JP5230648B2 - 自動血液分析装置による全血試料中の有核赤血球及び白血球細胞の測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、全血試料中の白血球細胞の測定方法に関する。より詳細には、本発明は、有核赤血球を白血球細胞から識別し、それによってより正確な全血球計算を可能にする方法に関する。

自動血液分析装置によって得られる最も重要な臨床結果の１つは、白血球濃度である。有核赤血球は、白血球と干渉する傾向があり、それによって分析装置の白血球計算が阻止され（ｆｌａｇ）、それによって白血球濃度が報告できなくなり、又は有核赤血球が白血球数に含まれ、それによって不正確な結果を生じる。脆弱な白血球を含む検体、又は耐低浸透圧性の赤血球を含む検体は、自動血液分析装置で問題を生じる。脆弱な白血球は、赤血球と一緒に溶解し、それによって白血球数が不正確になり、低すぎるようになり得る。耐低浸透圧性赤血球は、溶解し難く、白血球として計算され、それによって白血球数が不正確になり、高すぎるようになり得る。血液分析装置はこれらの不正確な結果を無効にし、その結果、操作者は報告可能な結果を手動手段によって取得せざるを得ない。

赤血球は、プログラムされた一連の中間発生段階を経て骨髄前駆体から産生される。赤血球前駆体はすべて有核であり、通常は骨髄内に存在する。これらの前駆体が赤血球段階に向かって成熟するにつれ、ＲＮＡ／ＤＮＡ合成が次第に低下し、ヘモグロビン数が増加する。有核赤血球は、正常な成体の血液ではまれな現象として起こり得るが、その頻度は極めて低く、観測されるときには、かなりの異常とみなされる。

血中の有核赤血球の存在は、通常、種々の血液疾患の原因に貴重な見識を与えるものである。有核赤血球が血液試料中に存在するときには、確実に白血球計算と干渉しないようにする必要がある。

有核赤血球による白血球計算の干渉は、方法の正確度、したがって、全血球計算に対する血液分析装置の性能に一般に悪影響を及ぼす。歴史的に、この悪影響は、有核赤血球数の形態学的評価と、それに続く報告された白血球細胞数の補正を必要とする。しかし、より最近では、蛍光フローサイトメトリーを適用することによって、全血球計算の一部として実施される半自動方法及び完全自動有核赤血球計算が開発された。

手動有核赤血球計算は、参照方法として残っている。手動有核赤血球計算は、２００又は１００個の白血球分類を使用する必要がある。有核赤血球の認識精度が高いにもかかわらず、１００又は２００個の白血球分類の統計学的制約は、有核赤血球と白血球の比が約１０％未満であるときには、明らかな不正確及び低感度をもたらすことが明白である。蛍光フローサイトメトリー技術は、有核赤血球を血液の他の細胞成分から正確に分離することができるが、実際には、これらの手順の費用、及び多数の手動操作段階に対するその信頼性が、定常的な臨床用途への広範な適用を妨げている。

有核赤血球数は、通常、有核赤血球数と全白血球数の比、又は白血球１００個当たりの平均有核赤血球数から計算される。全血試料では、有核赤血球が存在するときには、有核赤血球数と干渉する耐低浸透圧性赤血球、血小板凝集塊、細胞片などの別の血液成分が存在することが多い。これらの干渉物質は、全血球計算値（ＣＢＣ）に対する有核赤血球数及び白血球数の性能又は品質を求める方法の重要な因子、又は制約であることが多い。

幾つかの自動血液システムは、全血球計算値の一構成部分として有核赤血球推定値を与える。多数の自動血液システムは、幾つかの自動蛍光フローサイトメトリー技術を実行することに加えて全血球計算用に特別に設計されたフローサイトメーターを備える。このシステムは、白血球分類と有核赤血球分析を同時に実行することができる。しかし、新生児からの一部の試料、鎌状赤血球、並びに地中海貧血症赤血球及び有核赤血球は、有核赤血球分析中に使用される溶解試薬に対して耐性がある。これらの試料は、不正確な有核赤血球数、不正確な白血球数、又は不正確な有核赤血球数と不正確な白血球数の両方を与えることが多い。この問題を解決するために、耐低浸透圧性赤血球及び有核赤血球の大部分を溶解するための温置時間を延長する余分な段階が必要になる。しかし、溶解プロセス中に、小さい又は脆弱なリンパ球の一部が溶解し得、したがって有核赤血球として誤分類され得る。また、一部の自動蛍光フローサイトメトリー技術を実行するための蛍光色素及び特別な試薬は高価である。

有核赤血球は白血球数と干渉するので、有核赤血球の計数は重要である。使用者は白血球を数える別の方法を持たないので、白血球計算との干渉は重大な問題である。機器が白血球を無効にするときには、使用者は白血球数を測定する別の機器を使用する必要がある。自動血液分析装置が出現する前は、スライド上の格子を見ることによって実施される手動計数が、白血球数を測定する唯一の方法であった。

特に、有核赤血球を含むことの多い耐低浸透圧性赤血球を含む試料に対して、有核赤血球を測定する費用効果の高い、簡単で信頼できる方法の開発が望まれている。

発明の要旨
本発明の方法は、特別な溶解試薬と、有核赤血球濃度と白血球濃度の両方を測定する光散乱多角度偏光解消（ｍｕｌｔｉ−ａｎｇｌｅ ｄｅｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ）フローサイトメーターとの組合せを使用することができる。本方法は、有核赤血球集団を白血球集団から分離すること、及び例えば、血小板凝集塊、脂質、粒子の形の溶解した赤血球などの他の干渉粒子を同定することを含む。

一態様においては、本発明は、ヘモグロビンの測定に用いた試料の同じ一定分量から有核赤血球及び白血球を計数する方法を提供する。本発明は、溶解試薬と光散乱多角度偏光解消フローサイトメーターの組合せを使用する。本発明の方法は、
（ａ）溶解された全血試料を用意する段階、
（ｂ）溶解試料を光散乱多角度偏光解消フローサイトメーターに導入する段階、
（ｃ）偏光解消干渉（ｄｅｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）、例えば、脂肪滴及び他の測定される粒子を除去する段階、
（ｄ）偏光解消干渉の非存在下で、有核赤血球及びノイズを白血球から識別する段階、
（ｅ）偏光解消干渉及び白血球の非存在下で、有核赤血球をノイズから識別する段階、及び
（ｆ）存在し得る血小板凝集塊を識別する段階
を含む。

本発明の方法に使用するのに適切な光散乱多角度偏光解消フローサイトメーターは、干渉を除去するために０°、１０°、９０°、９０°偏光解消の各検出器を必要とする。溶解試薬は、好ましくは、耐低浸透圧性赤血球を溶解する一方で核が完全な状態で残ることができる、シアン化物を含まない３部構成の識別用溶解試薬である。

本発明の方法は、臨床血液試料中の耐低浸透圧性赤血球、脆弱な白血球、血小板凝集塊、脂質、網状赤血球、及び細胞片からの干渉を低下させる。また、本発明の方法は、多数の干渉物質を含む傾向にある骨髄試料及びさい帯血試料の分析に使用することができる。本発明は、同じ血液試料中の正確な全白血球及び有核赤血球計算、並びに血小板凝集塊の検出及び計数を、血液試料の単一希釈物中の同じ溶解試薬を用いて実行することができる。また、全有核細胞の計数は、多数の核（白血球又は有核赤血球）が存在するときに、ヘモグロビン測定の吸光度干渉に対するより正確な補正を可能にする。本発明の方法は、有核赤血球及び白血球の計数のための簡単で費用効果の高い、信頼できる全自動血液方法を提供する。

従来技術の他の方法は、例えば、耐低浸透圧性赤血球、血小板凝集塊、脂質などの干渉物質が臨床血液試料中に存在すると、正確な全白血球及び有核赤血球計算を実施することができない。

偏光解消干渉の除去のための１０°／０°散乱を示す散布図である。 偏光解消干渉の除去のための０°／９０°偏光解消散乱を示す散布図である。 図１Ａ及び１Ｂの結果を要約した０°、９０°偏光解消ヒストグラムである。 偏光解消干渉の非存在下で白血球と有核赤血球＋ノイズ（粒子の形の溶解した赤血球、細胞片、及び血小板凝集塊）とを識別する１０°／０°散乱を示す散布図である。 偏光解消干渉の非存在下で白血球と有核赤血球＋ノイズ（粒子の形の溶解した赤血球、細胞片、及び血小板凝集塊）とを識別する１０°／９０°偏光解消散乱を示す散布図である。 図２Ａ及び２Ｂの結果を要約した０°ヒストグラムである。 偏光解消干渉及び白血球の非存在下で有核赤血球とノイズ（粒子の形の溶解した赤血球、細胞片、及び血小板凝集塊）を識別する１０°／０°散乱を示す散布図である。 偏光解消干渉及び白血球の非存在下で有核赤血球とノイズ（粒子の形の溶解した赤血球、細胞片、及び血小板凝集塊）を識別する１０°／９０°偏光解消散乱を示す散布図である。 図３Ａ及び３Ｂの結果を要約した１０°ヒストグラムである。 存在し得る血小板凝集塊と白血球を識別するための０°／９０°散乱を示す散布図である。 存在し得る血小板凝集塊と白血球を識別するための１０°／９０°散乱を示す散布図である。 図４Ａ及び４Ｂの結果を要約した９０°ヒストグラムである。 リストセチンなしで血小板凝集塊を測定するための１０°／０°散乱を示す散布図である。 リストセチンなしで血小板凝集塊を測定するための０°／９０°散乱を示す散布図である。 リストセチンなしで血小板凝集塊を測定するための１０°／９０°を示す散布図である。 リストセチンを用いて血小板凝集塊を測定するための１０°／０°散乱を示す散布図である。 リストセチンを用いて血小板凝集塊を測定するための０°／９０°散乱を示す散布図である。 リストセチンを用いて血小板凝集塊を測定するための１０°／９０°を示す散布図である。 図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃの結果を要約した９０°ヒストグラムである。血小板凝集塊の存在は、明白ではない。 図５Ｄ、５Ｅ及び５Ｆの結果を要約した９０°ヒストグラムである。血小板凝集塊の存在は、明白である。 本明細書に記載の方法の正確度をＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００血液分析装置の有核赤血球計算と比較したグラフである。 低い異常値、すなわち、図７の右端の異常値を示す１０°／０°散布図である。 図８Ａの結果を要約した０°ヒストグラムである。 偽陽性又は偽陰性、すなわち、図７の左端の結果を示す１０°／０°散布図である。 図９Ａの結果を要約した０°ヒストグラムである。 ある範囲の異常な例、すなわち、１／１００から１６２／１００の有核赤血球／白血球を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 ある範囲の異常な例、すなわち、１／１００から１６２／１００の有核赤血球／白血球を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 ある範囲の異常な例、すなわち、１／１００から１６２／１００の有核赤血球／白血球を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 ある範囲の異常な例、すなわち、１／１００から１６２／１００の有核赤血球／白血球を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 ある範囲の異常な例、すなわち、１／１００から１６２／１００の有核赤血球／白血球を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 ある範囲の異常な例、すなわち、１／１００から１６２／１００の有核赤血球／白血球を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 ある範囲の異常な例、すなわち、１／１００から１６２／１００の有核赤血球／白血球を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 鎌状赤血球干渉のために一般に見落とされる異常例を示す散布図である。 ３つの正常な例を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 ３つの正常な例を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 ３つの正常な例を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 有核赤血球／白血球が１／１００未満の例を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 有核赤血球／白血球が１／１００未満の例を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。 有核赤血球／白血球が１／１００未満の例を示す１０°／０°散布図である。枠は、アルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。

発明の詳細な説明
本明細書では「形態学的評価」という表現は、細胞の形状の評価を意味する。「白血球細胞」という用語は、白血球を意味する。赤血球とは異なり、白血球は多数の異なるタイプで存在する。白血球細胞の例としては、顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球及び単球が挙げられる。「参照方法」という表現は、試験方法を比較する対象である従来技術の方法を意味する。「鎌状赤血球」という用語は、鎌のような形状の赤血球を意味する。鎌状赤血球は、典型的には、溶解試薬に対して耐性がある。「地中海貧血症」という用語は、骨髄が十分な赤血球を形成できず、赤血球寿命も短縮する、遺伝性血液疾患に関係する。「リンパ球」という用語は、リンパ節、ひ臓及び他のリンパ組織中で成熟し、血液に入り、全身を循環する白血球を意味する。「有核赤血球」という表現は、依然として核を含む未成熟赤血球を意味する。本明細書では「ノイズ」という用語は、粒子の形の溶解した赤血球、細胞片、血小板凝集塊などの物質を含むが、これらだけに限定されない。

本明細書では「事象」という用語は、事象の粒子が、０°検出器を作動させるのに十分なサイズであり、それによって検出器が分析装置に信号を送って、該粒子の０°、１０°、９０°及び９０°偏光解消の各測定値を収集することを意味する。粒子としては、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、血小板（ＰＬＴ）、ＲＢＣ断片、ＷＢＣ断片、脂質、血小板（ＰＬＴ）凝集塊が挙げられるが、これらだけに限定されない。

本明細書では「溶解試薬」という表現は、参照により本明細書に組み入れる米国特許第５，９５８，７８１号に記載のタイプの溶解試薬を意味する。本明細書では「希釈剤」という用語は、参照により本明細書に組み入れる米国特許第５，２２７，３０４号に記載のタイプの希釈剤を意味する。

本発明の方法は、多方向検出システム、多角度偏光解消フローサイトメーターを備えた、レーザー光源を有する自動血液分析装置、例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第５，５１０，２６７号に記載のタイプの血球計算器などを用いて実施することができる。本発明の方法に使用するのに適切な市販自動血液分析装置の代表例は、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬから市販されている、赤色レーザー光源を使用するＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）３０００シリーズ分析装置である。０°及び１０°における光散乱の検出は、全白血球及び有核赤血球数の検出及び測定に好ましい。フローサイトメーターによって分析する前に、分析する血液試料を識別用溶解試薬にさらす。本発明の方法に使用するのに適切な市販識別用溶解試薬の代表例は、先に参照により本明細書に組み入れた米国特許第５，９５８，７８１号に記載されている。

本発明に使用するのに適切な自動血液分析装置の略図は、先に参照により本明細書に組み入れた米国特許第５，５１０，２６７号に記載されている。米国特許第５，５１０，２６７号は、インピーダンス細胞計算及び分粒（ｓｉｚｉｎｇ）の原理も詳述している。米国特許第５，５１０，２６７号は、さらに、本発明の実施に使用することができる自動血液分析装置と一緒に使用するのに適切な光変換器も記載している。

溶解試薬のタイプ及びその濃度は、本発明の方法に重要である。本発明の方法は、溶解された試料を使用する必要がある。一実施形態においては、試料は、溶解試薬（例えば、米国特許第５，９５８，７８１号に記載の溶解試薬など）を、希釈剤（例えば、米国特許第５，２２７，３０４号に記載の希釈剤）で希釈した試料と混合することによって溶解することができる。溶解試薬と希釈剤の比は、約１：３から約１：８の範囲である。溶解試薬は、全血試料を溶解して、溶解物を形成する。溶解物の一部は、（米国特許第５，９５８，７８１号に記載のように）ヘモグロビン測定のためにヘモグロビンフローセルに移され、次いで溶解物の残部、又は以前に使用した溶解物は、白血球及び有核赤血球を計算する自動分析装置に移される。本明細書では「約１：３から約１：８」の範囲は、約１部の溶解試薬と約３から８部の希釈剤を意味する。好ましい実施形態においては、溶解試薬は、ｐＨ約２．５から約６．０、重量オスモル濃度約１５０から約７００ｍＯｓｍ／ｋｇを有する、１種類以上の約１５から約１５０ｇ／Ｌの第４級アンモニウム塩（例えば、Ｂｒ又はＣｌ）及び約０．５から約５０ｇ／Ｌのヒドロキシルアミン塩（例えば、ＨＣｌ）、約０から約１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウムの水溶液を含む。

本発明の方法は、従来技術の方法とは異なり、全臨床血液試料中の有核赤血球及び白血球の計算と干渉する物質の計算を除外し、全臨床血液試料を用いて正確な初回通過（ｆｉｒｓｔ ｐａｓｓ）結果を与える。本発明の多次元アルゴリズムを用いて除外される干渉としては、以下が挙げられる。
（１）０°及び１０°検出器によって収集されるデータを用いて除外される、粒子の形の溶解した赤血球。
（２）９０°偏光解消及び０°検出器によって収集されるデータを用いて除外される、脂質。
（３）９０°検出器によって収集されるデータを用いて除外される、血小板凝集塊。

本発明の方法は、公知の信頼できる装置、例えば、市販又は現在開発中の自動血液分析装置と、公知の信頼できる試薬、例えば、白血球及びヘモグロビン測定用の極めて低コストの試薬とを用いて使用することができる。

特に、本発明の方法は、最新のフロースクリプト及びソフトウェアを備えた自動血液分析装置のＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）３０００シリーズを用いて使用することができる。また、本発明の方法は、光学及びソフトウェアの改善された自動血液分析装置のＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００／Ｓａｐｐｈｉｒｅシリーズを用いて使用することができる。

干渉を除去すると、
（１）初回の報告可能な白血球の増加（失効の減少）、
（２）血小板凝集塊の高感度計数、
（３）脂肪滴の高感度計数
が得られる。

当技術の他の方法では、耐低浸透圧性赤血球又は脆弱な白血球を含む血液試料は問題になりやすい。それらの方法は、白血球数及び有核赤血球数と同時に白血球分類を作成しようとする。本発明の方法は、有核赤血球と白血球を識別し、それによって耐低浸透圧性赤血球及び脆弱な白血球は問題とならない。血液分析装置と一緒に使用すると、本発明の方法は、使用する試薬がヘモグロビンの測定に既に使用されているので、追加の分析試薬が不要である。白血球数がより正確であると、白血球数に対するヘモグロビン測定の補正も改善することができる。

本発明の方法は、存在する耐低浸透圧性赤血球、血小板凝集塊、網状赤血球及び細胞片からの有意な干渉なしに、単一の血液試料及び同じ試薬を用いて、全白血球及び有核赤血球の正確な計算が可能である。本発明の方法は、全臨床血液試料中の脆弱なリンパ球及び他の白血球細胞の白血球数に有意な影響を及ぼさない。本発明の方法は、同じアッセイで血小板凝集塊も検出し、計算し、骨髄及びさい帯血試料を用いて有意な干渉なしに使用することができる。

以下の非限定的例によって、本発明の方法を説明する。以下の実施例においては、測定するパラメータを以下のように記述する。
（１）０°光散乱：レーザー光線に対して約１°から約３°で散乱する光。
（２）１０°光散乱：レーザー光線に対して約３°から約１０°で散乱する光。
（３）９０°光散乱：レーザー光線に直交して散乱する光。
（４）９０°偏光解消光散乱：白血球と相互作用することによってもはや垂直に偏光しない、レーザー光線に直交して散乱する光。

現行のＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）３０００シリーズ分析装置及びＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）Ｄｉｆｆ Ｓｃｒｅｅｎ試薬、希釈剤、及び溶解試薬をこの方法に使用する。希釈剤は、先に参照により本明細書に組み入れた米国特許第５，２２７，３０４号に記載され、溶解試薬は、先に参照により本明細書に組み入れた米国特許第５，９５８，７８１号に記載されている。方法は、溶解試薬を希釈剤で希釈された全血試料と混合する段階を含み、溶解試薬と希釈剤の比は、溶解試薬約１部と希釈剤約３部から約８部の範囲である。溶解試薬は、全血試料を溶解して、溶解物を形成する。次いで、溶解物を白血球及び有核赤血球計算用分析装置に移す。実際の操作中、次いで、希釈剤９００μＬで希釈した溶解試薬２００μＬを混合室内で血液／試料１０μＬと即時に混合する。気泡混合後、溶解物を分析装置で自動的に分析する。

図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃを参照すると、偏光解消干渉を除去するための９０°偏光解消光散乱対０°光散乱を示した散布図に関して、図１Ｂ中の対角線よりも上の事象と対角線よりも下の事象が識別できる程度に分離しているので、偏光解消干渉が除去されていることがわかる。９０°偏光解消光散乱対０°光散乱を示した散布図の各々で、想像線を点ｘ＝０、ｙ＝０から各事象に引く。想像線とｘ軸の角度を各事象について求める。０°、９０°偏光解消ヒストグラムのｘ軸を、偏光解消事象（例えば、脂質事象）と非偏光解消事象（例えば、白血球事象、有核赤血球事象、血小板凝集塊事象、及び他の非偏光解消物質事象）の間で分割する。

図１Ｃの偏光解消干渉を除去する０°、９０°偏光解消ヒストグラムは、垂直線の左側の高頻度の事象と、垂直線の右側の測定可能な頻度の事象を示す。図１Ｃにおける垂直線の右側の事象は、脂質事象の頻度であり、図１Ｃにおける垂直線の左側の事象は、試料における残りの事象（例えば、白血球事象、有核赤血球事象、血小板凝集塊事象、及び他の非偏光解消物質事象）の頻度である。

図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃを参照すると、白血球と有核赤血球事象＋ノイズの組合せとの識別に関して、０°光散乱対１０°光散乱を示す図２Ａの散布図の下部、水平線の下に高頻度の有核赤血球事象＋ノイズが存在し、０°光散乱対１０°光散乱を示す図２Ａの散布図の上部、水平線よりも上に高頻度の白血球事象が存在することがわかる。９０°偏光解消光散乱対０°光散乱を示す図２Ｂの散布図の左側、垂直線の左に高頻度の有核赤血球事象＋ノイズが存在し、９０°偏光解消光散乱対０°光散乱を示す図２Ｂの散布図の右側、垂直線の右に高頻度の白血球事象が存在することもわかる。図２Ｃの０°ヒストグラムは、図２Ｃの垂直線の右側の高頻度の事象、及び垂直線の左側の測定可能な頻度の事象を示す。図２Ｃにおける垂直線の右側の事象は白血球事象の頻度であり、図２Ｃにおける垂直線の左側の事象は有核赤血球事象＋ノイズの頻度である。

図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃを参照すると、ノイズと有核赤血球の識別に関して、０°光散乱対１０°光散乱を示す図３Ａの散布図の右側、垂直線の右に高頻度の有核赤血球事象が存在し、０°光散乱対１０°光散乱を示す図３Ａの散布図の左側、垂直線の左に高頻度のノイズが存在することがわかる。図３Ｂにおいて、９０°偏光解消光散乱対１０°光散乱を示す散布図の下部に高頻度の有核赤血球事象が存在することがわかる。図３Ｃの１０°ヒストグラムは、垂直線の左側の測定可能な頻度の事象、及び垂直線の右側の高頻度の事象を示す。図３Ｃにおける垂直線の右側の事象は有核赤血球事象の頻度であり、図３Ｃにおける垂直線の左側の事象はノイズの頻度である。

図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃを参照すると、白血球と血小板凝集塊の識別に関して、９０°光散乱対０°光散乱を示す図４Ａの散布図の上部、水平線よりも上に高頻度の白血球事象が存在し、９０°光散乱対０°光散乱を示す図４Ａの散布図の下部、水平線の下に低頻度の可能な血小板凝集塊事象が存在することがわかる。９０°光散乱対１０°光散乱を示す図４Ｂの散布図の上部、水平線よりも上に高頻度の白血球事象が存在し、９０°光散乱対１０°光散乱を示す図４Ｂの散布図の下部、水平線の下に低頻度の可能な血小板凝集塊事象が存在することもわかる。図４Ｃの９０°ヒストグラムは、垂直線の左側の測定不能な頻度の事象、及び垂直線の右側の高頻度の事象を示す。図４Ｃにおける垂直線の右側の事象は白血球事象の頻度であり、図４Ｃにおける垂直線の左側の事象は血小板凝集塊事象の可能性を表す。

上記実施例、実施例１から５（実施例１と５を含む。）から、本発明の方法は、既存の光学装置及び既存の試薬を異なる様式で利用して、有核赤血球の計数及び白血球の計数を改善することがわかる。既存のＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）装置は、有核赤血球のサイズを有する粒子に焦点を合わせるように設定することができる。溶解試薬は、赤血球を溶解するように最適化され、有核赤血球と白血球の識別性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を保持し、それによって有核赤血球を数え、白血球を数える既存の方法の感度を改善する。

この実施例は、血小板凝集塊と白血球の識別を説明する。リストセチンは、血小板を集め（凝集させ）、それによって血小板の検出を促進するのに使用することができる試薬である。図５Ａは０°光散乱対１０°光散乱であり、図５Ｂは９０°光散乱対０°光散乱であり、図５Ｃは９０°光散乱対１０°光散乱である。リストセチンを使用しなかった図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃにおいて、図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃの水平線よりも上の部分は白血球事象を示す。図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃにおける水平線よりも下の部分は、可能な血小板凝集塊事象を示す。図５Ｄは０°光散乱対１０°光散乱であり、図５Ｅは９０°光散乱対０°光散乱であり、図５Ｆは９０°光散乱対１０°光散乱である。リストセチンを使用した図５Ｅ及び５Ｆにおいて、水平線よりも上の部分は白血球事象を示す。水平線よりも下の部分は、可能な血小板凝集塊事象を示す。リストセチンを使用すると、血小板凝集塊を検出できることがわかる。

図６Ａの９０°ヒストグラムは、図５Ｂ及び５Ｃの結果を要約したものである。図６Ｂの９０°ヒストグラムは、図５Ｅ及び５Ｆの結果を要約したものである。図６Ａにおいて、垂直線の左側の測定不能な頻度の事象、及び垂直線の右側の高頻度の事象が存在することがわかる。図６Ａにおける垂直線の右側の事象は白血球事象の頻度であり、図６Ａにおける垂直線の左側の事象は血小板凝集塊事象の可能性を表す。図６Ｂにおいて、垂直線の左側の測定可能な頻度、すなわち、適度に高頻度の事象、及び垂直線の右側の高頻度の事象が存在することがわかる。図６Ｂにおける垂直線の右側の事象は白血球事象の頻度であり、図６Ｂにおける垂直線の左側の事象は血小板凝集塊事象の可能性を表す。

９０°検出器を使用して、細胞外と細胞内の溶液の屈折率の不整合を測定する。血小板凝集塊は、１つの屈折率しか示さないので（細胞構造がない。）、９０°測定値は白血球集団よりも低い。

図７は、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００装置に対する、本明細書に記載の方法の正確度を示すグラフである。本明細書に記載の方法は、有核赤血球の割合に関して、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００装置の結果に極めて類似していることがわかる。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００装置は極めて有効な装置であるが、この装置の維持費は高く、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００装置は複雑である。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００装置は、高価な色素、高価で複雑な溶解試薬、及び高価な光源を使用する。これらの高価な部品は、白血球分類、白血球数及び有核赤血球数を同時に決定するのに重要である。本明細書に記載の方法は、白血球分類を提供しようとするものではない。本明細書に記載の方法は、種々の干渉源、すなわち、耐低浸透圧性赤血球、脂質及び血小板凝集塊を除去することが可能であるので、より報告可能な白血球結果及び有核赤血球結果を提供する。同時に、脆弱な白血球を含む試料を正確に計算する。本発明の方法は、異常値の例からわかるように、白血球１００個当たり有核赤血球１０個未満の濃度で有核赤血球を同定する。本明細書に記載の方法は、方法に使用することができる光源及び試薬がより安価であるので、より安価に実行及び実施される。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００装置は、現在、比較的高価な青色アルゴンレーザーを使用する。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００装置の試薬は、２種類の溶解成分、及びヨウ化プロピジウム色素を含むので、極めて複雑であり、製造費がかかり、その結果、より多大な費用を使用者にかける。

図７に示した偏り（ｂｉａｓ）のプロットにおいて、縦軸は、本明細書に記載のアルゴリズムによって求められる有核赤血球とＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００装置によって求められる有核赤血球との差である。データは、白血球１００個当たりの有核赤血球数である。日付（ｄａｔｅ）は、２つ組で試験した１０６個の検体、２６個の院内検体、８０個の異常検体を含み、３４個の陽性有核赤血球数及び６個の脆弱なリンパ球数を含む。プロットから、低い異常値が存在することがわかる。プロットから、多数の偽陽性試験結果が存在することもわかる。異常値及び偽陽性試験結果については、実施例８及び９で考察する。

この実施例では、図７で示された低い異常値を考察する。図８Ａは０°散乱対１０°散乱を示す散布図であり、矩形枠で囲まれた部分は、有意数の有核赤血球事象を含む。図８Ａの矩形枠よりも上の部分は白血球事象を含む。図８Ｂにおいて、垂直線の左側の測定可能な頻度、すなわち、適度に高頻度の事象、及び垂直線の右側の高頻度の事象が存在することがわかる。図８Ｂにおける垂直線の右側の事象は白血球事象の頻度であり、図８Ｂにおける垂直線の左側の事象は有核赤血球事象の可能性を表す。

この実施例では、図７で示された偽陽性異常値を考察する。１個の試料をこの実施例では考察する。図９Ａの０°散乱対１０°散乱を示す散布図において、矩形枠で囲まれた部分は、有意数の有核赤血球事象を含む。図９Ａの矩形枠よりも上の部分は、有意数の白血球事象を含む。図９Ｂにおいて、垂直線の左側の測定可能な頻度、すなわち、適度に高頻度の事象、及び垂直線の右側の高頻度の事象が存在することがわかる。図９Ｂにおける垂直線の右側の事象は白血球事象の頻度であり、図９Ｂにおける垂直線の左側の事象は有核赤血球事象の頻度を表す。図９Ａ及び９Ｂによれば、これらの試料は有核赤血球を実際に含む。

この実施例は、有核赤血球が存在するある範囲の異常な例を説明する一連の散布図を示す。散布図は０°散乱対１０°散乱を示す。図１０Ａから１０Ｇ（図１０Ａと１０Ｇを含む。）において、血液試料は、白血球１００個当たり有核赤血球約１から約１６２個の範囲である。

この実施例は、鎌状赤血球干渉のために一般に見落とされる異常例を説明する散布図を示す。散布図は０°散乱対１０°散乱を示す。この実施例によれば、本発明の方法は、干渉細胞の存在下で有核赤血球を検出することができる。

この実施例は、有核赤血球の真陰性の、ある範囲の正常な例を説明する一連の散布図を示す。散布図は０°散乱対１０°散乱を示す。図１２Ａ、１２Ｂ及び１２Ｃの矩形枠は、本明細書に記載のアルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。

この実施例は、脆弱な白血球の、ある範囲の試料を説明する一連の散布図を示す。脆弱な白血球事象は、同じ散乱空間を占める有核赤血球事象に類似しているので、脆弱な白血球は、現行技術にとって難題である。散布図は０°散乱対１０°散乱を示す。図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃの矩形枠は、本明細書に記載のアルゴリズムが有核赤血球を探索した場所を示す。各血液試料において、矩形枠で囲まれた事象は、白血球１００個当たり１個未満の有核赤血球が存在することを示す。

本発明の種々の改変及び変更が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者に明らかになるはずであり、本発明は、本明細書に記載した説明のための実施形態に過度に限定されないことを理解すべきである。

Claims (5)

1. （ａ）溶解された全血試料を用意する段階、
   （ｂ）溶解試料を多重散乱偏光解消フローサイトメーターにかける段階、
   （ｃ）フローサイトメーターの９０°偏光解消散乱及び０°散乱検出器によって収集されたデータを用いて偏光解消干渉を除去する段階、
   （ｄ）偏光解消干渉の非存在下で、有核赤血球及びノイズを白血球から識別する段階、
   （ｅ）偏光解消干渉及び白血球の非存在下で、有核赤血球をノイズから識別する段階、及び
   （ｆ）存在し得る血小板凝集塊を白血球から識別する段階、並びに
   （ｇ）溶解された全血試料中の有核赤血球数及び全白血球数を計算する段階
   を含む、白血球分類分析を要求することなく、同じ血液試料からの有核赤血球及び全白血球の計数のための方法。
2. ノイズが、０°散乱及び１０°散乱検出器によって収集されたデータを用いて除去される、請求項１に記載の方法。
3. 偏光解消干渉が、脂質からの干渉を含む、請求項１に記載の方法。
4. 血小板凝集塊が、９０°散乱検出器によって収集されたデータを用いて除去される、請求項１に記載の方法。
5. 溶解された全血試料が、希釈剤及び溶解試薬によって溶解されており、溶解試薬と希釈剤の比が１：３から１：８の範囲である、請求項１に記載の方法。

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