９）アベイシックサイトへのＡＲＰ、ａｏＮｇの標識反応
一本鎖への反応
酸化されたＦ−２０Ｚｏｘ（１２ｐｍｏｌ）を１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７）３μｌ及び滅菌水１５μｌに溶解し、９０℃で１分加熱し氷冷した。１０秒後に室温で５分放置して３７℃で５分間プレインキュベーションした。続いて、あらかじめ滅菌水に溶解しておいた標識試薬（５ｍＭ ＡＲＰ又はａｏＮｇ）１２μｌを加えて３７℃、４２℃又は４７℃で標識反応を開始した。一定時間後に２．５μｌをサンプリングしてｌｏａｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｘ ５μｌ（５０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０Ｍ 尿素，０．１％ ＢＰＢ；４μｌ、２００ｍＭ グルタルアルデヒド；１μｌを混合して調製）に加えて反応を止めた。その後、変性２０％ポリアクリルアミドゲル（１９：１）で解析した。各バンドのフルオレセインの蛍光強度を測定し、反応効率を算出した。反応の結果を図３に示す。
二本鎖での反応
二本鎖で反応を行う場合は、酸化オリゴヌクレオチド（Ｆ−２０Ｚｏｘ）（１２ｐｍｏｌ）に相補鎖Ｓｐ３５Ｃ（１４．４ｐｍｏｌ）を加え、その他の反応条件は一本鎖の反応と同様に行った。反応の結果を図３に示す。
Ｆ−２０Ｚ中のアベイシックサイトＺに対して試薬が反応した。ＤＮＡに対しても、ａｏＮｇの方が高い反応性を示した。特に二本鎖に対してはＡＲＰの反応効率は一本鎖と同じであったが、ａｏＮｇでは反応効率が大きく向上した。
（実施例１０）２’−デオキシウリジン（ｄＵ）を含むオリゴヌクレオチドの合成と精製
５’末端がフルオレセインで標識され、ｄＵを鎖内にもったオリゴヌクレオチド（Ｆ−２０ｄＵ）およびその相補鎖（Ｓｐ２０ｄＵ）は、２’−デオキシウリジンホスホロアミダイト試薬（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓ．社）を用いてＤＮＡ自動合成機によって合成した。Ｆ−２０ｄＵは、５’ Ｆ−ＧＡＡＴＴＧＣＴｄＵＧＧＡＡＧＡＧＧＴＴＴ ３’を、Ｓｐ２０ｄＵは、３’ ＣＴＴＡＡＣＧＡｄＵＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡ ５’を表す。合成オリゴヌクレオチドは通常の方法に従って脱保護した後、逆相ＨＰＬＣで分取、精製した（表６）。ＨＰＬＣの条件などを以下に示す。
逆相ＨＰＬＣ溶液
Ａ溶液 ５％ アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）；
Ｂ溶液 ２５％ アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
カラム温度：室温
カラムは、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（Ｃ−１８）カラムΦ３．０ｘ３００ｍｍ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用した。
ＨＰＬＣ条件
条件４ Ｂ溶液の％ ４０→６０％／２０分
（実施例１１）２’−デオキシウリジンを含むＤＮＡへのＡＲＰ、ａｏＮｇ、ａｏＮｇ−ｂｉｏの標識反応
本発明の化合物が２’−デオキシウリジン（ｄＵ）とウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）から生成したアベイシックサイトに反応するかどうかを評価する実験を行った。
ｄＵを含むＤＮＡ、Ｆ−２０ｄＵ（１２ｐｍｏｌ）と、その相補鎖（Ｓｐ３５Ｃ；２４ｐｍｏｌ）を、ＵＤＧバッファー（ｘ１０，３μｌ）を含む溶液（総量２９．５μｌ）に溶解させた。Ｓｐ３５Ｃは、３’ ＣＧＡＡＡＧＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＧＡＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＣＧＡ ５’を表す。反応液を９０℃で１分加熱し氷冷した後、３７℃で５分間プレインキュベーションし、そこにＵＤＧ（１ｕｎｉｔ，０．５μｌ）を加え、総量３０μｌで３７℃、６０分間反応を行った。その後、９０℃で１分加熱して酵素を失活させ、氷冷で１０分、室温で５分放置した。この反応液にあらかじめ溶解させた１０ｍＭに調整した標識試薬（ＡＲＰ、ａｏＮｇ、ａｏＮｇ−ｂｉｏ）６μｌを加えて３７℃で標識反応を開始した。一定時間後に２．５μｌをサンプリングしてｌｏａｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｘ ５μｌ（５０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０Ｍ 尿素，０．１％ ＢＰＢ；４μｌ、２００ｍＭ グルタルアルデヒド；１μｌを混合して調製）に加えて反応を止めた。その後、変性２０％ポリアクリルアミドゲル（１９：１）で解析した（図４）。各バンドのフルオレセインの蛍光強度を測定し、反応効率を算出した（図４）。
ａｏＮｇ、ＡＲＰ、ａｏＮｇ−ｂｉｏの反応速度定数は、それぞれ０．５１ｍｉｎ^−１、０．０３ｍｉｎ^−１、０．１７ｍｉｎ^−１であったことから、ａｏＮｇおよびａｏＮｇ−ｂｉｏの方が高い反応効率を示すことが明らかとなった。
（実施例１２）ａｏＮａｏのＤＮＡへの反応
ｄＵを含むＤＮＡ、Ｆ−２０ｄＵ（１２ｐｍｏｌ）と、その相補鎖（Ｓｐ２０ｄＵ；１３．２ｐｍｏｌ）を、ＵＤＧバッファー（ｘ１０，３μｌ）を含む溶液（総量２９．５μｌ）に溶解させた。Ｓｐ２０ｄＵは、３’ ＣＴＴＡＡＣＧＡｄＵＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡ ５’を表す。反応液を９０℃で１分加熱し氷冷した後、３７℃で５分間プレインキュベーションし、そこにＵＤＧ（１ｕｎｉｔ，０．５μｌ）を加え、総量３０μｌで３７℃、６０分間反応を行った。その後、９０℃で１分加熱して酵素を失活させ、氷冷で１０分、室温で５分放置した。この反応液にあらかじめ溶解させた２ｍＭ ａｏＮａｏ ６μｌを加えて３７℃で標識反応を開始した。同様の反応をＦ−２０ｄＵ、１本鎖のみでも行った。一定時間後に３μｌをサンプリングしてｌｏａｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｘ ５μｌ（５０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０Ｍ 尿素，０．１％ ＢＰＢ；４μｌ、２００ｍＭ グルタルアルデヒド；１μｌを混合して調製）に加えて反応を止めた。その後、変性２０％ポリアクリルアミドゲル（１９：１）で解析した（図５）。各バンドのフルオレセインの蛍光強度を測定し、反応効率を算出した（図５）。ａｏＮａｏは２本鎖間を架橋するように反応できることを確認した。
（実施例１３）ａｏＮｄｇ−ｂｉｏｔｉｎ試薬（以下ａｏＮｄｇ−ｂｉｏ；化合物１６）の合成
スキーム４
１−（Ｎ ^３ −フルオレニルメチルオキシカルボニルチオウレイド）−Ｎ ^５ −（トリチルアミノオキシアセチル）−５−アミノナフタレン（化合物１３）
アルゴン雰囲気下、フルオレニルメチルオキシカルボニルイソチオシアナート８５０ｍｇ（３．０１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン０．５２ｍｌ（３．０１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン３０ｍｌに溶解し、０℃に冷却した。ここにＮ^１−（トリチルアミノオキシアセチル）−１，５−ジアミノナフタレン（化合物２）１．１９ｇ（２．５１ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（３０ｍｌ）をゆっくりと滴下して加え、さらに室温に戻して１．５時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物１３）１．０４ｇ（収率５５％）を白色固体状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ７５５．３（ＭＨ^＋），７７７．２（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：７７７．２５１１（Ｃ_４７Ｈ_３８Ｎ_４Ｏ_４ＳＮａ［Ｍ＋Ｎａ］^＋），実測値：７７７．２４８６．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１１．８１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．６０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．６６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），
８．３７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９４−７．８５（ｍ，６Ｈ），７．７８−７．６８（ｍ，３Ｈ），７．６１−７．５３（ｍ，１Ｈ），７．４９−７．４１（ｍ，２Ｈ），７．３８−７．２７（ｍ，１７Ｈ），４．４９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−ＣＨ_２，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．３７（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ−ＣＨ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．２３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１８０．５９（Ｃ），１６８．９６（Ｃ），１５３．５６（Ｃ），１４４．０８（Ｃ），１４３．２３（Ｃ），１４０．６５（Ｃ），１３４．６８（Ｃ），１３３．１４（Ｃ），１２９．７９（Ｃ），１２８．７９（ＣＨ），１２８．６１（Ｃ），１２７．７７（ＣＨ），１２７．６４（ＣＨ），１２７．０７（ＣＨ），１２６．７７（ＣＨ），１２６．１０（ＣＨ），１２５．５８（ＣＨ），１２５．４３（ＣＨ），１２５．３１（ＣＨ），１２２．３４（ＣＨ），１２１．９８（ＣＨ），１２１．２８（ＣＨ），１２０．０８（ＣＨ），１１９．９３（ＣＨ），７３．６２（Ｃ），７３．３０（ＣＨ_２），６７．４２（ＣＨ_２），４５．９９（ＣＨ）。
１−（Ｎ ^３ −｛２−〔２−（２−ビオチニルアミノエトキシ）エトキシ〕エチル｝−Ｎ ^２ −フルオレニルメチルオキシカルボニルグアニジノ）−Ｎ ^５ −（トリチルアミノオキシアセチル）−５−アミノナフタレン（化合物１４）
アルゴン雰囲気下、１−（Ｎ^３−フルオレニルメチルオキシカルボニルチオウレイド）−Ｎ^５−（トリチルアミノオキシアセチル）−５−アミノナフタレン（化合物１３）９１０ｍｇ（１．２０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２０ｍｌに溶解して０℃に冷却した。この溶液に（＋）−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタンジアミン５４０ｍｇ（１．４４ｍｍｏｌ）、塩化第二水銀３６０ｍｇ（１．３２ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン０．５０ｍｌ（２．８８ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（１５ｍｌ）をゆっくりと滴下して加え、さらに０℃で１．５時間撹拌した。反応液に酢酸エチル１５０ｍｌを加えた後、セライト濾過により沈殿物を除去した。ろ液に酢酸エチルを加えて全量を３５０ｍｌとし、水１２０ｍｌで４回、飽和食塩水１２０ｍｌで１回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物（化合物１４）９６３ｍｇ（収率７３％）を白色泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ １０９５．５（ＭＨ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：１０９５．４８０３（Ｃ_６３Ｈ_６７Ｎ_８Ｏ_８Ｓ［ＭＨ^＋］），実測値：１０９５．４７９６．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：９．６１（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３３（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．８９−７．７５（ｍ，６Ｈ），７．６１−７．４７（ｍ，３Ｈ），７．４２−７．２５（ｍ，２０Ｈ），６．３９（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．３３（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．３０−４．２４（ｍ，６Ｈ），４．１０（ｍ，１Ｈ），３．４９（ｍ，６Ｈ），３．３８−３．３３（ｍ，４Ｈ），３．１６（ｍ，２Ｈ），３．０６（ｍ，１Ｈ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３，１２．２Ｈｚ），２．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ），２．０４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６３−１．３７（ｍ，４Ｈ），１．３２−１．２３（ｍ，２Ｈ）。
１−（Ｎ ^３ −｛２−〔２−（２−ビオチニルアミノエトキシ）エトキシ〕エチル｝−Ｎ ^２ −フルオレニルメチルオキシカルボニルグアニジノ）−Ｎ ^５ −（アミノオキシアセチル）−５−アミノナフタレン（化合物１５）
アルゴン雰囲気下、１−（Ｎ^３−｛２−〔２−（２−ビオチニルアミノエトキシ）エトキシ〕エチル｝−Ｎ^２−フルオレニルメチルオキシカルボニルグアニジノ）−Ｎ^５−（トリチルアミノオキシアセチル）−５−アミノナフタレン（化合物１４）１７０ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１５ｍｌに溶解して０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸１８０μｌ（２．４ｍｍｏｌ）およびトリイソプロピルシラン３３０μｌ（１．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温に戻して３０分撹拌した後、反応液にクロロホルム６５ｍｌを加え、飽和炭酸水素ナトリウム溶液３５ｍｌで１回、水３５ｍｌで１回、飽和食塩水３５ｍｌで１回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：メタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物（化合物１５）８６ｍｇ（収率６５％）を白色泡状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ８５３．４（ＭＨ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：８５３．３７０７（Ｃ_４４Ｈ_５３Ｎ_８Ｏ_８Ｓ［ＭＨ^＋］），実測値：８５３．３７１３．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：９．９０（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０２（ｍ，１Ｈ），７．８９−７．７１（ｍ，５Ｈ），７．７８（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．６２−７．３１（ｍ，８Ｈ），６．５６（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ_２），６．３９（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．３３（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．２９−４．２６（ｍ，６Ｈ），４．１０（ｍ，１Ｈ），３．４８（ｍ，６Ｈ），３．３６（ｍ，４Ｈ），３．１６（ｍ，２Ｈ），３．０６（ｍ，１Ｈ），２．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，１２．５Ｈｚ），２．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ），２．０４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６６−１．３８（ｍ，４Ｈ），１．２８（ｍ，２Ｈ）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１７２．０７（Ｃ），１６９．６８（Ｃ），１６２．６４（Ｃ），１４４．１５（Ｃ），１４０．６３（Ｃ），１２７．４５（ＣＨ），１２６．９８（ＣＨ），１２５．０４（ＣＨ），１２０．０４（ＣＨ），７４．３７（ＣＨ_２），６９．４７（ＣＨ_２），６９．１４（ＣＨ_２），６８．８１（ＣＨ_２），６６．０４（ＣＨ_２），６０．９９（ＣＨ），５９．１５（ＣＨ），５５．３７（ＣＨ），４６．６７（ＣＨ），３９．７９（ＣＨ_２），３８．３７（ＣＨ_２），３５．０４（ＣＨ_２），２８．１４（ＣＨ_２），２７．９９（ＣＨ_２），２５．２１（ＣＨ_２）。
１−（Ｎ ^３ −｛２−〔２−（２−ビオチニルアミノエトキシ）エトキシ〕エチル｝グアニジノ）−Ｎ ^５ −（アミノオキシアセチル）−５−アミノナフタレン（化合物１６、酢酸塩）
アルゴン雰囲気下、１−（Ｎ^３−｛２−〔２−（２−ビオチニルアミノエトキシ）エトキシ〕エチル｝−Ｎ^２−フルオレニルメチルオキシカルボニルグアニジノ）−Ｎ^５−（アミノオキシアセチル）−５−アミノナフタレン（化合物１５）８５ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン４ｍｌとメタノール４ｍｌの混合溶媒に溶解し、ピペリジン０．４０ｍｌ（４．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１６時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後、残渣を水３５ｍｌに溶解し、酢酸エチル１５ｍｌで３回洗浄した。水層を減圧下濃縮後、Ｃ１８カートリッジカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：アセトニトリル−０．１Ｍ ＴＥＡＡ溶液）により精製して粗精製物（５２ｍｇ）を得た。この粗精製物の一部を２％酢酸水溶液５ｍｌに溶解して、再度Ｃ１８カートリッジカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：アセトニトリル−水）により精製して標記化合物（化合物１６、酢酸塩）９．２ｍｇを白色綿状物質として得た。
ＦＡＢ−ＬＲＭＳ ｍ／ｚ ６３１．３（ＭＨ^＋）；ＦＡＢ−ＨＲＭＳ 計算値：６３１．３０２６（Ｃ_２９Ｈ_４３Ｎ_８Ｏ_６Ｓ［ＭＨ^＋］），実測値：６３１．３００５．
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：９．９４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．６４（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０７（ｍ，１Ｈ，ｎａｐ），７．８２（ｍ，１Ｈ），７．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，ｎａｐ），７．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，ｎａｐ），７．６２（ｍ，２Ｈ，ｎａｐ），７．５５（ｍ，２Ｈ），７．５１（ｍ，１Ｈ，ｎａｐ），６．５５（ｓ，２Ｈ，ＮＨ_２Ｏ），６．３９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．３５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．３１（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ_２），４．１２（ｂｒ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３，７．６Ｈｚ），３．５８（ｍ，６Ｈ），３．４２（ｍ，４Ｈ），３．２１（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｍ，１Ｈ），２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，１２．５Ｈｚ），２．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ），２．０７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６４−１．４２（ｍ，４Ｈ），１．３０（ｍ，２Ｈ）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ：１７２．１０（Ｃ），１６９．６８（Ｃ），１６２．５９（Ｃ），１５５．７５（Ｃ），１３３．７２（Ｃ），１３０．４４（Ｃ），１２９．３９（Ｃ），１２６．３２（ＣＨ），１２５．８１（ＣＨ），１２３．００（ＣＨ），１１９．８７（ＣＨ），７４．２７（ＣＨ_２），６９．６６（ＣＨ_２），６９．３８（ＣＨ_２），６９．０６（ＣＨ_２），６８．５２（ＣＨ_２），６０．９２（ＣＨ），５９．０８（Ｃ），５５．３１（ＣＨ），４１．２２（ＣＨ_２），３９．７３（ＣＨ_２），３８．２７（ＣＨ_２），３５．００（ＣＨ_２），２８．０８（ＣＨ_２），２７．９４（ＣＨ_２），２５．１６（ＣＨ_２）。
（実施例１４）
実施例１１と同様のオリゴヌクレオチドを用い、同じ条件でａｏＮｄｇ−ｂｉｏの反応効率を調べた。反応の結果、ａｏＮｄｇ−ｂｉｏの反応速度定数は、０．２３ｍｉｎ^−１であったことから、ａｏＮｇ、ａｏＮｇ−ｂｉｏと同様に、ＡＲＰよりもａｏＮｄｇ−ｂｉｏの方が高い反応効率を示すことが明らかとなった。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
［配列表］

Claims (11)

1. 一般式１：
   Ｒ_１−ＮＨ−Ｏ−Ｌ_１−Ｄ−Ｌ_２−Ａ （１）
   （式中、
   Ｒ_１は、水素原子、アルキル基又はアミノ基の保護基であり、
   Ｄは、置換若しくは無置換のフェニレン基、置換若しくは無置換のアントリレン基、置換若しくは無置換のナフチレン基、置換若しくは無置換のフェナントリレン基、置換若しくは無置換のアントラキノリレン基、及び置換若しくは無置換のアクリジニレン基から選択される芳香族基であり、
   芳香族基の置換基は、ハロゲン原子、Ｃ _１−６アルキル基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ_２−６アルケニル基、Ｃ_３−１０シクロアルキル基、Ｃ_１−１０アルコキシ基及びＣ_１−１０アシル基からなる群から選択され、
   Ｌ_１は、直接結合又は以下の一般式３又は４：
   （式中、Ｒ _３ は、Ｃ _１−９ アルキレン基又は−（ＣＨ _２ ） _ｏ −（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｐ −（ＣＨ _２ ） _ｑ −であり、ｏ〜ｑは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｏ＋ｐ＋ｑは、１〜１５である）
   のいずれかで表される２価の基であり、Ｌ_２は、直接結合又は以下の一般式５又は６：
   （式中、Ｒ _４ は、Ｃ _１−９ アルキレン基又は−（ＣＨ _２ ） _ｒ −（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｓ −（ＣＨ _２ ） _ｔ −であり、ｒ〜ｔは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｒ＋ｓ＋ｔは、１〜１５である）
   のいずれかで表される２価の基であり、
   Ａは、置換又は無置換のグアニジノ基、アミノオキシ基又は保護されたアミノオキシ基であり、
   グアニジノ基の置換基は、−（ＣＨ _２ ） _ｖ −（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｗ −（ＣＨ _２ ） _ｘ −ＮＨ−ビオチンであり、ｖ、ｗ及びｘは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｖ＋ｗ＋ｘは、１〜１５である）
   で表される化合物又はその塩。
2. Ａが、置換又は無置換のグアニジノ基である、請求項１記載の化合物又はその塩。
3. Ａが、以下の一般式２：
   （式中、Ｘ_１及びＸ_２は、水素原子又は−（ＣＨ _２ ） _ｖ −（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｗ −（ＣＨ _２ ） _ｘ −ＮＨ−ビオチンであり、ｖ、ｗ及びｘは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｖ＋ｗ＋ｘは、１〜１５である）
   で表される、請求項１又は２記載の化合物又はその塩。
4. Ｄが、以下の一般式：
   （式中、一方の結合部位がＬ_１又はＯに結合し、他方の結合部位がＬ_２又はＡに結合する）
   で表される２価の芳香族基、及びこれらの芳香族基において芳香環が１〜３個の置換基を有する芳香族基から選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物又はその塩。
5. 以下の一般式７：
   （式中、Ｒ_１は、水素原子又はアミノ基の保護基であり、ｎは、１〜５の整数であり、ｍは、１〜５の整数であり、Ｒ_ａ〜Ｒ_ｆは、それぞれ独立して、水素原子又は芳香族基の置換基であり、Ｘ_１及びＸ_２は、水素原子又は−（ＣＨ _２ ） _ｖ −（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｗ −（ＣＨ _２ ） _ｘ −ＮＨ−ビオチンであり、ｖ、ｗ及びｘは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｖ＋ｗ＋ｘは、１〜１５である）
   で表される、請求項１記載の化合物又はその塩。
6. 以下の一般式８：
   （式中、Ｒ_１は、水素原子又はアミノ基の保護基であり、ｎは、１〜５の整数であり、Ｒ_ａ〜Ｒ_ｆは、それぞれ独立して、水素原子又は芳香族基の置換基であり、Ｘ_２は、水素原子又は−（ＣＨ _２ ） _ｖ −（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｗ −（ＣＨ _２ ） _ｘ −ＮＨ−ビオチンであり、ｖ、ｗ及びｘは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｖ＋ｗ＋ｘは、１〜１５である）
   で表される、請求項１記載の化合物又はその塩。
7. 以下の一般式：
   （式中、Ｒ_１及びＲ_５は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基の保護基であり、ｎ及びｉは、それぞれ独立して、１〜５の整数であり、Ｒ_ａ〜Ｒ_ｆは、それぞれ独立して、水素原子又は芳香族基の置換基である）
   で表される、請求項１記載の化合物又はその塩。
8. Ａが−（ＣＨ _２ ） _ｖ −（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｗ −（ＣＨ _２ ） _ｘ −ＮＨ−ビオチンで置換されたグアニジノ基であり、ｖ、ｗ及びｘは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｖ＋ｗ＋ｘは、１〜１５である、請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物又はその塩。
9. Ｘ_１及びＸ_２の少なくとも一方が−（ＣＨ _２ ） _ｖ −（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｗ −（ＣＨ _２ ） _ｘ −ＮＨ−ビオチンであり、ｖ、ｗ及びｘは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｖ＋ｗ＋ｘは、１〜１５である、請求項３、５又は６記載の化合物又はその塩。
10. アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する生体分子を標識するための試薬であって、一般式（１）:
    Ｒ _１ −ＮＨ−Ｏ−Ｌ _１ −Ｄ−Ｌ _２ −Ａ （１）
    （式中、
    Ｒ _１ は、水素原子、アルキル基又はアミノ基の保護基であり、
    Ｄは、置換若しくは無置換のフェニレン基、置換若しくは無置換のアントリレン基、置換若しくは無置換のナフチレン基、置換若しくは無置換のフェナントリレン基、置換若しくは無置換のアントラキノリレン基、及び置換若しくは無置換のアクリジニレン基から選択される芳香族基であり、
    芳香族基の置換基は、ハロゲン原子、Ｃ _１−６ アルキル基、ニトロ基、シアノ基、Ｃ _２−６ アルケニル基、Ｃ _３−１０ シクロアルキル基、Ｃ _１−１０ アルコキシ基及びＣ _１−１０ アシル基からなる群から選択され、
    Ｌ _１ は、直接結合または以下の一般式３又は４：
    （式中、Ｒ _３ は、Ｃ _１−９ アルキレン基又は−（ＣＨ _２ ） _ｏ −（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｐ −（ＣＨ _２ ） _ｑ −であり、ｏ〜ｑは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｏ＋ｐ＋ｑは、１〜１５である）
    のいずれかで表される２価の基であり、Ｌ _２ は、直接結合または以下の一般式５又は６：
    （式中、Ｒ _４ は、Ｃ _１−９ アルキレン基又は−（ＣＨ _２ ） _ｒ −（ＯＣＨ _２ ＣＨ _２ ） _ｓ −（ＣＨ _２ ） _ｔ −であり、ｒ〜ｔは、それぞれ独立して０〜１５の整数であり、ｒ＋ｓ＋ｔは、１〜１５である）
    のいずれかで表される２価の基であり：
    Ａは、標識化されたグアニジノ基である）
    で表される化合物又はその塩を含む前記試薬。
11. 請求項１０記載の試薬と、アルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基を有する生体分子とが結合してなる、生体分子が標識化された試薬であって、該試薬のアミノオキシ基と該生体分子のアルデヒド基、ヘミアセタール基、カルボキシル基又はケト基とが反応して共有結合を形成している、前記生体分子が標識化された試薬。