JP5252366B2 - 乳酸脱水素酵素（ｌｄｈ）の機能賦活・回復方法 - Google Patents

Description

本発明は、不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法に関するものであり、更に詳しくは、高次構造が未形成なために不活性な乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、あるいはある種の原因で立体構造が変化し、失活した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をβ型ゼオライト（ゼオライトベータと記載することがある。）及びアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングさせ、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）固有の本来機能を賦活・再生させることを可能とする不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法、及び該方法を利用した活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の製造方法に関するものである。

生体内で実際的に作用し、働くのは遺伝子ではなく、それらから作られるタンパク質である。したがって、タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。

タンパク質の合成は、一般には、大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の発現系を用いて行われる。昆虫細胞や哺乳動物細胞による合成では、得られるタンパク質は、高次構造が制御され、秩序だった立体構造を取り、可溶性である場合が多い。しかし、これらの方法は、分離精製の操作が非常に煩雑であり、目的のタンパク質を得るまでに時間がかかり、コスト高となるばかりか、得られるタンパク質の量も極めて少ないという欠点がある。

これに対して、大腸菌によるタンパク質合成は、操作が簡単で、目的タンパク質を得るのにさして時間を要せず、コストもさほどかからない。このため、現在は、目的タンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込ませた大腸菌を用いる方法が、タンパク質合成の主流となっており、生産プロセスも確立されつつある。

ところが、ヒトなど高等生物のタンパク質を大腸菌発現系で合成した場合、アミノ酸の結合順序や数、すなわちアミノ酸鎖長に関しては、設計どおりのタンパク質が得られるものの、その立体構造には秩序がなく、高次構造が制御されていないタンパク質、すなわちアミノ酸鎖が縺れ絡まった、いわゆるインクルージョンボディと呼ばれる不溶性タンパク質が得られる。

当然のことながら、この不溶性タンパク質のインクルージョンボディは、欲する機能・性能を持たず、活性を示さない。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわちインクルージョンボディのリフォールディング（巻き戻し）が必要である。この種のリフォールディングは、大腸菌による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。

従来から、このリフォールディングは盛んに研究され、種々の方法が提案されている。しかし、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多い。現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。

最も古くから良く用いられているリフォールディング操作は、透析や希釈である。前者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かし、これを、界面活性剤や変性剤を含まない緩衝液で透析することで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げて、タンパク質をリフォールディングするもの（典型例：Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製ＦｏｌｄＩｔキット）である。

一方、後者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かした後に、これを、単に希釈して行くことで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げ、リフォールディングさせるものである。これらが一般であるが、その他にも、界面活性剤のＳｏｄｉｕｍ Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ溶液にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を溶かし、それを１〜２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈し、巻き戻す方法（非特許文献１参照）等、希釈剤を用いてリフォールディングさせる方法もある。

透析と希釈の両方に対し、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から、使い捨てキットが市販されており、これらの操作法では、Ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｋａｉｎａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｂ等の、極限られたタンパク質でリフォールディングが起こることが認められているに過ぎず（非特許文献２参照）、この方法は、試行錯誤法の域にとどまっていると言っても過言ではない。したがって、たまたま上手くいった方法の場合でも、他のタンパク質に適用するとほとんどうまくいかないのが通例である。

リフォールディングに、吸着分離カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジンで変性させたタンパク質、チオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にその巻き戻りが起こる（非特許文献３参照）。しかし、この方法では、リフォールディングは、必ずしも十分ではなく、他のタンパク質では、満足できる結果が得られないのが通常である。

構造が壊れたタンパク質の巻き戻しを促進するタンパク質の一種である分子シャペロンＧｒｏＥＬを固定したカラムに、８Ｍの尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと尿素をそれぞれ２Ｍ含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献４参照）。しかし、これらは、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ａ等、極めて限られたタンパク質で認められているに過ぎない。特に、分子シャペロンを用いる場合は、それが、ある種の鋳型であるために、その鋳型の形に適合しないものではまったく役に立たないというのが実情である。

また、リフォ−ルディング促進に関与すると考えられるタンパク質３種、ＧｒｏＥＬ 、ＤｓｂＡ（大腸菌のｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｏｘｉｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及びＰＰＩ （ｈｕｍａｎ ｐｒｏｌｉｎｅ ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を同時に固定した樹脂に、塩酸グアニジンで変性したタンパク質Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎ Ｃｎ５を混ぜると、このタンパク質の巻き戻りが樹脂上で起こることも報告されている（非特許文献５参照）。しかしながら、これについては、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎ Ｃｎ５等の特定タンパク質にしか適用できない欠点に加え、タンパク質３種を固定した樹脂の調製が煩雑で、コスト高となるという問題もある。

カラム上の固定物質として、巻き戻しタンパク質の代わりに金属キレートを用いる場合もある。ニッケルキレートを固定した樹脂に、塩酸グアニジンと尿素を含む水溶液で溶解変性したＨｉｓ６−タグ融合タンパク質を吸着させ、変性剤を含まない緩衝溶液で洗うと、該融合タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献６参照）。該方法の適用が、このタンパク質に限られることと、樹脂の調製が煩雑で、コスト高となることは、前記方法と同じである。

人工シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミロースを用い、このシャペロン溶液に界面活性剤で変性したタンパク質を混ぜると、界面活性剤の人工シャペロンによる取り込み除去が生じ、この過程で、タンパク質が巻き戻るとの報告もある（非特許文献７〜９参照）。しかし、この方法は、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｂなどで成功しているに過ぎない。しかも、この方法は、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。

一方、本発明者らは、これまで、ＺＳＭゼオライトやゼオライトベータ（例えば、非特許文献１０、１１、特許文献１、２参照）等のゼオライトへのバイオポリマーの吸着現象（非特許文献１２参照）について、研究を続けてきた過程で、ゼオライトベータを用いたタンパク質巻き戻し材料を開発することに成功した（特許文献３）。

遺伝子工学の発達により、学術的、産業的に有用と考えられるタンパク質を大腸菌体内で大量に生産することは非常に容易になった。しかしながら、大腸菌内で大量発現した組換えタンパク質は本来あるべき立体構造を維持できず、生化学的な活性を失い、封入体と呼ばれる不溶性の構造体に移行してしまうことが多い。封入体となってしまったタンパク質の活性を回復するためには、塩酸グアニジンなどの変性剤を用いてタンパク質を一旦可溶化した後、適当な条件下で変性剤を除くことによって、正しい立体構造となるように巻き戻すリフォールディング操作が必要となる。

本発明者らは、これまで、ゼオライトベータを用いて、タンパク質のリフォールディングを効率よく行わせることに成功し、更に、ゼオライトを用いたタンパク質のリフォールディングにおける汎用性の検討の一環として、各種不活性タンパク質の機能賦活・回復化を種々試みてきた。しかし、リフォールディング技術は適用可能なタンパク質が特定のものに限られており、リフォールディング技術が有効か否かは適用対象のタンパク質との関係で好適な条件が設定し得るか否かにかかっている。ゼオライトベータによるリフォールディング技術を含めて、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）については、従来法では高効率のリフォールディング手法が確立されておらず、当技術分野では、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディングを可能とする新しいリフォールディング手法の開発が強く要請されていた。

特開平６−１２７９３７号公報 特開平８−３１９１１２号公報 ＷＯ２００５／００５４５９ Ａ１ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２１０（１９９３）１７９−１８７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．８（１９９９）：１４７５−１４８３ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６（１９８７）３１３５−３１４１ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９４（１９９７） ３５７６−３５７８ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．１７（１９９９）１８７−１９１ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗｓ（Ｊａｐａｎ Ｅｄ．）Ｖｏｌ．３（２００１）６−７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．１１７（１９９５）２３７３−２３７４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７１（１９９６）３４７８−３４８７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．Ｖｏｌ．４８６（２０００）１３１−１３５ Ｚｅｏｌｉｔｅｓ，Ｖｏｌ．１１（１９９１）８４２−８４５ Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，Ｖｏｌ．８（１９９６）５１７−５２０ Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，Ｖｏｌ．７（２００１）１５５５−１５６０

このような状況下にあって、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法として有用な新しいリフォールディング技術を開発することを目標として鋭意研究開発を積み重ねた結果、β型ゼオライト、及びアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いた新しい不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法及び該方法を用いた活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の製造方法を提供することを目的とするものである。

上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能を賦活・回復する方法であって、
１）変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に、β型ゼオライト、及びアルギニンを含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディングを行い可溶化した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のβ型ゼオライトへの吸着と該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能の賦活・回復をさせる、
２）その際に、上記β型ゼオライトとして、ＮＨ _４ ^＋ 若しくはＮａ ^＋ フォームにしたゼオライトを使用し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と０．３Ｍ以上で１Ｍ未満の濃度のアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングを行い遊離した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を回収してその機能を賦活・回復させる、ことを特徴とする乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
（２）０．１％以上で０．４％以下の濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の入ったリフォールディングバッファーを用いる、前記（１）に記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
（３）０．３Ｍから０．５Ｍの濃度のアルギニンを添加したリフォールディングバッファーを用いる、前記（１）に記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
（４）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が、不活性乃至低活性の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）である、前記（１）から（３）のいずれかに記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
（５）前記（１）から（４）のいずれかに記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に適用して機能を賦活・回復させた活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を回収することを特徴とする活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の製造方法。

本発明は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能を賦活・回復する方法であって、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に、β型ゼオライト、及びアルギニンを含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディングを行い乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能を賦活・回復させることを特徴とするものである。本発明では、β型ゼオライトが、ＮＨ_４ ^＋若しくはＮａ^＋フォームにしたゼオライトであること、を好ましい実施の態様としている。

また、本発明では、所定濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の入ったリフォールディングバッファーを用いること、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングを行い乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能を賦活・回復させること、を好ましい実施の態様としている。更に、本発明は、上記の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に適用して機能を賦活・回復させた活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を回収することからなる活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の製造方法の点に特徴を有するものである。

本発明では、機能賦活の対象として、例えば、不活性乃至低活性の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、あるいは熱履歴等のある種の原因で失活した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が用いられる。本発明では、これらの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をゼオライトベータ（β型ゼオライト）で処理して該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の立体構造をリフォールディングすることにより、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）固有の本来機能の賦活・回復を行う。

賦活操作は、通常、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を、変性剤や界面活性剤等を含む溶液に先ず分散溶解し、その後、ゼオライトベータを含む溶液との混合や、ゼオライトベータ充填カラムへの注入により、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をゼオライトベータに吸着させ、次いで、ゼオライトベータから該タンパク質を脱着させる手順で行われる。

本発明で機能賦活剤として用いられるゼオライトベータとしては、未焼成ゼオライトベータ、及び、例えば、合成ゼオライトベータを３００〜５００℃で３〜１０ｈ焼成した焼成ゼオライトベータが例示されるが、これらに制限されるものではなく、これらと同等のものであれば同様に使用することができる。

ゼオライトベータに吸着前の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の分散溶媒としては、好適には、例えば、水が用いられる。しかし、必ずしもこれに限定されるものではなく、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）と反応を起こさないもの、及び該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の立体構造を不本意な形に変えるものでなければ、基本的には問題はなく、このような場合は、それらの溶媒単独あるいは水と混合して用いることが可能である。この種の溶媒の典型例として、一価及び多価のアルコールを挙げることができる。

該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の吸脱着は、一般には、縺れ絡んだタンパク質鎖長を解きほぐし易くし、また、巻き戻り易くするために、変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子等の存在下、で行われる。

この種の変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子の典型例として、例えば、塩酸グアニジン、トリスアミノメタン塩酸塩、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、ポリ燐酸、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−５００やＦｉｃｏｌ１４００等を挙げることができる。

また、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の脱着には、一般には、置換吸着が用いられるが、基本的には、該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の脱着後の機能賦活を阻まない操作であれば、いかなる操作も適用可能であり、特に限定されるものではない。したがって、ｐＨ変化、温度変化等も用いることができる上に、これらと置換吸着を併用することもできる。置換吸着で該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の脱着を促す物質には、一般的には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤やハロゲン化アルカリ等の塩が用いられるが、これらに限定されるものではなく、カラムクロマトグラフィーでの溶離に用いられるもの等、種々のものが使用可能である。

以上述べてきた、不活性タンパク質の活性賦活機能・変性タンパク質の巻き戻し能を発揮するリフォールディング剤を構成するＢＥＡ構造のゼオライト、いわゆるゼオライトベータとしては、典型例として、例えば、通常の市販ゼオライトベータ（例えば、商品名ＨＳＺ−９３０ＮＨＡ、東ソー社製）、文献等に従い自前で合成・調製したゼオライトベータ（Ｚｅｏｌｉｔｅｓ，Ｖｏｌ．１１（１９９１）２０２．参照）、それらを、焼成して得られるゼオライトベータが挙げられる。

該ゼオライトの有する空間中に、アンモニウムや種々の脂肪族及び／又は芳香族アンモニウム等のアンモニウム類があるゼオライトベータ、該ゼオライトを形成する骨格ケイ素の一部が他の金属に変わった骨格置換ゼオライトベータ、前記アンモニウム含有骨格置換ゼオライトベータ等が挙げられるが、ゼオライトベータの骨格構造を持つものであれば、基本的には、全て該機能・能力を有しており、該ゼオライトベータは、ここに挙げたものに必ずしも限定されるものではない。

該ゼオライトベータの骨格を形成する元素は、一般にはケイ素と酸素、あるいはケイ素とアルミニウムと酸素であるが、ケイ素やアルミニウムの一部が他の元素に置換したゼオライトベータ、及びその細孔中に前記アンモニウム類を含む置換ゼオライトベータも、不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性賦活機能を行うリフォ−ルディング剤となり得る。

該ゼオライトベータの骨格ケイ素と置換可能なものの典型としては、例えば、アルミニウム、ホウ素、燐、ガリウム、錫、チタン、鉄、コバルト、銅、ニッケル、亜鉛、クロム、バナジウム等を挙げることができるが、これらに留まるものではなく、基本的にゼオライトベータの構造を破壊しないものであればいずれでも良い。また、その置換量に関しても、ゼオライトベータの構造を破壊しない量であれば、置換量はいかなる量でもかまわず、該置換ゼオライトベータは、不活性並びに変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディング剤となり得ることは同様である。

本発明では、リフォールディング剤は、ＢＥＡ構造のゼオライト、いわゆるゼオライトベータ単味、又はゼオライトベータとそれを支持する基材（支持体）とから構成することができる。前者は、支持体無しで、後者は、支持体付きである。一般的に言って、ゼオライトという物質は、自己焼結性が乏しいため、単味単独では成形しにくいことが多いので、リフォールディング剤の作製、すなわち形態・形状の設計・制御に関しては、前者に比べ後者が、予め形が整えられた支持体上にゼオライトベータを固定・被覆すること等が可能なため、自由度が高く、有利である。

該ゼオライトベータの形態・形状につては、例えば、チップ状、膜状、ペレット状、ビーズ状等、該ゼオライトベータの利用方法・使用形態に応じて、適宜選定される。特に、支持体付き該ゼオライトベータでは、ゼオライトベータの固定・被覆を種々の形状、例えば、板、球、円筒、チューブ、カラム、溝、Ｕ字路等の支持体上に、前記方法等で行うことができるので、該ゼオライトベータの形状を如何様にも所望の形にすることができるという利点がある。この場合の支持体については、ガラス、石英、アルミナ、シリカ、コージェライトやムライト等の種々のセラミックス、濾紙等のセルロース、テフロン（登録商標）、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート（ペット）等、種々の有機ポリマーを挙げることができる。

塩酸グアニジンによって可溶化したＬＤＨとβ型ゼオライトを混合し、吸着等温線を測定したところ、β型ゼオライト１ｇ当たり、最大で２００ｍｇ程度のＬＤＨが吸着した。ＬＤＨ溶液のｐＨと塩濃度の影響を検討したところ、タンパク質溶液に高濃度のＮａＣｌ含まれていると、ＬＤＨの等電点より高いｐＨ域において、わずかに吸着量が低下する。しかし、ＮａＣｌによる影響は限定的であり、基本的には、疎水的な相互作用によって吸着されていることが推定された。

ＬＤＨが吸着したβ型ゼオライトを、塩酸グアニジンを含まない緩衝液で洗浄しても、ＬＤＨは遊離せず、β型ゼオライトに保持される。また、ＰＥＧ２００００とアルギニンを含む緩衝液とβ型ゼオライトを混合したところ、遊離してくるＬＤＨ量は、０．１％以上のＰＥＧ２００００により最大に達し、同時に、０．３Ｍ以上のアルギニンが含まれることが必要であった。可溶性のＬＤＨを回収するためには、ＰＥＧ２００００によって、疎水性相互作用を弱め、アルギニンによって、ＬＤＨの再凝集を防止することが有効である。

可溶性のタンパク質として回収されたＬＤＨの円二色性スペクトルを測定したところ、２０９，２２２ｎｍ付近にトラフを持つスペクトルが得られるが、これは、タンパク質に特徴的な立体構造を反映したシグナルであり、ＬＤＨが、本来の立体構造を回復したものと推察される。

また、得られたＬＤＨの脱水素活性を測定したところ、十分な活性の回復がみられたが、これは、ＬＤＨがリフォールドして、生化学的に活性なタンパク質として得られたことを示す。これらは、タンパク質が吸着する担体として、β型ゼオライトを用いることによって、リフォールディングに必要な緩衝液の交換を、簡便かつ速やかに行うことが可能となることを示している。

乳酸菌ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の遺伝子を大腸菌用タンパク質発現ベクターを用いて、大腸菌に導入することによって、組換え体タンパク質として大腸菌体内で大量発現させると、標準的な培養条件下で大量発現させたＬＤＨは、そのほとんどが、生化学的に不活性な不溶性の封入体へと移行する。

可溶化したＬＤＨのゼオライトへの吸着を試みると、ベータ型ゼオライト１ｇ当たり、２００ｍｇ前後のＬＤＨが吸着されることが分かった。また、ＬＤＨとゼオライトの混合を開始後、一定時間ごとにβ型ゼオライトに吸着されたＬＤＨの量を測定したところ、ＬＤＨは、極めて速やかに（一時間以内）吸着されることが分かった。

次に、ＬＤＨが溶けている緩衝液のｐＨや、含まれている塩（塩化ナトリウム）が、ＬＤＨの吸着に影響を与えるかどうか検討したところ、緩衝液に多量の塩化ナトリウム（５００ｍＭ）が含まれる場合、高いｐＨ域において、ＬＤＨの吸着量がわずかに低下することが分かった。境目となるｐＨは、ＬＤＨの等電点（ｐＨ５．０−５．５）とほぼ一致していることから、β型ゼオライトへの吸着には、イオン交換的な相互作用も働いている可能性が考えられる。しかしながら、その影響は限定的であり、ＬＤＨの吸着において、主となる作用機構は、タンパク質とβ型ゼオライト間の疎水的な相互作用であるものと予想される。

ＬＤＨとβ型ゼオライトの間には、疎水的相互作用が働いていると考えられることから、相互作用を弱める効果のある化合物を含む緩衝液を用いることで、吸着されたＬＤＨをゼオライトから遊離させることができると考え、そのような化合物として、分子量２００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて検討したところ、ＰＥＧの濃度を上げるにしたがって遊離してくるＬＤＨの量は増え、およそ０．１％以上のＰＥＧにより最大量に達することが分かった。また、ＬＤＨが遊離するためには、最低０．３Ｍ以上のアルギニンが同時に存在することが必要であることが分かった。回収率だけを考慮する場合、アルギニンの濃度が高ければ高いほど、高い収率でＬＤＨが得られる。

次に、ゼオライトに吸着した可溶化ＬＤＨ（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｏｎ ｚｅｏｌｉｔｅ）、及びゼオライトに吸着した活性型ＬＤＨ（Ｎａｔｉｖｅ ｏｎ ｚｅｏｌｉｔｅ）は、いずれも、完全に立体構造が失われている。一方、可溶化した状態でβ型ゼオライトに吸着した後、ＰＥＧとアルギニンの作用により遊離してきたＬＤＨ（Ｒｅｆｏｌｄｅｄ）は、ある程度の立体構造を回復している（リフォールディング）している。

収率に関しては、アルギニンの濃度が高いほど良好な高い収量が得られたが、酵素活性は下がってしまう。また、アルギニンの濃度が低い場合（０．３Ｍ）、良好な酵素活性をもつＬＤＨが得られるものの、その収率は低い。また、アルギニンの濃度が低く、遊離してくるＬＤＨの量が少ないときはＰＥＧの濃度が高くてもＬＤＨの比活性は低下しないようであるが、ＬＤＨが大量に遊離してくるようなアルギニンの濃度においては、高濃度のＰＥＧがＬＤＨの活性を下げる傾向がある。すなわち、ＬＤＨの再凝集を防ぐために、最低限のアルギニン（０．３から０．５Ｍ）と、十分な量のＬＤＨを遊離できる濃度のＰＥＧ（０．１％）を添加することで、リフォールドした活性型ＬＤＨを最も効率的に得ることができる。

本発明により、次のような効果が奏される。
（１）β型ゼオライトを用いた変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。
（２）変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を高活性で回復させることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。
（３）活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の回収率と活性回復率のバランスを高めたリフォールディング技術を提供することができる。
（４）アルギニン及びポリエチレングリコールとを組み合わせて、活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の回収率を向上させた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディング方法を提供することができる。
（５）封入体としての活性のない乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）から正しい立体構造及び活性を持った活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を得るためのリフォールディング技術を提供することができる。
（６）他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディング技術を提供することができる。
（７）希釈法、透析法の欠点である、大量のバッファーを必要とし、リフォールディングしたタンパク質の濃度が低いといった欠点を改善できる、シンプルに高効率でリフォールディングを行わせることが可能なリフォールディング技術を提供することができる。

次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。

本実施例では、乳酸菌由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を大腸菌内で大量発現させた。封入体として回収したＬＤＨを、６Ｍ塩酸グアニジンを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で可溶化した。可溶化したＬＤＨとβ型ゼオライトを室温で２時間混合した後、塩酸グアニジンを含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でβ型ゼオライトを洗浄した。続けて、分子量２００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００００）とアルギニンを含むＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）とβ型ゼオライトを混合し、緩衝液中に遊離してくるＬＤＨの濃度、円二色性スペクトル、及び酵素活性を測定した。酵素活性は、ピルビン酸を基質、還元型ＮＡＤＨを補酵素とした脱水素反応におけるＮＡＤＨの吸光度の減少を測定した。以下に、実験法方法とその結果を具体的に説明する。

（ゼオライトを用いた乳酸脱水素酵素のリフォールディング）
（１）乳酸脱水素酵素の生産
乳酸菌ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の遺伝子を、大腸菌用タンパク質発現ベクターｐＥＴ１００にサブクローニングした。その発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入することによって、ヒスチジンタグ付きの組換え体タンパク質として、大腸菌体内で大量発現させた。

標準的な培養条件下で大量発現させたＬＤＨは、そのほとんどが生化学的に不活性な不溶性の封入体へと移行した。大腸菌を破砕後、遠心分離によって回収された封入体を、変性剤入りの緩衝液（６Ｍ 塩酸グアニジン，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．５Ｍ ＮａＣｌ）中で可溶化し、ヒスチジンタグに対するアフィニティクロマトグラフィーを用いて、ＬＤＨを精製した。

（２）可溶化したＬＤＨのゼオライトへの吸着
可溶化したＬＤＨを、変性剤入りの緩衝液（６Ｍ 塩酸グアニジン，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．５Ｍ ＮａＣｌ）を用いて、様々な濃度に調整した。そのタンパク質溶液とβ型ゼオライトをサンプル管に入れ、室温で転倒混和した。２時間後、サンプル管を遠心し（３０００×ｇ、１０分）、β型ゼオライトと上清を分離した後、上清に残ったタンパク質の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。

上清のタンパク質濃度から、β型ゼオライトに吸着されたＬＤＨの量を算出し、吸着等温線を測定した。その結果、ベータ型ゼオライト１ｇ当たり、２００ｍｇ前後のＬＤＨが吸着されることが分かった。図１に、ＬＤＨのβゼオライトに対する吸着等温線を示す。また、ＬＤＨとゼオライトの混合を開始後、一定時間ごとにβ型ゼオライトに吸着されたＬＤＨの量を測定したところ、ＬＤＨは、極めて速やかに（一時間以内）吸着されることが分かった。図２に、ＬＤＨがβ型ゼオライトに吸着される速度を示す。

次に、ＬＤＨが溶けている緩衝液のｐＨや、含まれている塩（塩化ナトリウム）が、ＬＤＨの吸着に影響を与えるかどうか検討した。ｐＨの調整は、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５，４．５）、又はリン酸緩衝液（ｐＨ５．５，６．５）、又はトリスヒドロキシ塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５，８．５）を用いた。塩化ナトリウムは、１００ｍＭ又は５００ｍＭになるように調整した。

また、すべての緩衝液には、変性剤として、６Ｍのグアニジン塩酸が含まれる。調整した緩衝液にＬＤＨを溶かし、サンプル管中でβ型ゼオライトと混合した。室温で２時間転倒混和した後、β型ゼオライトに吸着されたＬＤＨの量を測定した。その結果、緩衝液に多量の塩化ナトリウム（５００ｍＭ）が含まれる場合、高いｐＨ域においてＬＤＨの吸着量がわずかに低下することが分かった。図３に、ＬＤＨの吸着に関するｐＨ、塩化ナトリウム濃度の影響を示す。

境目となるｐＨは、ＬＤＨの等電点（ｐＨ５．０−５．５）とほぼ一致していることから、β型ゼオライトへの吸着には、イオン交換的な相互作用も働いている可能性が考えられる。しかしながら、その影響は限定的であり、ＬＤＨの吸着において、主となる作用機構は、タンパク質とβ型ゼオライト間の疎水的な相互作用であるものと予想される。

（３）吸着されたＬＤＨの溶出
ＬＤＨとβ型ゼオライトの間には、疎水的相互作用が働いていると考えられることから、相互作用を弱める効果のある化合物を含む緩衝液を用いることで、吸着されたＬＤＨをゼオライトから遊離させることができると考えた。そこで、そのような化合物として、分子量２００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた。また、遊離したＬＤＨが再び凝集してしまうのを防ぐために、アルギニンも添加物として用いた。

ＬＤＨが吸着したβ型ゼオライトをＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄して変性剤を除いた後、様々な濃度のＰＥＧ、アルギニンを含むＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）と混合し、サンプル管に入れて４℃で一昼夜転倒混和した。サンプル管を遠心（３０００×ｇ、１０分）して上清を分離し、上清に含まれるＬＤＨの量を測定した。

ＰＥＧの濃度を上げるにしたがって、遊離してくるＬＤＨの量は増え、およそ０．１％以上のＰＥＧにより最大量に達することが分かった。図４に、ＰＥＧ２００００、アルギニンを添加した緩衝液によって回収されるＬＤＨ量を示す。また、ＬＤＨが遊離するためには、最低０．３Ｍ以上のアルギニンが同時に存在することが必要であることが分かった。回収率だけを考慮する場合、アルギニンの濃度が高ければ高いほど高い収率でＬＤＨが得られた。

（４）リフォールディングによって得られたＬＤＨの評価
ＰＥＧとアルギニンを含む緩衝液によって回収されたＬＤＨが、本来の生化学的な機能を取り戻しているかどうかを検討するために、ゼオライトに吸着させる前後のＬＤＨについて、円二色性を測定した。ＬＤＨの構造を反映したＣＤスペクトルの対照として、生化学的に活性型ＬＤＨを用いた。図５に、ＬＤＨの円二色性スペクトルを示す。

変性剤を含む緩衝液で可溶されたＬＤＨ（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ）は、その立体構造が失われていることにより、２２２ｎｍ付近に観察されるトラフが消失している。ゼオライトに吸着した可溶化ＬＤＨ（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｏｎ ｚｅｏｌｉｔｅ）、及びゼオライトに吸着した活性型ＬＤＨ（Ｎａｔｉｖｅ ｏｎ ｚｅｏｌｉｔｅ）は、いずれもシグナルがほとんど検出されず、ゼオライトに吸着されたＬＤＨは、完全に立体構造が失われていることが分かる。

一方、可溶化した状態でβ型ゼオライトに吸着した後、ＰＥＧとアルギニンの作用により遊離してきたＬＤＨ（Ｒｅｆｏｌｄｅｄ）は、活性型ＬＤＨ（Ｎａｔｉｖｅ）のスペクトルと同様の（２０９，２２２ｎｍ）トラフが観察される。これは、タンパク質に特徴的な立体構造を反映したものであり、ゼオライトから遊離してきたＬＤＨが、ある程度の立体構造を回復している（リフォールディング）していることを示す。

（５）遊離してきたＬＤＨの酵素学的な活性
５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に、ＰＥＧ２００００とアルギニンを添加した緩衝液によって、遊離してきたＬＤＨの乳酸脱水素活性を測定した。図６に、リフォールドしたＬＤＨの乳酸脱水素活性を示す。ＬＤＨは、基質（ピルビン酸）を代謝する際に、ＮＡＤＨを消費する。そこで、ＮＡＤＨの吸収波長（３４０ｎｍ）における吸光度の減少を測定することによって、ＬＤＨの活性が測定できる。２００ｍＭのピルビン酸と２ｍＭのＮＡＤＨを含む１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）にサンプルを添加したとき、波長（３４０ｎｍ）の吸光度を１秒間に１減少させる活性を１ユニットとして比活性を算出した。

アルギニン濃度が高すぎる（１Ｍ以上）と、乳酸脱水素活性が低かった。収率に関しては、アルギニンの濃度が高いほど、良好な高い収量が得られたが、酵素活性は下がってしまうことが分かる。また、アルギニンの濃度が低い場合（０．３Ｍ）、良好な酵素活性をもつＬＤＨが得られるものの、その収率は低い。

また、アルギニンの濃度が低く、遊離してくるＬＤＨの量が少ないときは、ＰＥＧの濃度が高くてもＬＤＨの比活性は低下しないようであるが、ＬＤＨが大量に遊離してくるようなアルギニンの濃度においては、高濃度のＰＥＧがＬＤＨの活性を下げる傾向がある。すなわち、ＬＤＨの再凝集を防ぐために、最低限のアルギニン（０．３から０．５Ｍ）と、十分な量のＬＤＨを遊離できる濃度のＰＥＧ（０．１％）を添加することで、リフォールドした活性型ＬＤＨを最も効率的に得ることができる。

以上詳述したように、本発明は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法に係るものであり、本発明により、β型ゼオライトを用いた変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の新しい機能賦活・回復方法を確立し、提供することができる。本発明により、封入体としての活性のない乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）から正しい立体構造及び活性を持った活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を得るためのリフォールディング技術を提供することができる。また、本発明は、他の方法と比べて、高効率でリフォールディングを行うことが可能な不活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディング技術を提供することを可能にするものとして有用である。

ＬＤＨのβゼオライトに対する吸着等温線を示す。 ＬＤＨがβ型ゼオライトに吸着される速度を示す。 ＬＤＨの吸着に関するｐＨ、塩化ナトリウム濃度の影響を示す。 ＰＥＧ２００００、アルギニンを添加した緩衝液によって回収されるＬＤＨ量を示す。 ＬＤＨの円二色性スペクトルを示す。 リフォールドしたＬＤＨの乳酸脱水素活性を示す。

Claims (5)

1. 乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能を賦活・回復する方法であって、
   １）変性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に、β型ゼオライト、及びアルギニンを含むリフォールディングバッファーを加え、所定の温度で一定時間インキュベーションすることによって、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のリフォールディングを行い可溶化した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）のβ型ゼオライトへの吸着と該乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能の賦活・回復をさせる、
   ２）その際に、上記β型ゼオライトとして、ＮＨ _４ ^＋ 若しくはＮａ ^＋ フォームにしたゼオライトを使用し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と０．３Ｍ以上で１Ｍ未満の濃度のアルギニンを含むリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングを行い遊離した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を回収してその機能を賦活・回復させる、ことを特徴とする乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
2. ０．１％以上で０．４％以下の濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の入ったリフォールディングバッファーを用いる、請求項１に記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
3. ０．３Ｍから０．５Ｍの濃度のアルギニンを添加したリフォールディングバッファーを用いる、請求項１に記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
4. 乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が、不活性乃至低活性の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）である、請求項１から３のいずれかに記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法。
5. 請求項１から４のいずれかに記載の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の機能賦活・回復方法を不活性乃至低活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）に適用して機能を賦活・回復させた活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を回収することを特徴とする活性乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の製造方法。