JP5198213B2 - レーザ顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。

標本中の分子の特定の振動を利用し、分子からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、この散乱光を検出することで標本の観察を行うコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡は、標本の分子の特定の振動を利用しているため、蛍光顕微鏡のように、観察対象を蛍光プローブであらかじめ標識する必要がない。また、利用する振動を変更することで観察する分子を変更することができる。

ところで、一般にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光には、分子の特定の振動が寄与した共鳴成分と、分子の特定の振動が寄与していない非共鳴成分とが含まれている。非共鳴成分は、いわゆるノイズに相当するため、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光により標本の観察を行う場合には、非共鳴成分を取り除いて共鳴成分のみを取り出すことが望ましい。これに対して、従来、周波数の異なる２つのポンプ光と１つのストークス光を用いて２つのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、その差分を取ることで非共鳴成分を除去する方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。

特表２００２−５２０６１２号公報 国際公開第２００７／０５０５９６号パンプレット

しかしながら、３つの異なる周波数のパルスレーザ光を使用することは、それぞれの周波数のパルスレーザ光を発生させるためのレーザ光源または周波数変換装置が必要となるため、装置構成が複雑となり、装置コストの増加および操作の煩雑化を招くという不都合がある。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、装置構成の複雑化を抑制しつつ、非共鳴成分を除去して画質を向上させることができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有し、時間軸方向に分布する２つの異なる周波数帯域を有するパルスレーザ光を導光する２つの光路と、該２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路に導光されるパルスレーザ光の標本面上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節するパルスタイミング調節手段と、前記２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、該合波手段により合波されたパルスレーザ光を前記標本に照射してコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させる照射手段と、前記標本から発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する光検出手段と、前記パルスタイミング調節手段により時間的タイミングを変化させることによって前記光検出手段により検出される２つのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の差分に基づいて画像を生成する画像生成手段と、フェムト秒パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を前記２つの光路に分岐する分岐手段と、前記光路のいずれか一方に設けられ、２つの光路を導光されるフェムト秒パルスレーザ光に標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるフォトニッククリスタルファイバからなる周波数変換手段と、前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数分散量が略同等となるように調節する周波数分散調節手段と、を備えるレーザ顕微鏡装置を提供する。

本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、２つの光路を導光される各パルスレーザ光が合波手段により合波され、合波されたパルスレーザ光が照射手段により標本に照射される。ここで、２つの光路を導光される各パルスレーザ光は、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有しているため、標本中の分子の特定の振動に共鳴したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光が発生し、光検出手段により検出される。

この際、パルスタイミング調節手段により、標本面上における２つのパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することで、２つのパルスレーザ光の周波数差を変化させることができる。これにより、標本中の分子の特定の振動に共鳴する周波数差だけでなく、任意の周波数差を与えた状態でコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。つまり、２つのパルスレーザ光の時間的タイミングの調節に応じて異なる周波数を有するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。

ここで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光に含まれる標本中の分子の特定の振動が寄与していない非共鳴成分、すなわちノイズは、パルスタイミング調整手段によって標本面上における２つの異なる周波数帯域を有するパルスレーザ光の周波数差を、標本中の分子の特定の振動に略等しくした場合、等しくしない場合のいずれの場合おいても、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光中に含まれている。そこで、２つのパルスレーザ光の周波数差を調節し、標本中の分子の特定の振動に略等しくした場合、等しくしない場合の２つの場合において、それぞれコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を光検出手段により強度を検出し、それら２つの場合のコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度の差分に基づいて、画像生成手段により画像を生成することで、非共鳴成分を除去した画像を生成することが可能となる。これにより、信号対雑音比を向上させ高画質な画像で観察を行うことが可能となる。すなわち、本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、２つの異なる周波数帯域を有するパルスレーザ光を用いてコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の非共鳴成分を除去することができる。

また、単一のレーザ光源から発生したフェムト秒パルスレーザ光を分岐し、一方の光路において、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるように、フェムト秒パルスレーザ光の周波数を周波数変換手段によって変換し、２つの異なる周波数帯域を有するパルスレーザ光を得ることができるので、周波数帯域の異なる２つのパルスレーザ光の光源を共通化して装置構成を簡略化することができる。

さらに、周波数変換手段がフォトニッククリスタルファイバであるので、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数帯域を有するパルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することで、さまざまな周波数成分および周波数帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光の周波数差を調節することが可能となる。

上記した発明において、前記照射手段は、前記標本に対し前記レーザ光による２次元的な走査を行うスキャナを備えていることが好ましい。

周波数分散調節手段により、２つの光路を導光される各パルスレーザ光を略等しい周波数分散量となるように調節することで、時間軸上の各時刻において、２つのパルスレーザ光の周波数差を一定にすることができる。これにより、２つのパルスレーザ光のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に用いることができる。また、周波数分散調節手段により周波数分散量を調節することで、フェムト秒レーザ光のように比較的広い周波数帯域を有するパルスレーザ光であっても、時間軸上の各時刻において、パルスレーザ光の周波数成分を時間軸上に分散させることができる。

上記発明において、前記パルスタイミング調節手段は、前記光検出手段により検出されるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度が極大または最大および極小または最小となるように、２つのパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することとしてもよい。

コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度の極大または最大値と極小または最小値との差分を取ることで、非共鳴成分を除去することができる。これにより、信号対雑音比を向上させ高画質な画像を得ることができる。また、２つのパルスレーザ光の周波数差がコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度が極大または最大値と極小または最小値となる範囲で変化するように、２つのパルスレーザ光の時間的タイミングを一定の振幅、かつ、所定の周波数で周期的に変動させ、それにより得られるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度の中で前記所定の周波数で変動する強度成分のみを抽出することで非共鳴成分を除去した画像を生成することもできる。

本発明によれば、装置構成の複雑化を抑制しつつ、非共鳴成分を除去して画質を向上させることができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光源装置２と、レーザ光源装置２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体３とを備えている。

レーザ光源装置２は、フェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源４と、レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を２つに分岐するビームスプリッタ（分岐手段）５と、ビームスプリッタ５により分岐された２つのフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２をそれぞれ通過させる２つの光路６，７と、該２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を合波するレーザコンバイナ８とを備えている。

第１の光路６には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節可能な周波数分散装置（周波数分散調節手段）９が設けられている。第２の光路７には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ２を通過させるフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１０と、フォトニッククリスタルファイバ１０通過後のパルスレーザ光Ｌ２’の光路長を調節する光路調節装置（パルスタイミング調節手段）１１とが設けられている。

周波数分散装置９は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）とを備えている。一対のプリズムを通過したフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し、同一の光路６上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、周波数分散装置９を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記プリズム対の代わりに回折格子対（図示略）を用いてもよい。

フォトニッククリスタルファイバ１０は、通過させるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を変更または拡大してパルスレーザ光Ｌ２’を生成し、光路６，７を導光されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっている。

光路調節装置１１は、例えば、ミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。少なくとも２組以上のリフレクタを用いてパルスレーザ光Ｌ２’の光路を折り返し、少なくとも２組以上のリフレクタの間隔を調節することでパルスレーザ光Ｌ２’の光路長を変化させることができる。これによって、パルスレーザ光Ｌ２’のパルスの時間的タイミングを調整することができる。

レーザコンバイナ８は、２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を合波する合波部（図示略）と、パルスレーザ光Ｌ２’から所望の周波数帯域の成分を切り出すフィルタ（図示略）とを備えている。このフィルタにパルスレーザ光Ｌ２’を通過させることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために不要な成分を除去することができる。

顕微鏡本体３は、例えば、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源装置２から出射されたパルスレーザ光Ｌ３を２次元的に走査するスキャナ１２およびレンズ群２０と、前記スキャナ１２により走査されたパルスレーザ光Ｌ３を標本Ａ面に集光する集光レンズ（照射手段）１３と、標本Ａを透過する方向に発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を集光する集光レンズ１５と、集光レンズ１５により集光されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する第２の光検出器（光検出手段）１６と、第２の光検出器１６により検出されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を用いて画像を生成するとともに光路調節装置１１を制御する制御部（画像生成手段）２１とを備えている。

図中、符号１７はダイクロイックミラー、符号１８はステージ、符号１９はミラーである。なお、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出されてもよい。

上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光による標本Ａの観察を行うには、レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させる。レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ５により２つの光路６，７に分岐される。

第１の光路６に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１は、第１の光路６上に配置されている周波数分散装置９を通過されることにより、初期の周波数分散量が与えられる。一方、第２の光路７に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２は、ミラー１９によって偏向された後、フォトニッククリスタルファイバ１０を通過させられることにより、第１の光路６のフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に比べて周波数が変更または拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２’）となる。また、同時に、パルスレーザ光Ｌ２’にはフォトニッククリスタルファイバ１０を追加することにより所定の周波数分散が与えられる。

周波数分散装置９によりパルスレーザ光Ｌ１’に与えられる初期の周波数分散量とフォトニッククリスタルファイバ１０を通過することによりパルスレーザ光Ｌ２’に与えられる周波数分散量とが相違する場合、図２（ａ）に示されるように、時間軸上においてパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数分布の傾きが相違する。この場合、２つの光路６，７を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’は時間軸上の各時刻において異なり、一定に保たれない。この状態においては、パルスレーザ光L１’，Ｌ２’のエネルギーを、標本Ａ中の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に効率よく利用することができない。

そこで、周波数分散装置９を作動させて、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える分散量が、第２の光路７のフォトニッククリスタルファイバ１０を通過したパルスレーザ光Ｌ２’に与えられる分散量と標本Ａ面上において略同等となるように調節する。すなわち、図２（ａ）の矢印Ｐ１に示されるように、時間軸方向の周波数分布の傾きを変化させる。

これにより、図２（ｂ）に示されるように、レーザコンバイナ８に到達する２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の時間軸方向の周波数分布の傾きが略同じになるように調節される。その後、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’は、レーザコンバイナ８によって合波され、パルスレーザ光Ｌ３となる。

このように合成されたパルスレーザ光Ｌ３は、顕微鏡本体３に入射させられ、スキャナ１２によって２次元的に走査された後、レンズ群２０と集光レンズ１３を介して標本Ａ面上に集光される。これにより、パルスレーザ光Ｌ３が集光された各位置において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数からコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。

標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、標本Ａを挟んで集光レンズ１３とは反対側に配置された集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ３の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第２の光検出器１６により検出されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の光強度とを対応づけて記憶することで、制御部２１により、２次元的なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を生成する。

ここで、上記のように得られたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像には、分子の特定の振動が寄与した共鳴成分と、分子の特定の振動が寄与していない非共鳴成分とが含まれている。
標本中の分子の特定の振動周波数をΩとすると、この分子から発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度Ｉ_ｃは、分子の３次の非線形感受率χ^（３）という物理量を用いて以下の（１）式のように表される。
Ｉ_ｃ（Ω）∝|χ^（３） _Ｒ（Ω）＋χ^（３） _ＮＲ|^２＝|χ^（３） _Ｒ（Ω）|^２＋（χ^（３） _ＮＲ）^２＋２Ｒｅχ^（３） _Ｒ（Ω）χ^（３） _ＮＲ・・・（１）

上記の（１）式において、χ^（３） _Ｒは共鳴成分に対応する３次の非線形感受率、χ^（３） _ＮＲは非共鳴成分に対応する３次の非線形感受率を示している。また、第１項の|χ^（３） _Ｒ（Ω）|^２は共鳴成分の寄与、第２項の（χ^（３） _ＮＲ）^２は非共鳴成分の寄与、第３項の２Ｒｅχ^（３） _Ｒ（Ω）χ^（３） _ＮＲは共鳴成分と非共鳴成分の干渉の寄与を表している。ここで、これら各項を重ね合わせて得られるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光には、その強度Ｉ_ｃが極大（ピーク）となる周波数Ω_ｐと強度Ｉ_ｃが極小（ディップ）となる周波数Ω_ｄとが存在する。

上記の（１）式の第３項のスペクトルの変化を利用することで、非共鳴成分を取り除くことができる。すなわち、第２の光検出器１６により、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度Ｉ_ｃが極大となる周波数Ω_ｐおよび極小となる周波数Ω_ｄのそれぞれに対してコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出し、その差分を取ることで非共鳴成分を取り除くことができる。

そこで、第２の光検出器１６により検出されるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度が極大および極小となるように、２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の時間的タイミングを変化させる。すなわち、制御部２１は、光路調節装置１１を作動させて、図２（ｂ）の矢印Ｐ２で示されるように、第２の光路７を通過するパルスレーザ光Ｌ２’を時間軸方向に遅延させる。

このようにして得られたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の周波数の時間分布が図３（ａ）および図３（ｂ）に示されている。図３（ａ）は、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度が極大となった状態を示している。この際、２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差はΩ_ｐである。
図３（ｂ）は、図３（ａ）の状態から、第２の光路７を通過するパルスレーザ光Ｌ２’を時間軸方向にΔｔ遅延させて、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度が極小となった状態を示している。この際、２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差はΩ＋ΔΩ＝Ω_ｄである。

次に、このようにして得られたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度Ｉ_ｃの極大値と極小値との差分を取り、該差分に基づいて制御部２１により２次元的な画像を生成する。これにより、ノイズが除去され信号対雑音比が向上した高画質なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を生成することが可能となる。

以上、説明してきたように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、光路調節装置１１により、パルスレーザ光Ｌ２’の時間的タイミングを調節することで、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差を変化させ、異なる周波数を有する２つのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。また、このように発生させた２つのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度の差分を取り、該差分に基づいて画像生成手段により画像を生成することで、非共鳴成分の除去した画像を生成することが可能となる。
特に、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度の極大または最大値と極小または最小値との差分を取ることで、非共鳴成分を除去し信号対雑音比がより向上した画像で観察を行うことができる。

また、単一のレーザ光源４から発生したフェムト秒パルスレーザ光をビームスプリッタ５により分岐し、第２の光路７において、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるように、フェムト秒パルスレーザ光の周波数をフォトニッククリスタルファイバ１０によって変換することで、周波数帯域の異なる２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の光源を共通化して装置構成を簡略化することができる。

また、周波数分散装置９により、２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、時間軸上の各時刻において一定となるように周波数分散量を調節することで、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に用いることができる。また、周波数分散装置９により周波数分散量を調節することで、フェムト秒レーザ光のように比較的広い周波数帯域を有するパルスレーザ光であっても、時間軸上の各時刻において、パルスレーザ光の周波数成分を時間軸上に分散させることができる。

また、周波数変換手段として、フォトニッククリスタルファイバ１０を使用することで、装置をさらに簡易かつ安価に構成することができる。また、光路調節装置１１も、ミラー（リフレクタ）により構成されるため、装置をさらに簡易かつ安価に構成することができる。なお、周波数変換手段として、フォトニッククリスタルファイバ１０の代わりに、例えば、同様の機能・作用を持つ、バルク、薄膜、フィルム、フォトニック結晶構造体のいずれかを用いても良い。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、本実施形態において、制御部２１が、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度の極大または最大値と極小または最小値との差分を取ることとして説明したが、これに代えて、２つのパルスレーザ光の周波数差がコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度が極大または最大値と極小または最小値となる範囲で変化するように、２つのパルスレーザ光の時間的タイミングを一定の振幅、かつ、所定の周波数で周期的に変動させ、それにより得られるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度の中で前記所定の周波数で変動する強度成分のみを抽出することで非共鳴成分を除去した画像を生成するもできる。

また、本実施形態においては、フェムト秒パルスレーザ光を発生する単一のレーザ光源４と、光路６，７に分岐するビームスプリッタ５を用いたが、これに代えて、各光路６，７に１台ずつレーザ光源４を取り付けることにしてもよい。この場合、各レーザ光源４は互いにパルスタイミングの同期がとれている必要がある。

また、周波数分散装置９は、第２の光路７に設けられていてもよいし、両光路６，７にそれぞれ設けられていてもよい。また、レーザ光源４とビームスプリッタ５との間に周波数分散装置が設けられている場合や、レーザ光源４と周波数分散装置とが一体型とされている場合においても、本実施形態と同様の構成とすることで、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の非共鳴成分を除去することができる。

また、少なくとも一方の光路６，７に、減光フィルタのような光量調節手段（図示略）を配置することにしてもよい。これにより、２つの光路６，７を通過してくるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の光量バランスを図ることができる。

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。 図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、（ａ）調整前、（ｂ）周波数分散量調整後をそれぞれ示している。 図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光のパルスの時間的タイミング調整時のコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度を示すグラフであり、（ａ）極大となった状態、（ｂ）極小となった状態をそれぞれ示している。

符号の説明

Ａ 標本
Ｌ１，Ｌ２ フェムト秒パルスレーザ光
Ｌ１’，Ｌ２’ パルスレーザ光
Ω，Ω’，Ω_ｐ，Ω_ｄ 周波数（差）
１ レーザ顕微鏡装置
４ レーザ光源
５ ビームスプリッタ（分岐手段）
６，７ 光路
８ レーザコンバイナ（合波手段）
９ 周波数分散装置（周波数分散調節手段）
１０ フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
１１ 光路調節装置
１３ 集光レンズ
１４ 第１の光検出器
１６ 第２の光検出器
２１ 制御部

Claims (3)

1. 標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有し、時間軸方向に分布する２つの異なる周波数帯域を有するパルスレーザ光を導光する２つの光路と、
   該２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路に導光されるパルスレーザ光の標本面上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節するパルスタイミング調節手段と、
   前記２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、
   該合波手段により合波されたパルスレーザ光を前記標本に照射してコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させる照射手段と、
   前記標本から発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する光検出手段と、
   前記パルスタイミング調節手段により時間的タイミングを変化させることによって前記光検出手段により検出される２つのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の差分に基づいて画像を生成する画像生成手段と、
   フェムト秒パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、
   該レーザ光源から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を前記２つの光路に分岐する分岐手段と、
   前記光路のいずれか一方に設けられ、２つの光路を導光されるフェムト秒パルスレーザ光に標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるフォトニッククリスタルファイバからなる周波数変換手段と、
   前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数分散量が略同等となるように調節する周波数分散調節手段と、
   を備えるレーザ顕微鏡装置。
2. 前記パルスタイミング調節手段は、前記光検出手段により検出されるコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の強度が極大または最大および極小または最小となるように、２つのパルスレーザ光の時間的タイミングを調節する請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
3. 前記照射手段は、前記標本に対し前記レーザ光による２次元的な走査を行うスキャナを備えている請求項１又は請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。

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