JP5185695B2 - レーザ顕微鏡装置及び標本画像取得方法 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ顕微鏡装置及び標本画像取得方法に関するものである。

標本中の分子の特定の振動を利用し、分子からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、検出することで標本の観察を行うコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡は、標本の分子の特定の振動を利用しているため、蛍光顕微鏡のように、観察対象を蛍光プローブであらかじめ標識する必要がない。また、利用する振動を変更することで観察する分子を変更することができる。

従来、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の光源には、比較的狭い周波数スペクトル帯域を有した２つの異なる周波数を有するピコ秒パルスレーザが用いられている。これら２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が、標本の分子の特定の振動周波数に一致するように調節した状態で標本面に集光する。このとき、焦点面近傍に広がる光子密度が高い極めて狭い空間において、２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数差が分子の特定の振動周波数に共鳴し、強いコヒーレントアンチストークスラマン散乱光が発生する。このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、照射した２つのピコ秒パルスレーザ光の周波数よりも高い周波数を有する（つまり短い波長を有する）。したがって、このコヒーレントアンチストークスラマン散乱光だけを分光的に選択して検出することで標本の分子の観察を行うことができる。

また、フェムト秒パルスレーザ光を標本面に集光することで、焦点面近傍に広がる極めて狭い空間において光子密度を高めて蛍光物質を多光子励起し、鮮明な蛍光画像を得ることができる多光子励起型のレーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献２参照。）。

特開２００２−５２０６１２号公報 特開２００２−２４３６４１号公報

しかしながら、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡において、標本の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を効率的に発生させるためには、周波数帯域が狭い（または、パルス幅が比較的広い）ピコ秒パルスレーザ光を用いる必要がある。というのも、周波数スペクトル帯域が広いパルスレーザ光を用いてしまうことで、２つのパルスレーザ光の周波数差の中に、分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分も生じてしまうからである。それら分子の特定の振動周波数に一致しない周波数差成分は、分子の特定の振動に共鳴せず、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に寄与しない。結果として、２つのパルスレーザ光のエネルギーを分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に効率的に利用できなくなってしまう。

一方、多光子励起型のレーザ顕微鏡においては、蛍光の励起効率をより高め、かつ、標本に与えるダメージをより軽減して観察を行うことを目的として、周波数スペクトル帯域が広い（または、パルス幅が極端に狭い）フェムト秒レーザ光が使用され、加えて、フーリエ限界パルスに近い状態で使用される。上記理由から、コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡と多光子励起型のレーザ顕微鏡の両観察方法は、使用するパルスレーザ光の仕様が相違するため、同一の顕微鏡装置によって達成することが困難である。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察および多光子蛍光観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるレーザ顕微鏡装置及び標本画像取得方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有する２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する２つの光路と、該２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数分散量を調節し、時間軸上の各時刻において、前記各パルスレーザ光の周波数差を一定に保つことが可能な周波数分散調節手段とを備えるレーザ顕微鏡装置を提供する。

導光される各パルスレーザ光に、周波数分散調節手段によって、等しい周波数分散量を与えることができる。周波数分散を与えることで、各パルスレーザ光の周波数スペクトルの周波数成分を時間軸上に分散させることができる。このため、フェムト秒レーザ光のように比較的広い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光であっても、周波数分散量を調節することで、時間軸上の各時刻において、比較的狭い周波数スペクトル帯域を有しているとみなすことができる。また、導光される各パルスレーザ光の周波数分散量を調整することで、時間軸上の各時刻において、２つのパルスレーザ光の周波数差を常に一定に保つように調節することが可能である。

このように２つのパルスレーザ光の周波数差を時間軸上で一定に保った状態で、標本面上に集光することにより、標本中の分子のうち２つのパルスレーザ光の周波数差に等しい周波数を持つ分子の振動からコヒーレントアンチストークスラマン散乱光が発生する。このとき、２つのパルスレーザ光の周波数差は時間軸上で一定に保たれているため２つのパルスレーザ光のエネルギーを効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に用いることができる。

上記説明のとおり、フェムト秒レーザのような周波数帯域が比較的広いパルスレーザ光を用いた場合でも、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。一方、フェムト秒レーザのような周波数帯域が比較的広いパルスレーザを利用した場合、２つのパルスレーザ光のうちいずれか一方のパルスレーザ光を標本に集光することにより、多光子励起光効果を発生させることが可能となる。すなわち、本発明により、１台のレーザ顕微鏡装置により、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察および多光子蛍光観察を行うことが可能となる。

また、上記発明においては、さらに前記周波数分散調節手段が、標本面上におけるパルスレーザ光が略フーリエ限界パルスに近づくように周波数分散量を調節可能であることが望ましい。このようにすることで、周波数分散調節手段によって、パルスレーザ光の分散量を調節し、標本面上において略フーリエ限界パルスを達成することができる。これにより、多光子蛍光観察において多光子蛍光をより効率よく発生させて、鮮明な多光子蛍光観察を行うことができる。

上記発明においては、フェムト秒パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、該レーザ光源から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を前記２つの光路に分岐する分岐手段と、いずれか一方の光路に設けられ、２つの光路を導光されるフェムト秒パルスレーザ光に標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差に相当する周波数差を与える周波数変換手段とを備えていてもよい。

このようにすることで、単一のレーザ光源から発生したフェムト秒パルスレーザ光を分岐し、一方の光路において、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるように、フェムト秒パルスレーザ光の周波数を周波数変換手段によって変換し、２つの異なる周波数をもつパルスレーザ光を得ることができる。これにより、２つの周波数の異なるパルスレーザ光のレーザ光源を共通化して装置構成を簡略化することができる。

また、上記発明においては、前記２つの光路の少なくとも一方に、２つの光路に導光されるパルスレーザ光の標本面上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することができるパルスタイミング調節手段を備えていてもよい。一方のパルスレーザ光に対して、他方のパルスレーザ光の時間的タイミングを調整することで、２つのパルスレーザ光の周波数差を２つのパルスレーザ光の周波数帯域内において任意に調整することが可能となる。

これにより、標本面上において２つのパルスレーザ光のタイミングを調整し、標本中の分子の特定の振動周波数に一致させるように２つのパルスレーザ光のタイミングを調整することができる。これにより、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、周波数差を任意に調整することができるため、標本中の分子の別の振動周波数に一致させることも可能となる。

また、上記発明においては、前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバであってもよい。周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することで、さまざまな周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、２つのパルスレーザ光の周波数差を調整することが可能となる。

また、上記発明においては、前記パルスレーザ光の光量を調節する光量調節手段が設けられていてもよい。このようにすることで、光量調節手段を作動させて、各光路のパルスレーザ光の光量を調節し、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および／または多光子蛍光を発生させる際の光量バランスを図ることができるとともに、最適な画像で観察を行うことができる。

本発明によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子蛍光の観察を同一の装置において両立することを可能とし、種々の観察方法により標本を観察することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について、図１〜図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１は、図１に示されるように、レーザ光源装置２と、該レーザ光源装置２からのレーザ光を標本Ａに照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体３とを備えている。

レーザ光源装置２は、フェムト秒パルスレーザ光を出射する単一のレーザ光源４と、該レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を２つに分岐するビームスプリッタ（分岐手段）５と、該ビームスプリッタ５により分岐された２つのフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２をそれぞれ通過させる２つの光路６，７と、該２つの光路６，７を通過してきた２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’を合波するレーザコンバイナ８とを備えている。

第１の光路６には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に与える周波数分散量を調節可能な周波数分散装置（周波数分散調節手段）９が設けられている。第２の光路７には、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ２を通過させるフォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）１０と、フォトニッククリスタルファイバ１０通過後のパルスレーザ光Ｌ２’の光路長を調節する光路調節装置（パルスタイミング調節手段）１１とが設けられている。

周波数分散装置９は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム（図示略）と、ミラー（図示略）とを備えている。一対のプリズムを通過したフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路６上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、周波数分散装置９を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記プリズムの代わりに回折格子（図示略）を用いてもよい。

また、周波数分散装置９は、例えば、板厚の変化する楔状のガラス板のように所定の周波数分散特性を有する材質からなる部材（図示略）であってもよい。部材が本来持つ周波数分散特性により、部材を通過するフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に所定の周波数分散を与えることができる。また、フェムト秒パルスレーザ光Ｌ１の通過する位置の部材の厚みを変化させることにより、与える周波数分散量が調整できる。また、周波数分散装置９は、所望の分散量を得るように調製された光ファイバであってもよい。

また、本実施形態においては、周波数分散装置９は、該周波数分散装置９を通過したパルスレーザ光Ｌ１’が、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくような分散量を設定することができるようになっている。これにより、レーザ光源４から標本Ａまでの全光路において生じる周波数分散によってフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１のパルス幅の広がりを補償することができ、標本Ａ上に集光される時点でのフェムト秒パルスレーザ光が、略フーリエ限界に近いパルス幅を達成することができるようになっている。

フォトニッククリスタルファイバ１０は、通過させるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数帯域を変更または拡大させることができる。また、フォトニッククリスタルファイバ１０を通過したパルスレーザ光Ｌ２’は、フォトニッククリスタルファイバの種類および通過させるフェムト秒パルスレーザ光の条件に応じた周波数分散をもった状態となっている。また、例えば、周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバ１０の代わりに、同様の機能・作用を持つ、バルク、薄膜、フィルム、フォトニック結晶構造体のいずれかを用いても良い。

パルスタイミング調節手段１１は、例えば、ミラー（リフレクタ）により構成される（図示略）。少なくとも２組以上のリフレクタを用いてパルスレーザ光Ｌ２’の光路を折り返し、少なくとも２組以上のリフレクタの間隔を調節することでパルスレーザ光Ｌ２’の光路長を変化させることができる。これによって、パルスレーザ光Ｌ２’のパルスの時間的タイミングを調整することができる。

本実施形態においては、パルスタイミング調節手段１１により、２つの光路６，７を通過してレーザコンバイナ８に入射されるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の時間的なタイミングを調節し、標本Ａ面上において２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を、標本Ａの分子の特定の振動周波数Ωに一致させることができる。これにより、効率的にコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることが可能となる。また、周波数差Ω’を任意に調整することができるため、標本Ａ中の分子の別の振動周波数に一致させることも可能となる。

顕微鏡本体３は、例えば、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光源装置２から出射されたパルスレーザ光Ｌ３を２次元的に走査するスキャナ１２およびレンズ群２０と、前記スキャナ１２により走査されたパルスレーザ光Ｌ３を標本Ａ面に集光する集光レンズ１３と、標本Ａにおいて発生し、集光レンズ１３によって集光された蛍光を検出する第１の光検出器１４と、標本Ａを透過する方向に発生するコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を集光する集光レンズ１５と、該集光レンズ１５により集光されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を検出する第２の光検出器１６とを備えている。

図中、符号１７はダイクロイックミラー、符号１８はステージ、符号１９はミラーである。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、前記集光レンズ１５により集光され第２の検出器１６で検出されてもよい。また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は前記集光レンズ１３により集光され第１の検出器１４で検出されてもよい。

このように構成された本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光による標本Ａの観察を行うには、レーザ光源４を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させる。レーザ光源４から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、ビームスプリッタ５により２つの光路６，７に分岐される。

第１の光路６に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１は、第１の光路６上に配置されている周波数分散装置９を通過されることにより、初期の周波数分散量を与えられる。一方、第２の光路７に分岐されたフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２は、ミラー１９によって偏向された後、フォトニッククリスタルファイバ１０を通過させられることにより、第１の光路６のフェムト秒パルスレーザ光Ｌ１に比べて周波数スペクトルが変更または拡大された広帯域光（パルスレーザ光Ｌ２’）となる。また、同時に、パルスレーザ光Ｌ２’にはフォトニッククリスタルファイバ１０を追加することにより所定の周波数分散が与えられる。

周波数分散装置９によりパルスレーザ光Ｌ１’に与えられる初期の周波数分散量とフォトニッククリスタルファイバ１０を通過することによりパルスレーザ光Ｌ２’に与えられる周波数分散量とが相違する場合、図２（ａ）に示されるように、時間軸上においてパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数分布の傾きが相違する。この場合、２つの光路６，７を通過してきたパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’は時間軸上の各時刻において異なり、一定に保たれない。この状態においては、パルスレーザ光L１’，Ｌ２’のエネルギーを、標本Ａ中の分子の特定の振動からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に効率よく利用することができない。

そこで、本実施形態においては、周波数分散装置９を作動させて、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える分散量が、第２の光路７のフォトニッククリスタルファイバ１０を通過したパルスレーザ光Ｌ２’に与えられる分散量と標本Ａ面上において略同等となるように調節する。すなわち、図２（ａ）の矢印Ｐ１に示されるように、時間軸方向の周波数分布の傾きを変化させる。

２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を時間軸上で一定に保った状態でも、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のパルスの時間的タイミングによっては、図２（ｂ）に示されるように、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致しない場合がある。そこで、本実施形態においては、パルスタイミング調節手段１１を作動させて、第２の光路７を通過するパルスレーザ光Ｌ２’を時間軸方向に遅延させる。すなわち、図２（ｂ）に矢印Ｐ２で示されるように、パルスレーザ光Ｌ２’の時間的なパルスタイミングを調節する。

これにより、図３に示されるように、レーザコンバイナ８に到達する２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数分散量と周波数差Ω’が調節される。その後、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’は、レーザコンバイナ８によって合波され、パルスレーザ光Ｌ３となる。また、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’を任意に調整することが可能となる。このため、標本Ａ面上において２つのパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の時間的なパルスタイミングを調整し、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致させるように２つのパルスレーザ光の時間的なパルスタイミングを調節することができる。

このように合成されたパルスレーザ光Ｌ３は、顕微鏡本体３に入射させられ、スキャナ１２によって２次元的に走査された後、レンズ群２０と集光レンズ１３を介して標本Ａ面上に集光される。これにより、パルスレーザ光Ｌ３が集光された各位置において、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させることができる。

また、レーザコンバイナ8以降の光学系により、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数分散量が変化した場合や時間的なパルスタイミングが変化した場合は、標本Ａ面上において再度、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’が標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致するように、周波数分散量と時間的なパルスタイミングを調節してもよい。

標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、標本Ａを挟んで集光レンズ１３とは反対側に配置された集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ３の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第２の光検出器１６により検出されたコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。また、標本Ａにおいて発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光は、集光レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出されてもよい。

この場合において、本実施形態によれば、２つの光路６，７のパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’は、時間軸上の各時刻においても、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに一致しているので、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’のエネルギーを効率的に標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光の発生に利用することができる。このように発生したコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を時間積算することにより、明るいコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。

また、本実施形態においては、周波数分散装置９を作動させることにより、図４（ａ）に矢印Ｐ３に示すように、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える周波数分散量を調節し、図４（ｂ）に示すように、パルスレーザ光Ｌ１’が標本Ａ面において略フーリエ限界パルスに近づくようにパルスレーザ光Ｌ１’の周波数分散量を設定することができる。その結果、このように設定されたパルスレーザ光Ｌ１’を集光レンズ１３により標本Ａに集光することで、標本Ａにおける集光位置において多光子励起による蛍光を効率よく発生させることができる。

標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１３によって集光された後、ダイクロイックミラー１７によって分岐されて第１の光検出器１４により検出される。そして、パルスレーザ光Ｌ１’の標本Ａ面上での集光位置の座標と、第１の光検出器１４により検出された蛍光強度とを対応づけて記憶することにより、２次元的な多光子蛍光画像を得ることができる。また、標本Ａにおいて発生した蛍光は、集光レンズ１５によって集光され、第２の光検出器１６により検出されてもよい。

また、多励起型の蛍光観察と同様の条件で、ＳＨＧ光（第二高調波光）観察も行うことができる。
このように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光観察、多光子励起型の蛍光観察およびＳＨＧ光観察を切り替えて効率よく行うことができる。すなわち、１台のレーザ顕微鏡装置１により、３種類の観察を効率よく行うことができ、マルチモーダル観察を達成することができる。

また、多光子励起の蛍光またはＳＨＧ光の励起効率が多少悪くなっても良い場合は、上記の３種類の観察を切り替えることなく同時に観察することも可能である。また、第１，２の光検出器１４，１６をコヒーレントアンチストークスラマン散乱光、多光子励起の蛍光、ＳＨＧ光のいずれかの光を検出する検出器として割り当ててもよい。また、光検出器が不足する場合は、第１，２の光検出器１４，１６のいずれかと同等の位置に光検出器を新たに追加してもよい。

この場合において、レーザ光源４としてフェムト秒パルスレーザ光を発生するレーザ光源を用意すれば足り、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させるために新たにピコ秒パルスレーザ光を発生させるレーザ光源が不要なため、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
また、周波数変換手段として、フォトニッククリスタルファイバ１０を使用するので、装置をさらに簡易かつ安価に構成することができる。また、パルスタイミング調節手段１１も、ミラー（リフレクタ）により構成されるため、装置をさらに簡易かつ安価に構成することができる。

また、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、パルスタイミング調節手段１１によって、２つの光路６，７を通過するパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の時間的なパルスタイミングを調節し、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’それぞれの周波数スペクトル帯域内で周波数差Ω’を自由に調節することが可能である。このため、パルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の周波数差Ω’は、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに略一致する程度でよく正確な周波数差である必要はない。

つまり、フォトニッククリスタルファイバ１０を通過することによるフェムト秒パルスレーザ光Ｌ２の周波数スペクトル帯域の変更または拡大も正確である必要はない。パルスタイミング調節手段１１により、標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωに精度よく一致させることができ、最も効率よく標本Ａ中の分子の特定の振動周波数Ωからのコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を発生させ、明るいコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像を得ることができる。

なお、本実施形態においては、フェムト秒パルスレーザ光を発生する単一のレーザ光源４と、光路６，７に分岐するビームスプリッタ５を用いたが、これに代えて、各光路６，７に１台ずつレーザ光源４を取り付けることにしてもよい。この場合、各レーザ光源４は互いにパルスタイミングの同期がとれている必要がある。

また、周波数分散装置９として、プリズム対とミラーとを備えて、周波数分散量を連続的に変更可能なものを例示したが、これに代えて、周波数分散量が固定のもの、それらを複数用意し、段階的に切り替える方式のものや、第１の光路６上に挿脱されてパルスレーザ光Ｌ１’に与える分散量を切り替える方式のものを採用してもよい。

また、周波数分散装置９は、第２の光路７に設けられていてもよいし、両光路６，７にそれぞれ設けられていてもよい。
また、少なくとも一方の光路６，７に、減光フィルタのような光量調節手段（図示略）を配置することにしてもよい。これにより、２つの光路６，７を通過してくるパルスレーザ光Ｌ１’，Ｌ２’の光量バランスを図ることができる。

また、第１の光路６を通過するパルスレーザ光Ｌ１’に与える周波数分散量を、標本Ａ面上において略フーリエ限界パルスに近づくように設定して行われる多光子励起の蛍光観察の際には、第２の光路７をシャッタ等により制限することとしてもよい。多光子励起の蛍光観察時には第２の光路７への分岐は不要となるので、これを制限することによって、多光子蛍光画像に発生するノイズや標本Ａに与えるダメージを低減することができる。

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。 図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、（ａ）調整前、（ｂ）周波数分散量調整後をそれぞれ示している。 図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光のパルスの時間的タイミング調整後の周波数の時間分布を示すグラフである。 図１のレーザ顕微鏡装置の２つの光路を伝達されるパルスレーザ光の周波数の時間分布を示すグラフであり、多光子励起の蛍光観察時におけるパルスレーザ光の周波数分散量の（ａ）調整前、（ｂ）調節後のそれぞれの状態を示している。

符号の説明

Ａ 標本
Ｌ１，Ｌ２ フェムト秒パルスレーザ光
Ｌ１’，Ｌ２’ パルスレーザ光
Ω，Ω’ 周波数（差）
１ レーザ顕微鏡装置
４ レーザ光源
５ ビームスプリッタ（分岐手段）
６，７ 光路
８ レーザコンバイナ（合波手段）
９ 周波数分散装置（周波数分散調節手段）
１０ フォトニッククリスタルファイバ（周波数変換手段）
１１ パルスタイミング調節手段

Claims (8)

1. 標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有する２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する２つの光路と、
   該２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、
   前記２つの光路の少なくとも一方に設けられ、前記２つの光路を導光される各パルスレーザ光の少なくとも一方の周波数分散量を調節し、時間軸上の各時刻において、前記各パルスレーザ光の周波数差を一定に保つことが可能な周波数分散調節手段とを備えるレーザ顕微鏡装置。
2. 前記周波数分散調節手段が、標本面上におけるパルスレーザ光が略フーリエ限界パルスに近づくように周波数分散量を調節可能である請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
3. フェムト秒パルスレーザ光を発生するレーザ光源と、
   該レーザ光源から発せられたフェムト秒パルスレーザ光を前記２つの光路に分岐する分岐手段と、
   いずれか一方の光路に設けられ、２つの光路を導光されるフェムト秒パルスレーザ光に標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差に相当する周波数差を与える周波数変換手段とを備える請求項１または請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
4. 前記２つの光路の少なくとも一方に、２つの光路に導光されるパルスレーザ光の標本面上におけるパルスレーザ光の時間的タイミングを調節することができるパルスタイミング調節手段を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
5. 前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバである請求項３に記載のレーザ顕微鏡装置。
6. 前記２つの光路に、前記パルスレーザ光の光量を調節する光量調節手段が設けられている請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
7. 標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有する２つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を２つの光路でそれぞれ導光し、
   該２つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波し、
   時間軸上の各時刻における前記各パルスレーザ光の周波数差を標本面上で一定に保つように、前記各パルスレーザ光の少なくとも一方の周波数分散量を調節し、
   前記各パルスレーザ光を照射することで得られる前記標本からの光を検出してこの標本の観察画像を取得するレーザ顕微鏡を用いた標本画像取得方法。
8. 前記パルスレーザ光が、フェムト秒パルスレーザ光である請求項７に記載の標本画像取得方法。

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